Compendio de Enzimologia PDF

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Compendio de Enzimologa
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Enrique Battaner Arias
COMPENDIO DE ENZIMOLOGA
Manuales Universitarios
88
Ediciones Universidad de Salamanca y Enrique Battaner Arias
1. edicin: julio, 2013

ISBN: 978-84-9012-295-2 (pdf)
ISBN: 978-84-9012-296-9 (e-Pub)
ISBN: 978-84-9012-297-6 (Mobipocket)
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Ficha catalogrfica
CEP
BATTANER ARIAS, Enrique
Compendio de enzimologa [Recuso electrnico] / Enrique Battaner Arias. 1a. ed. electrnica.
Salamanca : Ediciones Universidad de Salamanca, 2013.
320 p. - (Manuales Universitarios ; 88)
1. Bioqumica. 2. Biologa molecular. 3. Biomolculas

577.1
ndice
Introduccin a la Enzimologa..................................................................................... 17
Notas histricas.......................................................................................................................18
I. Los orgenes....................................................................................................................18
II. La fermentacin alcohlica............................................................................................20
El estudio de la Enzimologa....................................................................................................22
Bibliografa general..................................................................................................................23
Captulo 1 Las reacciones qumicas: criterios de espontaneidad y cintica................... 27

1.1. En qu circunstancias tiene lugar espontneamente una reaccin?...................................28
1.1.1. El calor absorbido o desprendido en reacciones qumicas.........................................28
1.1.2. Orden o desorden introducido en un sistema: la entropa........................................29
1.1.3. Trabajo til potencial en una transformacin: la Energa Libre.................................30
1.2. La velocidad de las reacciones qumicas.............................................................................33
1.2.1. Velocidad y concentracin: orden de reaccin y molecularidad.................................33
1.2.2. Velocidad y temperatura: concepto de energa de activacin.....................................38
1.2.3. Catlisis...................................................................................................................41
1.2.3.1. Los catalizadores no entran en la ecuacin estequiomtrica global...................41
1.2.3.2. Los catalizadores no alteran la posicin de equilibrio de la reaccin.................42
1.2.3.3. Los catalizadores modifican la energa de activacin........................................43
1.2.3.4. Catlisis homognea y heterognea..................................................................45
Captulo 2 Catlisis enzimtica: trminos, conceptos y caractersticas generales.......... 47

2.1. Conceptos y trminos.......................................................................................................48
2.1.1. Enzima....................................................................................................................48
2.1.2. Substrato..................................................................................................................50
2.1.3. Centro activo...........................................................................................................50
2.1.4. Protmero................................................................................................................51
2.1.5. Actividad enzimtica................................................................................................51
2.1.6. Actividad especfica, actividad molecular, nmero de recambio................................52
2.1.7. Inhibidor.................................................................................................................53
2.1.8. Activador.................................................................................................................53
2.1.9. Coenzima................................................................................................................53
2.1.10. Isoenzima...............................................................................................................55
2.2. Naturaleza qumica de las enzimas....................................................................................55
2.3. La especificidad de las enzimas..........................................................................................57
2.3.1. Especificidad sobre estereoismeros..........................................................................57
2.3.2. Proquiralidad...........................................................................................................58
2.3.3. Especificidad relativa................................................................................................60
2.3.4. Especificidad en enzimas multisubstrato...................................................................60
2.3.5. Especificidad en secuencias de nucletidos...............................................................61
2.4. Otros aspectos de la catlisis enzimtica............................................................................61
2.5. Teoras sobre la accin enzimtica.....................................................................................62
Captulo 3 Clasificacin y nomenclatura de las enzimas. Reacciones enzimticas........ 65

3.1. Principios generales de clasificacin y nomenclatura de enzimas.......................................66
3.1.1. Nomenclatura..........................................................................................................66
3.1.2. Clasificacin............................................................................................................67
3.2. Reacciones enzimticas.....................................................................................................68
3.2.1. Grupo 1: Oxidorreductasas......................................................................................68
3.2.1.1. Clasificacin sistemtica de las oxidorreductasas..............................................68
3.2.1.2. Nomenclatura alternativa (recomendada) para las oxidorreductasas.................69
3.2.1.3. Algunas reacciones enzimticas catalizadas por oxidorreductasas......................69
(a) Deshidrogenasas................................................................................................69
(b) Oxidasas...........................................................................................................70
(c) Peroxidasas........................................................................................................70
(d) Oxigenasas (no confundir con Oxidasas)...........................................................71
(e) Hidroxilasas.......................................................................................................72
(f ) Reductasas.........................................................................................................72
3.2.2. Grupo 2: Transferasas...............................................................................................73
3.2.2.1. Clasificacin sistemtica de las transferasas......................................................73
3.2.2.2. Algunas reacciones enzimticas catalizadas por transferasas..............................74
(a) Subgrupo 2.1: Transfieren grupos monocarbonados...........................................74
(b) Subgrupo 2.4: Glicosil transferasas....................................................................74
(c) Subgrupo 2.6: transfieren grupos nitrogenados..................................................75
(d) Subgrupo 2.7: Fosfotransferasas o kinasas..........................................................77
3.2.3. Grupo 3: Hidrolasas.................................................................................................77
3.2.3.1. Clasificacin sistemtica de las hidrolasas........................................................78
(a) Subgrupo 3.1. Hidrolizan enlaces ster..............................................................78
(b) Subgrupo 3.2: Glicsido hidrolasas (glicosidasas)..............................................79
(c) Subgrupo 3.4: Pptido hidrolasas.......................................................................80
- Serin proteinasas.............................................................................................80
- Tiol proteinasas...............................................................................................81
- Proteinasas cidas............................................................................................81
- Metaloproteinasas...........................................................................................81
(d) Subgrupo 3.6: Acil anhdrido hidrolasas............................................................82
3.2.4. Grupo 4: Liasas........................................................................................................82
(a) Subgrupo 4.1: Liasas C-C..................................................................................83
(b) Subgrupo 4.2: Liasas C-O.................................................................................84
3.2.5. Grupo 5: Isomerasas................................................................................................84
3.2.5.1. Clasificacin sistemtica de las isomerasas.......................................................85
3.2.5.2. Algunas reacciones enzimticas catalizadas por isomerasas...............................85
(a) Subgrupo 5.1: Racemasas y epimerasas..............................................................85
(b) Subgrupo 5.2: Isomerasas cis-trans....................................................................85
(c) Subgrupo 5.3: Oxidorreductasas intramoleculares.............................................86
(d) Subgrupo 5.4: Transferasas intramoleculares (mutasas)......................................86
(e) Subgrupo 5.99: Otras isomerasas.......................................................................87
3.2.6. Grupo 6: Ligasas o Sintetasas...................................................................................87
3.2.6.1. Clasificacin sistemtica de las ligasas..............................................................88
3.2.6.2. Algunas reacciones enzimticas catalizadas por ligasas......................................88
(a) Subgrupo 6.1: Ligasas C-O...............................................................................88
(b) Subgrupo 6.3: Ligasas C-N...............................................................................89
(c) Subgrupo 6.4: Ligasas C-C................................................................................89
Captulo 4 Coenzimas o cofactores ............................................................................. 91

4.1. Introduccin.....................................................................................................................92
4.2. Coenzimas asociadas a procesos redox...............................................................................93
4.2.1. Coenzimas piridnicas (NAD+, NADP+)..................................................................93
4.2.1.1. Estructura qumica y modo de accin..............................................................94
4.2.1.2. Significacin metablica y fisiolgica...............................................................96
4.2.1.3. Carcter vitamnico.........................................................................................97
4.2.2. Coenzimas flavnicas................................................................................................97
4.2.2.2. Flavoprotenas.................................................................................................100
4.2.3. Coenzimas hemnicas...............................................................................................101
4.2.3.2. Las peroxidasas................................................................................................103
4.2.3.3. Los citocromos................................................................................................104
4.2.4. Quinonas.................................................................................................................106
4.2.4.1. Ubiquinona o Coenzima Q.............................................................................106
4.2.4.2. Otras quinonas................................................................................................107
4.2.5. cido ascrbico (vitamina C)...................................................................................107
4.2.5.1. Estructura qumica..........................................................................................108
4.2.5.2. Funciones biolgicas........................................................................................108
4.2.6. Glutatin.................................................................................................................109
4.2.7. Otras coenzimas redox.............................................................................................110
4.3. Coenzimas asociados a otras reacciones (no redox)............................................................111
4.3.1. Tiamina pirofosfato..................................................................................................111
4.3.2. Piridoxal fosfato.......................................................................................................112
4.3.2.1. Estructura qumica y modo de accin; metabolismo de aminocidos...............113
4.3.2.2. Otras reacciones dependientes de piridoxal fosfato..........................................114
4.3.3. Coenzimas folnicas.................................................................................................114
4.3.3.3. Farmacologa asociada al cido flico...............................................................117
4.3.4. Coenzimas cobamdicas...........................................................................................118
4.3.4.2. Modo de accin...............................................................................................120
4.3.5. Biotina.....................................................................................................................121
4.3.5.2. Avidina............................................................................................................123
4.3.6. S-adenosil metionina................................................................................................123
4.3.6.2. Funcin metablica.........................................................................................123
4.3.7. Pantetenas...............................................................................................................124
4.3.7.2. Modo de accin...............................................................................................126
4.3.8. Carnitina.................................................................................................................126
4.3.9. 3-Fosfoadenosil 5-fosfosulfato (PAPS)....................................................................127
4.3.10. Adenosina 5 trifosfato (ATP).................................................................................128
(a) Reacciones de transferencia ligadas al ATP.........................................................128
(b) Suministro de energa para otras reacciones.......................................................128
4.3.11. Otros nucletidos que operan como coenzimas......................................................129
Captulo 5 Cintica de las reacciones enzimticas........................................................ 131

5.1. Introduccin.....................................................................................................................132
5.1.1. Inters de los estudios cinticos................................................................................132
5.1.2. Concepto de velocidad inicial..................................................................................134
5.2. Efecto de la concentracin de enzima...............................................................................135
5.3. Efecto de la concentracin de substrato............................................................................139
5.3.1. Estudio cintico de la interaccin enzima-substrato..................................................141
5.3.2. Mecanismo de Michaelis y Menten..........................................................................143
5.3.3. Concepto de Km.......................................................................................................145
5.3.4. Concepto de Vmax.....................................................................................................147
5.3.5. Aproximacin de estado estacionario........................................................................148
5.3.6. Eficiencia cataltica de las enzimas............................................................................150
5.3.7. Determinacin experimental de Km y Vmax...............................................................151
5.3.7.1. Transformaciones lineales de la ecuacin de Michaelis-Menten........................153
5.4. Efecto del pH sobre la velocidad de las reacciones enzimticas..........................................154
5.4.1. Bases moleculares.....................................................................................................154
5.4.2. Significado biolgico del efecto del pH....................................................................158
5.5. Efecto de la temperatura sobre las reacciones enzimticas..................................................159
5.5.1. Bases moleculares.....................................................................................................159
5.5.2. Significado biolgico del efecto de la temperatura....................................................161
Captulo 6 Inhibicin enzimtica................................................................................ 163

6.1. Concepto e importancia...................................................................................................164
6.2. Tipos de inhibidores.........................................................................................................166
6.2.1. Inhibidores reversibles..............................................................................................166
6.2.2. Inhibidores irreversibles...........................................................................................167
6.3. Inhibicin competitiva......................................................................................................168
6.3.1. Cintica de la inhibicin competitiva.......................................................................168
6.3.2. Diagnstico cintico de la inhibicin competitiva....................................................170
6.3.3. Aspectos estructurales de la inhibicin competitiva..................................................172
6.3.4. Anlogos de estado de transicin..............................................................................175
6.3.5. Anticuerpos catalticos.............................................................................................177
6.3.6. Importancia prctica de la inhibicin competitiva....................................................178
6.4. Otras formas de inhibicin reversible................................................................................179
6.4.1. Inhibicin no competitiva........................................................................................179
6.4.2. Inhibicin acompetitiva o anticompetitiva...............................................................181
6.5. Inhibicin irreversible.......................................................................................................182
6.5.1. Generalidades..........................................................................................................182
6.5.2. Reactivos de grupo -SH...........................................................................................184
6.5.3. Metales pesados........................................................................................................186
6.5.4. Inhibidores que combinan con cationes esenciales....................................................186
6.5.5. Reactivos especficos de grupo y marcadores de afinidad..........................................187
6.5.5.1. Organofosfricos.............................................................................................187
6.5.5.2. Marcadores de afinidad...................................................................................188
6.6. Substratos suicidas............................................................................................................189
6.6.1. Modo de accin de los antibiticos -lactmicos......................................................190
6.6.2. Resistencia a los antibiticos -lactmicos: la -lactamasa........................................192
6.6.3. Otros inhibidores suicidas........................................................................................194
Captulo 7 El Centro Activo enzimtico. Mecanismos de la accin enzimtica............ 195

7.1. El centro activo.................................................................................................................196
7.1.1. Concepto.................................................................................................................196
7.1.2. Pruebas experimentales de la existencia del centro activo..........................................197
7.1.3. Nmero de centros activos.......................................................................................199
7.1.4. Aminocidos y grupos qumicos implicados en el centro activo................................201
7.2. Mecanismos de la accin enzimtica.................................................................................205
7.2.1. Efectos de proximidad y orientacin........................................................................206
7.2.2. Catlisis cido-base..................................................................................................207
7.2.3. Grupos nuclefilos y electrfilos...............................................................................211
7.2.4. Formacin de intermediarios covalentes con la enzima.............................................211
7.2.5. Efectos mecanocunticos..........................................................................................212
7.3. Estudio del centro activo de la quimotripsina...................................................................213
Captulo 8 Regulacin de la actividad enzimtica, 1.................................................... 219

8.1. Generalidades...................................................................................................................220
8.1.1. Tipos de regulacin enzimtica.................................................................................220
I. Controles sobre la concentracin enzimtica.............................................................221
(a). Controles sobre la expresin gentica................................................................221
(b). Controles sobre la degradacin enzimtica.......................................................221
II. Controles sobre la actividad enzimtica....................................................................222
(a). Control alostrico o alosterismo.......................................................................222
(b). Modificacin covalente de las enzimas..............................................................222
8.2. Control por retroalimentacin negativa............................................................................223
8.2.1. Retroalimentacin negativa en sistemas enzimticos.................................................225
8.2.2. Caractersticas generales del control enzimtico por retroalimentacin negativa.......228
8.3. Alosterismo.......................................................................................................................231
8.3.1. Definicin................................................................................................................231
8.3.2. Pruebas experimentales............................................................................................234
8.3.3. Alosterismo y cooperatividad...................................................................................235
8.3.3.1. Concepto de cooperatividad............................................................................235
8.3.3.2. Implicaciones estructurales de la existencia de cooperatividad..........................236
8.3.3.3. Efectores positivos y negativos y cooperatividad...............................................236
8.3.3.4. Modelo alostrico restringido..........................................................................238
8.3.4. Interpretacin cuantitativa del alosterismo...............................................................239
8.3.4.1. El modelo de Monod, Wyman y Changeux.....................................................239
8.3.5. La aspartato transcarbamilasa...................................................................................242
8.3.5.1. Comportamiento alostrico de la aspartato transcarbamilasa...........................242
8.3.5.2. Adecuacin de la aspartato transcarbamilasa al modelo MWC........................242
8.3.6. La hemoglobina.......................................................................................................246
8.3.6.1. Comportamiento alostrico de la hemoglobina...............................................246
8.3.6.2. Adecuacin de la hemoglobina al modelo MWC.............................................248
Captulo 9 Regulacin de la actividad enzimtica, 2. Modificacin covalente de las enzi-

mas. Activaciones proteolticas.................................................................................... 253
9.1. Introduccin.....................................................................................................................254
9.1.1. Modificacin covalente: su importancia biolgica....................................................254
9.1.2. Formas de modificacin covalente............................................................................256
9.1.3. Concepto de segundo mensajero..............................................................................258
9.1.3.1 Concepto de activacin en cascada...................................................................260
9.2. Regulacin de la glucgeno fosforilasa..............................................................................261
9.2.1. Reaccin catalizada y formas moleculares de la glucgeno fosforilasa........................261
9.2.2. Cascada de activacin en la glucgeno fosforilasa.....................................................263
9.2.3. Mecanismos moleculares en el sistema de la glucgeno fosforilasa............................267
9.2.3.1. Glucgeno fosforilasa......................................................................................267
9.2.3.2. Fosforilasa kinasa.............................................................................................272
9.2.3.3. Protein kinasa A..............................................................................................273
9.2.3.4. Adenilato ciclasa..............................................................................................275
9.2.3.5. Protenas G.....................................................................................................276
9.2.4. Otras actividades ligadas al sistema de la glucgeno fosforilasa.................................278
9.2.4.1. Protein fosfatasas.............................................................................................278
9.2.4.2. cAMP fosfodiesterasa......................................................................................278
9.2.4.3. Glucgeno sintasa...........................................................................................279
9.3. Otros sistemas de fosforilacin de protenas......................................................................281
9.3.1. Protein kinasas A......................................................................................................281
9.3.2. Protein kinasas G.....................................................................................................282
9.3.3. Protein kinasas C.....................................................................................................282
9.3.4. Protein kinasas dependientes de calcio-calmodulina.................................................283
9.3.4.1. El sistema calcio-calmodulina..........................................................................283
9.3.4.2. Inositolfosftidos.............................................................................................284
9.3.5. Protein tirosin kinasas..............................................................................................285
9.4. Otras formas de modificacin covalente............................................................................285
9.4.1. ADP-ribosilacin.....................................................................................................285
9.4.2. Adenilacin y Uridilacin........................................................................................287
9.5. Activaciones proteolticas: Zimgenos digestivos...............................................................290
9.5.1. Pepsina.....................................................................................................................291
9.5.2. Tripsina....................................................................................................................291
9.5.3. Quimotripsina.........................................................................................................292
9.6. Activaciones proteolticas: Coagulacin de la sangre..........................................................292
9.6.1. El proceso de coagulacin: generalidades..................................................................293
9.6.2. Polimerizacin del fibringeno.................................................................................295
9.6.3. Formacin de trombina...........................................................................................297
9.6.4. Formacin del complejo protrombinasa...................................................................299
9.6.4.1. La va extrnseca..............................................................................................299
9.6.4.2. La va intrnseca..............................................................................................300
9.6.5. Anticoagulantes fisiolgicos......................................................................................301
Captulo 10 Enzimas en Medicina............................................................................... 303

10.1. Las enzimas en el diagnstico clnico..............................................................................304
10.1.1. Procedencia de las enzimas sricas..........................................................................304
10.1.2. Alteraciones en la concentracin enzimtica en suero.............................................305
10.1.2.1. Aumentos de la concentracin enzimtica.....................................................305
10.1.2.2. Disminuciones en la actividad enzimtica......................................................306
10.1.3. Estudio de las principales enzimas con inters diagnstico.....................................307
10.1.3.1. Aminotransferasas.........................................................................................307
10.1.3.2. Creatinkinasa................................................................................................309
10.1.3.3. Fosfatasa alcalina...........................................................................................310
10.1.3.4. -Glutamil transferasa...................................................................................311
10.1.3.5. -Amilasa......................................................................................................311
10.1.3.6. Fosfatasa cida...............................................................................................312
10.1.3.7. Lactato deshidrogenasa..................................................................................312
10.2. Enzimas en Teraputica...................................................................................................313
10.2.1. Teraputicas sustitutivas.........................................................................................314
10.2.2. Enzimas en Ciruga................................................................................................316
10.2.3. Trastornos de la circulacin....................................................................................316
10.2.4. Trastornos de la coagulacin sangunea..................................................................316
10.2.5. Enzimas en teraputica antineoplsica....................................................................317
10.2.6. Otros usos teraputicos de enzimas........................................................................317
COMPENDIO DE ENZIMOLOGA Enrique Battaner Arias
INTRODUCCIN A LA ENZIMOLOGA
Si algo distingue realmente a la Bioqumica del resto de las disciplinas qumicas,

es el papel central que en los seres vivos desempean las enzimas. Y si algn elemento
distintivo hay en la Bioqumica frente a las ciencias biolgicas es que las enzimas nos
brindan un modelo interpretativo de uso general para todas ellas sin excepcin en trmi-
nos de la teora atmico-molecular. El estudio de las biomolculas no es en s mismo ms
que una serie de captulos de la Qumica Orgnica, por ms que se utilicen tcnicas poco
convencionales desde el punto de vista de esta ciencia. Lo realmente nico en la qumica
biolgica es esa impresionante cantidad de catalizadores especficos encargados cada uno
de un determinado proceso dentro de los muchos miles de reacciones qumicas posibles
en lo organismos. Cmo son las enzimas? Cmo funcionan? Cmo se forman? La
respuesta a estas preguntas, entendidas en su ms amplio significado, nos brindara la
explicacin a todos los fenmenos que asociamos a la vida: la posibilidad de un metabo-
lismo; de su regulacin, y por tanto de su integracin a un nivel fisiolgico; igualmente,
de su biosntesis y todos los fenmenos genticos a ella asociados; y por ltimo, de las
complicadas pautas evolutivas y adaptativas de los organismos vivientes.
No es de extraar, por tanto, que los espectaculares avances de la Bioqumica habi-

dos en los ltimos treinta aos hayan tenido lugar normalmente en torno a sistemas ex-
perimentales nacidos del estudio convencional de las enzimas. Los mtodos y tcnicas
de purificacin y aislamiento de enzimas han marcado las pautas de toda la Bioqumica
preparativa o extractiva; los mtodos que la Enzimologa emplea en la cuantificacin
de enzimas forman la base de la Bioqumica Analtica, habiendo transcendido su uso al
Anlisis Qumico General; el estudio qumico de los inhibidores ha creado los protoco-
los que hoy se siguen en el desarrollo sistemtico de nuevos frmacos.
Y ya en la esfera puramente terica, el estudio de las reacciones enzimticas nos ha

suministrado un modelo de aplicacin general a todas las interacciones biolgicas; el de
un ligando unindose a un receptor de naturaleza proteica, y desencadenando en l un
cambio que es el ltimo responsable molecular del efecto fisiolgico investigado. Por otra
parte, el estudio cintico de cadenas de reacciones enzimticas nos va dando una idea,
hoy todava aproximada, de las complejidades dinmicas que pueden surgir en el ser
vivo por la accin de las enzimas, y que en un terreno puramente especulativo podemos
relacionar sin demasiada dificultad con cuestiones tan abstractas como el origen objetivo
17
del tiempo biolgico o las asimetras (y simetras) espaciales que surgen en la ontogenia
de los seres vivos.
En el momento actual quiz es posible que el trmino Enzimologa pueda sonar

un tanto pasado de moda, sobre todo en comparacin con otros como Biotecnologa
o Ingeniera Gentica, y que nos recuerde los viejos laboratorios donde se haca Bio-
qumica clsica all por los aos 50 y 60. Por ello trato de reivindicar la importancia de
la misma. Si la Biotecnologa no es otra cosa que introducir en gran escala a las enzimas
en el proceso productivo y econmico, la Ingeniera Gentica actual no es concebible
sin la ayuda de una serie muy concreta de enzimas; y adems, sus ltimas aspiraciones
son enteramente enzimticas: la introduccin de nuevos procesos metablicos all don-
de normalmente no los hay. La Gentica Molecular se ocupa de los planos del edificio
viviente; la Enzimologa, del estudio del propio edificio funcionando.
El propsito del autor de este libro es presentar una visin actualizada de las en-
zimas, pero a un nivel de estudiante de Grado, y especficamente, en el rea de Ciencias
de la Salud. Para el especialista hay numerosas y magnficas monografas, aparte de series
peridicas e innumerables artculos de investigacin y de divulgacin que tratan con
enzimas directa o indirectamente. A tal fin se da una cierta extensin a captulos como
la cintica enzimtica, que en los textos consagrados de Bioqumica ocupan un espacio
a nuestro juicio harto reducido, pero sin llegar por ello a extremos monogrficos o espe-
cializados. El autor pretende demostrar que la metodologa del estudio de las enzimas,
tanto en lo puramente tcnico como en lo ms conceptual y abstracto, es la indicada para
el abordaje de la gran mayora de los problemas, puros o aplicados, que nos plantea el
estudio de los seres vivientes.
Notas histricas
I. Los orgenes
El pensamiento yatroqumico que floreci a partir de Paracelso, en el s. xvi, es el

