Bioquimica General

Bioqumica General:
Fundamentos y anlisis
de laboratorio
Mairin J. Lemus, Liliana A. Cortez
Universidad Tcnica de Machala

Bioqumica General: Fundamentos y Anlisis de
Laboratorio
Ing. Csar Quezada Abad, MBA
Rector
Ing. Amarilis Borja Herrera, Mg. Sc.

Vicerrectora Acadmica
Soc. Ramiro Ordez Morejn, Mg. Sc.

Vicerrector Administrativo
COORDINACIN EDITORIAL
VICERRECTORADO ACADMICO
Toms Fontaines-Ruiz, PhD.

Investigador Becario Prometeo-Utmach
Asesor Del Programa De Reingeniera
Ing. Karina Lozano Zambrano

Coordinadora Editorial
Ing. Jorge Maza Crdova, Ms.

Ing. Cyndi Aguilar
Equipo de Publicaciones
Bioqumica General: Fundamentos y
Anlisis de Laboratorio
Mairin J. Lemus, Venezolana
Liliana Alexandra Cortez Surez
Universidad Tcnica de Machala

2015
Primera edicin 2015
ISBN: 978-9978-316-98-6
D.R. 2015, universidad tcnica de machala

Ediciones utmach
Km. 5 1/2 Va Machala Pasaje
www.utmachala.edu.ec
Este texto ha sido sometido a un proceso de evaluacin por pares externos

con base en la normativa editorial de la utmach.
Portada:
Concepto editorial: Jorge Maza Crdova
Samanta Cabezas (est. Comunicacin Social)
Diseo, montaje y produccin editorial: UTMACH
Impreso y hecho en Ecuador

Printed and made in Ecuador
Advertencia: Se prohbe la reproduccin, el

registro o la transmisin parcial o total de esta
obra por cualquier sistema de recuperacin
de informacin, sea mecnico, fotoqumico,
electrnico, magntico, electroptico, por
fotocopia o cualquier otro, existente o por existir,
sin el permiso previo por escrito del titular de los
derechos correspondientes.
ndice
Prlogo ........................................................................ 11
Soluciones amortiguadoras .......................................... 13

Introduccin .................................................................... 13
Objetivos especficos: ........................................................ 16
Materiales y reactivos: ...................................................... 16
Laboratorio ...................................................................... 17
Actividad 1 ....................................................................... 17
Actividad 2 ........................................................................ 17
Post- laboratorio: .............................................................. 18
Propiedades ionicas de los aminocidos ........................ 19

Introduccin ..................................................................... 19
Materiales y reactivos: ....................................................... 22
Laboratorio ....................................................................... 22
Actividad 1 ....................................................................... 22
Activdad 2 ........................................................................ 23
Post-laboratorio: ............................................................... 23
Aislamiento de proteinas .............................................. 25

Introduccin ..................................................................... 25
Objetivos especficos ........................................................ 27
Materiales y reactivos ....................................................... 27
Laboratorio: ...................................................................... 28
Actividad 1 ........................................................................ 28
Aislamiento de albmina de huevo .................................... 28
Actividad 2 ........................................................................ 28
Aislamiento de la casena de la leche ................................. 28
Cuantificacin de protenas por mtodos
de biuret y lowry ........................................................... 31
Introduccin ..................................................................... 31
Mtodo de biuret ............................................................... 31
Mtodo de lowry ................................................................ 32
Mtodo de cido bicincrnico (bca) .................................... 33
Absorbancia uv ................................................................. 34
Mtodo de bradford ........................................................... 35
Objetivos especficos ......................................................... 36
Materiales y reativos ......................................................... 36
Laboratorio ....................................................................... 37
Actividad 1 ........................................................................ 37
Recta de calibracin de la reaccin del biuret. ................... 30
Actividad 2 ........................................................................ 38
Recta de calibracin del mtodo de lowry: ......................... 38
Cromatografa de filtracin en gel de la hemoglobina ..... 41

Introduccin ..................................................................... 41
Objetivos ........................................................................ 43
Materiales y equipos ......................................................... 43
Laboratorio ...................................................................... 44
Actividad 1 ........................................................................ 44
Preparacin de la muestra ................................................ 44
Actividad 2 ........................................................................ 44
Preparacin de la cromatografa ........................................ 44
Resultados esperados ....................................................... 45
Actividad enzimtica: cintica de michaelis-menten ...... 47

Introduccin ..................................................................... 47
Materiales y reactivos ...................................................... 49
Laboratorio ....................................................................... 50
Actividad 1 ........................................................................ 50
Condiciones ptimas para realizar las mediciones: ............ 50
Determinacin del efecto de la concentracin de sustrato
sobre la actividad de la enzima catalasa ............................ 50
Post-laboratorio ................................................................ 53
Extraccin y cuantificacin de glucgeno ...................... 55

Introduccin .................................................................... 55
Laboratorio: ...................................................................... 57
Actividad 1 .................................................................... 57
Extraccin de glucgeno ................................................... 57
Recta de calibracin de glucosa ........................................ 57
Extraccion, cuantificacin y cromatografa de lpidos .... 59

Introduccin ..................................................................... 59
Laboratorio ....................................................................... 60
Actvidad 1 ........................................................................ 60
Extraccin de lpidos: ....................................................... 60
Anlisis cualitativo de lpidos: ........................................... 60
Aislamiento de adn ....................................................... 63

Introduccin ..................................................................... 63
Objetivos especficos ........................................................ 64
Materiales y reactivos ........................................................ 64
Laboratorio ....................................................................... 64
Post-laboratorio ................................................................ 65
Aislamiento de arn ..................................................... 67

Introduccin ..................................................................... 67
Objetivos especificos ........................................................ 67
Materiales y reactivos ...................................................... 68
Laboratorio ..................................................................... 68
Determinacin de adn y arn ......................................... 69

Materiales y mtodos: ....................................................... 69
Laboratorio ....................................................................... 70
Actividad 1 ........................................................................ 70
Normas para trabajar en el laboratorio ......................... 73
Bibliografa consultada ................................................. 75
Biografa ...................................................................... 79
Prlogo
Este texto de Bioqumica General comprende los fundamentos tericos

que sustentan anlisis en sistemas biolgicos, enmarcadas dentro
del programa terico de la asignatura de Bioqumica, cada uno de los
captulos est dirigido al estudio de las macromolculas de la vida:
aminocidos, protenas, carbohidratos, lpidos y cidos nucleicos.
Establecidas como estrategia metodolgica de aprendizaje que debe ser
aplicada luego de haber obtenido los conocimientos tericos correspon-
dientes.
Este texto comprende una herramienta de provecho del estudiante
durante el proceso de aprendizaje, que permitir sustraer la mayor
cantidad de conocimiento de la materia haciendo uso de las enseanzas
provenientes de las lecciones tericas de una manera crtica y cientfica
y a modo de introducir al estudiante al fascinante mundo de la
investigacin. Este documento comprende 10 secciones que explican
los aspectos tericos y las bases fundamentales que sustentan la
aplicacin de tcnicas de laboratorio, no obstante se han estructurado
de una forma didctica y sencilla haciendo uso de las publicaciones
cientficas que han sustentado el uso de las tcnicas en investigaciones
cientficas.
Conociendo que los avances cientficos son arrolladores, los
fundamentos aqu presentados pueden ser utilizados para aplicaciones
con equipos computarizados, muchos ms sofisticados e inclusive con
tcnicas an mucho ms sensible, pero es necesario disponer de los
conocimientos bsicos presentados que pueda sustentar el aprendizaje
de tcnicas ms avanzadas con nuevas tecnologas que podr aprender
el futuro profesional en el rea de la investigacin.
[11]
12 Lemus, M / Cortez, L
Para ampliar los conocimientos de los aspectos fundamentales y

bases tericas de cada una de estas prcticas los estudiantes podrn
consultar cualquier libro del programa terico de Bioqumica General
o cualquier texto relacionado con fisiologa, anlisis fsico-qumico o
qumica analtica.
Proporcionamos con esta herramienta de adquisicin de
conocimientos terico prcticos fundamentales que servirn como base
a estudios especializados y como parte indispensable de la formacin
integral de profesionales.
Soluciones amortiguadoras
Introduccin
En los organismos vivientes los cidos y las bases dbiles tienen gran
importancia ya que, permiten estabilizar el pH de los fluidos orgnicos
y en consecuencia ayudan a mantener la estructura y la actividad de
las macromolculas biolgicas.
Los sistemas biolgicos operan bajos ciertos lmites de acidez y
basicidad. Estos sistemas producen constantemente ciertas cantidades
de cidos y bases que no causan ningn efecto sobre el funcionamiento
del sistema, debido a que existen mecanismos que pueden controlar estos
excesos y se han denominado complejos amortiguadores o tampones.
Un complejo amortiguador o tampn est compuesto de:
cido, que es una sustancia capaz de ceder hidrogeniones
Base, que es una sustancia capaz de aceptar hidrogeniones.
Cuando existen alteraciones fisiolgicas asociados a la variacin del
pH fisiolgico se produce la acidosis y alcalosis, que hacen referencia a
los procesos patolgicos en los organismos vivos.
Los fluidos intracelulares y extracelulares de los organismos
contienen pares conjugados cido-bsicos, los cuales actan como
tampones al pH normal de dichos fluidos, el tampn intracelular
ms importante es el par cido-bsico H2PO4-/HPO= (pK=7,2),
mientras que el de los fluidos intersticiales es el sistema tampn de
bicarbonato (H2CO3/HCO3-; pK = 6,4). Los fosfatos orgnicos, tales
como glucosa-6-fosfato y el ATP, contribuyen tambin a la capacidad de
tamponamiento de la clula. Por otro lado los grupos cidos y bsicos
de las protenas contribuyen tambin a el mantenimiento del pH en los
[13]
organismos vivos (-SH/S-, -COOH/COO-, -NH3+/NH2).

La mayor capacidad amortiguadora en la sangre lo constituye la
relacin Hemoglobina/oxihemoglobina y su equilibrio determinan el
transporte de dixido de carbono.
El uso de amortiguadores en las investigaciones bioqumicas es de
gran importancia debido a que mantiene la integridad y el funcionamiento
celular, de lo contrario no se podra emprender el estudio de clulas
intactas, partculas celulares o en muchos casos aislar y caracterizar
biomolculas purificadas, particularmente biopolmeros sin poner
atencin al control del pH.
El pH de una solucin amortiguadora se puede calcular mediante
la ecuacin de Henderson-Hasselbalch. Considerando como ejemplo la
disociacin del cido actico:
AcH Ac-+H+
La constante de equilibrio es:
Ac- H+
K a=
AcH
Aplicando logaritmo a ambos a lados de la ecuacin:
Ac- H+ Ac-
log(Ka)=log =log +log(H+)
AcH AcH
Cambiando de signos:
Ac- H+ Ac-
-log(Ka)=-log =-log -log(H+)
AcH AcH
Arreglando:
Ac

pK a log + pH
AcH

Soluciones amortiguadoras 15
dando como resultado la ecuacin de Henderson-Hasselbalch

Ac-
pH=K2+ log=
AcH
Considerando que el cido actico es muy dbil, el equilibrio de

disociacin est desplazado, casi totalmente, hacia la izquierda,
favorecido por la mayor presencia de acetato, se puede sustituir en
la ecuacin de Henderson-Hasselbalch, sin introducir errores, la
concentracin de actico libre por la de actico total ([AcH]=[cido]).
Anlogamente, como el acetato sdico est completamente disociado
podemos considerar que la concentracin del in acetato coincide con
la concentracin de sal ([Ac-]=[sal]).
Con estas modificaciones la ecuacin de Henderson-Hasselbalch se
utiliza para todos los amortiguadores:
sal
pH=pK2+ log=
cido
A partir de esta frmula se pueden deducir fcilmente las

propiedades de los amortiguadores:
El pH de una solucin amortiguadora depende del pK del cido dbil,
de tal forma que para cantidades equimolares de sal y de cido, el pH es
el pK de este cido que se obtiene cuando [sal] = [cido]. De esto se deduce
que la proporcin entre la sal y el cido determinan el valor de pH del
amortiguador y no las concentraciones absolutas de sus componentes.
Por lo que aadir agua a una solucin amortiguadora no altera el pH.
'
9
8
7
.,
pH-l"kll -4,~
fCMJCOO.)
6
..
% s
t

