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28/10/2017

Aplicaes de tcnicas
moleculares e estudo dirigido
em sala

Guilherme Luis Pereira


Departamento de Melhoramento e Nutrio animal Unesp/Botucatu

Disciplina: Bioprocessos e Biotecnologia voltados a Diagnstco

Expresso gnica diferencial


PCR quantitativa em tempo real RT-qPCR (pequena escala)

Anlises de nmero limitado de genes

Padronizao trabalhosa e mo de obra especializada

Tcnica muito flexvel e sensvel - ensaios SYBR e TaqMan

mRNA cDNA Transcriptase reversa

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RT-qPCR
Quantificao de cidos nuclicos
Absoluta
Relativa

Deteco e identificao de produtos especficos de PCR


Microorganismos

Deteco de variaes genticas


SNPs

RT-qPCR
Genes diferentes no mesmo tecido Genes iguais em diferentes tecidos
ABSOLUTA RELATIVA
Nmero exatos de molculas Comparao entre amostras

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Delineamentos
Diferentes tecidos
Tecido adiposo intra-abdominal x subcutneo x intramuscular
VS
Diferentes indivduos pertencentes a diferentes grupos
Grupos contrastantes;
tratados com diferentes dietas;
normal x afetado; Combinar diferentes
delineamentos
Diferente amostragens no tempo (longos ou
curtos perodos)
Antes, durante e aps treinamento;
fase pr-desmama, ps desmama e abate

Delineamentos

Escolha de genes
Genes candidatos

Relacionados a fisiologia da caractersticas ou regies de QTL

Mapeamento GWAS

Analise de expresso ampla micro-array, RNA-Seq

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qPCR
-Baseada na PCR convencional, com o monitoramento da amplificao em
tempo real do fragmento de interesse.

-Monitoramento da fluorescncia que aumenta proporcionalmente a quantidade


de material gentico amplificado

COMPONENTES qPCR

-Amostra de DNA
-Primers o iniciadores
-DNA polimerase
-dNTPs
-Tampo e ions
- Fluorescncia

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TERMOCICLADOR qPCR

Termociclador com sistema ptico composto por uma fonte de iluminao ultra-violeta e
um detector de fluorescncia + um computador com software prprio para a aquisio de
dados.

PCR em Tempo Real

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FASES DA qPCR

Threshold

Como determinada a
quantidade inicial de DNA?
Estabelecendo: NMERO DE CICLOS Cycle Threshold

1)THRESHOLD: limite de fluorescncia definido arbitrariamente pelo software por cima


da baseline (rudo).

2)CYCLE THRESHOLD (CT): Ciclo em que a fluorescncia ultrapassa o threshold. Permite


correlacionar o aumento da fluorescncia com a quantidade inicial do DNA alvo.

FASES DA qPCR

Threshold

28 30 33 37
Cycle Threshold 28 30 33 37

Ct menor maior nmero de cpias iniciais de DNA

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QUANTIFICAO

1) ABSOLUTA:

Determinar o nmero exacto de molculas (nmero de cpias de DNA


ou nanogramas de DNA) em uma amostra. Mtodo da curva padro

2) RELATIVA

Analisar alteraes na expresso de um gene entre uma determinada


amostra e uma amostra de referncia. Mtodo de CT comparativo

QUANTIFICAO

1) ABSOLUTA:

- Amplificar padres com


quantidade do DNA alvo
conhecida.

- Representar o CT obtido com


esses padres num grfico vs
o logaritmo da quantidade de
DNA CURVA PADRO

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QUANTIFICAO
1) ABSOLUTA:
GERAO PADRES
CLONAGEM

TRANSFORMAO

QUANTIFICAO
PLASMDEO
(ng/L)
EXTRAO MULTIPLICAO
PLASMDEO

QUANTIFICAO

1) ABSOLUTA:

GERAO CURVA PADRO

Nm. copias= [DNA (g/L) x 6022*1023 (pb/mol)] / [lenght (pb) x 660 (g/mol)]

DILUIES SERIADAS

1:10 1:10 1:10 1:10 1:10

1011 1010 109 108 107 106

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QUANTIFICAO
1) ABSOLUTA:

Amplificar padres junto com amostras com


quantidade do DNA alvo desconhecida.