ms remoto antecedente histrico de la Bioqumica y de la Enzimologa. Precisamente
el representante ms genuino de este pensamiento, Van Helmont, a principios del s.
xvii sugiri que la digestin de los alimentos implicaba su transformacin a partir de
fermentos, tomando este trmino de la tecnologa del vino, y en la idea de que ambos
procesos tenan mucho en comn. Este pensamiento discrepaba radicalmente de la tra-
dicin galnica, que vea en la digestin una serie de cocciones. Tanto en un caso como
18
en otro imperaba el razonamiento de analoga, pero hemos de reconocer que van Hel-
mont estaba mucho ms cerca de la realidad. Y adems, desde entonces se estableci una
fructfera relacin entre los estudios que hoy llamaramos bioqumicos con los procesos
de digestin y de fermentacin, pues ambos fenmenos fueron desde entonces el objeto
principal de los estudios que han desembocado en la moderna Enzimologa.
Rn de Raumur (1683-1757) emprendi hacia el final de su vida (1752) una

serie de estudios sobre la digestin que representaron un importante avance metodol-
gico. Alimentando a aves con tubos metlicos rellenos de distintas materias alimenticias,
estudi las transformaciones de estas a lo largo del tubo digestivo y pudo comprobar que
exista realmente una transformacin qumica de los alimentos durante la digestin. La-
zzaro Spallanzani (1729-1799) ampli estos estudios dejando fuera de duda el hecho de
la transformacin qumica de los alimentos durante el proceso digestivo. Si consideramos
que por aquel entonces su contemporneo Antoine de Lavoisier (1743-1794) reduca a
trminos qumicos el proceso respiratorio, que Karl Wilhelm Scheele (1742-1786) co-
menzaba el estudio de los productos naturales y que unos pocos aos ms tarde (1804)
John Dalton (1766-1844) resucitaba en trminos cientficos el primitivo atomismo de
Demcrito, bien podemos sugerir que estaba teniendo lugar una verdadera revolucin
qumica al mismo tiempo que la Revolucin Francesa. En cuanto al proceso digestivo, en
1836, Schwann y Eberle describieron un principio en el jugo gstrico capaz de degradar
protenas, al que denominaron pepsina.
Otro campo, el de las reacciones qumicas, se desarrollaba ampliamente por aquel

entonces. En lo que a nuestra discusin se refiere, es importante sealar que en 1812
Kirchoff demostr la produccin de azcar a partir de almidn por accin de cidos
sin que estos quedaran modificados; y en 1814 comprob que el mismo proceso poda
tener lugar en presencia de un extracto de trigo en lugar de cidos. Unos aos ms tarde
(1817-1822), e independientemente, Davy, Dbereimer, Mitscherlich y Thnard des-
cubrieron que la descomposicin del perxido de hidrgeno era acelerada por metales,
sin cambios apreciables en estos; Thnard, por su parte, observ el mismo fenmeno en
presencia de fibrina sangunea. En 1833 Payen y Persoz obtuvieron a partir de malta un
principio similar al antes mencionado de Kirchoff, al que dieron el nombre de diastasa;
por su parte, Robiquet en 1830 descubri en las almendras amargas un principio albu-
minoide que era capaz de descomponer la amigdalina en glucosa, benzaldehdo y CNH
(y bautizado posteriormente por Liebig y Whler como emulsina). Con todos estos
datos y algunos ms, Jns Jacob Berzelius (1779-1848) elabor su teora de la catlisis,
central en toda esta discusin. Por ello le citamos literalmente:
19
...Tenemos amplias razones para suponer que en las plantas y en los animales vi-
vientes tienen lugar miles de procesos catalticos entre los tejidos y los fluidos, y que de
ellos resulta la formacin de gran nmero de distintos compuestos, para cuyo origen
a partir de la sangre o de los jugos vegetales no podemos asignar hoy da una causa
conocida (1836).
Y aqu entra en escena otro gran protagonista de la historia de la Enzimologa: el

estudio de la fermentacin alcohlica.
II. La fermentacin alcohlica
Conocido desde tiempo inmemorial, este proceso empez a recibir atencin cien-
tfica a finales del siglo xviii. En 1779 la Academia de Ciencias de Francia estableci
un premio consistente en una libra de oro para el trabajo que arrojara luz sobre el hasta
entonces misterioso proceso qumico. Aunque este premio fue retirado en 1793, no hay
duda que contribuy decisivamente a nuestro actual conocimiento no solo de las fer-
mentaciones, sino de la Enzimologa en general.
J. L. Gay-Lussac (1778-1850) reconoci como productos el etanol y el CO2,

aunque sus datos no establecieron la estequiometra del proceso. C. Cagniard-Latour
(1777-1859) sugiri la naturaleza celular de la levadura, estimando su dimetro en 6-7
m y observando el proceso de gemacin. Igualmente demostr las diferencias entre la
levadura de cerveza y la del vino; desde el punto de vista qumico, comprob el requeri-
miento de compuestos nitrogenados en el proceso. Observaciones similares fueron lleva-
das a cabo por F. T. Ktzing (1807-1893) y por T. Schwann (1810-1882).
Justus von Liebig (1803-1873), junto con F. Whler (el autor de la sntesis de
urea) consideraban la levadura como una sustancia qumica inestable que al comunicar
su inestabilidad al azcar lo degradaba a alcohol. Esto entraba en contradiccin con el
punto de vista sostenido por Schwann, Ktzing y Cagniard-Latour, es decir, la natura-
leza celular de la levadura. Por tanto se plante la cuestin de si las fermentaciones de-
pendan de la propia calidad viviente de la clula o bien se trataba de un componente
inanimado de la misma. Liebig defenda esta ltima postura, mientras que Schwann
sostena la primera.
20
Los experimentos de Louis Pasteur (1822-1895) parecieron dar la razn entera-

mente a Schwann. En 1860 escriba lo siguiente:
...El acto qumico de la fermentacin es esencialmente un fenmeno correlativo a un

acto vital, que comienza y termina con este. Creo que la fermentacin alcohlica no
puede tener lugar si no viene acompaada de la organizacin, desarrollo y multipli-
cacin de las clulas, o bien de la vida continua de las clulas ya formadas.
A consecuencia de este punto de vista, se estableci la distincin entre fermentos

organizados (o formes), de los que la levadura era el ejemplo, y fermentos no orga-
nizados (o informes) como la diastasa, pepsina, emulsina, invertasa, etc. (cuya lista iba
creciendo), que podan ser extrados de las clulas. Precisamente para evitar esta com-
plicada nomenclatura, Khne introdujo en 1878 el trmino enzima (literalmente, en
la levadura) para denominar los hasta entonces conocidos como fermentos no orga-
nizados, indicando as que estaban dentro de la clula, pero que no eran la clula. El
punto de vista de Pasteur prevaleci momentneamente, a pesar de que algunas voces se
alzaron en contra (en particular las de Claude Bernard, Berthelot y Traube; citamos a
este ltimo (1878):
...Los fermentos no son, como crea Liebig, sustancias inestables que transmiten a
materiales normalmente no reactivos su vibracin qumica, sino que son sustancias
qumicas, relacionadas con las protenas y que como todas las dems sustancias poseen
una estructura qumica definida... La hiptesis propuesta por Schwann y Pasteur de
que la fermentacin ha de ser considerada como expresin de la actividad vital de los
organismos inferiores no es satisfactoria... Los fermentos son la causa de los procesos
qumicos vitales no solo en los organismos inferiores, sino tambin en los superiores.
En 1897 E. Bchner (1860-1917) dio con la clave final al preparar un extracto

acelular de levadura capaz de fermentar azcar, lo que ech por tierra la teora celular de
la fermentacin (y todo el vitalismo que implicaba); la totalidad del proceso fermenta-
tivo poda ser llevada a cabo por enzimas individuales en el sentido de los definidos por
Khne (es decir, los no organizados).
21
Y por fin, Arthur Harden (1865-1940) utiliz el sistema de Bchner mediante

una metodologa que pas a ser clsica en todos los estudios metablicos: calentamiento,
dilisis, inhibidores, etc. de forma que unos aos ms tarde Meyerhof pudo enumerar
una a una todas las enzimas y reacciones de la fermentacin alcohlica.
A partir de entonces, el desarrollo histrico de la Enzimologa se confunde con

sus captulos concretos, y a ellos nos remitimos. Igualmente, el origen de la Bioqumica
moderna podemos cifrarlo en el momento en que qued resuelta la polmica sobre las
fermentaciones; la aparicin de las enzimas en la escena cientfica fue lo suficientemente
importante como para discernir esta ciencia de sus diversas predecesoras, como la Fisio-
loga, la Farmacia, la Qumica y la Agronoma. Adems, los estudios de Harden y Young
dotaron a la nueva ciencia de su arma principal: el sistema acelular.
El estudio de la Enzimologa
A lo largo de esta obra, trataremos de presentar la Enzimologa de acuerdo con la

siguiente sistemtica:
-- En primer lugar, se repasan algunas nociones de quimicofsica que son necesarias para
la comprensin, siquiera superficial, de las reacciones qumicas. Los conceptos im-
portantes que se abordan son: la energa libre, la velocidad y el orden cintico de las
reacciones y el fenmeno de catlisis tratado de una manera general.
-- Pasamos a continuacin a una visin introductoria de la catlisis enzimtica. Para

ello definimos los principales trminos propios de la Enzimologa, para seguir con
las principales propiedades de las enzimas: su naturaleza qumica, su especificidad y
su eficiencia cataltica. Se discuten por ltimo las principales teoras sobre la accin
enzimtica.
-- En el captulo 3 se describen las reacciones enzimticas, con las normas vigentes de

clasificacin y nomenclatura. El captulo 4 presenta el estudio de las coenzimas, los
reactivos especficos de la qumica biolgica.
-- Los dos captulos siguientes se refieren a la cintica de las reacciones enzimticas y a

sus inhibidores, respectivamente (captulos 5 y 6). Veremos cmo el estudio cintico
nos ayuda a comprender los mecanismos bsicos de reaccin y nos permite en mu-
22
chas circunstancias un estudio de los pasos individuales. La inhibicin, que se estudia

inicialmente bajo un punto de vista cintico, se termina discutiendo en trminos ms
estructurales, indicando su importancia prctica, y muy particularmente como para-
digma de la teraputica farmacolgica.
-- El siguiente captulo (7) trata de la estructura molecular de las enzimas. Se contempla

dicho estudio sobre todo en torno al centro activo enzimtico, presentndose los di-
versos mtodos de su estudio. Por otra parte, las estructuras primarias de las molculas
de enzima nos introducen a la evolucin filogentica y el origen de los enzimas.
-- La regulacin de la actividad enzimtica, que se presenta en el siguiente captulo (8),

tiene la enorme importancia de ser el nexo de unin entre el nivel metablico celular
y la fisiologa del organismo. Se presentan el fenmeno del alosterismo, otros modelos
regulatorios, la regulacin covalente de los enzimas y las cascadas de actividades enzi-
mticas (estos dos ltimos aspectos en el captulo 9).
-- Se estudian a continuacin (captulo 10) algunos aspectos de la Enzimologa aplicada

a la Medicina, muy especialmente en el diagnstico y en la teraputica.
Bibliografa general
Mencionamos a continuacin algunas referencias bibliogrficas y de Internet que

pueden ser de utilidad en el estudio de la Enzimologa.
23
Libros y artculos
Barrow, G. M. Qumica Fsica, 3 ed. Ed. Revert, Barcelona, 1975.
Cornish-Bowden, A. Fundamentals of Enzyme Kinetics. Portland Press, London,1984.
Fersht, A. R. Enzyme Structure and Metabolism, 2 ed. W. H. Freeman and Co., New
York, 1984.
Koshland, D. E. Jr. Evolution of catalytic function Cold Spring Harbor Symposia on Quan-
tiative Biology, vol. LII, 1-7, 1987.
Monod, J., Wyman, J., Changeux, J-P. On the nature of allosteric transitions: a plausible
model, J.Mol.Biol. 12, 88-118, 1965.
Nelson, D. L. & Cox, M. M. Lehninger. Principios de Bioqumica. Omega, 2001.
Nez de Castro, I. Enzimologa. Pirmide, Madrid, 2001.
Price, N. C. & Stevens, L. Fundamentals of Enzymology. Oxford University Press,

Oxford, 1987.
Prigogine, I & Stengers, I. La Nueva Alianza. Metamorfosis de la Ciencia. Alianza Edi-

torial. Madrid, 1979.
Segel, I. H. Enzyme Kinetics. Behavior and Analysis of rapid equilibrium and steady-state
systems. John Wiley and Sons, New York, 1975.
Voet, D. & Voet J. G. Bioqumica. Panamericana, 2006.
24
Pginas web
http://www.expasy.ch/enzyme/
http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/
http://en.wikipedia.org/wiki/Enzymes
http://en.wikipedia.org/wiki/Coenzyme
http://en.wikipedia.org/wiki/Enzyme_kinetics
http://en.wikipedia.org/wiki/Enzyme_inhibitor
25
CAPTULO 1
LAS REACCIONES QUMICAS: CRITERIOS DE

ESPONTANEIDAD Y CINTICA
Los organismos vivientes mantienen de forma constante y simultnea varios miles

de reacciones qumicas, cuyo conjunto llamamos metabolismo. Este conjunto de reac-
ciones es tan caracterstico de los mismos que, de hecho, un punto de vista perfectamen-
te vlido para la definicin de vida es la capacidad de mantenimiento de un metabolis-
mo. Por el momento, no sabemos de ningn proceso nuclear que tenga lugar en los seres
vivos, y de ah que la metodologa ms adecuada para el estudio de los seres vivos sea la
propia de la Qumica. En qumica estudiamos las reacciones desde el punto de vista de
su velocidad y de su mecanismo. Ambos tipos de estudio son asimismo cruciales, como
veremos, en el particular terreno de la Bioqumica. Pero en este ltimo se da un hecho de
importancia transcendental: la prctica totalidad de las reacciones qumicas que se dan
en un ser vivo estn catalizadas, es decir, en ellas interviene un agente que no aparece en
la estequiometra global de la reaccin, pero que acelera la consecucin del equilibrio. Se
conocen, como es lgico, muchas otras reacciones catalizadas fuera del mundo viviente,
pero a lo largo de este y los prximos captulos trataremos de ver por qu la catlisis bio-
lgica es tan importante en el contexto de un curso de Bioqumica. Antes de entrar en
esta materia especfica, es preciso que consideremos brevemente algunas generalidades
sobre las reacciones qumicas, particularmente su posibilidad y su velocidad.
1.1. En qu circunstancias tiene lugar espontneamente una reaccin?
La funcin bsica de toda ciencia natural es la prediccin de fenmenos, y los fe-

nmenos qumicos forman parte de nuestra experiencia cotidiana. Por ejemplo, tenemos
todos una idea bastante aproximada de qu sustancias pueden entrar en combustin al
acercar una llama; sabemos que es mucho ms fcil disolver sal que sacarla de la solucin;
y que una vez cuajada la clara de un huevo no podemos restituir esta a su estado original.
Es decir, en muchos casos tenemos una concepcin emprica del sentido espontneo en
que cursan las reacciones, y evidentemente puede ser de gran utilidad un conjunto de
reglas cientficas que nos permitan discernir clara y cuantitativamente la posibilidad o no
de reacciones qumicas. La respuesta a este problema nos la da la Termodinmica clsica,
de forma que hoy da podemos predecir con toda exactitud la posibilidad de cualquier
reaccin qumica real o imaginable. Veamos a continuacin dichos criterios.
1.1.1. El calor absorbido o desprendido en reacciones qumicas
Somos conscientes de que en muchas reacciones qumicas hay intercambio de

calor. Cuando un sistema se transforma a presin y temperatura constantes, el calor
desprendido o absorbido en el proceso recibe el nombre de entalpa (y se representa por
28
H). Como los procesos biolgicos tienen lugar por lo general en estas condiciones, en
lo sucesivo utilizaremos calor y entalpa prcticamente como sinnimos. Asimismo, he-
mos de sealar una importante convencin respecto a las variaciones de entalpa en una
transformacin: el incremento en entalpa se considera positivo cuando el sistema absor-
be calor a partir del entorno; en caso contrario, el incremento se considera negativo. Por
ejemplo, si se nos dice que una reaccin cursa con un incremento de entalpa de -100 kJ
(kilojoules), ello significa que la transformacin desprende esa energa en forma de calor
desde el sistema al entorno. El caso contrario (absorcin de calor por el sistema desde el
entorno) se representa como variacin positiva de entalpa.
Pues bien: una primera aproximacin emprica a la definicin de un criterio de

espontaneidad en las reacciones qumicas nos dira que en nuestra experiencia son ms
usuales aquellas reacciones en las que se desprende calor. As, definiramos como es-
pontneas las reacciones exotrmicas (reacciones que desprenden calor, con incremento
negativo de entalpa) y como no espontneas las reacciones endotrmicas (esto es, que
absorben calor, con incremento positivo de entalpa).
Es fcil refutar esta hiptesis, pues bastan unas pocas observaciones para compro-
bar que existen procesos endotrmicos y que son sin embargo espontneos. Por ejemplo,
la entrada en solucin de sales como el cloruro amnico es un proceso perfectamente
espontneo, y sin embargo cursa con absorcin de calor, como podemos comprobar al
tacto por el enfriamiento del recipiente que contiene la solucin. Por tanto, no es facti-
ble un criterio sobre espontaneidad de las reacciones qumicas basado nicamente en la
entalpa.
1.1.2. Orden o desorden introducido en un sistema: la entropa
Fijmonos en el ejemplo que refutaba la hiptesis anterior. La disolucin de una

sal amnica en agua es un proceso endotrmico y sin embargo, espontneo. El fenme-
no de disolucin de la sal implica el paso de un sistema altamente ordenado, cual es el
caso de un slido cristalino, al desorden propio de una solucin, similar al que existe en
el estado gaseoso. Toda vez que el desorden de un sistema es medido por una magnitud
termodinmica de estado, la entropa, que se representa con el smbolo S, y que el Se-
gundo Principio establece el aumento global de la entropa en cualquier transformacin
que sufra un sistema aislado, podramos pensar que un criterio vlido para dictaminar la
espontaneidad de las reacciones sera el siguiente: son espontneas las transformaciones
de un sistema que cursen con un incremento de entropa (y que por tanto van a favor de
29
la flecha del tiempo). Debemos hacer notar que en este caso definimos como positivas las
variaciones en las que aumenta la entropa del sistema.
Tampoco es vlido este segundo criterio. Por ejemplo, la congelacin del agua a
0 C y presin atmosfrica es un fenmeno totalmente espontneo y cursa con una im-
portante disminucin entrpica, la propia de pasar del relativamente desordenado estado
lquido al orden propio de los slidos cristalinos. Igualmente, la desnaturalizacin de una
protena cursa con un fuerte incremento de entropa en el sistema, ya que la estructura
nativa de aquella representa un sistema muy ordenado y, sin embargo, las protenas no se
desnaturalizan espontneamente.
1.1.3. Trabajo til potencial en una transformacin: la Energa Libre
A pesar de las consideraciones anteriores, las transformaciones espontneas cursan

por lo general o con desprendimiento de calor o con incremento de entropa. Existe una
tercera magnitud termodinmica de estado, la energa libre de Gibbs, que se representa
como G y que se define por la siguiente ecuacin en procesos isotrmicos a presin
constante:
[1]
G = H - TS
en la que vemos que entran como variables la entalpa H, la entropa S y la

temperatura absoluta T. La energa libre de Gibbs representa la cantidad mxima de
trabajo til que puede obtenerse en una transformacin a presin constante, y constitu-
ye un criterio vlido para predecir la espontaneidad de las reacciones qumicas. As, un
incremento negativo en energa libre (es decir, cuando el sistema desprende energa libre
hacia el entorno) significa que la transformacin puede tener lugar espontneamente.
Una variacin positiva tiene lugar cuando el sistema absorbe energa, y tales transforma-
ciones no pueden tener lugar espontneamente. La magnitud G tiene una gran impor-
tancia en todo tipo de clculos qumicos, y por tanto en los biolgicos.
1.1.3.1. Normalmente se dispone de tablas en las que se especifican las energas libres
standard de formacin de compuestos. Esta magnitud es el incremento en energa libre
que tiene lugar en la reaccin de formacin del compuesto a partir de sus elementos
en estado standard (se toma como cero la energa libre de formacin standard de un
30
elemento en su estado ms estable). Estas energas libres de formacin se refieren a esta-

dos standard, es decir, concentracin unidad, 298 K (25 C), 1 atm de presin, etc. A
partir de las energas de formacin de los reactivos y productos podemos calcular muy
fcilmente la energa libre standard de una reaccin dada. Esta energa libre standard se
representa por el smbolo G0.
Ejemplo: Calclese la energa libre standard de la descomposicin del perxido de

hidrgeno: 2H2O2 2H2O + O2. Esta es una interesante reaccin en el metabolismo
celular, catalizada por enzimas llamados peroxidasas, de las cuales el ejemplo ms repre-
sentativo es la catalasa, que cataliza esta misma reaccin. Sabemos que las energas libres
de formacin son:
H2O2 G0 = -103.04 kJ/mol
H2O G0 = -227.65 kJ/mol
O2 (oxgeno molecular) G0 = 0 kJ/mol
Solucin: Al ser la energa libre una funcin termodinmica de estado, su varia-

cin depende nicamente de los estados inicial y final de la reaccin, sin importar el
camino seguido. Por tanto, las energas libres se suman o restan de la misma forma que
en ecuaciones termoqumicas. A partir de la relacin
G0 = G0 (productos) - G0 (reactivos)
Tendremos para la ecuacin propuesta:
G0 = -227.65 -(-103.04 + 0) = -124.61 kJ/mol
Lo cual nos indica que en condiciones standard, la reaccin cursar espontnea-

mente de izquierda a derecha, tal como ha sido enunciada.
En aquellas reacciones en que intervienen cidos, el protn H+ suele ser un

reactivo o un producto; a concentracin unidad, por tanto, las energas libres standard
31
de las reacciones en que intervienen cidos disociados total o parcialmente, se refieren a

pH = 0 (es decir, el pH para el cual [H+] = 1 M. En el medio biolgico el pH siempre es
cercano a 7 (la neutralidad cido base) y se prefiere, por esa razn, calcular las energas
libres standard de las reacciones a pH 7, es decir, a una concentracin de protones igual
a 10-7 M. Las energas libres as calculadas se representan por el smbolo G0'.
1.1.3.2 Para unas condiciones dadas, diferentes de las standard, podemos calcular el in-
cremento en energa libre de una reaccin concreta A B mediante la relacin
[2]
En la que R es la constante de los gases, T la temperatura absoluta, y [A] y [B] las

concentraciones de reactivo y producto, respectivamente.
1.1.3.3 De la relacin anterior podemos obtener otra muy interesante, mediante la cual
se calcula la constante de equilibrio de una reaccin a partir de la energa libre standard,
o viceversa. En el equilibrio, G = 0, y por tanto,
[3]
G0 = -RT ln(Keq)
En la que Keq es la constante de equilibrio de la reaccin, y R y T tienen el mismo

significado que en [2]. Esta relacin nos indica que (a) son espontneas aquellas reac-
ciones para las que G0 es negativa, o lo que es lo mismo, tienen una Keq mayor que la
unidad; y a la inversa, (b) no pueden producirse espontneamente reacciones para las
que G0 es positiva, o bien, cuya constante de equilibrio es menor que la unidad.
1.1.3.4 Por til que sea la magnitud energa libre standard, debemos tener muy en
cuenta que una cosa son las condiciones standard de una reaccin y otra muy distinta las
condiciones actuales en que se desarrolla la reaccin que nos interesa. As, por ejemplo,
podemos ver que una reaccin metablica cuyo clculo de energa libre standard nos
indica que tiene lugar espontneamente en un sentido, puede estar funcionando en el
metabolismo en sentido inverso porque las condiciones en el interior de la clula son
evidentemente distintas, y en particular las concentraciones de reactivos y productos.
32
1.1.3.5 Por ltimo, veamos la reaccin de combustin aerbica de la glucosa:
[4]
C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O G0 = -2858 kJ/mol
Segn las consideraciones anteriores, esta reaccin cursar espontneamente,

puesto que transcurre con un fuerte incremento negativo en energa libre. Sin embargo,
todos somos conscientes de que la glucosa en presencia de oxgeno (por ejemplo, dentro
de un frasco) es perfectamente estable y no arde espontneamente. Esto no est en
contradiccin con todo lo que acabamos de exponer, ya que la energa libre standard nos
informa acerca de la posibilidad de una reaccin, pero no nos da ninguna informacin
acerca de la dimensin tiempo de los fenmenos. Para tener una idea de la velocidad con
que transcurre una reaccin, no nos queda hoy por hoy ms remedio que ir al laboratorio
y estudiarla experimentalmente. Quiz los progresos en qumica cuntica y las actuales
facilidades de clculo nos permitan algn da hacer predicciones tericas de la velocidad;
entre tanto, solo las determinaciones empricas nos valen para algo, como veremos a
continuacin.
1.2. La velocidad de las reacciones qumicas
La velocidad en sentido qumico es la variacin de concentracin por unidad de