4
3
(CH;JCOOt-1) (04~COO )
2
1 't l~lllCOOltl
o o e.s
tqurv.Jntet Oe OH
'
Figura 1:1. Variacin de pH de una solucin amortiguadora constituida por su cido dbil
(CH3COOH) y su base conjugada (CH3COO-)
Cuando se aaden cidos o bases fuertes a la disolucin

amortiguadora, el equilibrio se desplaza en el sentido de eliminar el
cido aadido (hacia la izquierda) o de neutralizar la base aadida (hacia
la derecha). Este desplazamiento afecta a las proporciones relativas de
sal y cido en el equilibrio. Como el pH vara con el logaritmo de este
cociente, la modificacin del pH resulta exigua hasta que uno de los
componentes est prximo a agotarse (Figura 1:1).
La siguiente prctica tiene como objetivo general preparar soluciones
amortiguadoras y determinar la capacidad de tamponamiento cuando
se le aaden pequeas cantidades de cidos y bases.
Objetivos especficos:
1.Utilizar la ecuacin de Henderson-Hasselbalch para resolver

problemas de preparacin de soluciones tampones.
2.Preparar las soluciones tampones previamente calculadas.
3.Medir el pH de las soluciones tampones preparadas en el
laboratorio.
4.Medir la capacidad de amortiguamiento que tienen las soluciones
tampones cuando son tratadas con cidos y bases.
Materiales y reactivos:
pHmetro
Balanza
Soluciones tampones de pH=4,0 y pH=7,0
Calculadora
Matraces aforados de 50 y 100 ml.
Pipetas.
Varillas de vidrio.
cido clorhdrico 2N.
Tris(hidroximethyl)aminometano
Bicarbonato de sodio.
Carbonato de potasio.
Soluciones amortiguadoras 17
Fosfato de potasio monobsico

Fosfato de potasio dibsico.
Acetato de Sodio.
cido actico glacial 2N.
Pizetas.
Laboratorio
Actividad 1
Resuelva los siguientes problemas

a.Qu volumen de cido actico glacial (CH3COOH 2N) y que peso
de acetato de sodio (CH3COONa. 3H2O PM=136 g mol-1) se requieren
para hacer 100 ml de un buffer 0,25 M y pH=4,5. pKa=4,6? Qu debe
hacer para preparar 100 ml de un buffer 0,04 M dado 50 ml de un
buffer 0,2 M y pH=4,5?
b.Qu cantidad de fosfato de potasio monobsico (KH2PO4, PM=136
g mol-1) y fosfato de potasio dibsico (K2HPO4.3H2O, PM=228 g mol-1) son
requeridos para preparar 50 ml de un buffer 0,2 mol L-1 y pH= 7,1 (pKa=7,21)?
Qu debe hacer para preparar 100 ml de un buffer 10X a un pH=7,1?
c.Qu peso de carbonato de potasio (PM=138 g mol-1) y bicarbonato
de sodio (PM=84 g mol-1) son requeridos para hacer 100 ml de un
buffer 0,2 M y pH=10,2 (pKa=9,8)? Cmo preparara 6 ml de un buffer
0,06 M y pH=10,2?
d.Qu volumen de cido clorhdrico 2N y que peso de tris(hy-
droxymethyl)aminometano (PM=121 g mol-1) se requieren para realizar
100 ml de un buffer 0,2 M y pH=8,2 (pKa=8,0)? Qu debe hacer para
preparar 100 ml de un buffer 0,01 M y pH=8,2 dado 100 ml de un
buffer 0,2 mol L-1 y pH=8,2?
Actividad 2
2.Prepare las soluciones de los problemas anteriores. Recuerde que

debe calibrar el pH metro con las soluciones de referencia, procediendo
de la siguiente manera:
a.Encienda el potencimetro y espere al menos 15 minutos.

b.Lave bien el electrodo con agua destilada.
c.Calibre el pH metro con soluciones de referencia de pH=4,0,
pH=7,0 y/o pH=9,0.
d.Luego proceda a lavarlo con agua destilada y medir el pH de sus
soluciones previamente preparadas.
3.Anote los resultados experimentales y comprelos con los tericos.
4.Tome una de las soluciones amortiguadoras previamente
preparadas y aada gota a gota una solucin de HCl 1 mmol L-1 y
observe los cambios de pH, repita la misma experiencia con agua.
Interprete sus resultados.
5.Determine cul es el cambio de pH cuando a la solucin
amortiguadora que Ud. prepar se le aadi 0,5 ml de HCl 1 mmol L-1
Post- laboratorio:
1.Cundo una solucin amortiguadora presenta su mxima

capacidad amortiguadora?
2.Cules son las consideraciones que debe tener presente antes
de preparar una solucin amortiguadora?
3.Resuelva los siguientes problemas.
a.Cmo se prepara un litro de un tampn de piridina 0,02 mol L-1
y pH 8,0 con una solucin de piridina 0,1 mol L-1y cido clorhdrico
1 mol L-1? (Considerar que el pKa de la piridina es 8,64).
b.Cmo se preparan 500 ml de tampn de fosfato sdico 0,1 mol
L-1y pH 7,1 partiendo de Na2HPO4.2H2O (PM=178 g mol) y NaH2PO4.
H2O (PM=138 g mol)?, (Considere valores de pKa para el cido
fosfrico de 1,96; 6,80 y 12,0).
c. Cul es el pH de una solucin que contiene 5 ml de acetato de
sodio 0,1 mol/l y 4,0 ml de cido actico 0,1 mol L-1 (pKa= 4,76).
Cul es el cambio que ocurre en el pH al agregar a la solucin
amortiguadora anterior 1 mL de HCl 0,1 mol L-1?
Propiedades ionicas de los aminocidos
Introduccin
Como los aminocidos poseen al menos un grupo amino y un grupo

carboxilo, deben considerarse como anfolitos es decir, sustancias que
pueden comportarse como cidos o como bases, estos aminocidos se
disocian en soluciones acuosas dando iones dipolares o zwiteriones de
tipo:
+
H3N - CH - COO la forma no disociada sera H N - CH - COOH
2 2
Una molcula de este tipo puede reaccionar con cidos de la

siguiente manera:
pKa1
+
H3N - COO +
H3N - CH2 - COOH
Base conjugada cido conjugado

Y con bases:
pKa1
+
H3N - COO H2N - CH2 - COO
cido conjugado Base conjugada

Analizando las reacciones qumicas que definen el comportamiento
cido bsico tanto del grupo a-amino como del grupo a-carboxilo, lo
primero que observamos es que cualquier compuesto que presente un
[19]
grupo carboxlico en su estructura tiene la posibilidad de existir en dos

formas:
R - COOH R - COO- H+
La primera presenta caractersticas de cido dbil pues es capaz de

ceder protones al medio, mientras que la segunda tiene caractersticas
de base y puede aceptar protones del medio
Tambin, cualquier compuesto que presente un grupo amino en su
estructura tiene posibilidad de existir en dos formas diferentes:
R - NH+3 RNH2 + H+
Al igual que el grupo carboxlico el grupo amino tambin se

comporta como un cido y como una base.
Un grupo de aminocidos, denominados inicos, presentan adems
del grupo -amino y -carboxilo otro grupo ionizable que tambin
puede comportarse como un cido o base dbil (tabla 1).
Es posible construir curvas de titulacin de aminocidos que
muestren los fenmenos de disociacin que corresponden a los grupos
disociables y as establecer los PK de disociacin de un aminocido,
observndose tambin el punto isoelctrico que viene dado por
pI= 1 (pK1 + pK2 )

2
El punto isoelctrico est siempre determinado por los valores de

pKa que definen las fuerzas cida y bsica del zwitterion. Por lo tanto,
el punto isoelctrico para un aminocido cido est dado por:
pI= 1 (pKa + pKa )

2 1 2
y para un aminocido bsico:
pI= 1 (pKa + pKa )

2 2 3
Propiedades ionicas de los aminocidos 21
La titulacin, es sencillamente la representacin grfica del proceso

qumico de neutralizacin, es decir cuando una solucin de un cido
dbil es neutralizada con una base; el grado de acidez que presenta
la solucin vara a medida que se va agregando la base fuerte. Esta
variacin de la acidez de la solucin de un cido dbil en funcin del
agregado de la base fuerte se puede representar grficamente, siempre
y cuando se grafique el pH de la solucin (Figura 2:1).
50%C
S0%0 1CO%D
50% 100%C
5Cl%C
4.2
2.1
Figura 2:1Curva de titulacin del cido glutmico. Tomado de http://libroelectronico.uaa.mx/capitulo-4-aminoa-

cidos-y/curvas-de-titulacion-de-los.html
Por lo tanto, utilizando la ecuacin de Henderson-Hasselbalch

y conociendo el pKa de cada grupo disociable, se puede calcular la
relacin entre las concentraciones de las variedades inicas para
cualquier pH.
Esta prctica tiene como objetivo general estudiar el comportamiento
cido-bsico de diferentes aminocidos, as como tambin evidenciar
algunas propiedades generales.
Titular aminocidos con soluciones de HCl y NaOH.

Construir curvas de titulacin de cambios de pH en funcin de los
mEq de cido o base aadidos.
Determinar las zonas de pKa y zonas de equivalencia
Determinar la solubilidad de los diferentes aminocidos.
Aminocidos (glicina, cido glutmico, lisina y alanina)

Aminocidos (glicina, alanina, histidina y lisina 100 mmol L-1;
cido glutmico, 50 mmol L-1.
HCl (100 mmol L-1)
NaOH (100 mmol L-1)
Etanol
Cloroformo o ter de petrleo
Buretas
pH-metro
Varillas de Vidrio.
Laboratorio
Actividad 1
1.Tome 20 ml de un aminocido problema, colquelo en un vaso

de precipitado y determine el pH inicial. Comience a titular con HCl
0,5 N, aadiendo 0,5 ml por vez y observando los cambios de pH hasta
aproximadamente 1,5. Lave muy bien los electrodos y estandarice de
nuevo el medidor de pH si es necesario.
2.Tome 20 ml del mismo aminocido y comience a titular con NaOH
0,5 N, y se procede de forma similar a lo realizado anteriormente, hasta
alcanzar un pH de 12,5.
3.Construya las curvas de titulacin en papel milimetrado colocando
en el eje de la Y cambio de pH en funcin de mEq de cido o base, seale
las zonas posibles de pK y comprelos con los valores que se dan en
seguida. Calcule el punto isoelctrico e interprete los resultados.
Tabla 1. Valores de Pkas tericos de algunos aminocidos
Aminocido pKa1 pKa2 pKa3
Glicina 2,4 9,7
Alanina 2,3 9,9
Ac glutmico 2,2 4,3 9,7
Histidina 1,8 6,0 9,2
Lisina 2,2 9,2 10,8
Propiedades ionicas de los aminocidos 23
Activdad 2
1.Examine la solubilidad de la glicina, cido glutmico, lisina y

triptfano en los siguientes solventes: cido clorhdrico (0,1 mol L-1),
Hidrxido de sodio (0,1 mol L-1), cloroformo y etanol, para lo cual pesar
0,1 g de cada aminocido y aada 5 ml de los solventes sealados
anteriormente, en tubos debidamente rotulados. Observe su solubilidad
e interprete los resultados.
Post-laboratorio:
1.De acuerdo a las curvas de titulacin graficadas, Qu tipo de

aminocido usted supone que ha titulado: cido, bsico o neutro?
2.Explique el comportamiento del aminocido en la medida que
aade mEq de cido o de base, seale zonas de pK y equivalencia.
3.Cul es la relacin entre el par cido/bsico cuando el pH=7,0.
4.Determine la curva de titulacin de un aminocido que presenta
dos grupos ionizables cuyos grupos disociables presentan los
valores de pK siguientes:
pK (Carboxlico) = 2,5
pK (Amino) = 9,5
1.A qu frmula responde el aminocido?