Comparar CT de cada amostra com curva padro


quantitade de cpias iniciais da sequncia alvo.

EFICINCIA

Condies ideais: eficincia da reao 100% (E = 1) com a quantidade de


produto gerado aumentado exponencialmente, dobrando a cada ciclo.

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QUANTIFICAO

2) RELATIVA:

Compara mudanas na expresso de genes.

- Mtodo CT Comparativo:

necessria a amplificao de genes de referncia (housekeeping genes):


gene com expresso estvel em diferentes situaes testadas (Ex.: rRNA 18S,
GAPDH, betaactina, TBP, HPRT, beta-2-microglobulina).

- Resultados expressados em ordem de grandeza: vezes, dobro, metade, fold-


change. Ex.: gene x 5 vezes mais expressado no tratamento que no controle.

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QUANTIFICAO
2) RELATIVA:

Diferenas de expresso gnica entre grupos com


diferente maciez de carne da raa nelore
Genes analisados

HSP
Complexo
CAPN/CAST Heat Shock
CAPN1 Proteins
HSP90AA1
Amostra inicial 90 CAPN2
Delineamento animais
experimental CAST
DNAJA1
CAST1
CAST2
Teste de shear force Genes
Calpastatina (CAST) inibe a ao
escolhidos HSPB1
proteoltica de calpana (CAPN)

Atua conjuntamente com


SF=3,5 SF=5,8 SF=8,2 outras protenas na
Carne Macia Carne intermediaria Carne dura regulao de CAST
(protege a clula da
6 indivduos 7 indivduos 7 indivduos protelise)

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Gene (GenBank ID) TaqMan probe Manufacturer

CAPN1 (281664) Bt03223357_m1

CAPN2 (281662) Bt03817738_m1

HSPB1 (516099) Bt03220563_m1

HSP90AA1 (281832) Bt03218068_g1


Thermo Fisher
DNAJA1 (528862) Bt03219626_g1

GAPDH (281181) Bt03210915_g1

TBP (516578) Bt03241947_m1

ACTB (280979) Bt03279175_g1

Gene (GenBank ID) Primer sequence (5 3) Manufacturer

F: ATGAGGAAACAGTCCCATCG
CAST (281039)
R: GGGCTTGGGTTTTTCTTCAG

F: CACCCAGGAGCATGTCAGTA
CAST 1 (NM_001030318.2)
R: ACTGCTCCCAAGGCTTGTT

F: TGCAAGCTGGTGGTACAAGA
CAST 2 (NM_174003.2)
R: GAGAGCTGACTGCTCCCAAG
Sinapse Biotecnologia
F: GCAGCCATTGTGGAGATG
EEF1A2 (515233)
R: ACTTGCCCGCCTTCTGTG

F: GAAATCGCCAATGCCAAC
GAPDH (281181)
R: GAGCCTTGTCTGCCTTCA

F: CCGTTCGACAGATAGCCGTAA
RPL-19 (510615)

1900ral
*
1900ral M-I
1900ral * M-D
1900ral I-D
Esse resultados juntos com novos
Log2 Fold Change

1900ral
1900ral estudos que os relacionam com o tipo de
1900ral
fibra muscular e outras protenas
proteolticas tem trazido novas
perspectivas sobre bases biolgicas da
variao da maciez da carne em bovinos
da raa Nelore
CAPN1 CAPN2 CAST CAST1 CAST2

1900ral
1900ral
* * * M-I
1900ral M-D
1900ral
I-D
1900ral
Log2 Fold Change

1900ral
1900ral
1900ral

HSP90AA1 DNAJA1 HSPB1

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OTAGO
Imprinting data
base

34 genes em bovinos
332 genes em humanos
228 genes em camundongos.
http://igc.otago.ac.nz/home.html

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ASE EXPRESSO ALLICA DIFERENCIAL


Genotipagem com sondas TaqMan e
CCCTTCTTTCGGCGA identificao de alelos de diferentes
________...CCCTTCTTTCGGCGA..__________
origens parentais

CCCTTCTTTCGGCGA
CCCTTCTTCCGGCGA T (VIC)
C (FAM)
Ct

? 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

Sondas TaqMan (VIC/FAM) especificas


para regio do SNP propores de DCt
de cada sonda (DCt1/DCt2)