tiempo, o ms propiamente, la variacin instantnea en concentracin. Para una reac-
cin cualquiera A B, podemos medir su velocidad bien como (a) velocidad de desapa-
ricin del reactivo A, es decir, -d[A]/dt, o bien (b) velocidad de aparicin del producto
B, es decir, d[B]/dt.
La velocidad de una reaccin qumica depende de varios factores cuyo efecto po-
demos medir experimentalmente en el laboratorio. De estos factores tienen especial sig-
nificacin para nosotros la concentracin de reactivos, la temperatura y la presencia o
ausencia de catalizadores.
1.2.1. Velocidad y concentracin: orden de reaccin y molecularidad
Hacia 1850 Wilhemy estudi la reaccin de inversin de la sacarosa:
33
[5]
C12H22O11 (sacarosa) + H2O C6H12O6 (glucosa) + C6H12O6 (fructosa)
Olvidndonos por el momento de que el agua es un reactivo en esta reaccin, los

resultados que obtuvo eran compatibles con la siguiente ley: La velocidad de la reaccin es
directamente proporcional a la concentracin de sacarosa. Es decir,
[6]
-d[A]/dt = d[B]/dt = d[C]/dt = k[A]
Donde representamos como A la sacarosa, B la glucosa y C la fructosa; k repre-

senta la constante de proporcionalidad entre la velocidad y la concentracin. En general,
para una reaccin irreversible
[7]
aA + bB cC + dD
En donde A y B son los reactivos, C y D los productos, y a, b, c y d los respectivos

coeficientes estequiomtricos, la velocidad v (en ausencia de productos, es decir, en el
momento t = 0 de la reaccin) puede en general expresarse como
[8]
v = -d[A]/dt = -d[B]/dt = d[C]/dt = d[D]/dt = k[A]x[B]y
es decir, como el producto de las concentraciones de los reactivos elevadas a los

exponentes x e y (que no son necesariamente iguales a los coeficientes estequiomtricos
a y b).
1.2.1.1. Llamamos orden de reaccin a la suma de los exponentes que aparecen en la

ecuacin de velocidad. En el caso de la inversin de la sacarosa, el orden es de uno, o
reaccin de primer orden; en el caso de la reaccin [7], el orden es de (x+y). En este l-
timo caso podemos tambin decir que la reaccin es de orden x respecto a A, de orden y
respecto a B y de orden global (x+y).
Es importante sealar que el orden de reaccin es una magnitud experimental, es

decir, que la obtenemos a partir de mediciones en el laboratorio. En este sentido, debe-
34
mos tener presente que son posibles rdenes de reaccin no enteros; por ejemplo, en la
reaccin de descomposicin del acetaldehdo
[9]
CH3-CHO CH4 + CO
la experimentacin nos dice que tiene un orden de 3/2 con respecto al acetaldeh-
do, a pesar de que la observacin de la ecuacin estequiomtrica nos hara pensar en un
primer orden para esta reaccin.
De la misma manera, son posibles rdenes cero de reaccin. Ms adelante tendre-

mos ocasin de ver que en las reacciones catalizadas por enzimas, a altas concentraciones
de substrato, el orden es prcticamente de cero, es decir, la velocidad es independiente
de la concentracin del reactivo.
Volvamos a la ecuacin [7]. En ella se deca que la velocidad puede ser igual a
k[A] [B]y, y por tanto el orden de reaccin global igual a (x+y). Es importante insistir en
x
el hecho de que el orden de reaccin no es necesariamente igual a la suma de los coefi-

cientes estequiomtricos, ya que el orden de reaccin depende del mecanismo de la mis-
ma, y no de su estequiometra global. Supongamos una reaccin en la que dos molculas
de A reaccionen con una de B para dar el producto C:
[10]
2A + B C
Para esta reaccin son posibles varios mecanismos. Por ejemplo: en un caso pode-
mos suponer que las tres molculas colisionan simultneamente para producir C. En ese
caso la reaccin sera de orden 3. Ahora bien, si la reaccin transcurre de manera que en
primer lugar reacciona una molcula de A con una de B para dar un intermediario X y
este posteriormente reacciona con una nueva molcula de A para dar el producto C, el
orden ya no sera de 3, sino que estara comprendido entre 2 y 3. Y de esta misma manera
podemos pensar en muchos otros mecanismos para esta reaccin, cada uno de los cuales
nos dara un orden distinto. De hecho, rdenes de reaccin de 3 son muy raros en la
prctica; y superiores a 3 son realmente excepcionales.
1.2.1.2 Por las consideraciones anteriores debemos definir un nuevo concepto en la ci-
ntica de reacciones qumicas, la molecularidad. La molecularidad de una reaccin es el
35
nmero de molculas que participan en la configuracin del complejo activo (vase ms

adelante), y por tanto, es un nmero que necesariamente ha de ser entero, a diferencia
del orden de reaccin. Y as como este es una magnitud experimental, la molecularidad
lo es terica, ya que se debe definir para los pasos elementales del mecanismo. En el
ejemplo [10] vimos que podamos postular varios mecanismos. De los propuestos, en el
primero de ellos habra una sola reaccin de molecularidad 3; en el segundo, haba dos
reacciones sucesivas de molecularidad 2 cada una.
1.2.1.3 Particularmente importantes en el mundo biolgico son los procesos de primer

orden. Definamos estos procesos como los que obedecen a la relacin
[11]
-d[A]/dt = k[A]
esta relacin puede integrarse directamente y conduce a la expresin
[12]
At = A0exp(-kt)
en la que At es la cantidad de A que queda a tiempo t; A0 es la cantidad inicial de

A; k la constante de primer orden, y t el tiempo. Si tomamos logaritmos naturales de esta
expresin llegamos a
[13]
ln At = ln A0 - kt
lo cual indica que si representamos el logaritmo de A en funcin del tiempo, ob-

tendremos una lnea recta de pendiente -k y cuyo corte en ordenadas ser igual al logarit-
mo de A0. Por otra parte, se define en estos procesos otra importante magnitud derivada:
el semiperodo o tiempo en que A queda reducido a A/2. No es difcil deducir de [13] que
el semiperodo t1/2 es igual a
[14]
t1/2 = ln2/k
36
Ejemplos:
(a) La desintegracin de un elemento radioactivo es un proceso de primer orden.

Por tanto, si conocemos la constante k (que en este caso se llama constante de desinte-
gracin) y la actividad total A, podremos conocer la actividad At en cualquier tiempo
t pasado o futuro. En este principio se basan los mtodos de datacin radioqumica de
muestras biolgicas, midiendo la cantidad de 14C que permanece en una muestra y cal-
culando el perodo de tiempo que ha tenido que transcurrir a partir de una proporcin
de 14C igual a la de los seres vivientes.
(b) Otro mtodo de datacin de muestras biolgicas consiste en la medicin de la

relacin D-aspartato/L-aspartato. Teniendo en cuenta que en un ser viviente todo el ci-
do asprtico presente lo est en forma L-, y que el D-aspartato se forma por racemizacin
del ismero L- despus de la muerte, siendo este un proceso de primer orden, conocida
dicha relacin en la muestra se puede calcular el perodo aproximado de muerte de la
muestra biolgica.
(c) La inactivacin de enzimas por agentes fsicos o qumicos es muy a menudo

un proceso de primer orden. As, en algunos procesos patolgicos, como el infarto de
miocardio, la destruccin de las clulas hace que se vierta su contenido a la circulacin
sangunea. Entre los componentes celulares vertidos a la sangre se encuentran muchas
enzimas; alguna de ellas, como la creatin kinasa, nos sirven para diagnosticar la presencia
de un infarto. Teniendo en cuenta que a lo largo del tiempo la actividad enzimtica en la
sangre va disminuyendo segn un proceso de primer orden, a partir de mediciones seria-
das del enzima podemos calcular la cantidad inicial vertida a la sangre, y de esta manera
podemos tener una idea de la extensin y gravedad del infarto.
(d) La inactivacin por calor de algunas enzimas, como la fosfatasa alcalina, sigue
un proceso de primer orden. Esta enzima se emplea como indicador de enfermedades
seas o del rbol biliar, entre otras; y las enzimas de distintas procedencias se pueden
distinguir por su estabilidad trmica. As, el semiperodo de inactivacin de la fosfatasa
alcalina de origen seo a 56 C es de dos minutos, mientras que el de la de procedencia
heptica es de 7 minutos.
(e) La desaparicin de un componente (por ejemplo, un medicamento) de cual-

quiera de los compartimentos lquidos del organismo sigue muchas veces una cintica de
primer orden (y a veces tambin de rdenes superiores). Teniendo presente este hecho,
37
podemos hacer un diseo racional de las pautas teraputicas para que la concentracin
de medicamento se mantenga en niveles ptimos.
1.2.1.4 La ecuacin [5] representaba la inversin de la sacarosa. En realidad se trata de

una reaccin bimolecular, en la que una molcula de agua ataca al enlace glicosdico
constituido entre glucosa y fructosa. Sin embargo, las mediciones experimentales nos
muestran que aparentemente es una reaccin de primer orden. Ello es debido a que
siendo uno de los reactivos el agua y teniendo lugar la reaccin en solucin acuosa, el
agua aparece a una concentracin muy elevada (55.5 M) y en la prctica constante, ya
que es mucho mayor que la de reactivos y productos. Este tipo de procesos (de hecho,
todas las reacciones de hidrlisis en el medio biolgico) se comportan como si fueran
de primer orden a pesar de ser bimoleculares. Por ello reciben el nombre de procesos de
pseudo primer orden.
1.2.2. Velocidad y temperatura: concepto de energa de activacin
En 1889, Arrhenius propuso que la dependencia de la constante de velocidad k

en funcin de la temperatura viene dada por la expresin
[15]
k = A exp(-Ea/RT)
en la que R es la constante de los gases, T la temperatura absoluta, A el llamado

factor de frecuencia y Ea la energa de activacin. Tomando logaritmos en la expresin [15]
llegamos a
[16]
ln k = -Ea/RT + ln A
En la que vemos que una representacin del logaritmo de la constante de velocidad

en funcin del recproco de la temperatura absoluta 1/T nos da una recta cuya pendiente
es -Ea/R y su corte en ordenadas ln A (figura 1.1) Por tanto, podemos calcular la energa
de activacin midiendo el valor de la constante de velocidad en funcin del recproco de
la temperatura y representando los datos conforme a la ecuacin [16], lo que se conoce
como representacin de Arrhenius.
38
Figura 1.1
Podemos dar una interpretacin de esta relacin de la siguiente forma: la tempe-

ratura es una medida de la energa cintica media de las molculas de un reactivo. Para
una temperatura concreta T, las energas de las molculas se distribuyen conforme a
una ley de probabilidad no muy diferente de las que rigen para fenmenos aleatorios;
habr un cierto nmero de molculas con energa igual a la media, otras con energas
superiores y otras con energas inferiores. El factor exp(-Ea/RT) (factor de Boltzmann)
es precisamente la fraccin de molculas con una energa igual o mayor a la requerida
para reaccionar. El factor de frecuencia, A, por su parte, tiene las mismas dimensiones
que la constante de velocidad k, y es proporcional a la frecuencia de colisiones entre las
molculas, de ah su nombre.
La ecuacin de Arrhenius nos indica que las molculas reactivas deben alcanzar
una energa crtica Ea antes de que puedan reaccionar. La figura 1.2, por su parte, nos
muestra grficamente el concepto de energa de activacin como la barrera que debe
superarse para alcanzar el complejo activo, de energa mxima, y a partir de l, caer del
lado de los productos. Por otra parte, en esta grfica se ve que el intercambio global de
energa, E no depende del camino que siga la reaccin, sino nicamente de los estados
inicial y final.
39
La ecuacin [16] nos demuestra que la constante de velocidad se hace mayor a

medida que disminuye la energa de activacin. Como veremos, la accin de los cataliza-
dores es precisamente esta: disminuir la energa de activacin gracias a situar los reactivos
en un entorno fsicoqumico ms favorable a su interaccin.
Figura 1.2
Las representaciones de Arrhenius no se utilizan solamente en el campo de la

qumicofsica. Una descripcin rigurosa del efecto de la temperatura sobre cualquier
fenmeno biolgico debe hacerse en base a este tipo de representaciones. Por ejemplo,
el estudio del efecto de la temperatura sobre la funcin cardiovascular en animales poi-
quilotermos, como los reptiles, se hace mediante representaciones de Arrhenius. Puede
observarse que hay variables, como la frecuencia cardaca, que dentro de ciertos lmites
siguen una relacin similar a la ecuacin [1.16].
A veces se emplea el ndice Q10; si a es el valor de una variable a la temperatura T,

y a el valor de la misma a la temperatura T+10, el Q10 es el cociente a/a. Un valor gran-
de de este ndice denota una fuerte dependencia de la temperatura. Una regla emprica
aproximada para las reacciones qumicas en general es que su Q10 es aproximadamente
de 2 (pero como toda regla emprica debe utilizarse con suma cautela).
40
1.2.3. Catlisis
Las velocidades de reaccin se ven alteradas por la presencia de catalizadores. El

trmino catlisis fue propuesto por Berzelius en 1835 para describir la accin de sustan-
cias que por su mera presencia inducen reacciones qumicas que no tendran normalmente
lugar en su ausencia. Hay una serie de ideas centrales respecto al fenmeno de catlisis:
1.2.3.1. Los catalizadores no entran en la ecuacin estequiomtrica global
Esto quiere decir que, aun cuando participan en la reaccin, los catalizadores no
sufren cambio alguno por efecto de la misma, o si lo sufren, en el transcurso de la reac-
cin vuelven a su estado original; de esta forma, en la ecuacin estequiomtrica global
apareceran iguales tanto en el trmino de la derecha como en el de la izquierda, por lo
que pueden ser eliminados de la misma.
Una reaccin cualquiera A B catalizada por X puede representarse como
[17]
A+XB+X
con los pertinentes pasos intermedios, si los hubiere; por ejemplo,
[18]
A + X AY BX B + X
Por esta razn, las reacciones catalizadas siempre pueden representarse como un
proceso cclico (figura 1.3). Este hecho tiene particular importancia en el metabolismo,
en el que las vas cclicas (como el ciclo de Krebs, por ejemplo), se comportan cataltica-
mente.
41
Figura 1.3
1.2.3.2. Los catalizadores no alteran la posicin de equilibrio de la reaccin
Antes hemos visto la relacin entre la energa libre standard G0 y la constante de

equilibrio de una reaccin, Keq. Siendo la energa libre una magnitud termodinmica de
estado, su variacin depende nicamente de los estados inicial y final, y no del camino
seguido en la transformacin. Como la constante de equilibrio es funcin de la energa
libre standard, podemos decir lo mismo de la posicin de equilibrio. Por lo tanto, esta
posicin es independiente del camino seguido por la reaccin, con o sin catalizador. Lo
que altera el catalizador es la velocidad de la reaccin. Ostwald demostr que un catali-
zador que alterara la posicin de equilibrio de una reaccin entrara en contradiccin con
el Primer Principio de la Termodinmica.
Por otra parte, dado que un catalizador no modifica la posicin de equilibrio de

una reaccin, pero altera su velocidad, debemos concluir que los catalizadores alteran
tanto la reaccin directa como la inversa, y en la misma medida.
42
Sea la reaccin reversible
[19]
en la que kd es la constante de velocidad directa y ki la inversa. En este caso, Keq =

ki/kd; si Keq no se modifica por la accin del catalizador, pero aumenta kd, tiene necesa-
riamente que aumentar ki.
1.2.3.3. Los catalizadores modifican la energa de activacin
Segn la teora de las colisiones, para que se produzca una reaccin entre tomos
o molculas, estas deben primero colisionar entre s. De esta forma se explica que a una
mayor concentracin de reactivo se acelere la reaccin. Ahora bien, no todas las colisio-
nes son eficaces; para que lo sean se necesita que las molculas reaccionantes posean una
cierta energa cintica y, adems, que las molculas entren en colisin con la orientacin
precisa.
Los catalizadores permiten un nivel energtico ms bajo, bien sea por introdu-
cir un nuevo agente en la reaccin que posteriormente se regenera (por ejemplo, en la
catlisis especfica cido-base), o bien por permitir el encuentro de las molculas en la
orientacin adecuada (caso de la catlisis heterognea). En todo caso, la accin del cata-
lizador se traduce en una disminucin de la energa de activacin, haciendo ms grande
el factor de Boltzmann y, por tanto, aumentando el nmero de molculas con capacidad
de reaccionar en unas condiciones dadas (figura 1.4).
43
Figura 1.4
Una reaccin ampliamente estudiada y de gran importancia industrial es la sntesis

de amonaco por el proceso Haber, en el que se hace reaccionar nitrgeno e hidrgeno en
fase gaseosa para producir amonaco:
[20]
N2 + 3H2 2NH3 G0 = -91.83 kJ/mol
A pesar del valor negativo de G0, que nos indica que el equilibrio favorecer la
formacin de amonaco, la reaccin es extraordinariamente lenta, y para que se lleve a
cabo se necesitan temperaturas de 450 C y presiones que van de 200 a 1000 atmsferas.
El amonaco as obtenido se utiliza ampliamente en la fabricacin de fertilizantes, explo-
sivos, fibras sintticas, etc., de tal manera que la cantidad total de amonaco producido
por la industria qumica viene a ser de unas 5107 Tm/ao.
Los seres vivos, en concreto las llamadas bacterias fijadoras de nitrgeno, realizan
un proceso que globalmente es anlogo al de Haber, fijando el nitrgeno atmosfrico
a compuestos amnicos como los aminocidos, pero en una magnitud global mucho
44
mayor; por esta va se incorporan aproximadamente 1.75108 Tm/ao. Lo realmente

notable es que este proceso tiene lugar a presin atmosfrica y a la temperatura del suelo,
que es donde residen las bacterias capaces de realizar esta funcin (gneros Rhizobium,
Azotobacter, Clostridium, etc.). Estas cifras nos dan idea de la extremada eficiencia de los
catalizadores biolgicos, capaces de reducir la energa de activacin hasta hacer posible
un proceso a temperatura y presin ambientales que de otra forma (e incluso en presen-
cia de catalizadores metlicos) requiere unas condiciones mucho ms extremas, y por
tanto, consumidoras de energa.
1.2.3.4. Catlisis homognea y heterognea
Se suele distinguir entre catlisis homognea, en la cual toda la reaccin tiene lu-
gar en la misma fase fsicoqumica, y catlisis heterognea, en la cual la reaccin ocurre
en una interfase (lquido-slido, gas-slido, gas-lquido), tambin llamada catlisis de
superficie. La catlisis homognea de mayor inters para nosotros es la que tiene lugar en
solucin, y particularmente la catlisis general cido-base o la catlisis especfica cido-base,
que estudiaremos con mayor detenimiento en un captulo posterior.
La catlisis heterognea tiene lugar en superficies, normalmente de partculas s-

lidas finamente divididas (con lo que se incrementa la superficie activa del catalizador),
mediante la adsorcin de molculas a dicha superficie. De esta manera los reactivos se
encuentran a una concentracin local mucho mayor en la superficie del catalizador y en
orientaciones ptimas para producir la reaccin. Aun cuando no podemos discutir con
la extensin adecuada este tema, es importante sealar que el primer tratamiento cuan-
titativo sobre la adsorcin a slidos fue el publicado por Langmuir en 1916; segn este
autor, la adsorcin de gases a slidos sigue la relacin
[21]
en donde es la fraccin de sitios en el slido ocupados por el gas, es decir, el

cociente (n de sitios ocupados/n de sitios totales), b es una constante emprica (deter-
minada a partir de medidas experimentales), y P es la presin parcial del gas (equivalente
a lo que en una solucin sera su concentracin). Al estar definida para una temperatura
dada, la relacin [21] recibe el nombre de isoterma de adsorcin de Langmuir.
45
No es exagerado afirmar que esta relacin es una de las ms importantes en el cam-

po de la qumica biolgica. Como veremos, en la catlisis enzimtica hay componentes
de catlisis homognea (general y especfica cido-base, por ejemplo), y de catlisis hete-
rognea (puesto que la reaccin se lleva a cabo en una zona concreta de la superficie del
enzima). Por esta ltima razn, las mejores descripciones cuantitativas de la catlisis en-
zimtica se hacen en base a expresiones anlogas a la isoterma de adsorcin de Langmuir
(por ejemplo, la ecuacin de Michaelis-Menten):
[22]
que relaciona la velocidad de una reaccin enzimtica, v, con la concentracin de

substrato, s, y dos constantes empricas, Km y Vmax, y que estudiaremos muy detenida-
mente en los siguientes captulos. Obsrvese que al dividir ambos miembros de la ecua-
cin [22] por Vmax, obtenemos
[23]
dividiendo numerador y denominador por Km, y llamando b = 1/Km,
[24]
anloga a la isoterma de adsorcin de Langmuir en [21].
46
CAPTULO 2
CATLISIS ENZIMTICA: TRMINOS, CONCEPTOS Y