2.Seale las especies inicas durante el proceso de titulacin
3.Qu pasa con el aminocido cuando existen unas altas concen
traciones de hidrogeniones (Bajo pH)?
4.Qu pasa con un aminocido cuando existe una baja
concentracin de hidrgenos (Alto pH)?
5.Qu porcentaje de las diferentes especies inicas predominan
cuando los valores de pH son iguales a 2,5 y 9,5?
6.Calcule el punto isoelctrico del aminocido
7.Cual en la especie inica predominante cuando el valor de pH es
igual al punto isoelctrico de la molcula.
8.Asumiendo que tenemos 1 mol del aminocido en su forma
protonada, que pasa cuando aadimos 0,1 mol de NaOH, que
cambio de pH experimenta el sistema.
a.Cul es el cambio de pH cuando se aade 0,7 moles de NaOH a

la solucin anterior?
b.Qu pasa si aumentamos la concentracin de NaOH hasta 1 mol
y cul es el valor de pH?
c.Qu ocurre si seguimos aadiendo 1,5 moles de NaOH? y cul
es el valor de pH?
Aislamiento de proteinas
Introduccin
El aislamiento de protenas puras no es tarea fcil, por lo general se

requieren de una serie de procedimientos diferentes que van eliminando
todas aquellas molculas no proteicas y elementos, que forman parte
de los subproductos de la purificacin proteica. En realidad, no existe
un mtodo universal para el aislamiento de las protenas, ms bien se
trata de mtodos de tanteo basados en las propiedades de las protenas
que deseamos purificar.
El primer paso, cuando se trate de protenas que se encuentran en
el interior de la clula se refiere a la ruptura de las clulas para formar
un extracto, por el contrario si se trata de protenas que estn libres
en el plasma no ameritan tal tratamiento. Existen varios mtodos para
romper la membrana plasmtica y su eficacia relativa depende del tipo
de clula que se est investigando. Los mtodos fsicos ms utilizados
son el choque osmtico, los ultrasonidos y la trituracin mecnica.
Estos procedimientos de ruptura celular rompen la mayora de
las membranas celulares (membrana plasmtica y membranas del
retculo endoplasmtico) en fragmentos que se cierran inmediatamente
sobre s mismos formando pequeas vesculas cerradas denominadas
microsomas. Utilizando un buffer adecuado y el procedimiento de
homogenizacin se realiza cuidadosamente, los orgnelos (ncleo,
mitocondria, aparato de Golgi, lisosomas, peroxisomas) permanecen
intactos y mantienen la mayora de sus propiedades bioqumicas
originales.
[25]
Una vez obtenida las protenas libres comienza el trabajo de

eliminar todas aquellas partculas que no tienen nada que ver con la
protena. La eliminacin de todos estos elementos y el mantenimiento
de la integridad de la protena que deseamos aislar dependern de las
caractersticas de la protena.
Cuando se trata de aislar protenas al igual que muchos materiales
biolgicos se deben evitar las condiciones extremas y se aconseja el uso
de mtodos fsicos en vez de qumicos para este propsito. En general
se recomienda concentraciones altas de protenas, baja temperatura y
pH alrededor de la neutralidad pues de lo contrario la protena puede
desnaturalizarse y en consecuencia se vuelve menos soluble y pierde
su actividad biolgica.
El fraccionamiento de las protenas con sulfato de amonio representa
una estrategia que se emplea con gran frecuencia para el aislamiento
de protenas. La incorporacin de sulfato de amonio a la solucin de
protenas disminuye la solubilidad de stas. Este efecto se conoce como
extraccin por sal, depende de la concentracin de sulfato de amonio
incorporado y de la naturaleza de la protena. Otras tcnicas utilizadas
para el aislamiento de las protenas son: precipitacin con solventes
orgnicos, tales como: la acetona, cido perclrico o metafosfrico.
Tambin se puede utilizar el calentamiento ligero a fin de alterar la
solubilidad de la protena, y la precipitacin isoelctrica que se basa
en el hecho de que una protena tiene solubilidad mnima en un pH
correspondiente a su punto isoelctrico.
La determinacin de protenas es de gran inters en la bioqumica,
clnica mdica y medicina. En prcticas de laboratorio para la purificacin de
protenas frecuentemente se requieren mtodos rpidos y sensibles para su
cuantificacin. Los mtodos ms usuales para su determinacin protenas
son: Reactivo de biuret, reactivo de Fenol de Folin-cilcalteus para Lowry, azul
brillante de comassie para Bradford y cido bicincrnico (BCA, patentado).
Adicionalmente, son usadas para su determinacin mediciones directas, las
cuales son de importancia para estimar y examinar pureza. Estos mtodos
son los siguientes: Absorbancia a 280 nm, Mtodo de Warburg-Cristiam
(Absorbancia a 260/280 nm) y Radio de correccin a 230/260.
La determinacin de la absorbancia a 280 nm mide la cantidad de luz
absorbida por los aminocidos aromticos (tirosina y triptfano) presentes
en las protenas (Layne, 1957). Aunque este mtodo es poco sensible,
Aislamiento de proteinas 27
puede medir concentraciones de protenas > 50 g/mL. El valor obtenido es

dependiente del tipo de protenas, aunque todas las sustancias que absorbe
luz a 280 nm pueden producir interferencias (cidos nucleicos, fenoles y
otros compuestos aromticos).
Con el mtodo de Warburg-Christian (Warburg & Christian, 1941),
existen los mismos problemas de interferencia, sin embargo la interferencia
originada por la presencia de cidos nucleicos puede ser compensada. Este
mtodo es ms sensible y especfico que el anterior y su sensibilidad se
encuentra en el orden de 50 3000 g mL-1.
El radio 230/260 nm se utiliza principalmente para chequear la pureza
de una protena. Algunos compuestos orgnicos como nitratos, nitritos
interfieren en esta prueba, no obstante, puede ser corregida automticamen-
te usando una lnea base a 320 nm.
El objetivo de la prctica es aplicar algunas tcnicas sencillas para
el aislamiento y cuantificacin de protenas tales como la albmina de
huevo y la casena de la leche.
Objetivos especficos
1.Aislar albmina de la clara de huevo, como ejemplo de su

solubilidad en agua destilada
2.Aislar casena de la leche, como ejemplo de aislamiento basado
en el punto isoelctrico de la protena
Materiales y reactivos
1itro de leche
1 L de amortiguador de acetato de sodio (0,2 mol L-1, pH 4,6)
Etanol 95%
ter
Termmetros
Muscelina
Embudo Buchner y papel de filtro
Cloruro de Sodio ( 0,15 mol L-1)
Huevo
Laboratorio:
Actividad 1
Aislamiento de albmina de huevo

La clara de huevo est constituida principalmente por protenas de
tipo albmina y globulinas, las cuales difieren en estructura funcin y
solubilidad, caracterstica sta que permite su separacin o aislamiento.
Las albminas tales como, ovoalbmina, albmina srica y
lactoalbmina son protenas fcilmente solubles en agua destilada y en
soluciones salinas diluidas, mientras que las globulinas son tambin
solubles en soluciones salinas diluidas pero insolubles en agua
destilada, basados en estas caractersticas podemos aislar albmina y
globulinas de huevo:
1.En un vaso de precipitado, rompa un huevo separando y
descartando la yema.
2.Aada 200 ml de agua destilada, agite rpidamente hasta que
las globulinas precipiten, mientras que las albminas permanecen
en solucin.
3.Centrifugue la suspensin a 3000 g por 10 min.
4.Deje secar el precipitado y calcule el rendimiento:
peso de la albmina
%albmina= x100
peso de la clara de huevo
5.Resuspenda el precipitado en 2 ml de solucin salina.

6.Guarde la solucin para realizar la determinacin de protenas
por medio de mtodos directo.
Actividad 2
Aislamiento de la casena de la leche

La casena es la principal protena encontrada en la leche y est
presente en una concentracin de 35 g L-1. No es un compuesto simple
sino una mezcla heterognea de protenas que contienen fsforo.
La mayora de las protenas muestran una solubilidad mnima en
su punto isoelctrico y este principio se utiliza para separar la casena
Aislamiento de proteinas 29
ajustando el pH de la leche a 4,8, su punto isoelctrico. La casena es

tambin insoluble en alcohol, lo cual permite remover la grasa de las
preparaciones.
1.En un vaso de precipitado de 500 ml coloque 100 ml de leche
y calintela a 40 C, aada lentamente 100 ml de buffer de acetato
previamente calentado a 40 C, mientras mezcla con una varilla de
vidrio.
2.Mida el pH final de la mezcla, recuerde que esta debe ser aproxi
madamente 4,8, si no es as ajuste el pH.
3.Enfri la suspensin a temperatura ambiente y deje reposar por
5 minutos antes de filtrarla a travs de la muselina.
4.Lave el precipitado varias veces con un pequeo volumen de agua
destilada y luego resuspenda en 30 ml de etanol.
5.Filtre la suspensin a travs de un embudo buchner y lave el
precipitado por segunda vez con una mezcla de etanol, ter 1:1.
6.Finalmente lave el precipitado con 50 ml de ter y squelo
manteniendo el vaco.
7.Remueva el polvo formado y colquelo en un vidrio de reloj para
permitir la evaporacin del ter.
8.Pese la casena y calcule el porcentaje de recuperacin.
peso de la caseina
%caseina= x100
peso de la leche
9.Guarde la muestra a 0C para la determinacin de protenas

por mtodos directos
Post-laboratorio:
1.Compare cada uno de los mtodos directos utilizados en prctica

en cuanto a sensibilidad de valoracin de protenas.
2.Considere las ventajas y desventajas de los mtodos directos en
relacin con los mtodos qumicos de cuantificacin.
Cuantificacin de protenas por mtodos de Biuret
y Lowry
Introduccin
Existen diversos mtodos que permiten cuantificar la concentracin de

protenas presente en muestras biolgicas, basados en las propiedades
que muestran las protenas en solucin. Los mtodos ms usuales en
laboratorios son: Reaccin del Biuret, Lowry, Bradford y el mtodo del
cido Bicincrnico. Tambin se utilizan Absorbancia a 280 y Mtodos
inmunolgicos. Cada uno de los mtodos tiene fundamentos diferentes
o simplemente son combinaciones que han permitido una mayor
sensibilidad de la determinacin. El uso de una tcnica en particular
depender del tipo de protena, de la cantidad de protena de la que se
disponga y de los costos de cada tcnica.
Mtodo de Biuret
El mtodo de Biuret se fundamenta en la formacin del compuesto

coloreado formado por la condensacin de dos molculas de urea
con eliminacin de amonaco. En presencia de la solucin alcalina de
sulfato cprico (CuSO4) se forma una complejo entre el ion cprico y
[31]
los enlaces peptdicos, con aparicin de una coloracin violeta-prpu-

ra, que presenta un mximo de absorcin a 540 nm (Figura 4:1).
RO
1 11 ) +l
( -CHC-N- + C1 --.
H (m.~
Figura 4:1. Reaccin de Biuret con protenas
Las caractersticas ms importantes de la reaccin son:

1.La reaccin del Biuret se aplica, a partir de los tetrapptidos, a
todos los pptidos y protenas;
2.Su rango de determinacin es de 1 a 10 mg/ml;
3.No depende de la composicin de aminocidos;
4.Puede provocar Interferencias con algunos compuestos tales
como NH4+, Tris, etc.
Mtodo de Lowry
Este mtodo se utiliza para aumentar la sensibilidad de la reaccin del

biuret, el complejo protena-Cu2+ se hace reaccionar con el reactivo
de Folin-Ciocalteus, dando una coloracin azul, con un mximo de
absorcin a 650 nm. Esta coloracin se atribuye a la reduccin del
cido fosfomolbdico/fosfotngstico a azul de heteropolimolibdeno
de composicin no definida, por medio de los residuos tirosilos,
Cuantificacin de protenas por mtodos de biuret y lowry 33
triptofanilos, y en menor grado, cisteinilos e histidilos de las protenas

que forman el complejo con el Cu2+ (Figura 4:2).
1mJ.
oif..
-~
tittl ..
;,.,.-:._ --
--
1w-. r>
(cdCfCIAJ
Figura 4:2. Reaccin de Folin- Ciocalteau con protenas
Las caractersticas del mtodo son:

1.La intensidad de la coloracin vara con la composicin de
aminocidos de la protena;
2.Es ms sensible que el ensayo del biuret.
3.Rango oscila de 0,1-1 mg/ml;
4.La modificacin de Hartree incrementa la sensibilidad de 2-200 g/ml,
5.Presenta algunas interferencias.
Mtodo de cido bicincrnico (bca)
El cido bicincrnico, es un compuesto constituido por una sal sdica

capaz de formar un complejo prpura intenso con iones Cu1+ en medio
alcalino. Este reactivo forma la base de un mtodo analtico capaz de
monitorizar el in cuproso producido en una reaccin entre las protenas
con Cu2+ en medio alcalino (reaccin de Biuret). La estabilidad del
reactivo y el cromforo proporciona un mtodo para la cuantificacin
de protenas sencillo, rpido, muy sensible, y que muestra una gran

tolerancia a compuestos que afectan a otros mtodos (Figura 4:3).
' 2
-- --- ,.
' ""
-
-
-l -l
Figura 4:3. Reaccin del cido bicincrnico con protenas

