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Aplicaes de tcnicas
moleculares e estudo dirigido
em sala
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28/10/2017
RT-qPCR
Quantificao de cidos nuclicos
Absoluta
Relativa
RT-qPCR
Genes diferentes no mesmo tecido Genes iguais em diferentes tecidos
ABSOLUTA RELATIVA
Nmero exatos de molculas Comparao entre amostras
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Delineamentos
Diferentes tecidos
Tecido adiposo intra-abdominal x subcutneo x intramuscular
VS
Diferentes indivduos pertencentes a diferentes grupos
Grupos contrastantes;
tratados com diferentes dietas;
normal x afetado; Combinar diferentes
delineamentos
Diferente amostragens no tempo (longos ou
curtos perodos)
Antes, durante e aps treinamento;
fase pr-desmama, ps desmama e abate
Delineamentos
Escolha de genes
Genes candidatos
Mapeamento GWAS
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qPCR
-Baseada na PCR convencional, com o monitoramento da amplificao em
tempo real do fragmento de interesse.
COMPONENTES qPCR
-Amostra de DNA
-Primers o iniciadores
-DNA polimerase
-dNTPs
-Tampo e ions
- Fluorescncia
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TERMOCICLADOR qPCR
Termociclador com sistema ptico composto por uma fonte de iluminao ultra-violeta e
um detector de fluorescncia + um computador com software prprio para a aquisio de
dados.
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FASES DA qPCR
Threshold
Como determinada a
quantidade inicial de DNA?
Estabelecendo: NMERO DE CICLOS Cycle Threshold
FASES DA qPCR
Threshold
28 30 33 37
Cycle Threshold 28 30 33 37
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QUANTIFICAO
1) ABSOLUTA:
2) RELATIVA
QUANTIFICAO
1) ABSOLUTA:
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QUANTIFICAO
1) ABSOLUTA:
GERAO PADRES
CLONAGEM
TRANSFORMAO
QUANTIFICAO
PLASMDEO
(ng/L)
EXTRAO MULTIPLICAO
PLASMDEO
QUANTIFICAO
1) ABSOLUTA:
Nm. copias= [DNA (g/L) x 6022*1023 (pb/mol)] / [lenght (pb) x 660 (g/mol)]
DILUIES SERIADAS
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QUANTIFICAO
1) ABSOLUTA:
EFICINCIA
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QUANTIFICAO
2) RELATIVA:
- Mtodo CT Comparativo:
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QUANTIFICAO
2) RELATIVA:
HSP
Complexo
CAPN/CAST Heat Shock
CAPN1 Proteins
HSP90AA1
Amostra inicial 90 CAPN2
Delineamento animais
experimental CAST
DNAJA1
CAST1
CAST2
Teste de shear force Genes
Calpastatina (CAST) inibe a ao
escolhidos HSPB1
proteoltica de calpana (CAPN)
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F: ATGAGGAAACAGTCCCATCG
CAST (281039)
R: GGGCTTGGGTTTTTCTTCAG
F: CACCCAGGAGCATGTCAGTA
CAST 1 (NM_001030318.2)
R: ACTGCTCCCAAGGCTTGTT
F: TGCAAGCTGGTGGTACAAGA
CAST 2 (NM_174003.2)
R: GAGAGCTGACTGCTCCCAAG
Sinapse Biotecnologia
F: GCAGCCATTGTGGAGATG
EEF1A2 (515233)
R: ACTTGCCCGCCTTCTGTG
F: GAAATCGCCAATGCCAAC
GAPDH (281181)
R: GAGCCTTGTCTGCCTTCA
F: CCGTTCGACAGATAGCCGTAA
RPL-19 (510615)
1900ral
*
1900ral M-I
1900ral * M-D
1900ral I-D
Esse resultados juntos com novos
Log2 Fold Change
1900ral
1900ral estudos que os relacionam com o tipo de
1900ral
fibra muscular e outras protenas
proteolticas tem trazido novas
perspectivas sobre bases biolgicas da
variao da maciez da carne em bovinos
da raa Nelore
CAPN1 CAPN2 CAST CAST1 CAST2
1900ral
1900ral
* * * M-I
1900ral M-D
1900ral
I-D
1900ral
Log2 Fold Change
1900ral
1900ral
1900ral
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OTAGO
Imprinting data
base
34 genes em bovinos
332 genes em humanos
228 genes em camundongos.
http://igc.otago.ac.nz/home.html
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CCCTTCTTTCGGCGA
CCCTTCTTCCGGCGA T (VIC)
C (FAM)
Ct
? 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
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Protemica
Delineamentos
Diferentes tecidos
Tecido adiposo intra-abdominal x subcutneo x intramuscular
VS
Diferentes indivduos pertencentes a diferentes grupos
Grupos contrastantes;
tratados com diferentes dietas;
normal x afetado; Combinar diferentes
delineamentos
Diferente amostragens no tempo (longos ou
curtos perodos)
Antes, durante e aps treinamento;
fase pr-desmama, ps desmama e abate
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Coleta de tecido
muscular,
Extrao e
quantificao
Gel Bidimensional
2D-PAGE
Estabilizao do gele e
Anlise de imagens
Digesto de spots e
identificao de
protenas
Rede de interao
Protena-Protena
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2D-PAGE - EQUINOS
Protocolo de
treinamento
Biopsia do musculo
2D-PAGE/analise
de imagem e
estatstica
Digesto em gel
Espectrometria de
massas/procura
em base de dados
MALDI-TOF
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Aplicadas
1. Raas zebunas (bos indicus), de forma geral, comeam a apresentar
deposio de gordura subcutnea tardia, em mdia com mais de dois anos,
podendo haver animais que comecem esse processo antes e outros depois.
Esse tipo de acmulo de gordura responsvel pelo chamado acabamento
da carcaa, que determina o momento em que os animais podem ser
abatidos sem penalizaes no valor pago por arroba. J, bovinos da raa
angus (bos taurus) comeam a apresentar deposio de gordura
subcutnea de forma mais precoce (em sua grande maioria < 2 anos).
Como seria possvel, utilizando uma abordagem em pequena escala,
identificar genes que podem estar sendo expressos de forma diferente em
cada raa? Seria possvel determinar genes que atuam na deposio de
gordura de forma mais rpida dentro da raa nelore? Determine
delineamentos em cada situao apresentada acima. Como seria o
processo de anlise diferencial de expresso (explique sobre
padronizaes, cuidados na reao, medidas de comparao).
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FIM
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