CARACTERSTICAS GENERALES
Los seres vivientes se caracterizan por llevar a cabo varios miles de reacciones qu-
micas diferentes, a cuyo conjunto damos el nombre de metabolismo. Estas reacciones
no tienen lugar aleatoriamente; en lneas generales, los fines que persiguen son los si-
guientes: (a) proveer a la clula de energa en una forma directamente aprovechable; (b)
sintetizar los elementos plsticos necesarios en la estructura celular; (c) generar y procesar
seales informativas a efectos regulatorios y adaptativos; y (d) propagar y mantener la
informacin gentica propia de la especie. La mera enumeracin de estos fines nos da
una idea de la complejidad de los sistemas bioqumicos, y de las complicadas reagrupa-
ciones moleculares que tienen lugar en el metabolismo. Todas las reacciones que en un
momento dado tienen lugar en la clula cursan, como es lgico, en el sentido de un in-
cremento negativo en energa libre en la forma definida por la ecuacin 1.2 del captulo
anterior. Ahora bien, la gran mayora de ellas seran extremadamente lentas para el ritmo
temporal propio de los seres vivientes; por eso todas ellas, o al menos la gran mayora,
son reacciones catalizadas, y llamamos enzimas a estos catalizadores. Pero a diferencia de
otros catalizadores que emplea la Qumica, las enzimas tienen la particularidad de ser
especficas para cada reaccin. No sera rigurosamente exacto, pero tampoco muy aleja-
do de la realidad, afirmar que en el metabolismo hay tantas enzimas como reacciones;
en otras palabras, cada reaccin tiene su enzima especfica. Uno de los criterios exigidos
cuando se propone tericamente una va metablica estriba en el hallazgo de una enzima
especfica para cada uno de los pasos postulados.
En este captulo vamos a tratar de ofrecer una idea de las caractersticas ms rele-
vantes de la catlisis enzimtica, como la naturaleza proteica de las enzimas, su especifici-
dad y su eficiencia como catalizadores. Antes de entrar a estos apartados, vamos a definir
algunos trminos comnmente empleados en Enzimologa, y de los que se har amplio
uso en el presente estudio.
2.1. Conceptos y trminos
2.1.1. Enzima
Siguiendo la definicin de Dixon y Webb, llamamos enzima a una protena do-

tada de actividad cataltica debida a su capacidad de activacin especfica. Son varios los
puntos que merecen comentario en esta definicin.
En primer lugar, y ya desde el principio, hacemos alusin al carcter proteico de

las enzimas. Este concepto predomin en la Bioqumica hasta que en la dcada de los 80
48
del pasado siglo se descubrieron RNAs con actividad cataltica (ribozimas). No obstante,
casi todas las enzimas conocidas son protenas, y en este curso partiremos de esa base. En
la mayora de los casos, la actividad enzimtica se debe a los grupos qumicos propios de
las protenas. Esto no excluye que en determinadas ocasiones (a) la actividad cataltica
est ligada a grupos no proteicos asociados a la enzima; o bien (b) el caso citado de las
ribozimas, molculas de RNA dotadas de actividad cataltica. Pero estas excepciones no
contradicen en absoluto el principio antes citado. Ms adelante se discutir con mayor
profundidad este concepto.
Al hablar de capacidad de activacin estamos dando a entender la accin pro-

pia de todos los catalizadores, esto es, la disminucin en la energa de activacin. Pero
tambin aludimos al modo de accin concreto de las enzimas. Como veremos, la accin
enzimtica procede gracias a la formacin de un complejo enzima-substrato, que no hay
que confundir con el complejo activo de la cintica qumica; el complejo enzima-subs-
trato (complejo ES) es una entidad bastante ms estable, y representa un mnimo local
de energa potencial en la coordenada de reaccin (figura 2.1), a diferencia del complejo
activo, que es un mximo.
Figura 2.1
49
Por ltimo, el adjetivo especfica se refiere a una caracterstica general y propia

de todas las enzimas, consistente en su capacidad para catalizar solo una o unas pocas
reacciones similares (a diferencia de los catalizadores convencionales) y que se tratar ms
adelante con mayor detenimiento. Su generalidad es motivo suficiente para que entre en
la definicin de enzima.
2.1.2. Substrato
Denominamos substrato a la sustancia sobre la que acta la enzima, y a quien se

refiere por otra parte la especificidad de la misma. Tngase en cuenta que la gran mayora
de las enzimas tienen ms de un substrato; las reacciones estrictamente monosubstrato
son la excepcin. Igualmente, el substrato entra a formar parte del complejo ES al inte-
raccionar con los grupos activos de la enzima.
2.1.3. Centro activo
Es la regin de la molcula de enzima que fija el substrato y contiene los grupos

qumicos que lo transforman. Ntese que el concepto de centro activo indica un ca-
rcter heterogneo en la catlisis enzimtica, en el sentido de que el substrato es fijado
a la molcula de enzima en un sitio especfico. Como veremos, la razn molecular de
la especificidad radica en la configuracin tridimensional, altamente precisa, del centro
activo. En lneas generales, existe un solo centro activo por molcula de enzima o pro-
tmero (vase ms adelante). Conviene pensar en el centro activo como realizando dos
funciones: una, la fijacin especfica del substrato; otra, su transformacin. En muchos
casos estas funciones no son estrictamente disociables; aun as, nuestra idea de la catlisis
enzimtica se ve facilitada por esta distincin.
Hoy da disponemos de las estructuras tridimensionales de muchas enzimas. Muy

a menudo se logra la cocristalizacin de la enzima con su substrato o un anlogo del mis-
mo. En la figura 2.2 se presenta la estructura de la ribonucleasa pancretica unida a un
anlogo de substrato, un oligodesoxinucletido (que se fija a la enzima pero no reacciona
por no disponer de un 2-OH).
50
Figura 2.2
2.1.4. Protmero
Es este un trmino introducido por Monod, Wyman y Changeux. Alude a que al

poseer estructura cuaternaria la mayor parte de las enzimas, a veces de una gran comple-
jidad, llamamos protmero a la mnima parte de la molcula capaz de exhibir actividad
enzimtica, o lo que es lo mismo, la parte de la molcula que configura un nico centro
activo. Protmero y subunidad son, en ocasiones, equivalentes: as, la gliceraldehdo-
3-fosfato dehidrogenasa de msculo de conejo posee cuatro subunidades idnticas, todas
ellas activas. Pero en otras ocasiones, como en la aspartato transcarbamilasa, un prot-
mero consta de ms de una subunidad; la enzima necesita dos subunidades tipo C (la
estructura cuaternaria es C6R6) para configurar un centro activo. Las asociaciones de
protmeros y subunidades tienen un importante papel en los fenmenos de regulacin
enzimtica.
2.1.5. Actividad enzimtica
Entendemos por actividad enzimtica la velocidad con que transcurre una reaccin
catalizada por una enzima. Ntese que excluimos cualquier otro significado que pueda
51
atribuirse al trmino actividad; una enzima muy activa, en el presente estudio, significa
que est catalizando muy rpidamente una reaccin. La velocidad de una reaccin en-
zimtica es en todo momento directamente proporcional a la concentracin de enzima;
por tanto, la actividad es una medida de la concentracin de enzima.
La actividad enzimtica se expresa en unidades de velocidad (concentracin/tiem-

po). En principio se utilizaban unidades arbitrarias, derivadas del mtodo de ensayo, y a
la unidad se le sola dar el nombre del autor del mtodo. As se hablaba de unidades Bo-
dansky, unidades Karmen, unidades Rosalki, etc. Posteriormente se normaliz la medida
de la actividad enzimtica en (a) la Unidad Internacional y (b) el katal.
La Unidad Internacional (UI) es la actividad enzimtica que transforma un mol

de substrato por minuto a 25 C y en condiciones ptimas de pH. Esta unidad fue la
recomendada por la I.U.B. hasta que con la adopcin del sistema SI de unidades fue
necesario definir el katal.
El katal (kat) es la actividad enzimtica que transforma un mol de substrato por

segundo, sin referirse a ningn otro tipo de condicin. Puede observarse que el katal es
una unidad muchsimo ms grande que la UI (1 kat = 6.107 UI). Por esa razn se prefie-
ren submltiplos del mismo, como el kat o el nkat.
Es importante insistir en la equivalencia actividad - concentracin. Ya hemos te-

nido ocasin de comentar que en muchas circunstancias patolgicas el contenido celular
de los tejidos daados se vierte a la sangre, y por esa razn podemos estimar la magnitud
del dao midiendo la cantidad de una enzima marcadora presente en el suero. Resulta
a veces sorprendente que esta cantidad sea medida como UI/L o kat/L. Pero dada
la proporcionalidad directa entre actividad y concentracin enzimtica, tan vlida es esta
forma de expresin como la de g/L o mg/L, por ejemplo.
2.1.6. Actividad especfica, actividad molecular, nmero de recambio
Se define la actividad especfica como la actividad por unidad de masa de protena

en la preparacin enzimtica. Es este un trmino ampliamente utilizado en la purifica-
cin de enzimas. En una preparacin cruda de enzima, existe una gran cantidad de pro-
tena contaminante, que no tiene nada que ver con la enzima que tratamos de purificar.
A medida que la purificacin avanza, vamos eliminando la protena contaminante. Si la
52
purificacin va bien, se conserva la actividad enzimtica pero aumenta la actividad espe-

cfica. Es obvio que la actividad especfica a lo largo de una purificacin llega a un lmite
superior correspondiente a la actividad intrnseca de la enzima pura.
Cuando conocemos el peso molecular de la enzima, podemos medir la actividad

molecular como actividad enzimtica por mol de enzima. Si conocemos el nmero de
centros activos por molcula de enzima, podremos expresar la actividad del centro cata-
ltico como moles de substrato transformados por mol de centro activo y por segundo.
Esta ltima medida de actividad era conocida tambin como nmero de recambio o n-
mero de turnover.
2.1.7. Inhibidor
Es el agente cuya presencia en la reaccin hace disminuir la actividad enzimtica.

Existen inhibidores que alteran irreversiblemente la estructura de la enzima y su
efecto, por tanto, no desaparece al eliminar el inhibidor. Son los llamados inhibidores
irreversibles. Otros, por el contrario, se fijan reversiblemente a la molcula enzimtica y
su efecto desaparece cuando son eliminados: son los inhibidores reversibles. El estudio de
la inhibicin enzimtica es de suma importancia, y le dedicaremos todo un captulo.
2.1.8. Activador
Es el agente cuya presencia en la reaccin hace que aumente la actividad enzimti-

ca. El fenmeno de activacin es un tanto ms ambiguo que el de inhibicin, ya que en
algunas ocasiones se trata de un componente cuya presencia en la reaccin es obligatoria,
como por ejemplo los activadores metlicos, mientras que en otras es un efector de algu-
na regulacin fisiolgica, o incluso un agente capaz de restaurar la estructura nativa de la
protena enzimtica, perdida en parte por las maniobras experimentales de purificacin
y ensayo (caso de los compuestos -SH como mercaptoetanol y ditiotreitol).
2.1.9. Coenzima
Es un componente adicional, aparte de enzima y substrato, que es necesario para

la reaccin enzimtica, y que tiene la particularidad de participar en muchas reacciones
enzimticas diferentes (aunque generalmente del mismo tipo). Algunas de ellas (como
los nucletidos flavnicos, figura 2.3) suelen volver al estado original al trmino del ciclo
53
reactivo, y hay autores que reservan el trmino coenzima para estas. Otras, por el con-
trario, aparecen modificadas al trmino de la reaccin (como los nucletidos de nicoti-
namida, figura 2.4) y en la misma lnea sera preferible el trmino de cosubstrato; ambos
tipos de agentes, en conjunto, seran los cofactores. En el presente trabajo, sin embargo,
no se har esta distincin terminolgica, y utilizaremos indistintamente estos trminos.
Figura 2.3
Figura 2.4
54
Ya desde aqu es interesante sealar la relacin que existe entre los trminos de
coenzima y vitamina. Muchas coenzimas tienen estructuras qumicas complejas que no
pueden ser sintetizadas por nuestro organismo. Por lo general, no se trata de toda la
molcula, sino tan solo de una parte. Esta porcin no sintetizable debe necesariamente
ingresar en el organismo con la dieta, y por ello son factores obligatorios en la alimen-
tacin: muchos de ellos son lo que llamamos vitaminas. Ahora bien, conviene no con-
fundir los trminos: ni todas las coenzimas son vitaminas, ni todas las vitaminas forman
parte de coenzimas, al menos en el sentido restringido en el que han sido definidos aqu.
2.1.10. Isoenzima
Las grandes vas metablicas son comunes a todos los seres vivos, y se llevan a
cabo gracias a enzimas que catalizan la misma reaccin aunque tengan estructuras mole-
culares diferentes. Pero este fenmeno no se da solamente entre diferentes especies, sino
entre diferentes rganos y tejidos del mismo individuo. As, por ejemplo, la hexokinasa
(ATP:D-hexosa fosfotransferasa), enzima que permite la entrada de glucosa en el meta-
bolismo a travs de su transformacin en glucosa-6-fosfato, presenta diferentes formas
segn el tejido de procedencia: hexokinasa cerebral, hexokinasa muscular, hexokinasa
heptica, etc., cada una de ellas con diferente estructura molecular.
2.2. Naturaleza qumica de las enzimas
Hoy da sabemos por un impresionante cmulo de evidencia que la gran mayo-

ra de enzimas son protenas. Este concepto, que hoy se da por hecho, ha recibido sin
embargo a lo largo de muchos aos, hasta aproximadamente la mitad del siglo pasado,
mltiples ataques que curiosamente se han basado en la extremada eficiencia cataltica
de las enzimas. As, durante las primeras dcadas del siglo, no se dispona de mtodos
suficientemente sensibles para la deteccin de las minsculas concentraciones proteicas
que se dan en algunas preparaciones enzimticas purificadas. Por tanto, al persistir en
ellas sin embargo una apreciable actividad enzimtica, poda ser lgico pensar que la ac-
tividad cataltica no estaba ligada a las protenas; en todo caso, estas podran ser un mero
soporte de la actividad enzimtica. Este hecho, unido al estudio qumico de muchos
enzimas en los que el centro activo estaba constituido por un grupo prosttico (flavnico
o porfirnico, por ejemplo), y por tanto, no proteico, eran los principales argumentos
que se esgriman contra el concepto de la naturaleza proteica de las enzimas.
Sin embargo, dicho concepto ha prevalecido de tal manera que hoy nadie duda de
la naturaleza protenica de las enzimas. El fallo en le deteccin de protena era debido,
55
como se dijo, a la inadecuacin de los mtodos cuantitativos para detectar cantidades

muy pequeas de protena, junto con las impresionantes cifras de actividad molecular de
algunas enzimas. En cuanto a los grupos prostticos detectados en algunos enzimas, hoy
da sabemos que son efectivamente parte del centro activo enzimtico, pero su reactivi-
dad y su funcin biolgica, en definitiva, se deben al entorno proteico de la apoenzima
(cuando una enzima presenta un grupo prosttico, denominamos holoenzima a la enzi-
ma completa, y apoenzima a la parte especficamente proteica de la misma).
Repasaremos a continuacin las principales lneas de evidencia que nos llevan a

afirmar categricamente la naturaleza proteica de las enzimas.
1. Una de las primeras observaciones a este respecto fue que la actividad enzi-
mtica puede ser eliminada de una preparacin mediante tratamiento de la misma con
enzimas proteolticas, como pepsina, tripsina o quimotripsina.
2. Anlogamente, la actividad enzimtica desaparece de las muestras biolgicas

con aquellos tratamientos capaces de desnaturalizar las protenas: calor, interfases, sol-
ventes orgnicos, reactivos de grupos -SH, urea, guanidina, extremos de pH, etc.
3. Los mismos procedimientos que se emplean en la purificacin y aislamiento de

protenas son los adecuados para la purificacin de enzimas; por ejemplo, precipitacin
isoelctrica, precipitacin salina, cromatografa y electroforesis. En estadios avanzados de
purificacin, por ejemplo, la electroforesis de protenas llega a presentar una nica banda
a partir de preparaciones enzimticas purificadas.
4. El peso molecular de las enzimas, en aquellos casos en que puede ser determina-
do, es compatible con una estructura proteica.
5. Un importantsimo avance en la determinacin de la naturaleza qumica de las

enzimas fue la cristalizacin de la ureasa por Sumner en 1926. A falta de otros mtodos
ms avanzados para definir criterios de pureza, durante mucho tiempo se consider que
la obtencin de un compuesto en estado cristalino era la mxima purificacin posible.
Una enzima en estado cristalino, y dando todas las reacciones propias de una protena,
constituy una importante evidencia a favor de la naturaleza proteica de las enzimas. Hoy
sabemos que los primeros cristales de Sumner contenan muchas impurezas. No obstante,
su trabajo fue seguido por los estudios de Northrop y Kunitz sobre la cristalizacin de
56
enzimas proteolticas digestivas. Hoy da se cuentan por centenares las enzimas que han
podido ser purificadas hasta la cristalizacin; todas ellas son protenas.
6. La prueba definitiva de estructura que se exige en Qumica es la sntesis a partir

de la estructura postulada. Pues bien, esto se consigui por vez primera en el caso de la
ribonucleasa pancretica. Independientemente, los grupos de Merrifield, en la Universi-
dad Rockefeller, y de Denkewalter y Hirschmann en la Compaa Merck, consiguieron
la sntesis por medios qumicos de esta enzima. Las propiedades de la enzima sinttica,
incluidas por supuesto las catalticas, son idnticas a la enzima natural.
7. Al aplicar a enzimas cristalinas los mtodos de difraccin de rayos X para el

conocimiento de su estructura terciaria, no solamente se ha comprobado su estructura
proteica. Los estudios de Phillips sobre la lisozima de clara de huevo, pioneros en este
campo, pudieron determinar incluso la disposicin molecular de los grupos enzimticos
en relacin a la estructura molecular del substrato, comprobando la complementariedad
estereoespecfica entre unos y otros y el papel determinante de algunos residuos en la
accin cataltica. Se dispone hoy da de estudios similares con muchas otras enzimas; los
avances en cristalografa de rayos X han llegado al punto de que la autntica dificultad
de los mismos sea lograr la cocristalizacin de enzima y ligando (substrato o anlogo
estructural del mismo).
2.3. La especificidad de las enzimas
La caracterstica diferencial ms llamativa de las enzimas en relacin a los catali-

zadores inorgnicos radica en su especificidad. La mayor parte de las enzimas son ni-
camente capaces de actuar sobre un substrato dado o a lo sumo sobre molculas muy
parecidas al mismo. No obstante, existen grados diferentes de especificidad, que van
desde la absoluta de aquellas enzimas que solo pueden actuar sobre un nico substrato
a la relativa de aquellas otras que reconocen a lo sumo un determinado grupo qumico,
como ster o amida. Veremos a continuacin algunos datos referentes a la especificidad
enzimtica.
2.3.1. Especificidad sobre estereoismeros
Cuando el substrato tiene un centro de asimetra, la especificidad suele ser absolu-

ta si el grupo atacado est sobre el carbono asimtrico. As, las reacciones de oxidacin de
57
los hidroxicidos que contienen el grupo -CHOH- suelen ser absolutamente especficas
hacia el ismero L- o hacia el D-, no actuando la enzima en absoluto sobre el enanti-
mero. Si el carbono asimtrico est relativamente lejos del grupo atacado en la reaccin
enzimtica, la especificidad ya no es tan absoluta y puede haber un cierto grado de reac-
tividad por parte del enantimero; en otras ocasiones este se comporta como inhibidor
competitivo.
Por otra parte, las enzimas son capaces de llevar a cabo sntesis asimtrica, es decir,
de generar un solo enantimero a partir de un grupo simtrico. Por ejemplo, en la reduc-
cin del piruvato llevada a cabo por la lactato dehidrogenasa, encontramos que solo se
produce L-lactato (en el caso de la enzima de fuentes animales) o D-lactato (en la enzima
procedente de bacterias). Esta reaccin se presenta en la figura 2.4.
La especificidad suele ser absoluta asimismo en el caso de ismeros geomtricos

(ismeros cis-trans) cuando el grupo atacado es el que porta el doble enlace. Un caso par-
ticularmente llamativo es el de la fumarato hidratasa, que presenta especificidad cis-trans
absoluta hacia el fumarato y especificidad ptica absoluta hacia el L-malato (figura 2.5).
Figura 2.5
2.3.2. Proquiralidad
Las enzimas son capaces de diferenciar grupos iguales en molculas simtricas, lo

cual es imposible por medios qumicos convencionales. As, en la molcula de citrato,
58
la enzima aconitasa ataca al grupo -CH2-COOH que procede de oxalacetato, mientras

que no acta sobre el grupo idntico procedente de acetato (vase figura 2.6).
Ogston ha explicado el fenmeno de proquiralidad en el sentido expresado en la

figura 2.7: cuando un carbono C est sustituido por dos grupos x, un grupo y y un grupo
z (es decir, cuando su estructura puede representarse como Cx2yz), caben dos formas de
interaccin con el centro activo de la enzima en el caso en que sean necesarios tres de los
cuatro grupos para la fijacin. Solo una ser la forma correcta, y de ese modo la enzima
reconocer como distintos los dos grupos idnticos.
Figura 2.6
59
Figura 2.7
2.3.3. Especificidad relativa
Algunas enzimas, particularmente esterasas, fosfatasas y peptidasas tienen una

especificidad muy dbil hacia sus substratos. As, las enzimas citadas nicamente
reconocen en sus substratos los grupos -CO-O- (esterasas), -CO-NH- (peptidasas) o
-CH2-O-PO3H2 (fosfatasas). No obstante, existen algunas enzimas de estos tres grupos
que presentan especificidad absoluta hacia sus substratos.
2.3.4. Especificidad en enzimas multisubstrato
Cuando la enzima cataliza una reaccin multisubstrato (lo cual es ms regla que
excepcin en Bioqumica), la especificidad suele ser absoluta hacia todos ellos. Esto ocu-
rre particularmente con las deshidrogenasas y las kinasas (bisubstrato) y las sintetasas (tri-
substrato). Como es lgico, existen tambin excepciones a esta regla. La alcohol deshi-
drogenasa es completamente especfica hacia uno de sus substratos, la coenzima NAD+,
pero admite muchos tipos de alcohol como segundo substrato.
60
2.3.5. Especificidad en secuencias de nucletidos
Un interesantsimo grupo de enzimas, las endonucleasas de restriccin, ampliamen-

te utilizadas en la moderna tecnologa gentica, reconocen secuencias especficas en los
cidos nucleicos, a veces de hasta doce pares de nucletidos. As, la enzima EcoRI, enzima
de restriccin obtenida de E.coli, es capaz de reconocer especficamente la secuencia
-GAATTC-
-CTTAAG-
por otra parte, las aminoacil-tRNA sintetasas son capaces de reconocer una secuen-
cia especfica en el tRNA propio del aminocido que activan; esta secuencia se sabe que
es diferente del anticodon.
2.4. Otros aspectos de la catlisis enzimtica
Ya mencionamos anteriormente que una de las caractersticas ms sobresalientes

de las enzimas es su extraordinaria eficiencia como catalizadores. Las actividades molares
de las enzimas oscilan entre 10 molculas por segundo y centro activo para las ms lentas
hasta cifras tan altas como 108 molculas por segundo y centro activo para las ms r-
pidas. Este hecho, unido a la ya comentada especificidad de las reacciones enzimticas,
hace que muchos campos de la tecnologa moderna, particularmente los relativos al pro-
cesado de alimentos o el reciclaje de residuos, por citar solo algunos, estn muy intere-
sados en la catlisis enzimtica en un doble sentido: (a) utilizacin de enzimas naturales
aisladas de fuentes biolgicas; (b) estudio de los mecanismos enzimticos al objeto de
mejorar procesos artificiales.
Por otra parte, las enzimas son catalizadores polivalentes en el sentido de que son
muchos los tipos de reacciones catalizadas por ellos, a pesar de que los mecanismos in-
trnsecos de la catlisis enzimtica son relativamente pocos. Entre las reacciones cataliza-
das encontramos: reacciones redox, transferencia de grupos, hidrlisis, deshidrataciones
y decarboxilaciones, fosforolisis, condensaciones aldlicas, reacciones de radicales libres,
polimerizaciones, etc.
61
2.5. Teoras sobre la accin enzimtica
El carcter protenico de las enzimas lleva a pensar en una interaccin entre el

substrato y una porcin de la superficie de la protena enzimtica (el centro activo) para
explicar la accin de las enzimas. Por otra parte, el estudio cintico de las reacciones en-
zimticas nos muestra (como veremos en captulos posteriores) que la accin procede a
travs de la formacin de un complejo enzima-substrato; para una reaccin monosubs-
trato,
E + S ES E + P
donde E es la enzima, S el substrato, P el producto de la reaccin y ES el complejo

enzima-substrato. La suposicin de que la reaccin tiene lugar en la superficie de la
molcula de enzima da un carcter de catlisis heterognea a la accin enzimtica, y
de ah que su velocidad pueda expresarse por una relacin anloga a la isoterma de
adsorcin de Langmuir, como veremos al estudiar la cintica enzimtica (la ecuacin de
Michaelis-Menten).
Pero por otra parte, la especificidad de las reacciones enzimticas nos indica que la
interaccin enzima-substrato est mediada a travs de una disposicin altamente precisa
de los grupos qumicos de la enzima, de forma que solo pueden entrar al centro activo las
molculas que encajen perfectamente en los mismos. De esta forma, una pequea varia-
cin en la estructura molecular del substrato podra impedir su fijacin al centro activo.
Estas ideas fueron adelantadas por Emil Fischer en 1894, cuando propuso su
conocida analoga de la llave y la cerradura para explicar la especificidad enzimtica; una
enzima es especfica hacia su substrato de la misma forma que una cerradura solo puede
ser abierta por una llave determinada. Esta idea se ha mantenido bsicamente inaltera-
da durante dcadas, y ha dado lugar a lo que podramos llamar el modelo de interaccin
estereoqumica que explica no solo la accin enzimtica, sino muchos otros fenmenos
biolgicos que tienen lugar a travs de la interaccin de una protena y un ligando (por
ejemplo, la accin hormonal y el efecto de frmacos).
A pesar de su general aceptacin, el modelo de llave y cerradura no explica algunos

fenmenos en Enzimologa. Para eliminar estos inconvenientes Koshland en 1959 am-
pli la hiptesis de llave y cerradura para dar origen a la teora del ajuste inducido, segn
62
la cual, la fijacin del substrato al centro activo altera la configuracin de la enzima de

modo que acerca los grupos encargados de su transformacin a sus objetivos especficos.
Este punto de vista est ms de acuerdo con lo que hoy sabemos de la estructura protei-
ca, que imaginamos mucho ms flexible que lo que se supona; y asimismo encaja con
el modo de accin de los llamados efectores alostricos. Esto no quiere decir que se haya
abandonado la idea de llave-cerradura; de hecho, la accin de muchas enzimas se puede
explicar en esa lnea; el ajuste inducido no ha hecho sino ampliar su significado; en un
smil mecnico, podramos hablar de llaves y cerraduras flexibles para exponer nuestro
actual concepto de la accin enzimtica.
La teora del ajuste inducido conduce a un desarrollo ulterior sobre la accin en-
zimtica. Esta puede ser descrita en trminos de estabilizacin del estado de transicin. El
estado de transicin es una especie qumica inestable, situada en un mximo de energa
potencial, con una configuracin tridimensional que no es ni la de los reactivos ni la de
los productos, sino una forma intermedia. As, la fijacin al centro activo de la enzima
depende de la disposicin estereoqumica precisa y complementaria de una serie de gru-
pos qumicos. Esta complementariedad se refiere, pues, sobre todo al estado de transicin,
y no a los reactivos o productos en su estado basal. Este concepto ser analizado ms
detenidamente en el captulo 6 de esta obra, cuando se hable de los llamados anlogos
de estado de transicin, poderossimos bloqueadores de la accin enzimtica (figura 2.8).
Figura 2.8
63
CAPTULO 3
CLASIFICACIN Y NOMENCLATURA DE LAS ENZIMAS.