Las caractersticas del mtodo son:
1.Presenta una sensibilidad similar al mtodo ms sensible de
Folin.
2.Compatible con detergentes caotrofos y solventes orgnicos.
3.No compatible con agentes reductores.
4.Las muestras deben ser ledas dentro de un lapso de 10 minutos.
Absorbancia uv
El enlace peptdico puede ser ledo en absorbancias de 205 y 280

nm en los aminocidos tirosina y triptfano y las principales caracte-
rsticas son:
1.La sensibilidad depende del nmero de aminocidos aromticos.
2.No es destructivo.
3.No se utilizan reactivos para su determinacin por lo que su costo
es muy bajo.
4.A la absorbancia se 205 nm la sensibilidad es de e 10 a 50 g. ml-1
5.A la absorbancia de 280 nm es de 50 g. ml-1 hasta 2 mg. ml-1
Mtodo de bradford
Se basa en la unin de un colorante, Comassie Blue G-250 (tambin

Serva Blue) a las protenas. El colorante, en solucin cida, existe en
dos formas una azul y otra naranja. Las protenas se unen a la forma
azul para formar un complejo protena-colorante con un coeficiente
de extincin mayor que el colorante libre. Este reactivo reacciona con
aminocidos especficos y estructura terciaria de la protena (Figura
4:4).
~
tulc tnd 11omtlc
lfde chaln5
Figura 4:4. Reaccin entre el reactivo de Bradford y las protenas. Tomado de https://bioquimexpe-
rimental.files.wordpress.com/2009/08/metodos-espectroscopicos-y-curva-patron.pdf
Las caractersticas son:

1.Existe gran variacin de protena a protena.
2.Pocas sustancias interfieren en su determinacin: solo algunos
detergentes y soluciones bsicas.
3.Esta tcnica es til cuando la precisin no es muy importante.
4.Este mtodo es sensible (1-15 g), simple, rpido, barato y Entre
las sustancias que interfieren estn los detergentes y las soluciones
bsicas.
Tabla 4:1. Comparacin de la sensibilidad de mtodos para cuantificar protenas
Acido Bicicrmico Biuret Bradford Folin-ciocalteau

Loury
Rango de 1-15 1000-10000 1-20 (micro) 25-100 a 500 nm

sensibilidad (g/
ml)
100-1500 (macro) 2-30 a 660 nm
1-2 a 750 nm
Al trmino de la prctica el alumno ha de ser capaz de:

Aplicar los principales mtodos de valoracin de las protenas.
Construir una recta de calibracin con una solucin de albmina
de suero bovino como protena patrn para cada una de los mtodos
colorimtricos de Biuret y Lowry.
Establecer el desarrollo de los mtodos determinando la linealidad,
la sensibilidad, el lmite de deteccin y el rango de cada uno de los
mtodos ensayados.
Comparar Los mtodos qumicos utilizados con los Mtodos Directos
Materiales y reativos
Reactivo de Biuret: Disolver 3,8 g de CuSO4.5H2O y 6,7 g NaEDTA en

700 ml de H2O. Mientras se agita aadir 200 ml de NaOH 5N y luego 1g
de KI como estabilizante. Guardar en frasco de plstico.
Solucin Standard de albumina de bovino (1 mg ml-1).
Muestra problema, de concentracin desconocida.
Reactivo de Lowry, compuesto por tres soluciones que se mezclan
en el momento de su utilizacin, y que son las siguientes:
1.A: Carbonato sdico al 2% en NaOH 0,1 M
2.B: Sulfato cprico al 1%
3.C: Tartrato sdico-potsico al 2%
En el momento de su uso se mezclan 50ml de A con 0,5 ml de B y

0,5 ml de C.
Reactivo de fenoles de Folin-Ciocalteau. Este reactivo viene
preparado comercialmente y se debe mantener en refrigeracin. Para
su uso se diluye inmediatamente antes en la relacin de 1 parte de
reactivo por 2 de agua destilada.
Laboratorio
Actividad 1
Recta de calibracin de la reaccin del Biuret.
1.Se colocan en una gradilla ocho tubos de ensayo que deben de
estar limpios y secos.
2.Se numeran del 1 al 6 con un rotulador permanente al agua y dos
tubos adicionales para las muestras problemas.
3.Con las pipetas adecuadas se adiciona a cada uno de los
volmenes de la disolucin patrn de albmina de suero bovino
al 10 mg mL-1 (bsa) y de agua destilada que se indican en la
siguiente Tabla:

Tubos
1(blanco) 2 3 4 5 6 7 8
BSA (10 mg ml-1)
(ml) - 0,1 0,2 0,4 0,8 1,0 0,5 0,5
NaCl
(ml) 3,0 ml 2,9 2,8 2,6 2,2 2,0 2,5 2,5
Protena
(mg) 0 1 2 4 8 10
Biuret
(ml) 3,0 ml 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0
4.Se agitan suavemente cada uno de los tubos y se deja reposar a

los tubos durante 30 min.
5.Se procede a medir en el espectrofotmetro, ajustndose el mando
de seleccin de la longitud de onda del espectrofotmetro a 540 nm.
6.Se ajusta el cero de absorbancia con la solucin blanco exenta de
protena (tubo 1).
7.Se miden las absorbancias de los tubos 2 a 6. Siempre que se
realicen las medidas desde la solucin menos concentrada (tubo 2)
a la ms concentrada (tubo 6), se cometer el mismo error de medida,

por lo que no ser necesario enjuagar y secar la cubeta despus de cada
medicin. Luego se procede a medir las concentraciones problemas
tubos 7 y 8.
Actividad 2
Recta de calibracin del mtodo de Lowry:

Puesto que el mtodo de Lowry es ms sensible que la reaccin
del Biuret, lo primero que hay que realizar es la preparacin de una
solucin de protena patrn ms diluido (1 mg ml-1).
Para obtener la recta de calibracin del mtodo de Lowry se siguen
los siguientes pasos:
1.Se colocan en una gradilla siete tubos de ensayo que deben de
estar limpios y secos.
2.Se numeran del 1 al 7 con un rotulador permanente al agua
3.Con las micropipetas adecuadas al volumen a medir, se adiciona
a cada uno de ellos los volmenes de la solucin patrn de albmina
de suero de bovino (BSA) y de agua destilada que se indican en la
siguiente Tabla:
Tubo No (N) BSA

(1mg/ml) Agua Solucin alcalina Folin Albminas Globulinas
1 0 ml 1,0 ml 3 ml 0,9 ml 0,1 ml
2 0,1 ml 0,9 ml 3 ml 0,9 ml 0,1 ml
3 0,2 ml 0,8 ml 3 ml 0,9 ml 0,1 ml
4 0,3 ml 0,7 ml 3 ml 0,9 ml 0,1 ml
5 0,5 ml 0,5 ml 3 ml 0,9 ml 0,1 ml
6 0,7 ml 0,3 ml 3 ml 0,9 ml 0,1 ml
7 0,2 ml 0,8 ml 3 ml 0,9 ml 0,1 ml
8 0,2 ml 0,8 ml 3 ml 0,9 ml 0,1 ml
4.Luego de esperar 30 min, Se procede a medir en el espectrofo-

tmetro siguiendo las normas expresadas anteriormente Se ajusta el
mando de seleccin de la longitud de onda del espectrofotmetro a 650
nm y se procede a medir como se indic para el reactivo de Biuret.
5.Una vez determinados los valores de absorbancia para cada
concentracin de protena patrn para los mtodos establecidos de
Biuret y Lowry, el desarrollo de los mismos pasa por optimizar una serie
de parmetros, tales como, linealidad, sensibilidad, precisin, rango,

selectividad y robustez, mediante el uso de herramientas estadsticas
Para comparar dos curvas de calibracin, se requiere medir la
bondad del ajuste de los patrones, De los valores estadsticos el
coeficiente de correlacin es el ms popular. Un valor de +1 indica una
relacin lineal perfecta entre la absorbancia y la concentracin.
Post-laboratorio:
1.Calcule la concentracin de protenas utilizando el coeficiente de

extincin de cada protena y comprelo con el mtodo grfico.
Cromatografa de filtracin en gel de la
Hemoglobina
2.Compare datos de cada mtodo e interprete.

Introduccin
La hemoglobina (Hb) transporta el oxgeno desde el tejido respiratorio

hasta los tejidos. Tambin transporta desechos del metabolismo desde
los tejidos hasta los pulmones para eliminarlos. Existen distintas
clases de Hb, oxihemoglobina, en forma reducida (Fe2+) de color rojo,
unida al oxgeno y metahemoglobina, forma oxidada (Fe3+) incapaz de
unirse al oxgeno y de color pardo. En esta prctica se aprender a
manejar la tcnica de cromatografa por filtracin en gel, aprovechando
las caractersticas diferentes de estas dos formas de Hb. En ella, la Hb
oxidada (metahemoglobina) la separaremos de su oxidante artificial,
reducindola a oxihemoglobina. Asimismo, se determinarn los
espectros de absorcin de las dos formas de hemoglobina citadas.
La sangre es un tejido orgnico en forma de lquido viscoso, de color
rojizo, e integrado por elementos celulares libres (clulas sanguneas)
y por una sustancia fundamental lquida (plasma). De las clulas
sanguneas las que nos interesan son los eritrocitos, clulas anucleadas
en forma de disco circular bicncavo y superficie lisa, que contienen
un 33% de hemoglobina. La hemoglobina es la molcula encargada de
transportar el oxgeno a cada una de las clulas del organismo, por lo
que juega un papel vital en el aspecto ms importante del metabolismo,
ya que los mecanismos ms eficientes para generar energa en las
clulas animales, requieren oxgeno molecular para la oxidacin
de los alimentos. Tambin transporta una parte del CO2 producido
en los tejidos hasta los pulmones. La hemoglobina es una protena,
[41]
con un peso molecular de 66.000 d. Est formada por 4 cadenas

polipeptdicas, cada una unida a un grupo hemo. ste est formado
por una porfirina unida a Fe que puede estar en forma oxidada (Fe3+)
o en forma reducida (Fe2+). La forma reducida es la nica capaz de
unirse al O2 y se denomina oxihemoglobina cuando est unida al O2
(de color rojo vivo, es la que se encuentra en la sangre arterial). La
sangre venosa (rojo oscuro) contiene bastante desoxihemoglobina, que
no contiene oxgeno y s CO2 unido como carbamino-Hb. El tomo de
hierro del grupo hemo se mantiene en todas estas formas en su forma
reducida Fe2+. Si se oxida a Fe3+ es incapaz de unirse al O2 ni al CO2
y se denomina metahemoglobina (de color pardo)
La cromatografa de filtracin en gel o exclusin molecular, una
de las modalidades de cromatografa en gel, es un proceso en que los
componentes de una muestra se separan en funcin de su tamao y
su forma molecular.
La separacin se realiza en una columna que contiene un gel
formado por bolitas porosas compuestas de un polmero insoluble, pero
altamente hidratado, tales como el dextrano y la agarosa (carbohidratos)
o la poliacrilamida. Sephadex, Sepharosa y Biogel son preparaciones
comerciales de estas bolitas usadas normalmente.
Los componentes a separar se establecen entre el disolvente que
fluye por el exterior de estas bolitas (fase mvil) y el que se encuentra
en el interior de las mismas (fase estacionaria). Las variables que
determinan la distribucin de los solutos entre ambas fases son funda-
mentalmente de tipo estrico.
' '
Figura 5:1. Filtracin en gel
Cromatografa de filtracin en gel de la Hemoglobina 43
Las molculas pequeas pueden entrar en estas bolitas, pero no

las grandes. El resultado es que las molculas pequeas se distribuyen
tanto en el interior de las bolitas como entre ellas, mientras que las
molculas grandes se localizan solamente en la disolucin entre las
bolitas. Las molculas grandes fluyen ms rpidamente a travs de
esta columna y salen antes porque disponen de un volumen accesible
menor. Las molculas que son de un tamao intermedio y que pueden
penetrar en las bolitas slo parcialmente fluirn de la columna en una
posicin intermedia y las molculas pequeas, que siguen un camino
ms largo y tortuoso, saldrn las ltimas.
Consecuentemente, el orden de elucin de los distintos componentes
de la mezcla ser inverso al de su tamao molecular.
Objetivos
Comprender el mecanismo de la cromatografa de exclusin

molecular o filtracin en gel.
Observar las diferentes formas redox de la hemoglobina y sus
diferentes espectros de absorcin
Materiales y equipos
Columna de Sephadex G-25.