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Protemica

Delineamentos
Diferentes tecidos
Tecido adiposo intra-abdominal x subcutneo x intramuscular
VS
Diferentes indivduos pertencentes a diferentes grupos
Grupos contrastantes;
tratados com diferentes dietas;
normal x afetado; Combinar diferentes
delineamentos
Diferente amostragens no tempo (longos ou
curtos perodos)
Antes, durante e aps treinamento;
fase pr-desmama, ps desmama e abate

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Diferenas na qualidade de carne entre Angus (bos taurus) e


Nelore (bos indicus) grupos contrastantes
Nelore carne rgida x Angus carne macia tecido muscular (longissumus lumburum)
7 animais de cada raa mesmo manejo por 84 dias (antes do abate)
2D-PAGE e espectrometria de massas

Coleta de tecido
muscular,
Extrao e
quantificao

Gel Bidimensional
2D-PAGE

Estabilizao do gele e
Anlise de imagens

Digesto de spots e
identificao de
protenas

Rede de interao
Protena-Protena

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Diferenas na qualidade de carne entre Angus (bos taurus) e Nelore


(bos indicus)

Diferenas na qualidade de carne entre Angus (bos taurus) e Nelore


(bos indicus)

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Diferenas na qualidade de carne entre Angus (bos taurus) e


Nelore (bos indicus)

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2D-PAGE - EQUINOS
Protocolo de
treinamento

Biopsia do musculo

2D-PAGE/analise
de imagem e
estatstica

Digesto em gel

Espectrometria de
massas/procura
em base de dados

MALDI-TOF

E1 Antes e aps treinamento manuteno (6 cavalos) (18 semanas)

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Treinamento manuteno (18


semanas de treinamento) vs
treinamento normal (18 + 6 semanas
de treinamento)

Treinamento normal vs treinamento intensificado (5 cavalos


cada grupo) (perodo de 18 + 6 semanas)

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Questes para responder em sala


Conceituais
1. Olhando de forma geral, como alteraes no DNA e em
protenas que atuam na regulao gnica poderiam modificar
os nveis de expresso (transcrio de mRNA) de genes em
organismos eucariotos? Cite 5 situaes e explique como cada
uma poderia ocorrer.
2. De como modo anlises de protenas importante para rea
de diagnstico?

Aplicadas
1. Raas zebunas (bos indicus), de forma geral, comeam a apresentar
deposio de gordura subcutnea tardia, em mdia com mais de dois anos,
podendo haver animais que comecem esse processo antes e outros depois.
Esse tipo de acmulo de gordura responsvel pelo chamado acabamento
da carcaa, que determina o momento em que os animais podem ser
abatidos sem penalizaes no valor pago por arroba. J, bovinos da raa
angus (bos taurus) comeam a apresentar deposio de gordura
subcutnea de forma mais precoce (em sua grande maioria < 2 anos).
Como seria possvel, utilizando uma abordagem em pequena escala,
identificar genes que podem estar sendo expressos de forma diferente em
cada raa? Seria possvel determinar genes que atuam na deposio de
gordura de forma mais rpida dentro da raa nelore? Determine
delineamentos em cada situao apresentada acima. Como seria o
processo de anlise diferencial de expresso (explique sobre
padronizaes, cuidados na reao, medidas de comparao).

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1. Diferentes intensidades de exerccios podem trazer diferentes adaptaes


metablicas a curto e longo prazo. Treinos de alta intensidade com curtos
perodos de descanso pode trazer queda de rendimento a longo-prazo. Equinos
so amplamente utilizados em provas de velocidade e podem receber treinos
de manuteno, treinamento normal para provas de corrida e treinamentos
intensivos (o qual pode ser prejudicial em alguns casos). Cavalos de corrida
Puro-Sangue Ingls podem ser submetidos a treinos demasiadamente intensos,
contudo a percepo a longo prazo dessa prtica poderia ser tardia por j
apresentar queda no desempenho. Com base nessas informaes como seria
possvel identificar, a partir do tecido muscular esqueltico, biomarcadores para
diagnstico de animais sob overtraining? (Determine um delineamento e
anlises de protenas em ordens correta que poderiam levar a esse objetivo).

FIM

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