REACCIONES ENZIMTICAS
3.1. Principios generales de clasificacin y nomenclatura de enzimas
A lo largo del s. xix y durante gran parte del xx no se dispona de una nomenclatura
o clasificacin sistemtica de las enzimas. El nombre de cada enzima reflejaba vagamente
la reaccin catalizada en el mejor de los casos, y no era en absoluto extrao encontrar
nombres nacidos directamente de la jerga del laboratorio descubridor: diastasa (separador,
por separar dextrinas solubles a partir de almidn insoluble); Zwischenferment (enzima
intermedia), Gelbferment (enzima amarilla), y otros que an siguen hoy en plena vigencia
a pesar de su inadecuacin o su falta de sistemtica descriptiva: catalasa, pepsina, tripsina,
etc. En otras ocasiones se pretenda reflejar el gnero o especie biolgica de procedencia;
as, la ficina, un grupo de enzimas proteolticas extradas del gnero Ficus, o la papana,
aislada del ltex de la papaya. Por ltimo, y ya de una forma semisistemtica, se intentaba
denominar a la enzima por el substrato atacado y aadiendo al mismo el sufijo -asa:
ureasa, maltasa, tirosinasa, etc. El inconveniente de esta forma de denominacin era
obvio: no daba ningn detalle sobre el tipo de reaccin catalizada.
Para tratar de poner orden y dar lugar a un criterio uniforme de clasificacin, en

los aos 50 del siglo pasado se constituy en el seno de la I.U.B. una Comisin para
redactar una serie de reglas a partir de las cuales la denominacin de las distintas enzi-
mas fuera inequvoca. Esta Comisin (Enzyme Commission, E.C.) present sus primeras
propuestas al V Congreso de la IUB celebrado en Mosc (1961), propuestas que han
sido revisadas y perfeccionadas varias veces y forman la base de la clasificacin que hoy
se utiliza, aun cuando estas recomendaciones no son ni mucho menos seguidas al pie
de la letra en la bibliografa bioqumica. Muy brevemente expondremos los principios
generales de la Clasificacin Internacional, que pueden encontrarse en las direcciones
web http://www.expasy.ch/enzyme/ (Base de datos ENZYME en el entorno ExPASy), y
http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/ (Nomenclatura de enzimas en la pgina
de la IUPAC IUBMB).
3.1.1. Nomenclatura
La clasificacin de las enzimas se hace sobre la base de la reaccin catalizada. Esta,

junto con los substratos, forma el nombre completo de la enzima. Adems de este nom-
bre sistemtico, en muchas enzimas se recomienda tambin un nombre ms corto, en
general menos descriptivo pero ms consagrado por el uso. En todo caso las recomen-
daciones de la E.C. cuidan que en estos casos no haya ambigedades o equvocos en
la denominacin. Adems del nombre sistemtico y del nombre usual, cada enzima es
66
reconocida por un nmero sistemtico formado por cuatro elementos numricos separa-
dos por punto y precedido de las siglas E.C. Por ejemplo,
Acetil-CoA:colina O-acetiltransferasa (Nombre sistemtico)
Colina acetiltransferasa (Nombre recomendado)
[E.C. 2.3.1.6] (Nmero)
En el nombre sistemtico vemos: la reaccin catalizada (O-acetil transferasa) y

el nombre de los substratos (acetil-CoA y colina), en orden dador:aceptor. El nombre
recomendado, colina acetiltransferasa, sustituye al primitivo colinacetilasa con el que era
conocido esta enzima. El nmero consta de cuatro elementos; el primero [2] correspon-
de al grupo, en este caso el grupo 2 (transferasas). El segundo y tercer elemento [3] y [1]
son subgrupos y sub-subgrupos de la clasificacin; y por ltimo, el cuarto elemento [6], la
enzima individual.
Ahora bien, enzimas que catalizan una misma reaccin pueden proceder de muy
diversas fuentes (microorganismos, vegetales, animales), y vara ampliamente su estruc-
tura molecular; igualmente, dentro de un mismo organismo, enzimas que catalizan la
misma reaccin pueden corresponder a estructuras moleculares distintas (isoenzimas).
Por ello, se suele aadir entre parntesis la fuente biolgica de la enzima, y en su caso el
rgano; por ejemplo,
[E.C. 2.7.1.1], ATP:D-hexosa fosfotransferasa, hexokinasa (cerebro de rata)
3.1.2. Clasificacin
La clasificacin de las enzimas se hace distribuyndolos en seis grupos conforme a

la naturaleza de la reaccin catalizada. El nmero de grupo (1-6) es el que aparece como
primer elemento en el nmero sistemtico de la enzima. Estos grupos son los siguientes:
1.Oxidorreductasas; 2. Transferasas; 3. Hidrolasas; 4. Liasas; 5. Isomerasas; y 6.

Ligasas.
67
Pasamos a continuacin a una descripcin somera de estos grupos y sus principa-

les reacciones.
3.2. Reacciones enzimticas
En la exposicin que sigue, como regla general, no mencionaremos en este aparta-

do a efectos de brevedad enzimas que vamos a encontrar ms adelante en el curso, en la
parte correspondiente a metabolismo. Se han seleccionado las reacciones ms ilustrativas
de la accin de cada grupo.
3.2.1. Grupo 1: Oxidorreductasas
Las oxidorreductasas son enzimas que catalizan reacciones de oxidacin-reduc-

cin, que en el medio biolgico tienen lugar a travs de la transferencia de electrones
o tomos de hidrgeno de un dador (reductor) a un aceptor (oxidante). Otras veces la
reaccin consiste en la incorporacin de tomos de oxgeno en el substrato. El nombre
sistemtico de las oxidorreductasas se forma as:
Dador:aceptor oxidorreductasa
Por ejemplo: Glucosa: O2 oxidorreductasa, glucosa oxidasa, [E.C. 1.1.3.4]
3.2.1.1. Clasificacin sistemtica de las oxidorreductasas
En el nmero sistemtico de las oxidorreductasas, el primer dgito es el de grupo.

Por ello todas ellas llevan el nmero 1 en dicha posicin. El segundo elemento del n-
mero sistemtico en las oxidorreductasas es el subgrupo. En la mayora de los casos, pero
no en todos, los subgrupos dependen de la naturaleza del dador electrnico. Por ejemplo
(no exhaustivo):
1.1.-.- Actan sobre grupos alcohol (-CHOH-)

1.2.-.- Actan sobre grupos aldehdo u oxo (-CHO, -CO-)
1.3.-.- Actan sobre grupos -CH-CH-
1.4.-.- Actan sobre grupos -CH-NH2
1.5.-.- Actan sobre grupos -CH-NH-
1.6.-.- Actan sobre NADH o NADPH
68
Y as hasta 20 subgrupos, constando cada uno, adems de varios sub-subgrupos.
En el contexto de esta obra, sera excesivo seguir al pie de la letra las recomenda-
ciones de la EC para hacer una descripcin elemental de las enzimas. Se ha presentado
esta clasificacin nicamente a efectos informativos.
3.2.1.2. Nomenclatura alternativa (recomendada) para las oxidorreductasas
Al tratar de oxidorreductasas es muy frecuente utilizar nombres abreviados o tri-

viales. Ahora bien, estos nombres aluden a categoras de oxidorreductasas que no se co-
rresponden, a veces en absoluto, con la clasificacin sistemtica. Por su inters, y su uso
generalizado, damos a continuacin algunos de estos nombres: Deshidrogenasas, Oxi-
dasas, Oxigenasas, Hidroxilasas o Reductasas. En cada caso se citarn una o dos enzimas
caractersticas de la categora.
3.2.1.3. Algunas reacciones enzimticas catalizadas por oxidorreductasas
(a) Deshidrogenasas
La transferencia de electrones catalizada por estas enzimas se hace en forma de

tomos de hidrgeno (2 tomos, esto es, dos protones y dos electrones, o un ion hidru-
ro H-, un protn y dos electrones). Puede verse que en lo que respecta a la clasificacin
anterior, podemos encontrar deshidrogenasas en todos los grupos. Las deshidrogenasas
utilizan siempre alguna coenzima; por ejemplo, nucletidos de nicotinamida (NAD+,
NADP+), nucletidos de flavina (FAD, FMN), cido lipoico, cido ascrbico, quinonas,
pteridinas, etc.
Un gran nmero de reacciones redox estn catalizadas por deshidrogenasas.
EC 1.1.1.1, Alcohol deshidrogenasa (ADH). Cataliza la oxidacin de alcoholes

a aldehdos, con NAD+ como aceptor. Se trata de una importante enzima, implicada
en el metabolismo del etanol o alcohol etlico, siendo la ltima enzima del proceso de
fermentacin alcohlica. Tiene poca especificidad, dado que es capaz de oxidar un gran
nmero de alcoholes primarios o secundarios y hemiacetales. Es una metaloenzima, que
contiene Zn o Fe.
69
(b) Oxidasas
Son las enzimas que utilizan como aceptor electrnico el oxgeno molecular, pro-
ducindose por lo general H2O2 o H2O, o incluso el anin superxido O2- ,en el curso
de la reaccin. Al utilizar O2, estas reacciones son aerbicas, mientras que las catalizadas
por deshidrogenasas pueden tener lugar aerbica o anaerbicamente. Las oxidasas suelen
ser flavoprotenas o metaloprotenas, o ambas cosas a la vez; las reacciones que catalizan
suelen ser bastante complejas.
EC 1.1.3.4, Glucosa oxidasa. (GOD) Se trata de una enzima de origen fngico

con una gran cantidad de aplicaciones biotecnolgicas. Es una flavoprotena con estruc-
tura de homodmero, y utiliza FAD como cofactor. La gran mayora de los mtodos ac-
tuales de determinacin de glucosa en fluidos biolgicos se basa en la reaccin catalizada
por esta enzima.
(c) Peroxidasas
Utilizan perxidos (R-O-OH) y muy frecuentemente el perxido de hidrgeno

(H2O2) como aceptores electrnicos. Hemos visto que este ltimo compuesto se produce
muy frecuentemente en las reacciones catalizadas por oxidasas, y puede resultar bastante
daino hacia las estructuras celulares. De ah que sean necesarias enzimas encargadas de
70
su reduccin a H2O. Este papel lo cumplen las peroxidasas. En general, las peroxidasas
suelen ser hemoprotenas, es decir, con un grupo prosttico porfirnico. Las peroxida-
sas corresponden al subgrupo 1.11.-.- de la clasificacin sistemtica.
AH2 + H2O2 A + 2H2O
EC 1.11.1.6 Catalasa. Pertenece a este grupo la catalasa, enzima que cataliza la

descomposicin de H2O2 a H2O y oxgeno molecular O2. Es muy abundante en los leu-
cocitos polimorfonucleares, y es la responsible del burbujeo de oxgeno cuando la sangre
entra en contacto con perxido de hidrgeno (agua oxigenada).
2H2O2 2H2O + O2
(d) Oxigenasas (no confundir con Oxidasas)
Introducen oxgeno molecular en la molcula de substrato, lo que resulta nor-

malmente en la apertura de una estructura cclica cuando la introduccin se hace en un
enlace doble (dioxigenasas), o bien se introduce un solo tomo de oxgeno y el otro se
libera en forma de agua (monooxigenasas). Aparecen en los subgrupos 1.13 y 1.14 de la
clasificacin sistemtica.
EC 1.13.11.5 Homogentisato-1,2-dioxigenasa. Forma parte de la va de degra-

dacin de los aminocidos fenilalanina y tirosina. Su carencia congnita conduce a la
enfermedad metablica conocida como alcaptonuria.
71
(e) Hidroxilasas
Catalizan la introduccin de un tomo de oxgeno a partir de oxgeno molecular

con formacin de un grupo hidroxilo -OH, al tiempo que que un segundo dador elec-
trnico reduce al tomo de oxgeno restante. Como en el caso anterior, corresponden a
los subgrupos sistemticos 1.13 y 1.14.
EC 1.14.16.1, Fenilalanina 4-monooxigenasa (Fenilalanina hidroxilasa). Ca-

taliza la formacin de tirosina a partir de fenilalanina, introduciendo un grupo hidroxi-
en el anillo bencnico de la fenilalanina. Utiliza como correductor un biopterina reduci-
da (representada por AH2). Es una enzima clave en el metabolismo de los aminocidos
aromticos, y su deficiencia congnita conduce a una grave enfermedad congnita, la
fenilcetonuria.
(f ) Reductasas
Se trata de un nombre que se asigna sin ninguna sistemtica a muchas reacciones

catalizadas por oxidorreductasas, cuando la reaccinrelevante, o de importancia biolgi-
ca, es una reduccin.
EC 1.5.1.3, Dihidrofolato reductasa. Reduce el dihidrofolato a tetrahidrofola-

to, que es una coenzima activa en la transferencia de grupos monocarbonados, de gran
importancia en el metabolismo de nucletidos (sntesis del anillo purnico). Por ello su
inhibicin especfica se emplea en la quimioterapia antineoplsica, mediante un inhibi-
dor competitivo de esta enzima, el methotrexate.
72
3.2.2. Grupo 2: Transferasas
La reaccin general catalizada por este grupo de enzimas es
A-X + B A + B-X
en rigor, esta reaccin general sera asimismo vlida para las oxidorreductasas si el
grupo transferido X fuera un par electrnico, dos tomos de hidrgeno o un ion hidru-
ro. Asimismo, las hidrolasas catalizan una reaccin similar. Igualmente, las reacciones de
fosforolisis, similares a las de hidrlisis, son catalizadas por enzimas de este grupo que re-
ciben el nombre de fosforilasas. Desde el punto de vista de nomenclatura, las transferasas
forman su nombre sistemtico como
Dador:aceptor grupo-transferasa
y se clasifican conforme al grupo transferido.
3.2.2.1. Clasificacin sistemtica de las transferasas
Algunos de los subgrupos ms representativos de este grupo son:
2.1.-.-Transfieren grupos monocarbonados (-CH3, -CHO, -COOH, -CHNH2,

etc.)
2.4.-.- Glicosiltransferasas
2.5.-.- Transfieren grupos alquil- o aril-, distintos del grupo metil-.
2.6.-.- Transfieren grupos nitrogenados
2.7.-.- Transfieren grupos fosforados
73
3.2.2.2. Algunas reacciones enzimticas catalizadas por transferasas
(a) Subgrupo 2.1: Transfieren grupos monocarbonados
El subgrupo 2.1 comprende a las transferasas de grupos monocarbonados, esto es,

que transfieren entre dador y aceptor los grupos metilo -CH3, hidroximetilo -CH2OH,
formil -CHO y formimino -CHNH. Las metiltransferasas utilizan normalmente como
dador la coenzima S-adenosil metionina (SAM); las transferencias de los restantes grupos
se hacen a partir de coenzimas folnicas. Estos ltimos tienen particular importancia en
la sntesis de nucletidos, entre otros procesos.
EC 2.1.1.6 Catecol-O-metiltransferasa (COMT). Transfiere el grupo metilo de

la S-adenosilmetionina (SAM) a uncatecol aceptor. SAM se convierte en S-adenosil ho-
mocistena (SAHC). Se trata de una reaccin de gran importancia en el catabolismo de
aminas neurotransmisoras (catecolaminas), como dopamina, adrenalina y noradrenali-
na. Esta enzima funciona en combinacin con la aminooxidasa (monoaminooxidasa,
MAO, EC 1.4.3.4) para dar los distintos catabolitos de estas aminas.
(b) Subgrupo 2.4: Glicosil transferasas
En el subgrupo 2.4 estn las glicosiltransferasas, que transfieren restos glicosilo

entre dador y aceptor. En ocasiones el aceptor es fosfato inorgnico, y en ese caso habla-
mos de fosforilasas. Estas reacciones suelen ser reversibles en las condiciones intracelu-
lares, de modo que la fosforilasa, por ejemplo, puede catalizar la transferencia de restos
glicosdicos desde un ster fosfato a una cadena de poli- u oligosacrido. Otras veces se
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transfiere todo un segmento oligosacrido, como en el caso de la enzima ramificante del

glucgeno. Asimismo, muchas de estas enzimas utilizan como substratos derivados de
nuclesido-difosfatos, como el UDP, ADP o CDP. En este subgrupo encontramos enzi-
mas de una gran importancia metablica; adems de las ya citadas fosforilasas, tenemos
todos los implicados en la glucuronoconjugacin de compuestos, importantsima reac-
cin de los procesos destoxificantes del organismo.
EC 2.4.1.1 Glucgeno fosforilasa. Esta enzima tiene una extraordinaria impor-

tancia metablica, por cuanto que cataliza la reaccin de degradacin del glucgeno,
heptico o muscular. La reaccin de degradacin es una fosforolisis (de ah le viene el
nombre a la enzima) realizada sobre un residuo -1,4-glucosil situado en los extremos no
reductores de -glucanos como amilopectina, amilosa o glucgeno.
Utiliza como cofactor piridoxal fosfato.La enzima heptica controla, mediante

esta reaccin, el nivel de glucemia sistmica. Por ello no es de extraar que sea una en-
zima fuertemente regulada; alostricamente, mediante una activacin ejercida por AMP
e inhibicin por ATP, ADP y glucosa-6-fosfato; y lo que es ms importante, a travs de
una compleja cascada de modificaciones covalentes, que se exponen detalladamente en
el captulo 9 de esta obra.
Glucgeno (n) + Fosfato Glucgeno (n-1) + Glucosa-1-fosfato
(c) Subgrupo 2.6: transfieren grupos nitrogenados
Otro importante subgrupo de transferasas es el 2.6 que agrupa las enzimas

encargadas de la transferencia de grupos nitrogenados, y particularmente el 2.6.1
(aminotransferasas o transaminasas). Estas ltimas catalizan el intercambio de un grupo
amino entre un aminocido y un cetocido; se trata de reacciones reversibles que
utilizan como coenzima el piridoxal fosfato. Una pareja aceptor-dador muy frecuente
en estas reacciones es oxoglutarato-glutamato. De esta manera en el catabolismo de
los aminocidos el nitrgeno amnico va concentrndose en forma de glutamato, para
formar posteriormente amonaco libre mediante la glutamato dehidrogenasa. Por otra
parte, las aminotransferasas tienen una gran importancia en Bioqumica Clnica, como
elementos diagnsticos de enfermedades hepticas y miocrdicas (v. captulo 14).
EC 2.6.1.1 Aspartato aminotransferasa (AST, glutamato-oxalacetato transami-

nasa, GOT). Cataliza la transaminacin de aspartato (y tambin fenilalanina, tirosina y
75
triptfano) a 2-oxoglutarato, con formacin de glutamato y el correspondiente cetocido

(oxalacetato en caso de aspartato). Es una reaccin fcilmente reversible, de gran impor-
tancia en el metabolismo de aminocidos. Es una enzima ampliamente distribuida por
todos los tejidos animales, siendo especialmente abundante en el hgado y en el msculo
cardaco. Se trata de un homodmero que utiliza piridoxal fosfato como cofactor (ver
cap. 4) y que presenta en eucariotas dos isoenzimas, una citoplsmica y otra mitocon-
drial. Su determinacin se emplea ampliamente en Bioqumica Clnica como marcador
de enfermedades hepticas y cardacas, aunque se especificidad es menor que la de otras
enzimas.
EC 2.6.1.2 Alanina aminotransferasa (ALT, glutamato-piruvato transaminasa,

GPT). Se trata de una reaccin muy similar a la anterior, aunque el substrato prcti-
camente nico es la alanina, quecede su grupo amino al 2-oxoglutarato con formacin
de piruvato y glutamato. Al igual que la AST, requiere piridoxal fosfato, tiene gran im-
portancia metablica, es un heterodmero y presenta isoenzimas citoplsmica y mito-
condrial. Es una enzima inducible por glucocorticoides. A pesar de estar ampliamente
distribuida, su valor como enzima marcadora es bastante mayor que el de la AST, dado
que es particularmente abundante en hgado. Todas las enfermedades del parnquima
heptico cursan con elevaciones sustanciales en sangre de la ALT (GPT).
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(d) Subgrupo 2.7: Fosfotransferasas o kinasas
El subgrupo 2.7 contiene a unas enzimas de gran importancia metablica y fisio-

lgica: las fosfotransferasas. Dentro del mismo, los apartados 2.7.1 a 2.7.4 contienen las
enzimas llamadas comnmente kinasas. Normalmente el compuesto dador es el ATP, o
ms propiamente, el complejo ATP-Mg2+. La importancia de estas enzimas deriva del
hecho de ser enzimas activantes de multitud de substratos, que entran en el metabolis-
mo en forma de steres fosfricos. En el subgrupo 2.7.7 encontramos las nucleotidil
transferasas, entre las que se encuentran enzimas como las DNA polimerasas y las RNA
polimerasas.
EC 2.7.3.2,Creatinkinasa (CK, Creatinfosfokinasa, CPK). Cataliza la transfe-

rencia de un fosfato desde el ATP a la creatina para formar creatinfosfato, un fosfgeno
muy abundante en tejidos cuyas necesidades energticas son grandes y pueden fluctuar
ampliamente, como el msculo esqueltico, corazn, cerebro y espermatozoides.
Se trata de una enzima homo- o heterodimrica formada por subunidades de tipo

B o de tipo M (existen adems otros dos tipos de subunidades de origen mitocondrial).
As, las isozimas de la CK pueden ser BB, MB y MM. La isozima BB es predominante
en el tejido cerebral, y la MM en el msculo esqueltico. La isozima MB est presente en
el msculo miocrdico y se utiliza en qumica clnica como enzima marcadora de infarto
de miocardio, siendo su nivel elevado un signo relativamente precoz del mismo, muy
especfico y con importancia pronstica.
3.2.3. Grupo 3: Hidrolasas
Son enzimas que catalizan reacciones de hidrlisis. La reaccin general catalizada

puede representarse como
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A-B + H2O A-H + HO-B
El nombre de las hidrolasas se forma a partir del substrato seguido de hidrolasa.