Vasos de precipitado de 50 ml.
Tubos de vidrio de 10 ml.
Pipetas de vidrio de 1 ml y 5 ml, y pipetas automticas con puntas
desechables.
Tampn fosfato 20 mmol pH 7.
Agente Reductor: Ditionito sdico (S2O4Na2). Para 5 ml pesar 200
mg de S2O4Na2
Agente Oxidante: Ferricianuro potsico (Fe(CN)6K3). A saturacin
Sangre.
Cubeta semi-micro.
Agua destilada
Laboratorio
Actividad 1
Preparacin de la muestra
Un paso previo consiste en la recoleccin de sangre. Para ello se
aadirn agentes anticoagulantes con una concentracin de 1 mg
ml-1 de edta y 0,2 mg ml-1 de heparina. Una vez bien mezclada se
repartir en recipientes pequeos y se conservarn a -80C hasta su
utilizacin. Este paso suele hacerlo el profesor. Para realizar la prctica
se proceder de la siguiente forma:
Hemolizar la sangre para que se libere la hemoglobina que contiene
al medio: se diluye 250 l de sangre en 1 ml de agua destilada.
Oxidar la hemoglobina a metahemoglobina: para ello se aaden 50
l de ferricianuro potsico a 500 L del hemolizado anterior, mezclando
con agitacin suave. El ferricianuro es un oxidante que convierte todas
las formas de Hb en su forma oxidada o metahemoglobina. Se podr
observar como la sangre pasa de un color rojo intenso a un color pardo
oscuro.
Una vez realizado este paso previo se realizar la cromatografa.
Actividad 2
Preparacin de la cromatografa
Lavar la columna con tampn fosfato potsico 20 mM pH 7 con
un volumen igual al doble del volumen total de la columna (llenar la
columna hasta arriba y dejar que pase entero a travs de la misma
antes de aadirlo por segunda vez). Mientras tanto se deber numerar
los tubos de vidrio del 1 al 20.
Depositar una fina capa de solucin de ditionito, 200 l, en la
superficie del lecho de la columna. Dejar que el ditionito pase por
completo al interior de la columna.
Aadir 650 l de tampn para que el ditionito se introduzca bien
en la columna. Dejar que el tampn se introduzca por completo en el
interior de la columna.
Cromatografa de filtracin en gel de la Hemoglobina 45
Aplicar una fina capa de solucin de metahemoglobina, 200 l,

de forma uniforme. Dejar que la metahemoglobina pase a la columna.
Volver a llenar la columna con tampn hasta arriba. A partir de este
momento y hasta el final de la cromatografa se recogern fracciones de
10 gotas del lquido eluyente.
Aadir 5 ml de H2O a cada tubo y medir la absorbancia a 420 nm
de cada fraccin, ajustando a 0 con H2O.
Nota: a las fracciones donde se eluye la hemoglobina (color rojo
intenso) se aaden 10 ml de H2O en lugar de 5 ml.
Volver a equilibrar la columna con tampn repitiendo el lavado del
primer paso y dejndola llena de tampn y cerrada para su posterior
utilizacin.
Resultados esperados
Al final de la prctica se realizar una grfica en la que se representar

el volumen de elucin, nmero de fraccin, (en el eje X) frente a
unidades de densidad ptica o absorbancia a 420 nm (en el eje Y). De
esta forma se obtendr un cromatograma que indicar el perfil de
elucin de la hemoglobina y el ferricianuro potsico y el retraso que
sufre este ltimo frente a aquella. El ferricianuro sale de la columna
detrs de la hemoglobina y se anotar en el cromatograma el tubo en
el que hay un color amarillo ms intenso, que corresponde al pico de
elucin del ferricianuro.
A continuacin el estudiante realizar un del cromatograma corres-
pondiente a los datos incluidos. En el eje de las X se colocar el nmero
del tubo y en la Y la absorbancia a 420 nm. En dicho cromatograma
observar dos picos de elucin, el primero se corresponde con la
hemoglobina y el segundo con el ferricianuro de potasio
En presencia de ferricianuro potsico (oxidante), la hemoglobina
reducida se oxida a metahemoglobina (de color pardo), cambiando el
estado de oxidacin del Fe del grupo hemo de Fe2+ a Fe3+.
Hb(Fe2+) + Fe (CN)63 Meta Hb(Fe3+) + Fe(CN)64-
Al eluir la muestra (metahemoglobina ms ferricianuro) a travs

de la columna, las molculas grandes de metahemoglobina pasan
rpidamente entre las partculas de Sephadex G-25, mientras que las
molculas pequeas de ferricianuro quedan retrasadas. As, al final
se separan en dos bandas distintas de diferente color (una amarilla
correspondiente al ferricianuro y otra parda dela metahemoglobina).
Como la metahemoglobina emigra rpidamente acaba alcanzando
a la banda de ditionito sdico (reductor, de bajo peso molecular por lo
que eluye despacio). Entonces la metahemoglobina se reduce de nuevo
a hemoglobina roja.
La hemoglobina regenerada puede entonces oxigenarse espont-
neamente con el O2 disuelto en el tampn para formar oxihemoglobina
de un color rojo brillante caracterstico (ver esquema).
Meta Hb(Fe3+) + Ditionito (red) Hb(Fe2+) +Ditionito (oxid)
Fcniciaruro
(amonio) 1M;~
Metahen'o~loblr.o
(parda)
Oitionito
Oitcnlto
Oxit.emoglobine
(tojo-)
Figura 5:2. Esquema de la cromatografa del experimento realizado en la prctica

Actividad enzimtica: cintica de michaelis-menten
Introduccin
Las enzimas son catalizadores biolgicos que se encargan de realizar

todas las transformaciones energticas que ocurren en un organismo,
modificando la velocidad de las reacciones qumicas, ms no el equilibrio
final. Para la transformacin de un gran nmero de molculas de
sustrato se requieren por lo general pequeas cantidades de enzima.
Las enzimas son especficas, ya que catalizan un nmero pequeo
de reacciones y en algunos casos tan slo una reaccin, funcionando
bajo condiciones bien definidas de pH, temperatura, concentracin de
sustrato y cofactores. La catalasa (EC 1.113.6; CAT) es una enzima
ampliamente distribuida en organismos aerobos, la misma desempea
el papel de controlar los niveles fisiolgicos del perxido de hidrgeno
(H2O2) en la clula, acelerando su descomposicin a agua y oxgeno:
2 H2O2 H2O + O2
Esta enzima fue aislada y cristalizada por primera vez en el hgado

de Buey y luego en sangre. Su actividad est asociada principalmente a
los peroxisomas, mitocondrias y cierta parte en el citosol. Los eritrocitos
humanos se caracterizan por ser ricos en catalasa, aunque existen
tambin formas extracelulares. La catalasa forma parte de los sistemas
de destoxificacin de las clulas animales y vegetales, y de bacterias
aerobias y anaerobias facultativas. La reaccin especfica que cataliza
es la ruptura del H2O2 para formar agua y oxgeno. El H2O2 se forma
[47]
en el transporte de electrones de la cadena respiratoria y en ciertas

reacciones de hidroxilacin y oxigenacin (Alef y Nannipieri, 1998).
El H2O2 es txico para la mayora de los organismos vivos. Muchos
organismos son capaces de destruir el H2O2 mediante la accin de
enzimas antes de que pueda realizar mucho dao. Aunque esta reaccin
ocurre espontneamente, las enzimas incrementan la velocidad de
reaccinde forma considerable.
La inhibicin de catalasa o determinadas enzimas localizadas en
puntos estratgicos dentro de diferentes rutas metablicas, permite el
funcionamiento normal dela clula, por cuanto el procesos de inhibicin
conlleva al control exacto de la actividad metablica celular.
Las inhibiciones enzimticas estn divididas en dos grupos:
Inhibicin enzimtica irreversible, cuando un inhibidor reacciona
con una enzima producindose un complejo enzima inhibidor (EI) no
disociable. Este tipo de inhibicin es progresiva, lo cual indica que
puede conseguir la prdida total de la actividad con el incremento
progresivo de la concentracin del inhibidor. Adems, la actividad no
puede ser restaurada por mtodos fsicos ni qumicos.
Inhibicin enzimtica reversible, cuando un inhibidor reacciona
con una enzima y se produce un complejo parcial EI, en otras palabras,
es reversible y su inactivacin enzimtica puede recuperarse por
mtodos fsicos como dilisis, filtracin en gel, entre otros. Dentro de
este tipo de inhibicin se puede nombrar a: 1. Inhibicin competitiva,
2. Inhibicin no Competitiva, 3. inhibicin acompetitiva, 4. Inhibicin
por sustrato.
La actividad cataltica de una enzima puede cuantificarse por:
Ensayos continuos, en los que el mtodo ofrece una lectura
continua de la actividad monitorizando a tiempo real el sustrato
consumido o el producto generado.
Ensayos discontinuos, en los que la reaccin se detiene en un
punto y se mide la concentracin de los sustratos o los productos.
En esta seccin se describe el mtodo de Johnson y Temple (1964),
que mide el H2O2 residual, para lo cual se adiciona una cantidad
determinada de H2O2 a la muestra incubando a 37C durante un tiempo
determinado en el que acta la enzima, segn la siguiente reaccin:
El H2O2 residual se valora con permanganato potsico. Esta
valoracin se basa en la reduccin del permanganato potsico por el
Actividad enzimtica: cintica de michaelis-menten 49
H2O2 en solucin cida, segn la siguiente reaccin:
5 H2O2 + 2MnO4 + 6H+ 5O2Mn++ + 8H2O
Determinar la Velocidad inicial (Vo) utilizando diferentes concen

traciones de sustrato.
Construir la grfica Vo vs concentracin de sustrato
Calcular el Km y la Vmax de la enzima
Agua destilada
Oxalato de sodio grado analtico
Solucin de cido sulfrico 5 mol L-1. Se depositan 28,86 mL de
H2SO4 de 98 % en matraz aforado y se lleva a 1000 mL.
Solucin de permanganato de potasio grado analtico 2 mmol
L-1(0,31 g de KMnO4 en 400 mL de agua destilada-, calentar y agitar
hasta su disolucin completa, se filtra y se afora a 1 L). Se guarda en
frasco ambar. La solucin se debe valorar con oxalato de sodio cada vez
que se utilice para conocer su normalidad.
Solucin de perxido de hidrgeno se prepara a una concentracin de
10 mmol L-1. Esta solucin debe prepararse inmediatamente antes de su uso.
Solucin de cloruro de magnesio 0,1 mol L-1
Micropipetas (25, 50 L)
Espectrofotmetro UV
Celdas espectrofotomtricas de cuarzo (capacidad del 3 mL)
Toallas secantes
Papel de aluminio
Recipiente con hielo
Buffer fosfato de potasio 50 mmol L-1, pH 7,0. (0, 6805g de
KH2P04 y 0,8710 K2HP04, ajustar pH hasta 7)
Solucin stock de azida de sodio 2,0 mmol L-1, se disuelven 3
mg de azida de sodio en 10 ml de agua bidestilada. Se prepara el
mismo da que se usa; recuerde preparar el volumen necesario para los

ensayos que se realizarn.
Pipetas y micropipetas
Buretas
Bao a 37C
Laboratorio
Actividad 1
Condiciones ptimas para realizar las mediciones:

Evitar la inactivacin de la enzima durante el ensayo manteniendo
todos los reactivos en frio.
Evitar la concentracin excesiva de burbujas en la cubeta, para
ello utilizar concentraciones baja de perxido (10 mmol L-1).
El pH debe ser mantenido en el rango de 6,8 7,5, aunque
mejor a pH 7.Valoracin del H2O2: a concentracin inicial del H2O2
se determina por la valoracin con la solucin de KMnO4 2mmol L-1
del blanco sin muestra y con H2O2. Un ml de KMnO4 2mmol L-1
ser equivalente a 5 mmol L-1 de H2O2. Si no se gastan 1 ml para
neutralizar esta cantidad de perxido aadida, calcule la concentracin
real de perxido y procesa a trabajar de ahora en adelante con esta
concentracin.
Preparacin del Blanco, proceda como sigue, recuerde que el
perxido es muy inestable y se degrada con facilidad.
Componentes Volmen (ml)

Perxido de hidrgeno 10 mmol L -1
5 ml
Buffer fosfato mmol L-1 50 pH 7 5ml
cido Sulfrico 5 mol L-1 5ml
2 gotas de Cloruro de magnesio 0,1 mol L-1 2 gotas
Determinacin del efecto de la concentracin de sustrato sobre la

actividad de la enzima catalasa
Prepare 4 vasos de precipitado que contengan la mezcla indicada
en la tabla siguiente y colquelos en un bao a 37C
Componentes Volmen (ml)
Volmen (ml) 8 ml
Catalasa (Extracto de hgado) 1 ml
Esperar a que la incubacin este a 37C
Aadir Perxido de hidrgeno 10 mmol L-1 1 ml
cido Sulfrico 5 mol L-1 5ml
2 gotas de Cloruro de magnesio 0,1 mol L-1 2 gotas
T-1min T- 2min T- 3min T- 4min
Una vez colocado el perxido se da inicio a la reaccin enzimtica

por lo que usted desde este momento comenzara a tomar el tiempo de
reaccin y deteniendo cada una de ellas en los tiempos de 1, 2 3 y 4
minutos, como lo sealan los bekers arriba.
Deje enfriar los vasos con las reacciones y coloque las dos gotas de
cloruro de magnesio.
Titule cada uno de los vasos con el permanganato de potasio y
anote los resultados en la siguiente:
Catalasa Tiempo mmol de ml de KMnO4 mmol de H2O2 mmol de H2O2

(ml) (min) H2O2 gastados neutralizados metabolizados
1 1
2
3
4
2 1
2
3
4
3 1
2
3
4
4 1
2
3
4
5 1
2
3
4
Repita lo anterior pero ahora utilizando las otras concentracio-
nes de sustrato:
Ahora proceda a realizar las curvas de progreso. La velocidad
de una reaccin enzimtica se puede expresar como la funcin de
la concentracin de sustrato transformado o producto obtenido con
respecto al tiempo. El tipo de curva se muestra en la Figura 5:2 y se
conoce como curva de progreso de la reaccin. En la figura observar
que la transformacin de sustrato con respecto al tiempo es lineal al
comienzo de la reaccin, pero pronto comienza a disminuir debido a
que la enzima estar menos saturada de sustrato y finalmente todo el
sustrato tiende a ser metabolizado y la enzima comienza a inhibirse o
inactivarse lentamente. Todos estos factores hace que sea imposible
derivar una ecuacin estndar que se ajuste a la curva de progreso.
Por todo lo anteriormente sealado la velocidad de la enzima (Vo) se
determina considerando nicamente la velocidad inicial de la reaccin,
ya que en esta etapa los efectos discutidos anteriormente son ms
pequeos.
Utilizando los resultados de la tabla anterior construya los 5
grficos correspondientes a las diferentes concentraciones de perxido
de hidrgeno utilizadas. Grafique mol de perxido metabolizados vs
tiempo. Obtenga grficas similares a la Figura 5:1.
Trace una recta que comience desde el origen con la finalidad de
calcular la pendiente
Y esto representa la Vo:
mol de perxido metabolizado2 - mol de perxido metabolizado1

V0 =
t2 - t1
Tiempo (min)
Figura 6:1 Curva tpica de progreso de la reaccin enzimtica

Coloque los valores en la siguiente tabla
Concentracin de sustrato Vo
(mol Catalasa) (mol de H202 metabolizados/min)
La actividad enzimtica expresada en mol/min es lo que se

define como unidad (U), es decir la cantidad de enzima que cataliza
la conversin de un mol de sustrato por minuto bajo condiciones
definidas.
Una vez calculada la Vo multiplique por el factor de dilucin de la
muestra de enzima y procesa a construir la grfica [ catalasa] vs Vo
Post-laboratorio
1.Diga y explique si la enzima cumple con la cintica de Michaelis-

Menten
2.Calcule a travs del grfico obtenido el Km y la Vmax de la reaccin
3.Cules son los posibles errores presentes en el experimento
4.Investigue que tipo de enzima es la catalasa, cuantas isoformas
tienen, cul es su funcin en la clula?
Extraccin y cuantificacin de glucgeno
Introduccin
El glucgeno es un polisacrido de reserva de los animales, se

depositan generalmente en forma de grandes grnulos en el
citoplasma celular, tales grnulos poseen un dimetro de 100 a 400
A y estn constituido por un nmero variado de molculas de
polisacridos estrechamente asociadas. En dichos grnulos tambin
se encuentran protenas as como tambin enzimas que actan en la
sntesis y degradacin del mismo.
El glucgeno heptico se degrada con mucha facilidad cuando el
requerimiento de glucosa aumenta; esta constituye principal fuente
de energa ms inmediata, de tal manera que las reservas hepticas
y musculares pueden suministrar el rendimiento energtico para 24
horas de ayuno.
El glucgeno puede aislarse de los tejidos animales con soluciones
de KOH en las que los enlaces no reductores O(1-6) y O(1-4) son
estables.
Una de las tcnicas utilizadas para la cuantificacin de glucgeno es
el mtodo de Antrona (Van Handel, 1965). La muestra de tejido se hace
reaccionar con la solucin de antrona a 80C, resultando un compuesto
colorido que es directamente proporcional a la concentracin de
carbohidratos totales presente en la muestra, leyndose su absorbancia
en un espectrofotmetro a 620 nm.
Por su naturaleza polihidroxialdehidica o polihidroxicetnica los
carbohidratos e pueden deshidratar parcialmente por la accin de
cidos fuetes como el cido sulfrico o clohdrico concentrado para
[55]
formar los glcidos en derivados del furfural (pentosas) o de hidroxi-

metilfurfural (hexosas). Estos derivados se pueden condensar con
ciertos compuestos fenlicos o quinnicos, ocasionando la formacin
de compuestos coloreados que son la base de las pruebas analticas
cuantitativas. La cuantificacin con el reactivo de antrona es muy
sencilla y confiable y ampliamente utilizada. La reaccin de la antrona
en cido sulfrico concentrado hidroliza los enlaces glucosdicos para
dar monosacridos que puedan ser luego deshidratados dando furfural
y sus derivados. Estos productos se combinan con la Antrona, dando
un complejo azul verdoso; la prueba es muy sensible.
El objetivo del presente trabajo es aislar y cuantificar el glucgeno
del msculo, glndula digestiva y Manto en un determinado bivalvo y
cuantificar los niveles en ambos tejidos.
Aislar glucgeno de algunos rganos de bivalvos.

Cuantificar por el reactivo de Antrona los niveles de glucgeno en
c/u tejidos.
Establecer diferencias en cuanto a la concentracin en ambos
tejidos.
1 organismo (rata, ostra, Mejilln)

Equipo de diseccin
KOH 25% p/v
Etanol 95%
Etanol Absoluto
cido tricloroactico 10%
Bao de agua hirviente.
Reactivo de Antrona: 2g en1000 ml de H2SO4
Extraccin y cuantificacin de glucgeno 57
Laboratorio:
Actividad 1
Extraccin de glucgeno
1.Se diseca el hgado de una rata se pesa, se fragmenta y se
homogeniza en agua destilda en proporcin (1 g: 10 mL de agua). Se
toma 1 mL del homogenizado y se pasa rpidamente a un tubo de
ensayo que contenga 2 ml de KOH al 60%.
2.Se calienta la suspensin de las muestras en bao de agua
hirviendo durante 20 minutos o hasta que se complete la digestin. Se
puede acelerar la saponificacin agitando el matraz.
3.Se aaden 4 ml de alcohol etlico al 95%. El floculado que se
forma es principalmente glucgeno contaminado con algunas protenas.
Debido a la alta interferencia que presenta el mtodo con las protenas
presentes en las muestras, es necesario realizar una precipitacin con
cido Tricloroactico (tca).
4.Para acelerar la precipitacin de glucgeno someta la muestra a
ebullicin, teniendo cuidado de que de no dejar botar la muestra.
5.Centrifugue durante 15 minutos a 7000 rpm. Se descarta el
sobrenadante se disuelve el precipitado en 3,5 ml de tca (cido triclo-
roactico fro al 10%) y se eliminan por centrifugacin las protenas
que contaminan la muestra. Se le aade al sobrenadante que contiene
el glucgeno 5 ml de alcohol etlico al 95%, cuando el glucgeno flocule,
someta a ebullicin la muestra y centrifugue.
6.El precipitado de glucgeno se resuspende en 5 ml de agua y de
aqu se toman alcuotas (0,1 0,4 mL) para la cuantificacin.
Recta de Calibracin de glucosa
La cuantificacin a travs de la reaccin de Antrona constituye
la base de un mtodo rpido para la determinacin cuantitativa
de carbohidratos, bien sea que estn libres o formando parte del
polisacrido. Esta reaccin no es adecuada si en la muestra tambin
se encuentran presentes protenas que contengan grandes cantidades
de triptfano, puesto que en este caso se obtiene una coloracin rojiza.
1.Prepare la siguiente curva de calibracin, teniendo el cuidado
de colocar el reactivo de antrona ya que este se encuentra preparado
en H2SO4 concentrado
No tubos Estndar de Glucosa Agua (mL) Antrona

(mL) Absorbancia
1 0,1 0,9 4
2 0,2 0,8 4
3 0,4 0,6 4
4 0,6 0,4 4
5 0,8 0,2 4
6 0,0 1,0 4
Muestra 0,2 0,8 4
2.El reactivo de antrona debe colocarse con una bureta.

3.Simultneamente coloque 0,5 ml de cada una de las muestras y
proceda como en la curva.
4.Mezcle los tubos con una varilla de vidrio y hierva las muestras
durante 15 min.
5.Deje enfriar las muestras y lea la absorbancia a 620 nm.
6.Exprese los resultados en mg de glucgeno por gramo de tejido
hmedo.
7.Cul de los tejidos presenta mayor contenido de glucgeno?,
explique los resultados.
Linealidad
El mtodo es lineal hasta una concentracin de 10 mg/ml, la muestras

con concentraciones superiores a esta, debern ser diluidas con
solucin salina.
Extraccin, cuantificacin y cromatografia de
lipidos
Introduccin
Los lpidos constituyen un grupo heterogneo de molculas presentes

en los seres vivos, son insolubles en agua y solubles en solventes
orgnicos tales como ter, cloroformo, bencina, etc.
Los lpidos pueden dividirse en dos grandes categoras considerando
su polaridad: los lpidos apolares tales como los triacilgliceroles y
los steres de colesterol, y los lpidos polares que son anfipticos y
contienen tanto un dominio hidrofbico como una regin hidroflica
en la misma molcula, entre estos se encuentran los fosfolpidos y
los esfingolpidos. Los dominios hidroflicos e hidrofbicos estn
unidos por una molcula de glicerol en los glicerofosfolpidos y por una
esfingosina en el caso de la esfingomielina y de los glucoesfingolpidos.
Los triglicridos estn situados mayoritariamente en los puntos de
almacenamiento del tejido adiposo, mientras que los lpidos polares se
encuentran mayoritariamente en las membranas celulares.
La separacin de los compuestos presentes en cada categora puede
hacerse por cromatografa de capa fina. El solvente se selecciona de
acuerdo a los lpidos que se investigan, pero, generalmente los lpidos
neutros se separan con solventes no polares y los lpidos cargados con
solventes polares.
El objetivo de la siguiente prctica extraer y separar diferentes
clases de lpidos de acuerdo a su polaridad.
[59]
Separar mediante cromatografa de capa fina algunos lpidos

constituyentes del tejido heptico y muscular de una rata.
Identificar los diferentes lpidos revelados en la placa y sealar la
importancia biolgica que cada uno de ellos tiene.
Comparar las muestras reveladas para tejido heptico y muscular.
Una rata.
Lminas de slica gel G para capa fina.
Cmaras de separacin
Solvente (ter de petrleo, dietilter. cido actico glacial; 80:20:1).
Patrones de Esteres de colesterol (Acetato de colesterol, oleato de
colesterol o esterato de colesterol).
Patrn de ster de vitamina A (palmitato de vitamina A)
Patrones de cidos grasos libres
Patrones de esteroles.
Iodo sublimado.
Papel cebolla.
Lpiz de grafito.
Lminas de slica gel: Limpie las lminas de vidrio con etanol,
luego que se seque extienda el gel con el equipo. Realice las lminas
con 100 m de espesor y active las lminas calentando a 110 C por
una hora y deje enfriar.
Laboratorio
Actvidad 1
Extraccin de lpidos:
1.Decapite una rata, extraiga el hgado y una porcin de
musculatura. Pese 1 gramo de cada tejido y colquelo en 15 ml de
mezcla cloroformo: metanol (2:1), homogenice y djelo reposar en fro
Extraccion, cuantificacin y cromatografia de lipidos 61
durante 30 min. Una extraccin efectiva debe mostrar una solucin