Ahora bien, el nombre comn o recomendado de estas enzimas se forma con el nombre
del substrato seguido del sufijo asa; es decir, en nombres como ureasa, fosfatasa, ami-
lasa, etc., se entiende que se trata de enzimas hidrolticas. En muchos casos, particular-
mente en las proteinasas, se conservan nombres consagrados por el uso sin que tengan
ninguna sistemtica; por ejemplo, tripsina, pepsina, papana, ficina, etc.
3.2.3.1. Clasificacin sistemtica de las hidrolasas
Presentamos alguno de los subgrupos ms representativos.
3.1.-.- Hidrolizan enlaces ster

3.2.-.- Glicosidasas
3.4.-.- Pptido hidrolasas
3.6.-.- Hidrolizan acil-anhdridos
(a) Subgrupo 3.1. Hidrolizan enlaces ster
EC 3.1.1.7, Acetilcolinesterasa. Esta enzima hidroliza la acetilcolina a acetato

y colina. y de esta manera se interrumpe la accin de este neurotransmisor en los re-
ceptores colinrgicos. Es el inactivador fisiolgico de este tipo de sinapsis. Por ello, los
inhibidores de la acetilcolinesterasa (por ejemplo, los organofosfricos, ver cap. 6) hacen
persistir el efecto de la acetilcolina, lo que en la placa neuromuscular se traduce en una
activacin continua de la misma, produciendo parlisis muscular (y en su caso la muerte
a travs de la parlisis respiratoria).
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EC 3.1.3.1, Fosfatasa alcalina. Hidroliza una gran variedad de steres fosfricos

y se caracteriza por tener un ptimo de pH alcalino (en torno a 10). Requiere para su ac-
tividad zinc y magnesio. No se conoce con exactitud la funcin de esta enzima, que tam-
bin cataliza transfosforilaciones; no obstante, se cree que tiene un papel importante en
los procesos de osificacin. Es una enzima muy ampliamente distribuida y se presenta
en muchas formas isozimticas: placentaria, seudoplacentaria, intestinal y tisular (a su
vez, con formas heptica, sea y renal). Es un importante marcador en Bioqumica Cl-
nica, sobre todo de enfermedades del aparato hepatobiliar (p.e. colestasis) y del sistema
seo (enfermedad de Paget, tumores seos primitivos, metstasis seas de tumores, etc.).
EC 3.1.3.2, Fosfatasa cida. Hidroliza una gran cantidad de fosfomonosteres,

y tambin es capaz de catalizar transfosforilaciones, al igual que la fosfatasa alcalina. La
principal diferencia con esta radica en su pH ptimo, que est entre 5 y 6, y de ah su
nombre. Se conocen varias isozimas de la fosfatasa cida: las isozimas S y F del hemate,
variantes de la ACP1; la ACP2, o fosfatasa cida lisosmica; la ACP5, o fosfatasa cida
tartrato-resistente (que aumenta en determinados estados patolgicos: enf. de Gaucher,
enf. de Hodgkin, ciertas leucemias linfocticas); y la ACPP o fosfatasa cida prosttica,
que es un marcador caracterstico de los carcinomas prostticos.
En ambas enzimas la reaccin es la siguiente:
(b) Subgrupo 3.2: Glicsido hidrolasas (glicosidasas)
Es un numeroso grupo de enzimas cuya accin consiste en la hidrlisis de enlaces

glicosdicos. Tienen un gran inters biotecnolgico, en las industrias del almidn, de la
celulosa y otros productos naturales (ver cap. 14). Se clasifican en tres subgrupos: 3.2.1,
rompen O-glicsidos; 3.2.2 rompen N-glicsidos; 3.2.3, rompen S-glicsidos. El me-
canismo de accin de todas ellas es similar, presentando dos residuos de aminocidos
dicarboxlicos (asprtico o glutmico) en el centro activo.
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EC 3.2.1.17 Lisozima. Hidroliza los enlaces -glicosdicos establecidos entre re-

siduos de N-acetilmurmico y N-acetil glucosamina de los peptidoglicanos bacterianos.
Se trata de una enzima ampliamente difundida en la naturaleza, desde los bacterifagos
hasta los mamferos, y cumple una funcin esencialmente bactericida. Est presente en
multitud de secreciones (lgrima, clara de huevo, etc.) y su estructura y funcin estn
muy bien estudiadas. Fue la primera enzima que pudo estudiarse mediante cristalografa
de rayos X formando complejo con su substrato.
(c) Subgrupo 3.4: Pptido hidrolasas
En el subgrupo 3.4 encontramos las pptido hidrolasas, que hidrolizan enlaces

peptdicos -CO-NH-. Normalmente se distingue entre peptidasas, antiguamente llama-
das exopeptidasas, de las proteinasas o endopeptidasas. Las primeras hidrolizan los enlaces
peptdicos situados en los extremos de la cadena; distinguimos as las aminopeptidasas,
que operan sobre el N-trmino, y las carboxipeptidasas, que lo hacen sobre el C-trmino.
Las proteinasas operan sobre enlaces peptdicos establecidos en el interior de las cadenas
polipeptdicas.
Las pptido hidrolasas se clasifican asimismo atendiendo al mecanismo cataltico.

Este puede ser de cuatro tipos distintos: (1) Presentan una serina en el centro activo,
acompaada de una histidina y un residuo dicarboxlico (aspartato o glutamato), cons-
tituyendo lo que se llama una trada cataltica. Son las serin proteinasas. (2) Poseen en el
centro activo un grupo -SH de una cistena, siendo por lo dems el mecanismo cataltico
muy parecido al de las anteriores. Se conocen como tiol proteinasas. (3) El sitio activo
es un residuo dicarboxlico, normalmente cido asprtico: son las aspartil-proteinasas
o proteinasas cidas. (4) Otras tienen un ion metlico, generalmente Zn2-, vital para la
actividad cataltica: las metaloproteinasas.
- Serin proteinasas
EC 3.4.21.1, Quimotripsina. Es una enzima pancretica, producida como zi-

mgeno en las clulas acinares de este rgano, y que se activa proteolticamente en la luz
intestinal. Es una enzima muy bien conocida, siendo el prototipo de las serinproteinasas.
Su centro activo est configurado por los residuos de serina, histidina y asprtico y su
modo de accin muy bien estudiado (ver captulo 7). Tiene preferencia por enlaces -Tyr-
X-, -Trp-X-, -Phe-X y -Leu-X.
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EC 3.4.21.4 Tripsina. Es asimismo una enzima pancretica, producida como zi-

mgeno que se activa al ser secretado a la luz intestinal por la accin de la propia enzima
o de la enteropeptidasa (EC 3.4.21.9). Se trata tambin de una serin proteinasa con un
centro activo y un mecanismo cataltico muy parecido al de la quimotripsina. Rompe
enlaces constituidos por un aminocido dibsico y cualquier otro aminocido, es decir,
-Arg-X y -Lys-X
Entre las serinproteinasas tenemos asimismo una gran cantidad de factores de la

coagulacin sangunea, como por ejemplo la trombina.
- Tiol proteinasas
EC 3.4.22.2 Papana. Es el prototipo de tiolproteinasa, con un residuo de ciste-

na en el centro activo y un mecanismo cataltico similar al de las serinproteinasas (ver
captulo 7). Se extrae del latex de la papaya. Hidroliza una amplia variedad de enlaces
peptdicos y tiene muchas aplicaciones en la tecnologa de alimentos. Otras tiolproteina-
sas de origen vegetal son la ficina y la bromelana.
- Proteinasas cidas
EC 3.4.23.1 Pepsina. Es el prototipo de proteinasa cida (o aspartilproteinasa).

Se trata de la enzima propia de la secrecin gstrica. Se produce como zimgeno (pepsi-
ngeno) en las clulas principales de la mucosa gstrica y se activa a travs del pH cido
del contenido gstrico. Presenta cinco isoenzimas distintas, de las cuales la principal es la
pepsina A. Tiene preferencia por enlaces establecidos entre aminocidos hidrofbicos y o
aromticos en ambas posiciones respecto al enlace roto. Tiene la particularidad de tener
un pH ptimo de accin muy bajo, entre 0 y 2.
- Metaloproteinasas
EC 3.4.24.7 Colagenasa intersticial. Rompe las molculas de colgeno en el

dominio helicoidal, aproximadamente a las tres cuartas partes de la molcula desde el
N-trmino. Requiere un ion de zinc para su actividad cataltica.
81
(d) Subgrupo 3.6: Acil anhdrido hidrolasas
En el subgrupo 3.6 encontramos las hidrolasas de anhdridos de cido. Tienen

particular importancia en este grupo las que hidrolizan anhdridos fosfricos, y sobre
todo las adenosin trifosfatasas o ATPasas. Son enzimas ampliamente distribuidas y su
accin est acoplada a procesos de transporte inico y transduccin de energa; por ejem-
plo, la Na+,K+-ATPasa de la membrana plasmtica, o la Ca++-ATPasa de la mitocondria.
EC 3.6.1.37 ATPasa transportadora deNa+-K+ (ATPasa bomba de sodio). Se

encuentra esta enzima en la membrana plasmtica de las clulas animales, de las que
forma parte integral.La hidrlisis de ATP llevada a cabo por esta enzima est acoplada al
transporte contra gradiente de Na+ y K+ (sodio hacia el exterior y potasio hacia el interior
celular). Por esta razn tiene una extraordinaria importancia en todos los fenmenos
celulares acoplados al gradiente inico (como excitabilidad, p.e.). Es un heterotrmero
, y su actividad puede ser inhibida de forma caracterstica por los glicsidos cardio-
tnicos (digital, ouabana, etc.) y por el anin vanadato.
EC 3.6.1.38 ATPasa transportadora de Ca2+ (ATPasa bomba de calcio). Se

encuentra formando parte integral de las membranas del retculo endoplsmico, y su
funcin consiste en bombear contra gradiente iones de calcio hacia el interior de las ve-
sculas. En el msculo cumple una funcin destacada, ya que es el ion Ca2+ el segundo
mensajero que induce la contraccin muscular. Esta ATPasa vuelve a integrar los iones
liberados a sus depsitos en el retculo sarcoplsmico (nombre especfico que recibe el
retculo endoplsmico en la clula muscular).
3.2.4. Grupo 4: Liasas
Son enzimas que catalizan reacciones de rotura (o establecimiento) de un enlace

de forma que la reaccin puede describirse como adicin o sustraccin de un grupo a o
desde un doble enlace, y que normalmente suelen ser reversibles. Se caracterizan por te-
ner un substrato en una direccin y dos en la contraria. Esquemticamente las reacciones
lisicas pueden describirse como
A=B + X AXB
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el nombre sistemtico de estas enzimas se forma as:
Substrato grupo-liasa
Por ejemplo: L-Malato hidro-liasa (Fumarato hidratasa, E.C.4.2.1.2)
Entre los nombre recomendados para estas enzimas, encontramos, por ejemplo,
descarboxilasas, enzimas que eliminan CO2; sintasas (no confundir con sintetasas), cuan-
do la reaccin relevante es la de unin; aldolasas, cuando catalizan condensaciones ald-
licas; hidratasas, cuando la reaccin consiste en una adicin de agua a un doble enlace.
La clasificacin de las liasas se hace conforme al enlace atacado.
3.2.4.1. Clasificacin sistemtica de las liasas
4.1.-.- Liasas C-C

4.2.-.- Liasas C-O
4.3.-.- Liasas C-N
4.4.-.- Liasas C-S
4.5.-.- Liasas C-halgeno
4.6.-.- Liasas P-O
4.99.-.- Otras liasas
3.2.4.2. Algunas reacciones enzimticas catalizadas por liasas
(a) Subgrupo 4.1: Liasas C-C
El subgrupo 4.1 contiene varios sub-subgrupos importantes de enzimas. 4.1.1

son las descarboxilasas, enzimas que eliminan grupos carboxilo, de gran importancia en
el metabolismo. Muchas de ellas utilizan tiamina difosfato o piridoxal fosfato como
coenzimas. El sub-subgrupo 4.1.2 son las aldehdo-liasas o aldolasas, que catalizan con-
densaciones aldlicas; en 4.1.3 estn agrupadas las oxocido-liasas, con enzimas de gran
importancia metablica, como la citrato sintasa o enzima condensante. Veremos su ac-
cin detallada al estudiar el metabolismo.
83
EC 4.1.1.22 Histidina descarboxilasa. Cataliza la descarboxilacin de histidi-

na para dar histamina. Esta reaccin y otras similares son importantes en la sntesis de
numerosos neurotransmisores. Esta enzima es un homodmero que requiere piridoxal
fosfato. La histamina es un efector muy potente en los estados alrgicos y anafilcticos.
(b) Subgrupo 4.2: Liasas C-O
El subgrupo 4.2 son las liasas C-O. En el apartado 4.2.1 encontramos las hidro-
liasas (hidratasas o dehidratasas), enzimas que catalizan la adicin o eliminacin de agua
en un doble enlace.
EC 4.2.1.1 Carbonato deshidratasa (anhidrasa carbnica). Esta enzima catali-

za la hidratacin de CO2 a cido carbnico, el cual se disocia inmediatamente en bicar-
bonato y protn.
CO2 + H2O H2CO3 HCO3- + H+
Requiere zinc como cofactor, y se conocen al menos siete formas moleculares dis-
tintas de la enzima en mamferos. Tiene una gran importancia fisiolgica, ya que partici-
pa en el proceso de transporte de gases en sangre, en la secrecin de HCl por el estmago
y en la excrecin renal de bicarbonato.
3.2.5. Grupo 5: Isomerasas
Catalizan reagrupamientos dentro de la misma molcula. A pesar de ser (apa-

rentemente) enzimas monosubstrato, muchas veces las reacciones catalizadas por estas
enzimas son muy complicadas.
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3.2.5.1. Clasificacin sistemtica de las isomerasas
5.1.-.- Racemasas y epimerasas

5.2.-.- Isomerasas cis-trans
5.3.-.- Oxidoreductasas intramoleculares
5.4.-.- Transferasas intramoleculares (mutasas)
5.5.-.- Liasas intramoleculares
5.99.-.- Otras isomerasas
3.2.5.2. Algunas reacciones enzimticas catalizadas por isomerasas
(a) Subgrupo 5.1: Racemasas y epimerasas
El subgrupo 5.1 contiene las racemasas y las epimerasas, que catalizan la inversin
de configuracin en un carbono asimtrico. Son importantes las que actan sobre ami-
nocidos y sobre monosacridos o sus UDP-derivados.
EC 5.1.1.1 Alanina racemasa. Presentamos esta reaccin como ejemplo de las

aminocido racemasas. Requiere piridoxal fosfato como cofactor. Es una enzima impor-
tante en el metabolismo bacteriano, en el que la D-alanina es necesaria en la sntesis del
peptidoglicano.
(b) Subgrupo 5.2: Isomerasas cis-trans
En el subgrupo 5.2 encontramos enzimas que catalizan isomerizaciones cis-trans

en torno a un doble enlace.
EC 5.2.1.3 Retinal isomerasa. Cataliza la isomerizacin de todo-trans-retinal a

11-cis-retinal. Tiene, por esa razn, una gran importancia en el proceso visual, ya que
85
este consiste en la absorcin de un fotn por el ismero 11-cis para dar lugar al todo-
trans. La retinal isomerasa regenera la molcula receptora.
(c) Subgrupo 5.3: Oxidorreductasas intramoleculares
Las oxidorreductasas intramoleculares constituyen el subgrupo 5.3; tienen impor-

tancia, por ejemplo, las enzimas que interconvierten aldosas en cetosas, o que transfieren
dobles enlaces entre carbonos de la misma molcula.
EC 5.3.1.9 Glucosa-6-fosfato isomerasa (fosfoglucosa isomerasa, fosfohexosa

isomerasa) Es una enzima de la va glicoltica encargado de la interconversin entre
glucosa-6-fosfato y fructosa-6-fosfato. Es un homodmero. Las formas mutantes de esta
enzima son causa de anemias hemolticas.
(d) Subgrupo 5.4: Transferasas intramoleculares (mutasas)
El subgrupo 5.4 contiene a las transferasas intramoleculares; genricamente reci-

ben el nombre de mutasas. Catalizan la transferencia de un determinado grupo de una
parte a otra de la misma molcula.
EC 5.4.2.4 Bisfosfoglicerato mutasa. Cataliza la conversin de 1,3-bisfosfoglicerato

en 2,3 bisfosfoglicerato. La reaccin tiene lugar de manera que la enzima es en primer
lugar fosforilada por 1,3 bisfosfoglicerato para dar fosfoenzima y 3-fosfoglicerato; en
una segunda fase, este ltimo es refosforilado en la posicin 2. El bisfosfoglicerato es
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un importante efector alostrico de la hemoglobina, que da lugar a una disminucin

en la afinidad de esta por el oxgeno. La ausencia de esta enzima es causa de anemias
hemolticas.
(e) Subgrupo 5.99: Otras isomerasas
EC 5.99.1.2 DNA topoisomerasa. Esta enzima cataliza la interconversin entre

distintos ismeros topolgicos del DNA, por ejemplo, la relajacin de un superenrolla-
miento negativo. A diferencia de la siguiente, no requiere ATP. Participa en multitud de
procesos asociados a la replicacin, reparacin y recombinacin del material gentico.
Estas acciones las lleva a cabo a travs de la introduccin de un corte en una cadena (nick,
melladura) y el cabo roto de DNA se fija transitoriamente a travs de un fosfodister al
grupo fenol de un residuo de tirosina. Posteriormente la cadena rota vuelve a soldarse
por accin de la misma enzima.
EC 5.99.1.3 DNA topoisomerasa dependiente de ATP (DNA girasa). Inter-

convierte ismeros topolgicos de DNA a travs de la rotura dependiente de ATP de
DNA. A diferencia de la anterior, la DNA girasa rompe los dos filamentos del cido
nucleico. Esta enzima puede introducir superenrollamiento negativo o positivo en mol-
culas de DNA. No aparece en eucariotas. La DNA girasa es inhibida por los antibiticos
del grupo de las quinolonas (cido nalidxico, ciprofloxacino, etc.)
3.2.6. Grupo 6: Ligasas o Sintetasas
Catalizan la unin de dos molculas concomitante a la hidrlisis de un enlace pi-

rofosfato del ATP u otro nuclesido trifosfato. Para estas enzimas se utiliza el nombre de
sintetasas en contraposicin a las sintasas, que son liasas y no requieren la rotura de
un enlace rico en energa. Las reacciones catalizadas por las sintetasas suelen ser bastante
complejas, ya que son reacciones trisubstrato como mnimo. La reaccin general podra
describirse como
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A + B + ATP A-B + ADP + Pi
o bien
C + D + ATP C-D + AMP + PPi
Siendo Pi fosfato inorgnico y PPi pirofosfato inorgnico.
3.2.6.1. Clasificacin sistemtica de las ligasas
Se clasifican conforme a la naturaleza del enlace formado:
6.1.-.- Ligasas C-O

6.2.-.- Ligasas C-S
6.3.-.- Ligasas C-N
6.4.-.- Ligasas C-C
6.5.-.- Ligasas P-O
3.2.6.2. Algunas reacciones enzimticas catalizadas por ligasas
(a) Subgrupo 6.1: Ligasas C-O
El subgrupo 6.1 contiene las ligasas que forman enlaces C-O. Entre ellas, el sub-
subgrupo 6.1.1 es el correspondiente a las aminoacil-tRNA sintetasas, enzimas encargadas
de la activacin de los aminocidos en la sntesis de protenas.
EC 6.1.1.1 Tirosina-tRNA ligasa (Tirosil-tRNA sintetasa). Citamos a esta enzi-

ma como el prototipo de las aminoacil-tRNA sintetasas, enzimas encargadas de la unin
de un aminocido a su tRNA especfico. La reaccin es dependiente de ATP, formndose
en una primera fase un aminoacil-adenilato y transfirindose despus el residuo aminoa-
cil al trmino 3 del polinucletido. Estas enzimas son de una especificidad absoluta para
sus substratos, tanto el aminocido como el tRNA.
88
(1) Aminocido + ATP Aminoacil-AMP + PPi
(2) Aminoacil-AMP + tRNA AMP + Aminoacil-tRNA
(b) Subgrupo 6.3: Ligasas C-N
Las sintetasas que forman enlaces C-N estn en el subgrupo 6.3. Entre ellas des-
tacan la asparragina- y glutamina sintetasas, encargadas de la introduccin de NH3 en el
carboxilo terminal de aspartato o glutamato.
EC 6.3.1.2 Glutamato-amonio ligasa (Glutamina sintetasa). La actividad de

esta enzima consiste en la formacin de un grupo amida por unin de amonaco al
-carboxilo del cido glutmico, con formacin de glutamina (en dos pasos). Es una
enzima de gran importancia metablica por cuanto que es un sistema central en el
metabolismo nitrogenado. Se encuentra sometida a un complicado sistema de regulacin
por modificacin covalente.
Glutamato + ATP + NH4+ Glutamina + ADP + Pi
(c) Subgrupo 6.4: Ligasas C-C
El subgrupo 6.4 presenta las enzimas encargadas de formar enlaces C-C, normal-
mente en reacciones de carboxilacin, por lo que las enzimas de este grupo son las llama-
das carboxilasas (no confundir con las descarboxilasas). La mayor parte de ellas contienen
biotina como grupo prosttico.
EC 6.4.1.2 Acetil-CoA carboxilasa. Es una enzima multifuncional. La actividad

que nos interesa en este contexto es la formacin de malonil-CoA a partir de acetil-CoA
y CO2, que es el paso limitante en la biosntesis de cidos grasos. Es el prototipo de las
enzimas conocidas como carboxilasas. Utiliza, como todas las carboxilasas, biotina como
cofactor (ver captulo 4). Es una enzima sometida a regulacin, con efectos alostricos y
modificacin covalente a travs de fosforilacin.
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90
CAPTULO 4
COENZIMAS O COFACTORES
4.1. Introduccin
Ya hemos visto en el captulo 2 el significado de estos trminos. Una coenzima es

una molcula que participa en un determinado tipo de reacciones enzimticas, general-
mente de una de dos maneras distintas: (a) o bien como grupo prosttico, en cuyo caso
suele estar fuertemente unida al centro activo enzimtico, a veces de forma covalente, y
que en este caso permanece inalterada una vez terminado el ciclo de reaccin (es decir,
una participacin propiamente cataltica), o bien (b) como una molcula adicional que
acta como transportador entre dos reacciones distintas, catalizadas por enzimas diferen-
tes, de forma que la molcula es modificada en una reaccin y regenerada en la siguiente.
Hay quien reserva el trmino de coenzima para el primer caso, y de cosubstrato para el
segundo (y cofactores como abarcando a ambos). En el presente trabajo, sin embargo,
aplicaremos el trmino coenzima por igual en las dos categoras. Bien es verdad que en
el segundo caso no est clara la distincin entre substrato y coenzima; y que definimos
a estas en funcin de una segunda reaccin ulterior que lo puede regenerar. Pero en el
caso de las primeras, es decir, los llamados grupos prostticos, encontramos el mismo
comportamiento, salvo que la regeneracin se produce sobre el mismo centro activo
enzimtico, no necesitndose una segunda enzima.
En todo caso, el concepto de coenzima queda en realidad reducido al de transpor-

tador de grupos qumicos. Casi todas las reacciones enzimticas pueden ser interpretadas
en trminos de transferencia:
A-X + B A + B-X
donde el grupo transferido X puede ser, por ejemplo, electrones o equivalentes

de reduccin en las oxidoreductasas; fosfato, grupos amino, grupos monocarbonados,
residuos glicosdicos, grupos acilo, etc., en otras reacciones. Y adems, podemos con-
siderar asimismo la existencia de coenzimas (ATP o GTP) que transfieren energa libre
qumica entre unas reacciones y otras. Por lo tanto, es este concepto de coenzimas como
transportadores el que nos interesa; otros elementos que puedan participar en la reaccin
enzimtica, como metales, efectores o moduladores, etc., no son considerados coenzi-
mas. Tambin veamos en el captulo anterior que las reacciones hidrolsicas pueden
interpretarse en trminos de transferencia.
Ya adelantamos la estrecha relacin existente entre las vitaminas, factores dietti-

cos indispensables, y algunas coenzimas. Siendo estas por lo general molculas orgnicas
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complejas, la sntesis de la totalidad de la molcula es con frecuencia imposible en los

distintos organismos; por ello, en muchos casos es necesario el aporte diettico de la
totalidad o parte de la molcula coenzimtica. Su falta en la dieta da lugar a las llamadas
enfermedades carenciales, como el escorbuto, el beri-beri, la pelagra, etc. Durante un tiem-
po se dio mucha importancia a las enfermedades carenciales en la Patologa Humana, y
por consiguiente, al estudio de las vitaminas como tales en Bioqumica. Hoy preferimos
hablar de ello en el contexto ms general de las coenzimas. Determinados sndromes ca-
renciales presentan hoy da un inters renovado debido al uso de anlogos de coenzimas
en la teraputica (por ejemplo, el antiflico methotrexate en la quimioterapia antineo-
plsica), que desencadenan alteraciones similares a la carencia diettica de los mismos.
Por otra parte, existen vitaminas cuya adscripcin a coenzimas determinadas es ms que
dudosa; bien sea por desconocerse su modo de accin, o bien porque su funcin fisio-
lgica no es lo que se espera de una coenzima en el sentido estricto en que fueron arriba
definidos; tal es el caso de los retinoides (vitamina A), en los que su participacin en el
proceso visual no es propiamente una funcin coenzimtica de transportador (en todo
caso de transductor) y su papel en otros procesos celulares es an bastante oscuro aunque
sin duda importantsimo. Por tanto, en la presente exposicin aludiremos al carcter
vitamnico all donde sea pertinente en cuanto a la discusin de las coenzimas.
4.2. Coenzimas asociadas a procesos redox
4.2.1. Coenzimas piridnicas (NAD+, NADP+)
NAD+ (Nicotinamido adenil dinucletido, Niacin adenil dinucletido) y NADP+