monofsica y se puede extraer aproximadamente el 95% de los lpidos.
2.Para eliminar los componentes no lipdicos lave la muestra con
0,2 ml de agua destilada o solucin salina 0,05 N. Aqu se formaran
dos fases una orgnica donde estarn presente todos los lpidos y una
acuosa donde estarn los componentes no lipdicos.
3.Dejar reposar 15 min., luego para acelerar el proceso centrifugue
durante 15 min. a 4000 r.p.m. o deje reposar durante toda la noche.
4.Con una pipeta Pasteur extraiga con mucho cuidado la fase
orgnica. (No importa que no pueda extraer en su totalidad la fase,
recuerde que realizar un anlisis cualitativo).
5.Coloque en un beaker el extracto lipdico y evapore sobre un bao
de Mara a 40 C hasta obtener un volumen mnimo (0,5 y 1,0 ml)
Anlisis cualitativo de lpidos:
1.Tome una de las lminas con el cuidado de no daar la slica y
coloque en la parte inferior (2 cm por encima del borde inferior) 20 l de
cada lpido patrn (1%p/v) y 50 l de la muestra problema.
2.Espere que se seque la lmina e introdzcala en la cmara de
separacin que contiene el solvente. Espere que el solvente ascienda
hasta aproximadamente 2cm del borde superior.
3.Seque la lmina bajo una corriente de aire y luego para revelar
los lpidos introdzcala en otra cmara que contenga iodo sublimado,
el cual se disolver en los lpidos dando una coloracin entre amarilla
y marrn. Tambin puede revelar los lpidos con una solucin de
2,7-diclorofluorecena (2g/l en etanol al 95%) y examinando las
lminas bajo lmparas de luz ultravioleta.
4.Por comparacin directa de las muestras con los patrones
identifique los lpidos revelados en cada una de los tejidos.
5.Compare los resultados obtenidos para musculatura y para hgado.
Post-laboratorio:
1.Diga en qu orden se separan los lpidos y por qu?

2.Existen diferencias entre los componentes lipdicos de la
musculatura y el hgado? explique.
3.Cul es la importancia de los lpidos que Ud. acaba de revelar?
Aislamiento de adn
Introduccin
Casi todas las clulas contienen adn, pero su concentracin vara

dependiendo del tejido. El tejido linfoide, el bazo y el timo resultan
buenas fuentes para obtener adn. Algunos tejidos contienen actividades
altas de las enzimas deoxirribonucleasa, lo cual trae como consecuencia
la fragmentacin del adn, en consecuencia para la obtencin de adn
es aconsejable que el tejido tenga una baja actividad de la enzima y
una alta concentracin de adn. La extraccin de adn requiere una serie
de etapas bsicas. En primer debe romperse la membrana plasmtica
y el ncleo para dejar libre el adn. Al mismo tiempo es necesario
inactivar las enzimas que puedan degradarlo y finalmente aislarlo por
precipitacin en alcohol.
Para extraer el adn a menudo se efecta con disolventes para
eliminar los contaminantes de los cidos nucleicos. Por ejemplo,
suele emplearse una combinacin de fenol y cloroformo con objeto
de eliminar las protenas. Para concentrar los cidos nucleicos suele
realizarse una precipitacin con isopropanol o etanol. Si la cantidad de
cido nucleico es escasa, puede aadirse a la mezcla un portador inerte
(como el glucgeno) para favorecer la precipitacin. Tambin puede
realizarse una precipitacin selectiva con concentraciones salinas
elevadas (precipitacin salina) o una precipitacin de las protenas
mediante cambios del pH.
El adn se desnaturaliza fcilmente y debe trabajarse con cuidado
para obtener un buen producto. Debe evitarse la tensin mecnica y
condiciones fsicas y qumicas extremas y deben inhibirse las nucleasas
[63]
Aislar adn a partir de hgado de pez, basado en las propiedades de

la molcula
Realizar y discutir las diferentes etapas para el aislamiento de ADN
Bazo de cerdo (tambin puede ser hgado de rata)

Buffer salino: 0,15 mol L-1 de NaCl y 0,015 mol L-1 de Citrato de
Sodio
Cloruro de Sodio (2 mol L-1).
Cloroformo/Alcohol amlico (6:1)
Alcohol absoluto
ter
Licuadora
Laboratorio
1.Pique en pedazos muy pequeos 10 g de bazo de cerdo y homogenice

en 40 ml de buffer salino fro durante 1 min, centrifugue la suspensin
a 5000 g. 5 min.
2.Descarte el sobrenadante y resuspenda el precipitado en NaCl 2
mol L-1, hasta obtener un volumen total de 200 ml
3.Descarte el precipitado y el sobrenadante colquelo en un vaso
de precipitado, agite la solucin con una varilla de vidrio, mientras va
aadiendo un volumen igual de agua destilada.
4.Aparecer un precipitado fibroso, trate de envolverlo con la varilla
de vidrio y djela secar en un vaso de precipitado por 30 min.
5.Coloque el grumo sobre un papel de filtro para eliminar totalmente
el contenido de agua.
6.Disuelva la deoxirribonucleoprotena en 20 ml de NaCl 2 mol
L-1, agregue un volumen igual de mezcla cloroformo: alcohol amlico y
homogeneice por 30 sec.
7.Centrifugue la emulsin a 5000 g por 15 min. y recoja la capa
Aislamiento de adn 65
superior (acuosa). Succione cuidadosamente la capa superior en forma

tal que no se agite la protena presente en la interfase de los dos lquidos.
8. Repita el paso anterior.
9. Aada el doble de volumen de alcohol fro para precipitar las
fibras de adn y mezclar lentamente con una varilla de vidrio hasta que
las fibras de adn se enrollen en ella.
10. Saque la varilla y presione cuidadosamente el adn fibroso contra
las paredes del vaso precipitado para exprimir el solvente.
11. Lave finalmente el precipitado metiendo la varilla en una serie
de solventes y exprimiendo el exceso del solvente. Los cuatro solventes
a usar sern etanol 70% v/v, etanol 80% v/v, etanol absoluto, ter.
12. Deje evaporar el ter remanente colocando el adn en un vidrio
de reloj por 10 min.
13. Pese el adn seco y gurdelo en el congelador resuspendido en
2ml de buffer salino 0,015 mol L-1 hasta cuando los necesite
Post-laboratorio
Seale la importancia y la funcin de cada uno de los pasos

realizados para la obtencin de adn.
Aislamiento de arn
Introduccin
El arn al igual que el adn se obtienen a partir de homogeneizados de

tejidos o clulas con fenol. La concentracin saturada de fenol rompe
los enlaces de hidrgeno en las macromolculas, causando desnatura-
lizacin de las protenas. La suspensin turbia se centrifuga y aparecen
dos fases, la fase inferior de fenol que contiene el adn y la fase superior
contiene el arn. La protena desnaturalizada se encuentra en ambas
fases y puede removerse por centrifugacin. El arn se precipita luego con
etanol. El producto obtenido no contiene adn, pero generalmente est
contaminado con polisacridos. Se puede obtener mayor purificacin
tratando esta preparacin con amilasa.
Los protocolos para la extraccin de arn estn basados en el
aislamiento de este cido nucleico empleando fenol-cloroformo. Durante
el procedimiento se realiza una etapa de homogenizacin de la muestra
con el fenol, la adicin posterior de cloroformo separa la solucin en
fase acuosa y orgnica, donde la primera de estas contiene el arn, esta
fase acuosa es posteriormente tratada con isopropanol para recuperar
por precipitacin el arn.
Objetivos especificos
Aislar arn de una muestra de levadura utilizando el fenol

Discutir cuales son las propiedades del arn que permiten la
extraccin de la molcula con fenol.
[67]
Levadura seca
Solucin de fenol (90 g L-1)
Acetato de potasio (200 g L-1, pH= 5)
Etanol Absoluto
ter etlico
Bao de agua 37 C
Laboratorio
1.Suspenda 10 gr de levadura en 40 ml de agua a 37C y espere

15 min.
2.Agregue 50 ml de solucin concentrada de fenol (altamente
corrosivo).
3.Agite mecnicamente la suspensin durante 30m min. a
temperatura ambiente.
4.Luego centrifugue en fro a 3000 g durante 15 min. para romper
la emulsin.
5.Con una pipeta Pasteur remueva cuidadosamente la capa
superior acuosa y centrifugue a 10,00 g durante 5 min. en una
centrifuga refrigerada para separar la protena desnaturalizada.
6.Agregue acetato de potasio al sobrenadante hasta obtener una
concentracin final de 20 g/L y precipite el ARN aadiendo 2 vol
de etanol.
7.Enfre la solucin en hielo y djela all por una hora.
8.Recoja el precipitado por centrifugacin en fro a 2000 g por 5
min.
9.Lave el ADN con una mezcla de etanol-agua (3:1), luego con etanol
y finalmente con ter.
10.Deje secar al aire y pese. El contenido de ARN en levadura es
aproximadamente el 4% de su peso seco.
11.Guarde la preparacin para utilizarla en el trabajo practico No

Determinacin de adn y arn
El proceso de extraccin est basado en el rompimiento de las

membranas celulares utilizando el detergente aninico sarcosina al 1%
p/v, aunque este interfiere con la fluorescencia, es necesario realizar
una dilucin de 10 veces con buffer tris-edta, despus de extraccin,
de tal manera que la interferencia sea reducida a aproximadamente el
5% de fluorescencia del valor ms alto del estndar de cidos nucleicos.
El bromuro de etidio tiene la particularidad de unirse al arn y reactivo
de Hoecht al adn emitiendo fluorescencia directamente proporcional a
la concentracin de cidos nucleicos que contenga la muestra de tejido.
Materiales y mtodos:
Reactivos:
Buffer 1: tris 50 mmol L-1, edta 0,5 mmol L-1, pH=7,5, pesar 0,605
g de TRIS, 0,186 g de EDTA/ 1L de agua destilada, ajustar pH a 7,5
con HCl 0,1 N.
Buffer 2: tris 50 mmol L-1, edta 0,5 mmol L-1, pH=7,5, pesar 0,605
g de tris, NaCl 0,1 M, 0,186 g de edta en 1L de agua destilada,
ajustar pH a 7,5 con HCl 0,1N, pH=7,0.
Solucin madre de Hoechst 33258: 10 mg ml-1en buffer 2.
Solucin madre de bromuro de Etidio: 1 mg ml-1 en buffer 1.
Solucin de trabajo de Hoechst: diluir 50 l de solucin madre en
100 ml de buffer 2.
Solucin de trabajo de Bromuro de Etidio: diluir 400 l de solucin
madre en 100ml de buffer 1.
[69]
Sarcosina: 1% p/v en buffer 1.