(NAD+ fosfato) son dos importantes transportadores redox en el metabolismo celular. Ac-
tan fundamentalmente como coenzimas de deshidrogenasas, pero tambin tienen un
importante papel, como veremos, en otros procesos como la ADP-ribosilacin de prote-
nas. En el trabajo clsico de Harden y Young de 1904 se estableca que la fermentacin
acelular de glucosa requera la presencia de un factor termoestable y dializable, que fue
bautizado por los autores como cozimasa. Purificado posteriormente por von Euler y
cols. y por Warburg y Christian en 1936, su conocimiento qued complementado por
el descubrimiento del NADP por estos ltimos autores como factor dializable necesario
para la oxidacin de la glucosa-6-fosfato en hemates. Estos dos factores han recibido
los nombres de Coenzima I y DPN (difosfopiridin nucletido), el NAD+, y Coenzima
II y TPN (trifosfopiridin nucletido) el NADP+. Ambas coenzimas estn ampliamente
distribuidas en todo tipo de clulas y tejidos; dentro de su papel como transportadores
redox, podemos decir en lneas generales que el NAD+ participa preferentemente en pro-
cesos asociados a fermentaciones y respiracin, mientras que el NADP+, o ms bien su
93
forma reducida NADPH, suele proveer el poder reductor necesario para las biosntesis
celulares.
4.2.1.1. Estructura qumica y modo de accin
La hidrlisis de NAD+ da lugar a 1 adenina, 1 nicotinamida, 2 ribosa y 2 ortofos-

fato. La de NADP+ produce los mismos componentes, pero con 3 ortofosfatos en lugar
de dos. En la figura 4.1 se presentan las estructuras de estas dos coenzimas.
Figura 4.1 Estructura de las coenzimas piridnicas (formas oxidadas)
En el caso del NAD+, podemos ver que se trata de un nucletido de adenina unido
a un nucletido de nicotinamida a travs de sus fosfatos. La nicotinamida (tambin lla-
mada niacina) es la 3-amidopiridina (de ah el nombre de coenzimas piridnicas). Los en-
laces de ambas bases a sus respectivas ribosas son del tipo -N-glicosdico. La unin gli-
cosdica en - da lugar a anlogos inactivos de estos coenzimas (-NAD+ y -NADP+).
En el NADP+ el fosfato adicional aparece unido al C-2 de la ribosa adenosnica.
94
En su forma oxidada, el anillo piridnico de la nicotinamida se presenta en forma

catinica, y de ah la representacin como NAD+ y NADP+ de los mismos, a pesar de que
al pH celular, los fosfatos estn ionizados y por tanto estos compuestos presentan una
carga neta de -1 el NAD+ y -2 el NADP+.
Al ser reducidos por un dador electrnico adecuado en presencia de la correspon-

diente enzima, por ejemplo, etanol y alcohol deshidrogenasa, el anillo piridnico se re-
duce a una forma quinonoide, desapareciendo la carga positiva y pasando el carbono 4 a
una forma metilnica -CH2- (figura 4.2). Con la reduccin hay un aumento significativo
de la absorbancia a 340 nm, lo que se emplea para el ensayo de todas las enzimas ligadas
a estas coenzimas.
En el curso de la reduccin, pues, el substrato que se oxida pierde dos tomos de

hidrgeno (dos protones y dos electrones), transfirindose a la coenzima un ion hidruro
(H-, un protn y dos electrones) y liberndose a la solucin el protn restante.
Figura 4.2 Reduccin del anillo piridnico de nicotinamida
Por esa razn las reacciones asociadas a estas coenzimas se representan as:
AH2 + NAD+ A + NADH + H+
o bien:
AH2 + NADP+ A + NADPH + H+
95
4.2.1.2. Significacin metablica y fisiolgica
Un gran nmero de oxidorreductasas utiliza coenzimas piridnicas. La gran ma-

yora de reacciones redox a nivel substrato, por ejemplo, suelen ser deshidrogenaciones
ligadas a estas coenzimas. No es de extraar, por tanto, la distribucin tan extensa de las
mismas en todas las clulas y tejidos. En los animales predomina en cantidad la pareja
NAD+/NADH sobre la de NADP+/NADPH, mientras que en los vegetales la propor-
cin suele ser aproximadamente la misma; en el caso del primero predomina la forma
oxidada, NAD+ y en el del segundo la forma reducida NADPH.
(a) NAD+
El par redox NAD+ / NADH + H+ participa, entre otras muchas reacciones, en

oxidorreducciones ligadas a procesos de produccin energtica, como la fermentacin
de la glucosa y la degradacin aerbica de cidos grasos, azcares y aminocidos. En el
primer caso, se produce en primer lugar NADH que posteriormente es regenerado a
NAD+; no hay produccin energtica directa, por tanto, a partir de estas coenzimas. En
las degradaciones aerbicas, sin embargo, el NADH producido por las deshidrogenasas
del ciclo de Krebs o de la -oxidacin son oxidadas por la cadena respiratoria y en ltimo
trmino sus electrones van a parar al oxgeno, teniendo lugar al mismo tiempo la fosfo-
rilacin oxidativa, con produccin de ATP.
(b) NADP+
En las clulas el NADPH se produce esencialmente en las reacciones redox de la

va de las pentosas; su concentracin determina lo que se ha dado en llamar poder reductor
de la clula, que es ampliamente utilizado en procesos de biosntesis (cidos grasos, este-
roides, etc.), as como de destoxificacin y mantenimiento. A diferencia de los procesos
respiratorios, que tienen lugar en la mitocondria, las biosntesis ligadas a NADPH son
de localizacin citoplsmica.
Por otra parte, el poder reductor generado en el proceso fotosinttico en plantas

verdes o microorganismos autotrficos toma normalmente la forma de NADPH.
96
4.2.1.3. Carcter vitamnico
Una gran cantidad de organismos, entre ellos el hombre, son incapaces de sinteti-
zar el anillo de nicotinamida (o el correspondiente cido nicotnico), por lo cual deben
recibirlo como factor diettico esencial. En el s. xviii el mdico de la corte de Felipe V,
Gaspar de Casal, describi el mal de la rosa en poblaciones cuya alimentacin era
esencialmente a base de maz. Esta enfermedad, llamada asimismo pelagra, consiste en
una serie abigarrada de sintomatologa neurolgica, cutnea e intestinal (la trada der-
matitis- diarrea-demencia). En 1937, Elvehjem y Woolley demostraron que la pelagra
poda ser prevenida por la administracin de cido nicotnico o de nicotinamida, reci-
biendo as el nombre de factor PP (preventivo de la pelagra) reconocido por los estudios
de von Euler y Warburg como un componente de la primitiva cozimasa de Harden y
Young. Tambin es conocida como Vitamina B3.
En realidad, la pelagra es una deficiencia alimenticia casi generalizada; es decir,

producida no solo por la deficiencia de nicotinamida, sino que va acompaada de otras
deficiencias vitamnicas o proteicas; de ah su variabilidad semiolgica. En cualquier
caso, se ha podido comprobar que en los enfermos de pelagra el metabolismo oxidativo
no est alterado significativamente; ello da pie a pensar que la limitacin en estos en-
fermos est en el papel que el NAD+ desempea en otros procesos, particularmente la
ADP-ribosilacin de protenas y su papel en la reparacin del DNA (por ejemplo, en
la DNA-ligasa) y en otros procesos asociados al flujo de informacin gentica.
4.2.2. Coenzimas flavnicas
La presencia de pigmentos flavnicos (del Lat. flavus, amarillo) fue detectada el

siglo xix en preparaciones de suero de leche; pigmentos de este tipo fueron parcialmente
caracterizados en los aos 30 del siglo xx por Szent-Gyrgyi y Ellinger, entre otros.
Fue el descubrimiento por Warburg de la enzima amarilla capaz de oxidar el NADPH
producido en la reaccin de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa lo que dio pie al conoci-
miento ms sistemtico de estas coenzimas. Warburg observ que al tratar con metanol
la enzima amarilla se disociaba en un pigmento y una protena incolora. El pigmen-
to fue caracterizado como flavin mononucletido (FMN), nombre algo incorrecto dado
que la unin de la base (isoaloxazina) al azcar (en realidad el polialcohol ribitol) no es
propiamente una unin glicosdica; una forma ms correcta de denominarlo sera la de
riboflavin fosfato. Con posterioridad al descubrimiento del FMN, Warburg y Christian
estudiaron la D-aminocido oxidasa, otra flavoenzima pero conteniendo flavin adenin
97
dinucletido (FAD). El FAD es la unin del FMN con un nucletido de adenina a travs
de los fosfatos, como en el caso del NAD+ (figura 4.3).
Figura 4.3 Estructura de las coenzimas flavnicas
A pesar de lo que superficialmente pudiera parecer al ver las estructuras de las

coenzimas flavnicas, y particularmente del FAD, sus caractersticas biolgicas son bas-
tante diferentes a las de las coenzimas piridnicas. El rasgo diferencial ms acusado es sin
duda la unin con la protena. Mientras en el caso de NAD+ y NADP+ esta unin no es
ms intensa que la de cualquier substrato, las coenzimas flavnicas aparecen fuertemente
unidas a la protena enzimtica, formando lo que comnmente llamamos flavoprote-
nas. En la flavoprotena tiene lugar normalmente todo el ciclo cataltico; la coenzima es
reducida por un dador electrnico y oxidada por un aceptor sobre la misma molcula, a
diferencia de las coenzimas piridnicas, que necesitan dos enzimas distintas, y por tanto,
su disociacin de las mismas. Otra importante diferencia estriba en que muchas coenzi-
mas flavnicas, formando las correspondientes flavoprotenas, pueden utilizar el oxgeno
molecular como aceptor electrnico.
98
La estructura de estas coenzimas se presenta en la figura 4.3. Constan de una base

tricclica, la isoaloxazina, unida a travs del N-10 al polialcohol ribitol. Esta estructura re-
cibe el nombre de riboflavina, y como su sntesis no es posible en el organismo humano,
debe ingresar como tal en la dieta. Tiene, por tanto, carcter vitamnico (vitamina B2).
El ribitol esterificado en C-5 a fosfato da lugar al riboflavin fosfato o flavin mo-

nonucletido (FMN), el cual aparece como coenzima en multitud de flavoprotenas. La
unin del FMN a travs de un anhdrido fosfrico con 5-AMP da lugar al flavin adenin
dinucletido (FAD), que es la otra coenzima flavnica.
El modo de accin en reacciones redox puede observarse en la figura 4.4.
Figura 4.4 Formas redox de las coenzimas flavnicas
La isoaloxazina plenamente oxidada puede captar uno o dos equivalentes de re-

duccin en forma de tomos de hidrgeno (y no ion hidruro como en las coenzimas
99
piridnicas). Esto da lugar a que existan tres grados en el proceso de reduccin del anillo:
la forma oxidada, la semiquinona y la forma plenamente reducida (FMNH2 y FADH2).
Las distintas flavoenzimas (se conocen alrededor de un centenar) se diferencian entre s,
por tanto, respecto al modo de oxidorreduccin en tres grupos: (a) las que oscilan entre
las formas plenamente reducida y plenamente oxidada, es decir, F - FH2, como la glucosa
oxidasa; (b) las que oscilan entre la forma oxidada y la semiquinona, F - FH, como es el
caso de la dihidrolipoamida deshidrogenasa; y (c) las que oscilan entre la semiquinona y
la forma plenamente reducida, es decir, FH - FH2.
4.2.2.2. Flavoprotenas
FAD y FMN aparecen en la clula unidos a protenas formando las llamadas

flavoprotenas. Como ya se ha dicho, la unin de las coenzimas a la apoprotena es mucho
ms fuerte que en el caso de los piridin nucletidos, hasta el punto que pueden ser
propiamente considerados como grupos prostticos. La unin es muy fuerte, con constantes
de disociacin del orden de 10-8 M a pH 7. El aumento de la fuerza inica y el descenso
del pH favorecen la disociacin del grupo flavnico, dejando libre la apoprotena. En
ocasiones encontramos la coenzima unida covalentemente a la estructura proteica,
generalmente a residuos de histidina o cistena.
La unin con la protena produce cambios importantes en las propiedades de las

flavinas:
(a) La unin a la protena determina la aparicin de especificidad. Las flavinas libres

pueden ser reducidas u oxidadas por multitud de dadores o aceptores electrnicos. La
unin a la protena hace mucho ms restringido el conjunto de compuestos que pueden
reaccionar con la flavina.
(b) La unin a la protena favorece la interaccin de las flavinas con otros grupos,
particularmente metales como Fe o Mo. Esto permite un gran espectro de actividades
redox para estas protenas. En este mismo sentido, podemos decir que aunque la mayor
parte de las flavoprotenas contienen un solo grupo prosttico, puede haberlas con dos,
en cuyo caso, teniendo en cuenta los modos de reduccin que veamos antes (reducida,
semiquinona y oxidada), los estados de oxidorreduccin de algunas flavoprotenas pue-
den ser extremadamente variados.
100
La riboflavina no puede ser sintetizada por el organismo animal; de ah que fue-

ra reconocida como factor vitamnico en la dieta con el nombre de vitamina B2. Sin
embargo, no se conoce en el hombre una enfermedad carencial definida por la falta de
riboflavina; s se ha reconocido la falta de la misma en sndromes pluricarenciales, como
el kwashiorkor y la pelagra. Las caractersticas clnicas supuestamente debidas a la falta de
riboflavina, como lesiones en torno a la boca y lengua, o posibles alteraciones corneales,
se observan tambin en otros estados carenciales, por lo que no pueden ser consideradas
como especficas.
4.2.3. Coenzimas hemnicas
Las estructuras tetrapirrlicas cclicas, porfirinas, presentan una amplsima

distribucin en toda la materia viviente. Podemos decir que su evolucin ha ido pareja con
la del metabolismo aerbico en general, es decir, con todos aquellos procesos relacionados
con el oxgeno. Desde la clorofila, pigmento tetrapirrlico cclico modificado presente
en organismos fotosintticos (y por tanto, relacionados con la evolucin del O2 libre en
la atmsfera), hasta las peroxidasas encargadas de combatir los efectos txicos del propio
oxgeno, pasando por transportadores de oxgeno, como hemoglobina y mioglobina y
transportadores de electrones como los citocromos, encontramos estructuras cuyo tipo
general se presenta en la figura 4.5. Esta estructura aparece con un metal coordinado
y formando el grupo prosttico de una protena, que en conjunto denominamos
hemoprotenas. Estos grupos, por otra parte, se comportan como coenzimas en el sentido
en que se expuso en la introduccin: al igual que los grupos flavnicos, no se disocian de
la protena.
101
Figura 4.5 Estructura del grupo hemo. Se trata de una protoporfirina IX coor-
dinada a un ion Fe++. El hemo es el grupo prosttico caracterstico de la hemog-
lobina y de los citocromos b.
A diferencia de los grupos flavnicos y piridnicos que hemos visto hasta ahora,
nuestro organismo sintetiza por completo la porfirina, por lo cual no tiene carcter vi-
tamnico. Est descrita en humanos una serie interesantsima de trastornos metablicos
relacionados con la sntesis del grupo porfirnico, las denominadas porfirias. Y adems, el
inters que presentan estos compuestos se extiende tambin a sus productos de degrada-
cin, los pigmentos biliares (bilirrubina, biliverdina, etc.).
Podemos apreciar en la figura 4.5 que se trata de un sistema tetrapirrlico cclico,

denominado genricamente porfirina y que de manera caracterstica es capaz de formar
quelatos con un tomo o ion metlico coordinado a los cuatro nitrgenos centrales del
anillo.
El papel fisiolgico de estos compuestos est ntimamente ligado al metal que

invariablemente aparece coordinado al sistema tetrapirrlico planar, que en las formas
funcionales de estas estructuras, aparece como grupo prosttico de una protena. En la
102
mayora de los casos, este metal es el hierro, bien en forma ferrosa, o en forma frrica, o
alternando ambas, o incluso en estados de valencia superiores, como en las peroxidasas.
Dado que el hierro se presenta en complejos hexacoordinados de forma octadrica (fi-
gura 4.6) su unin al grupo porfirnico deja libres otras dos posiciones de coordinacin.
Estas posiciones estn normalmente ocupadas bien por grupos de la apoprotena, o por
ligandos propios del sistema, o no estn ocupadas. El grupo porfirnico suele estar ubica-
do en el interior de la estructura proteica, dado su carcter hidrofbico.
Figura 4.6 Forma octadrica de los ligandos de coordinacin al hierro en las

hemoprotenas. Las posiciones 1-4 estn ocupadas por los nitrgenos pirrlicos;
5 y 6, por ligandos de la protena o bien, el 6, por otros ligandos (oxgeno, agua,
cianuro, etc.).
Existen tres grandes grupos de hemoprotenas relacionadas con el metabolismo ae-

rbico: las protenas transportadoras de oxgeno hemoglobina y mioglobina; las peroxi-
dasas y los citocromos. En esta exposicin trataremos brevemente de estos dos ltimos.
4.2.3.2. Las peroxidasas
Las peroxidasas (o hidroperoxidasas) son un grupo de hemoenzimas cuya funcin

metablica fundamental es la descomposicin de perxidos, productos a su vez de mul-
titud de reacciones oxidsicas. Tienen una amplia distribucin en la naturaleza, paralela
al desarrollo de la vida aerbica; en este sentido contribuyen a la defensa antioxidante
de la clula. Los perxidos, producto de numerosas reacciones metablicas, dan lugar
a radicales libres altamente reactivos y perjudiciales para la integridad de las estructuras
celulares. Las peroxidasas se encargan indirectamente, pues, de su eliminacin. Una pe-
roxidasa particularmente abundante es la catalasa, enzima encargada de la eliminacin
de perxido de hidrgeno (ver captulo 3).
103
Casi todas las peroxidasas conocidas suelen ser hemoprotenas que contienen una
ferriprotoporfirina IX. El modo de reaccin de las peroxidasas es bastante complejo y
puede seguirse por mediciones pticas y magnticas. As se ha podido determinar, por
ejemplo, que en el curso de la reaccin las posiciones quinta y sexta del complejo estn
esencialmente vacantes, y que el hierro pasa por estados de valencia superiores a tres (io-
nes ferrilo, 4+ y perferrilo, 5+).
La mayor parte de la catalasa celular est contenida en los peroxisomas, orgnulos

celulares que contienen tambin D-aminocido oxidasa y urato oxidasa. Estas partcu-
las son especialmente abundantes en los leucocitos polimorfonucleares, consumen una
gran cantidad del oxgeno celular y se cree que tienen un importante papel en la defensa
antioxidante. Hay quien cree que los peroxisomas son un vestigio de las partculas respi-
ratorias de las clulas protoeucariticas, antes del establecimiento evolutivo del sistema
simbitico mitocondrial.
4.2.3.3. Los citocromos
Los citocromos fueron descubiertos por McMunn en el siglo xix al estudiar teji-
dos animales con un espectroscopio y observar sus bandas de absorcin caractersticas.
Fue Keilin, alrededor de 1925, quien sistematiz el conocimiento en torno a estas he-
moprotenas (y a quien debemos el nombre de las mismas).
A diferencia de la hemoglobina y la mioglobina, los citocromos tienen ocupadas

todas las posiciones de coordinacin y su funcin fisiolgica se ejerce a travs de la al-
ternancia de estados ferroso (2+) y frrico (3+) en el hierro coordinado. Por esa razn los
citocromos actan esencialmente como transportadores electrnicos, y no como enzimas.
Los citocromos son molculas amplsimamente difundidas en la Naturaleza, y son el
prototipo de molculas conservadas, esto es, con secuencias de aminocidos muy poco
variadas a lo largo de la escala filogentica.
Los citocromos operan como transportadores electrnicos. Las reacciones en que

participan pueden representarse como
D- + cit (Fe3+) D + cit (Fe2+)
A + cit (Fe2+) A- + cit (Fe3+)
104
Es decir, el dador electrnico D cede un electrn a la forma oxidada del citocro-

mo, el ferricitocromo, que se reduce a ferrocitocromo; este cede el electrn a un aceptor
que se reduce. Encontramos entre los diversos citocromos conocidos una amplia gama
de potenciales redox. Estas variaciones se deben al entorno proteico del grupo hemo, que
vara de unos a otros.
Existen tres tipos principales de citocromos que reciben el nombre de citocro-

mos a, b y c. Los citocromos a suelen tener por lo general un potencial redox elevado
y por tanto los encontramos como dadores a los aceptores terminales de electrones: O2
en organismos aerbicos, NO3- y SO42- en bacterias anaerbicas. Estos citocromos que
reducen a los aceptores terminales se caracterizan por tener vacante la sexta posicin de
coordinacin, a diferencia de todos los dems citocromos, en los que el hierro aparece
hexacoordinado. Esta es la razn por la cual los citocromos terminales son sensibles a cia-
nuro y monxido de carbono, cuyo modo de accin consiste precisamente en la unin al
hierro a travs de la sexta posicin vacante e impidiendo su funcionamiento normal. La
porfirina de los citocromos a es el llamado hemo A, que se caracteriza por la presencia de
una cadena lateral poliprenoide (fitil) sustituyendo a la porfirina. En ocasiones se presen-
tan varios citocromos sobre un mismo complejo proteico; tal es el caso de la citocromo
oxidasa, que es una protena conteniendo citocromos a y a3 adems de Cu2+.
Los citocromos b suelen aceptar electrones a partir de substratos de bajo potencial

dentro de la cadena respiratoria. Su grupo prosttico es una protoporfirina IX con un
ion de hierro, es decir, el mismo grupo hemo que la hemoglobina y la mioglobina, con
la diferencia de que el ion de hierro oscila entre los estados 2+ y 3+. Dentro de este tipo
nos encontramos, aunque con caractersticas algo diferentes, al citocromo P-450, carac-
terstico de los sistemas redox microsmicos de clulas animales, implicados en impor-
tantes procesos de hidroxilacin (de esteroides, compuestos xenobiticos, compuestos
aromticos, etc.). En realidad, en torno al citocromo P-450 se establece todo un sistema
de transporte electrnico no mitocondrial responsable de una gran parte del consumo
celular de oxgeno, en el que se incluyen otros citocromos, flavoprotenas y ferrosulfo-
protenas.
Los citocromos c tienen un potencial redox intermedio entre los a y los b; por ello
los encontramos como transportadores centrales en los sistemas redox celulares. Uno de
ellos, el citocromo c (los dems se conoces como c2, c3, etc.) tiene la particularidad de ser
fcilmente extrable de la mitocondria por su solubilidad en agua. Esta caracterstica lo
hace nico en su gnero, dado que los dems suelen estar fuertemente unidos a membra-
nas de manera que su estudio ha de hacerse necesariamente a partir de la disociacin de
105
estas por mtodos ms o menos drsticos: detergentes, pH, etc. El grupo prosttico en
este tipo de citocromos es el hemo C, cuya estructura es anloga al B excepto en la unin
a la protena, que en este caso es covalente a travs de dos residuos de cistena invariantes
en la protena.
4.2.4. Quinonas
Un grupo muy extendido de cofactores redox est basado en el anillo quinnico y

su eventual reduccin a hidroquinona (figura 4.7).
Figura 4.7 El anillo quinnico como transportador redox.
Las formas biolgicamente relevantes de este tipo de coenzimas aparecen susti-

tuidas y con una cadena lateral poliprenoide, a travs de la cual se piensa que estos co-
factores se anclan en las estructuras lipdicas relacionadas con el transporte electrnico.
A diferencia de los cofactores que hemos estudiado en los tres ltimos apartados, las
ubiquinonas no aparecen unidas a una protena en sus fuentes naturales. Existen tres
grupos interesantes dentro de este tipo de coenzimas: las ubiquinonas, las plastoquinonas
y las vitaminas K.
4.2.4.1. Ubiquinona o Coenzima Q
La ubiquinona mitocondrial, tambin llamada coenzima Q, es un transportador

redox cuya estructura aparece en la figura 4.8.
106
Figura 4.8 Estructura de la ubiquinona o coenzima Q.
Posee una cadena lateral poliprenoide compuesta por diez unidades isoprnicas en
mamferos y seis en algunas bacterias. La ubiquinona opera en el transporte electrnico
mitocondrial, entre los complejos I y III y entre los complejos II y III, cuestin que es-
tudiaremos detalladamente en el metabolismo.
La ubiquinona no tiene carcter vitamnico.
4.2.4.2. Otras quinonas
Existen en la naturaleza muchas otras quinonas que operan como coenzimas re-
dox: las plastoquinonas, compuestos anlogos a la ubiquinona en la cadena de transporte
electrnico fotosinttico del cloroplasto; las vitaminas K o naftoquinonas y la pirroloqui-
nolina quinona (PQQ), grupo prosttico de las quinoprotenas, protenas presentes en
bacterias metilotrficas de gran inters biotecnolgico.
4.2.5. cido ascrbico (vitamina C)
Se trata de una molcula muy abundante en todos los seres vivos que opera esen-
cialmente como transportador redox, aunque son relativamente pocas las reacciones en-
zimticas conocidas en las que participa como coenzima. Por esta razn, se piensa que
su abundancia en los tejidos se debe ante todo a su poder antioxidante, ya que reacciona
de forma espontnea con multitud de aceptores electrnicos. El cido ascrbico es una
vitamina para los primates y el cobaya; el resto de los seres vivos sintetiza la molcula. Su
sndrome carencial es el escorbuto, enfermedad ampliamente conocida por los marineros
de la poca de navegacin a vela. Fueron precisamente estudios conducidos por la Royal
107
Navy britnica durante el siglo xviii los que sentaron las bases de la prevencin del es-
corbuto mediante las verduras frescas, y sobre todo, el zumo de lima. Reconocido en el
siglo xx como vitamina (la vitamina C), fue aislado y cristalizado por Szent-Gyrgyi en
1928, determinando Haworth posteriormente su estructura.
4.2.5.1. Estructura qumica
La estructura del cido ascrbico se muestra en la figura 4.9. Opera como

transportador redox mediante la cesin de dos hidrgenos y su transformacin a cido
dehidroascrbico. La forma reducida tiene carcter cido por la ionizacin del grupo
enediol. El anillo lactnico se hidroliza fcilmente en el cido dehidroascrbico, dando
lugar a la forma abierta, que ya no puede volver a reducirse.
Figura 4.9 cidos ascrbico y dehidroascrbico
El cido ascrbico puede ser oxidado por multitud de aceptores electrnicos; entre
ellos tenemos diversos colorantes, nitrato de plata (dando lugar a plata metlica), oxge-
no y yodo en presencia de trazas de metal, etc.
4.2.5.2. Funciones biolgicas
El cido ascrbico participa como coenzima en algunas reacciones de hidroxila-

cin catalizadas por las correspondientes hidroxilasas. Entre estas tenemos la dopamina
-hidroxilasa, enzima que da lugar a noradrenalina en la sntesis de catecolaminas neuro-
108
transmisoras. Asimismo, participa en el proceso de hidroxilacin de residuos de lisina y

prolina en el colgeno, en presencia de oxgeno e ion ferroso.
4.2.6. Glutatin
El glutatin es el tripptido -glutamil cisteinil glicina (figura 4.10). Descubierto

en la levadura en 1888, se obtuvo su sntesis en 1935. No tiene carcter vitamnico.
Figura 4.10 Glutatin reducido (GSH)
Est presente en la prctica totalidad de tejidos y clulas vivas, a concentraciones

que pueden llegar al nivel mM. Es el tiol de bajo peso molecular ms abundante entre las
biomolculas. Se suele representar la estructura del glutatin como GSH para la forma
reducida y GSSG el disulfuro. La reaccin ms caracterstica es su oxidacin al disulfuro:
2GSH + A GSSG + AH2
La oxidacin a GSSG puede tener lugar mediante yodo o ferricianuro. Tambin

puede ser oxidado por oxgeno molecular y citocromo c.
Otra reaccin importante caracterstica del glutatin es la transferencia del grupo