Solucin estndar: 20 g ml-1de adn y arn en sus respectivos
buffers.
Antes de realizar la curva de calibracin hacer una dilucin de 1:10
(20 g ml-1)
Laboratorio
Actividad 1
Preparacin de muestras:
1.Colocar una larva o 20 mg de tejido en un vial de ependorf de 1,5
ml de capacidad, aadir 100 l de sarcosina. La larva es digerida con
gran facilidad, mientras que el tejido de ser picado con una microtijera,
dentro del ependorf hasta formar un homogenizado con la finalidad de
facilitar el efecto del detergente.
2.Mezcle vigorosamente la muestra en el momento de prepararlas,
a los 30 min y a los 60 min.
3.Aada 900 l de buffer 1, mezcle y centrifugue a 2500 rpm por
15 min.
4.Pipetee alcuotas de 100 l del sobrenadante en dos tubos de
borosilicato, aadir 400 l de buffer 1 (a uno de los tubos se le aade
500 l de solucin de bromuro de etidio y al otro 500 l de Hoechst). La
concentracin final de sarcosina en las muestras es de 0,01%, esto no
es mucho pero puede afectar la fluorescencia y por tal motivo debe ser
mantenida la misma concentracin en los tubos patrones
Recta patrn de ADN:
Para realizar la curva patrn tome 200 l de la solucin estndar de
ADN, la cual ha sido preparada previamente y guardada en el congelador
a 20C por un perodo no mayor de 3 meses. Una vez utilizada una
alcuota descarte el resto. Coloque los 200 l en el tubo No 1. El cual
contiene 300 l de solucin buffer y realice diluciones seriadas de 250
l cada vez, como se seala en la tabla siguiente:
Determinacin de adn y arn 71
No Buffer 1 (l) Patrn ADN Buffer 1 Sarcosina Bromuro de

(l) 1% p/v (l) Etidium (l)
1 300 200 240 10 500

2 250 240 10 500
3 250 240 10 500
4 250 240 10 500
5 250 240 10 500
6 250 240 10 500
Recta Patrn de ARN:

Proceder como en la curva patrn de ADN.
No Buffer 1 (l) Patrn ADN Buffer 1 Sarcosina Bromuro de

(l) 1% p/v (l) Etidium (l)
1 300 200 240 10 500

2 250 240 10 500
3 250 240 10 500
4 250 240 10 500
5 250 240 10 500
6 250 240 10 500
Normas para trabajar en el laboratorio
1.Acudir a las actividades de laboratorio con puntualidad a la hora

asignada.
2.Antes de cada sesin prctica el estudiante debe poseer los
conocimientos bsicos referentes al tema, para lo cual deber leer la
actividad sealada y hacer un esquema de trabajo que discutirn en
grupo de tres estudiantes.
3.Las prcticas deben ser realizadas en conjunto, con trabajo
cuidadoso y poco hablar; equipos de trabajo con resultados incorrectos
debern repetir el experimento.
4.Cada sesin de laboratorio se iniciar con un examen prctico de
conocimiento acerca de los fundamentos bsicos de la (s) tcnica (s) a
desarrollar.
5.Antes de iniciar la prctica asegrese de que el material de
laboratorio que se le ha suministrado a su equipo de trabajo est
completo, en caso contrario comunquelo al profesor instructor.
6.Evite colocar sobre la mesa del laboratorio prendas personales,
libros, u otros artculos. Solo deben estar los reactivos, material y
equipos a utilizar.
7.Todo el material de vidrio a utilizar debe estar limpio, y debe
asegurarse de rotularlo detalladamente, para evitar confusiones o
errores experimentales.
8.Los reactivos corrosivos como cidos y lcalis fuertes, deben ser
manejados siempre con sumo cuidado y con el empleo de mtodos de
barrera para evitar quemaduras (guantes, pinzas).
9.Cuando manipule un reactivo inflamable, debe asegurarse que
no existan llamas encendidas cerca de usted.
[73]
10.Evitar:
a.Colocar material de vidrio en superficies fras o mojadas.
b.Limpiar el material de vidrio con cepillos gastados.
c.Calentar vasos de precipitado o fiolas que tengan ranuras de
consideracin.
d.Mezclar cido y agua en una probeta.
e.Almacenar soluciones alcalinas en envases de vidrio.
f.Succionar lcalis o cidos fuertes directamente con pipetas.
11.Al terminar su ensayo prctico debe limpiar su sitio de trabajo y
material de vidrio utilizado.
12 El estudiante debe traer el material biolgico asignado.

Bibliografa consultada
Bradford mm .1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of

microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye
binding. Anal Biochem. 72: 248-254.
Caldarone, E. & L. Buckley. 1991. Quantitation of and and rna in crude
tissues extracts by flow injection analysis. Ana. Biochem. 199:
137-141.
Canino M & E Calderone E. 1995. Modification and comparison of two
fluorometric techniques for determining nucleic acid contents of
fish larvae. Fish Bull. 93:158-165.
Clark, J.M. & R L Switzer. 1977. Experimental Biochemistry. Editorial
W. H. Freeman y Company. 2da Edicin.
Davidson, D. 1980. Bioqumica de los cidos nucleicos. Editorial
Revert. 1ra Edicin. 401 p.
Di Giulio, R.T. Washburm, P.C., Wenning, R.J., Winston, G.M. & C.S.
Jewell. 1989. Biochemical responses in aquatic animals: A review
of determinants of oxidative stress. Environ. Toxicol. Chem., 70 :
1103-1123.
Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ & D.C. Klenk. 1985. Measurement
of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem 150: 76-85.
Hans W. M.2000. Advanced Kinetic Analysis Using a Lambda Series
Spectrometer and the UV KinLab Software Module. Biochemical
Applications for UV/Vis Spectroscopy. PerkinElmer, Inc. Printed in
the United Kingdom
http://libroelectronico.uaa.mx/capitulo-4-aminoacidos-y/cur-
vas-de-titulacion-de-los.html https://bioquimexperimental.files.
[75]
wordpress.com/2009/08/metodos-espectroscopicos-y-curva-pa-
tron.pdf
Layne, E. 1957. Protein estimation by ultraviolet absorption. In Methods
in enzymology (Vol. 3, p. 451). Academic Press New York.
Layne, E. 1957. Spectrophotometric and turbidimetric methods for
measuring proteins. Methods in enzymology, 3, 447-454.
Litchfield, C. 1972. Analysis of tryglycerides. Academic Press, New
York. Cap 2. 17-47.
Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., & , R. J. Randall .1951.
Protein measurement with the Folin phenol reagent. J biol Chem,
193(1): 265-275.
Mathews CK, van Holde KE . 1996. Protein function and evolution.
En: Biochemistry 2 ed. The Benjamin/Cummings Publishing
Company, INC. (California, EE.UU), pp 214-234.
Morris J. G. Fisicoqumica para bilogos. Editorial Revert. 2da Edicin,
Barcelona, Espaa, 389 p.
Nelson DL & MM. Cox. 2001. Aminocidos, pptidos y protenas En: .
Lehninger, Principios de Bioqumica, 3 ed. Ediciones Omega S.A.
(Barcelona, Espaa), pp 130-134.
Gonzlez M J M. Nomenclatura, D. L. Curso de biomolculas..
Universidad del Pas Vasco.
Ohnishi, S. T., & J. K. Barr. 1978. A simplified method of quantitating
protein using the biuret and phenol reagents. Analytical
biochemistry, 86(1), 193-200.
Overturf, M., & Dryer, R. L. 1969. Experiments in the biochemistry of
animal lipids. In Experiments in physiology and biochemistry (Vol.
2, pp. 89-163). Academic Press London.
Perrin, D. D. 2012. Buffers for pH and metal ion control. Springer
Science & Business Media.
Plumer, D. T. 1981. Bioqumica prctica. Editorial Mc Graw Hill. 1ra
Edicin, Bogot, Colombia. 345 p.
Rendina, G. 1974. Tcnicas de Bioqumica aplicada. Editorial
Interamericana, 1ra Edicin. Mexico. 280 p.
Skoog A D y D. M. West 1983. Fundamentos de qumica analtica.
Editorial Revert, S. A. 2da Edicin. Barcelona, Espaa. 980 p.
Tinoco, Y Jr k. Sauer y J. C. Wang. 1980. Fisicoqumica. Principios
Bibliografa consultada 77
y aplicaciones en las ciencias biolgicas. Editorial Dossat, 1ra

Edicin Madrid, Espaa. 634 p.
Van Handel E. 1965. Estimation of glycogen in small amounts of tissue.
Anal. Biochem. 1:256-265.
Warburg, O., & W. Christian. 1941. Isolierung und kristallisation des
grungsferments enolase. Naturwissenschaften, 29(39), 589-590.
Williams LB, Wilson K .1981. Captulo 3: Tcnicas cromatogrficas.
En: Principios y Tcnicas de Bioqumica Experimental. Ediciones
Omega S.A. (Barcelona, Espaa), pp 84-90.
Wilson K and Walker J . 1994. Chromatographic techniques. En: .
Principles and Techmiques of Practical Biochemistry, 4 ed.
Cambridge University Press (Somerset, Great Britain), pp 504-508.
Biografa
Mairin J. Lemus, Venezolana, Dra
En Ciencias Biolgicas, profesor titular de la Universidad e Oriente

y trabaja en el rea de bioqumica y Ecotoxicologa, miembro del
Programa de Promocin a lnvestigacin del Observatorio Nacional de
Ciencia y Tecnologa, Venezuela.
Liliana Alexandra Cortez Surez
Ecuatoriana, Doctora. En Bioqumica y Farmacia, profesor titular

de las asignaturas de Bioqumica I y II de la Unidad Acadmica de
Ciencias Qumicas y de la Salud de la Universidad Tcnica de Machala,
Magister en Salud Pblica por la Universidad de Guayaquil. Miembro
del Programa Nacional del Observatorio Acadmico Utmach, Ecuador-
[79]
Bioqumica General: Fundamentos
y Anlisis de Laboratorio
Se termin de imprimir en marzo de 2016 en la
imprenta de la UTMACH, calle Loja y 25 de Junio
(campus Machala)
Esta edicin consta de 300 ejemplares.
www.utmachala.edu.ec
ISBN: 978-9978-316-98-6
11
9 789978
1
316986

Bioquimica General

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Bioquimica General

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Bioqumica General:

Universidad Tcnica de Machala

Ing. Amarilis Borja Herrera, Mg. Sc.

Soc. Ramiro Ordez Morejn, Mg. Sc.

Toms Fontaines-Ruiz, PhD.

Ing. Karina Lozano Zambrano

Ing. Jorge Maza Crdova, Ms.

Mairin J. Lemus, Venezolana

Liliana Alexandra Cortez Surez

Universidad Tcnica de Machala

D.R. 2015, universidad tcnica de machala

Este texto ha sido sometido a un proceso de evaluacin por pares externos

Diseo, montaje y produccin editorial: UTMACH

Impreso y hecho en Ecuador

Advertencia: Se prohbe la reproduccin, el

Soluciones amortiguadoras .......................................... 13

Propiedades ionicas de los aminocidos ........................ 19

Aislamiento de proteinas .............................................. 25

Cromatografa de filtracin en gel de la hemoglobina ..... 41

Actividad enzimtica: cintica de michaelis-menten ...... 47

Extraccin y cuantificacin de glucgeno ...................... 55

Extraccion, cuantificacin y cromatografa de lpidos .... 59

Aislamiento de adn ....................................................... 63

Aislamiento de arn ..................................................... 67

Determinacin de adn y arn ......................................... 69

Normas para trabajar en el laboratorio ......................... 73

Bibliografa consultada ................................................. 75

Este texto de Bioqumica General comprende los fundamentos tericos

Para ampliar los conocimientos de los aspectos fundamentales y

organismos vivos (-SH/S-, -COOH/COO-, -NH3+/NH2).

La constante de equilibrio es:

Aplicando logaritmo a ambos a lados de la ecuacin:

dando como resultado la ecuacin de Henderson-Hasselbalch

Considerando que el cido actico es muy dbil, el equilibrio de

A partir de esta frmula se pueden deducir fcilmente las

Cuando se aaden cidos o bases fuertes a la disolucin

1.Utilizar la ecuacin de Henderson-Hasselbalch para resolver

Fosfato de potasio monobsico

Resuelva los siguientes problemas

2.Prepare las soluciones de los problemas anteriores. Recuerde que

a.Encienda el potencimetro y espere al menos 15 minutos.

1.Cundo una solucin amortiguadora presenta su mxima

Como los aminocidos poseen al menos un grupo amino y un grupo

Una molcula de este tipo puede reaccionar con cidos de la

Base conjugada cido conjugado

cido conjugado Base conjugada

grupo carboxlico en su estructura tiene la posibilidad de existir en dos

La primera presenta caractersticas de cido dbil pues es capaz de

Al igual que el grupo carboxlico el grupo amino tambin se

pI= 1 (pK1 + pK2 )

El punto isoelctrico est siempre determinado por los valores de

pI= 1 (pKa + pKa )

y para un aminocido bsico:

pI= 1 (pKa + pKa )

La titulacin, es sencillamente la representacin grfica del proceso

Figura 2:1Curva de titulacin del cido glutmico. Tomado de http://libroelectronico.uaa.mx/capitulo-4-aminoa-

Por lo tanto, utilizando la ecuacin de Henderson-Hasselbalch

Titular aminocidos con soluciones de HCl y NaOH.

Aminocidos (glicina, cido glutmico, lisina y alanina)

1.Tome 20 ml de un aminocido problema, colquelo en un vaso

1.Examine la solubilidad de la glicina, cido glutmico, lisina y

1.De acuerdo a las curvas de titulacin graficadas, Qu tipo de

1.A qu frmula responde el aminocido?

a.Cul es el cambio de pH cuando se aade 0,7 moles de NaOH a