-glutamilo a un aminocido, reaccin catalizada por la -glutamil transferasa:
GSH + aa -Glu-aa + Cys-Gly
109
Las funciones del glutatin pueden establecerse en dos categoras: (a) protectoras
contra el stress oxidativo y (b) de transporte y metablicas. Nos ocuparemos solamente
de las primeras.
(1) El glutatin participa en reacciones de transhidrogenacin, intercambiando

sus equivalentes reductores con otros tioles intracelulares, por lo que se cree que su prin-
cipal misin es el mantenimiento de stos en estado reducido. Se ha podido comprobar
que intercambia hidrgeno in vivo con cistena, homocistena, coenzima A y protenas.
Se han aislado igualmente disulfuros mixtos.
(2) Participa asimismo como donador de la capacidad reductora necesaria para la

formacin de desoxirribonucletidos (sistema de la ribonucletido reductasa).
(3) El glutatin forma parte de sistemas de proteccin contra perxidos y radica-

les libres. La enzima clave en estos procesos es la glutatin peroxidasa, en cuya reaccin
acta como correductora la forma GSH producindose GSSG. Posteriormente este se
reduce a GSH por el concurso de la GSSG reductasa, enzima muy difundida que utiliza
NADPH. As, una de las consecuencias del dficit en glucosa-6-fosfato dehidrogenasa es la
inversin de la relacin celular normal GSH/GSSG, que en condiciones normales es
muy superior a la unidad. Asimismo hay en dicho dficit desnaturalizacin de la hemog-
lobina y destruccin de la membrana.
(4) Puede ser oxidado enzimticamente por cido dehidroascrbico en presencia

de glutation dehidrogenasa; la forma oxidada, por su parte, es reducida por la glutation
reductasa en presencia de la coenzima NADPH.
4.2.7. Otras coenzimas redox
Estudiaremos en su contexto metablico otras coenzimas que participan en pro-

cesos de oxidorreduccin, como las ferredoxinas (o protenas NHI, Non-Heme Iron), las
biopterinas, el cido lipoico, etc.
110
4.3. Coenzimas asociados a otras reacciones (no redox)
4.3.1. Tiamina pirofosfato
Tiamina pirofosfato es una coenzima que opera esencialmente como transporta-

dor de grupos carbonilo (aldehdo o ceto) y por tanto con un importante papel metab-
lico en las reacciones en que participan cetocidos o cetosas. Fue reconocido como un
cofactor indispensable en la decarboxilacin no oxidativa de piruvato en levadura por
Lohman y Schuster en 1937, y caracterizado con el nombre de cocarboxilasa:
Previamente se haba reconocido a la tiamina como un factor nutricional esencial

en el hombre y los animales, habiendo sido aislada independientemente por Jansen y
Donath, por una parte, y Windaus, en Alemania, en 1925 (recibi el nombre de vita-
mina B1). Pronto se demostr su papel fundamental en la descarboxilacin oxidativa de
piruvato y de -cetoglutarato, reacciones ambas asociadas el ciclo de Krebs. La estructura
de la tiamina fue establecida por Williams y Cline en 1935 (figura 4.11).
Figura 4.11 Tiamina pirofosfato
111
La tiamina consta de una pirimidina sustituida unida a un grupo tiazlico, como

se puede apreciar en la figura 4.11. La parte activa de la molcula es el grupo tiazlico. La
coenzima activa es tiamina pirofosfato (TPP), que aparece unida a la protena enzimtica
de una forma bastante dbil.
La tiamina pirofosfato participa en varias reacciones enzimticas. Para nosotros,

las ms importantes son las ya citadas descarboxilaciones oxidativa y no oxidativa de
-cetocidos. Por ejemplo, la no oxidativa a acetaldehdo y la oxidativa a acetil-CoA
catalizada por el complejo de la piruvato dehidrogenasa; una reaccin similar es la decar-
boxilacin de -cetoglutarato a succinilCoA en el ciclo de Krebs. En estos dos ltimos
casos, se trata de reacciones muy complejas que requieren la accin concertada de varias
enzimas y coenzimas.
Los animales pluricelulares han perdido la capacidad de sntesis de tiamina, por lo

cual debe ingresar en la dieta como factor esencial, y en este contexto recibe el nombre
de vitamina B1. Es asimismo un factor indispensable para el crecimiento de muchos mi-
croorganismos.
La carencia de vitamina B1 en los animales de experimentacin produce una poli-

neuritis comparable al sndrome carencial que se da en humanos, el beriberi, polineuritis
endmica en el Sudeste asitico y en general en todos los pases cuya alimentacin se
hace a base de arroz descascarillado. En otro contexto, el dficit de tiamina es un factor
patognico importante en el sndrome de Wernicke-Korsakow de los alcohlicos crnicos.
4.3.2. Piridoxal fosfato
El piridoxol o piridoxina fue parcialmente caracterizado por Birch y Gyorgy en

1934. Su estructura fue determinada por Gale y Epps, y Braunstein y Kritzman inde-
pendientemente en 1943. Caracterizado en principio como un factor necesario para la
prevencin de la acrodinia, dermatitis carencial desarrollada en ratas sometidas a dietas
sintticas suplementadas con tiamina y riboflavina, se pudo comprobar posteriormente
que alguno de los metabolitos urinarios del piridoxol tenan una capacidad preventiva
112
mucho mayor, particularmente la forma aldehdo piridoxal y la amnica piridoxamina.

En sistemas microbiolgicos de ensayo se determin que el metabolito activo es el piri-
doxal fosfato, lo que es cierto asimismo para los dems organismos. Es un factor indis-
pensable en la dieta humana; como tal se le conoce como vitamina B6.
El piridoxal fosfato participa en una gran cantidad de reacciones enzimticas. La

gran mayora de ellas, pero no todas, estn relacionadas con el metabolismo de los ami-
nocidos. Este es el aspecto qumico mejor conocido del piridoxal como coenzima, que
discutiremos a continuacin.
4.3.2.1. Estructura qumica y modo de accin; metabolismo de aminocidos
El piridoxol es la 3-hidroxi 4,5-dihidroximetil 2-metil piridina (figura 4.12). La

forma enzimticamente activa es el piridoxal fosfato, en el que el sustituyente en 4 es un
grupo aldehdo y el alcohol en 5 aparece esterificado a ortofosfato. En esta forma aparece
unido ms o menos fuertemente a las protenas en las que opera como coenzima.
Figura 4.12 Estructura de las diversas formas del piridoxal
El espectro de reacciones en que participa el piridoxal fosfato se extiende princi-

palmente en las relacionadas con el metabolismo y reacciones generales de aminocidos.
Participa entre otras muchas, en (a) racemizaciones; (b) transaminaciones; (c) descar-
boxilaciones.
En la forma descrita, el piridoxal fosfato acta como coenzima en los grupos 2.4.1
(aminotransferasas o transaminasas), 4.1.1 (carboxiliasas o decarboxilasas) y 5.1.1 (ami-
nocido racemasas), entre otros.
113
4.3.2.2. Otras reacciones dependientes de piridoxal fosfato
Algunas reacciones no directamente relacionadas con el metabolismo de los

aminocidos dependen asimismo de piridoxal fosfato. Entre ellas destaca la glucgeno
fosforilasa (EC 2.4.1.1) encargada de la degradacin del glucgeno. No se conoce el
modo de accin de la coenzima en esta reaccin.
Otros enzimas o grupos en los que participa el piridoxal son: transferasas de gru-
pos CH2OH-, CHO-, CHNH2-, etc. (grupo 2.1.2) y algunas aldehdo-liasas del grupo
4.1.2.
No se ha descrito en la especie humana un sndrome propio de la carencia de vita-

mina B6. En pacientes tratados durante mucho tiempo con isoniazida (un tuberculost-
tico) pueden aparecer sntomas de deficiencia (dermatitis, anemia microctica, etc.) que
remiten rpidamente ante el tratamiento con la vitamina. En el hombre, como en todos
los mamferos, el requerimiento de B6 vara con el aporte proteico de la dieta. Cuanto
mayor es este, mayor es el requerimiento de vitamina B6.
4.3.3. Coenzimas folnicas
El cido flico fue primitivamente aislado a partir de levadura por Day como un
factor nutricional requerido para el crecimiento de Lactobacillus. Aislado posteriormente
de las hojas de espinaca, en las que se presenta en elevada concentracin, y de donde
deriva precisamente su nombre (Lat. folium, hoja), fue reconocido como factor vita-
mnico (vitamina B9) en la dieta humana; su carencia es la responsable de la aparicin
de anemias megaloblsticas. Como veremos, algunos frmacos activos en la teraputica
antineoplsica son anlogos de cido flico (aminopterina y methotrexate, por ejemplo),
por lo que el sndrome carencial correspondiente tiene una cierta importancia clnica.
La coenzima activa es el cido tetrahidroflico (THF), forma reducida del cido

dihidroflico que se oxida muy fcilmente en presencia de O2, razn por la cual esta ltima
es la forma comn en que se asla esta coenzima a partir de fuentes biolgicas. El papel
metablico del cido tetrahidroflico est ntimamente relacionado con la transferencia
de grupos monocarbonados, particularmente formil (-CHO), hidroximetil (-CH2OH),
114
formimino (-CHNH), metileno (-CH2-) y metenil (-CH=); con menor frecuencia opera
como transportador de grupos metilo (-CH3). En este sentido podemos considerar al cido
tetrahidroflico como miembro de una familia de coenzimas involucrados de un modo
u otro en el metabolismo de grupos monocarbonados, y que estara integrado, adems
del THF, por S-adenosil metionina (como transportador principal de grupos metilo), la
biotina (de grupos carboxilo - COOH) y las coenzimas cobamdicas (cuya funcin no
suele ser la de transportadores estrictos, como los anteriores, sino que participan en sus
interconversiones).
Qumicamente el cido tetrahidroflico es una pteridina reducida unida al cido

p-aminobenzoico o 4-aminobenzoico (PAB) y este a uno o varios residuos de cido glutmico
unidos a travs del grupo -carboxilo, dando lugar a la estructura pteroil n-glutmico o
pteroil poliglutmico (figura 4.13). El grado de polimerizacin del cido glutmico vara
entre 1 y 10.
Figura 4.13 Estructura del cido tetrahidroflico (THF)
La funcin transportadora de grupos monocarbonados tiene lugar a travs de la

formacin de enlaces covalentes entre estos y los nitrgenos 5 y 10 de la pteridina. Al-
gunas de estas estructuras se presentan en la figura 4.14: N10 formil-THF (1), N5N10
metenil-THF (2), y N5N10 metilen-THF (3).
115
Figura 4.14 Algunas coenzimas folnicas. El grupo transportado se representa

en rojo
Participan como coenzimas en los siguientes sistemas, entre otros:
Transferasas: EC 2.1.1.13-14, enzimas encargadas de la transferencia de grupo

metilo desde metil-THF a homocistena para dar metionina. La enzima de mamfero
requiere una coenzima cobamdica. EC 2.1.2.1-10, que catalizan las reacciones propias
de estas coenzimas: transferencias de grupos formil, hidroximetil, formimino, etc.
Ligasas: EC 4.3.2.12, dihidrofolato sintetasa; EC 4.3.3.2, metenil-THF sinteta-

sa; y EC 4.3.4.3, formil-THF sintetasa.
La funcin transportadora de grupos monocarbonados es esencial en la sntesis

de nucletidos y, por lo tanto, en la sntesis de cidos nucleicos. Tanto en la sntesis del
anillo purnico como en muchos otros procesos asociados a dicha sntesis (por ejemplo,
conversin de uracilo en timina) las coenzimas folnicas son indispensables.
116
La carencia de cido flico (vitamina B9) en la especie humana se traduce en una

anemia de tipo megaloblstico como principal sntoma (se llaman megaloblsticas las
anemias que cursan con hemates de mayor tamao que el normal). La causa de la misma
radica probablemente en la incapacidad de sntesis de cidos nucleicos ante la carencia
de cido flico. En este sentido, sealaremos que las coenzimas folnicas participan en la
incorporacin de dos carbonos del anillo purnico (C2 y C8) y en la incorporacin del
grupo 5-metil de la timina. En las carencias experimentales de cido flico puede obser-
varse que el suplemento de la dieta con purinas hace desaparecer el sndrome carencial.
La importancia de este tipo de megaloblastosis ha aumentado ltimamente debido

al empleo de agentes antiflicos en la teraputica antineoplsica, en especial methotrexate
y aminopterina. Por tanto, estas anemias pueden darse en individuos sometidos a este
tipo de tratamientos.
4.3.3.3. Farmacologa asociada al cido flico
Los anlogos de cido flico se emplean en la teraputica antineoplsica por su pa-

pel de inhibidores indirectos de la sntesis de cidos nucleicos. Los principales antiflicos
son los ya citados aminopterina y methotrexate (figura 4.15), que operan inhibiendo a la
dihidrofolato reductasa, encargada de la formacin de cido tetrahidroflico.
Figura 4.15 Anlogos de cido flico empleados en teraputica
117
En otro orden de cosas, la teraputica antibacteriana emplea desde principios del

siglo xx las sulfonamidas (ver figura 4.15) que son anlogos del cido 4-aminobenzoico
y en cuya presencia no puede tener lugar la sntesis normal de cido flico en bacterias
(inhiben la folato sintetasa de estos organismos). Por esta razn las sulfonamidas no
actan sobre organismos incapaces de formar cido flico, como por ejemplo la especie
humana; y de ah su inters teraputico. Una accin parecida puede atribuirse al cido p-
aminosaliclico (PAS), primer quimioterpico que se demostr efectivo en el tratamiento
antituberculoso.
4.3.4. Coenzimas cobamdicas
En 1926 Murphy describi el valor teraputico del extracto de hgado en la anemia

perniciosa humana, un sndrome megaloblstico asociado a trastornos gstricos. En 1948,
e independientemente, los equipos de Folkers en Estados Unidos y Smith en Inglaterra
cristalizaron el factor responsable, al que se le haba dado el nombre de vitamina B12. En
1957, gracias a los estudios de D. Hodgkin se pudo conocer la complicada estructura
qumica de la misma. Se trata de un factor que no es sintetizado ni por animales ni
por plantas; nicamente ciertos microorganismos, afortunadamente muy abundantes,
producen esta vitamina. Es asimismo requerida para el crecimiento de muchos otros
microorganismos, lo que ha facilitado su aislamiento gracias al desarrollo de ensayos
microbiolgicos. Otra observacin importante fue que la anemia perniciosa humana se
debe, en la mayor parte de los casos, no a la falta de vitamina B12, sino a la carencia de
una protena presente en la secrecin gstrica, el factor intrnseco, que es el responsable
de la absorcin intestinal de la vitamina B12.
Tal y como es normalmente aislada del extracto de hgado, la vitamina B12 aparece
bajo la forma de cianocobalamina, cuya estructura se presenta en la figura 4.16.
118
Figura 4.16 Estructura de la cianocobalamina
Consiste en un sistema tetrapirrlico llamado corrina y una estructura parecida

a un nucletido (bencimidazol). El anillo corrnico (por lo que las coenzimas cobam-
dicas se llaman tambin corrinoides), es semejante a una porfirina, con la salvedad de
presentar dos pirroles unidos directamente y no por el habitual grupo metnico de las
porfirinas. Coordinado a los nitrgenos pirrlicos aparece un ion de cobalto, cuyo esta-
do de valencia vara segn la naturaleza de los distintos corrinoides. La quinta posicin
de coordinacin del cobalto aparece unida al nucletido. El ligando de la sexta vara; en
la cianocobalamina se trata de un ion cianuro CN- pero es un artefacto del mtodo de
extraccin. En esta posicin pueden verse asimismo los grupos hidroxi, agua, nitrito,
cloruro y sulfato, dando lugar a las distintas cobalaminas: hidroxicobalamina, acuocoba-
lamina, nitritocobalamina, etc.
Las formas activas, como coenzimas cobamdicas o corrinoides, presentan la sexta

posicin de coordinacin del cobalto ocupada por un ligando distinto a los aniones con
los que suelen ser aisladas. En un caso se trata del nuclesido 5-desoxiadenosina (otra
singularidad: los desoxinuclesidos del DNA son 2-desoxi y no 5-desoxi como en este
caso), y hablamos entonces de adenosilcorrinoides. En otros casos la sexta posicin est
ocupada por agua, por lo que hablamos de acuocorrinoides. Los sistemas enzimticos me-
jor caracterizados en los que participan las coenzimas cobamdicas son, por lo general,
sistemas bacterianos. Son muy pocas las enzimas conocidas de tejidos de mamfero que
requieran estas coenzimas.
119
4.3.4.2. Modo de accin
Se ha podido comprobar que los adenosil corrinoides participan en reacciones

en las que hay un intercambio de hidrgeno con otro grupo situado en principio en un
carbono contiguo (intercambio 1,2), aunque en ocasiones puede darse este intercambio
de forma intermolecular y no necesariamente intramolecular. Un ejemplo de estas reac-
ciones es la catalizada por la metilmalonil-CoA mutasa, que se presenta en la figura 4.17.
Figura 4.17 Reaccin de la metilmalonil-CoA mutasa
Las coenzimas cobamdicas participan en muchas otras reacciones, de distinto

tipo; desde la ribonucletido reductasa bacteriana (fundamental en la sntesis de DNA),
pero no en la de mamferos.
Tambin participan en la formacin de metionina a partir de homocistena; esta

actividad existe tanto en bacterias como en mamferos. De hecho, se puede mantener a
ratas en dietas carentes de metionina si se las suplementa con homocistena.
Las cobamidas participan tambin en la sntesis de metano en bacterias metano-

gnicas.
Ni las plantas superiores ni los animales son capaces de sintetizar coenzimas coba-
mdicas, y para muchos microorganismos se trata de un factor necesario para su creci-
miento. La carencia pura de vitamina B12 no existe en la prctica; normalmente la flora
bacteriana intestinal sintetiza toda la necesaria en la nutricin. En la especie humana, el
sndrome carencial (anemia perniciosa) se debe esencialmente a la carencia de factor in-
trnseco. Este es una glicoprotena producida por las clulas parietales del estmago, con
120
un P.M. de 50 kDa, que fija vitamina B12 en la proporcin 1:1 y que es esencial para la
absorcin de la vitamina en los tramos distales del tubo digestivo. Una vez absorbidas,
las cobalaminas circulan en la sangre asociadas a dos protenas, transcobalaminas I y II.
Las principales fuentes naturales de esta vitamina se dan en los fangos y en el es-
tircol; los tejidos animales, como el hgado, pueden ser asimismo una fuente rica en la
vitamina, pero no los vegetales.
4.3.5. Biotina
Reconocida en principio como un factor de crecimiento para la levadura, la bio-

tina fue aislada de la yema de huevo por Kgl en 1935, y se identific con la coenzima
R de Rhizobium. Du Vigneaud, en 1943, estableci su estructura qumica e identific
la biotina como el factor capaz de prevenir la aparicin del sndrome txico de la clara de
huevo (producido por la administracin a ratas de grandes cantidades de clara de huevo
cruda). Los estudios de Lardy sugirieron un papel para la biotina en las reacciones de
carboxilacin, ampliamente corroborados por estudios posteriores. La biotina tiene en
el hombre carcter vitamnico (fue conocida como vitamina H, pero hoy se prefiere el
nombre de Vitamina B7).
La estructura de la biotina se presenta en la figura 4.18. Se presenta normalmente

unida a las protenas a travs del carboxilo de su cadena lateral unido a un grupo -amino
de la lisina. De hecho, en hidrolizados de estas enzimas se encuentra frecuentemente la
biocitina, formada por la unin de biotina y lisina.
121
Figura 4.18 Estructura de la biotina y su unin a protena.
Las reacciones en que participa la biotina son esencialmente carboxilaciones de-

pendientes de ATP (que se hidroliza a ADP en el proceso), catalizadas por enzimas del
grupo 6.4 (ligasas C-C). Como ejemplos podemos citar la piruvato carboxilasa y la acetil-
CoA carboxilasa.
Las reacciones de carboxilacin mediadas por biotinil-enzimas tienen lugar me-

diante la formacin dependiente de ATP de carboxibiotina (figura 4.19).
Figura 4.19 Estructuras de biotina y carboxibiotina
122
4.3.5.2. Avidina
El sndrome txico de la clara de huevo se debe a la existencia en esta de una con-

centracin apreciable de avidina. Se trata de una glicoprotena de 70 kDa, compuesta
por cuatro subunidades idnticas, y que es capaz de fijar biotina con una extraordinaria
afinidad (Ka de aprox. 1015). De ah que la toxicidad de la clara de huevo resulte de eli-
minar prcticamente toda la biotina libre.
4.3.6. S-adenosil metionina
La S-adenosil metionina (SAM, S-AM) es una coenzima que participa en la prc-

tica totalidad de las reacciones de metilacin que se dan el medio biolgico. No tiene
carcter vitamnico, siendo sintetizada por el organismo humano siempre que haya su-
ministro diettico de metionina (que es un aminocido esencial)
En la figura 4.20 aparece la estructura de la S-adenosil metionina. La caracterstica

ms acusada de este compuesto es la presencia de un grupo sulfonio, lo que le confiere
un carcter de compuesto de alta energa de hidrlisis.
Figura 4.20 Estructura de la S-adenosil metionina
4.3.6.2. Funcin metablica
La prctica totalidad de las metilaciones metablicas conocidas estn mediadas

por la S-adenosil metionina. Es decir, casi todas las enzimas del grupo 2.1.1 operan con
esta coenzima. Alguno de los procesos con particular inters biolgico son los siguientes:
123
(a) Sistemas de metilacin de DNA. El reconocimiento del DNA como propio

tiene lugar en las clulas a travs de un patrn especfico de metilacin de las bases. Si
este no existe, el DNA es degradado por enzimas de restriccin. Las metilaciones ms
frecuentes tienen lugar en N6 de adenina y C5 de citosina.
(b) Sntesis de ribotimidilato a partir de UMP para la formacin de tRNA.
(c) Sntesis de lecitinas (fosfatidil colinas) a partir de fosfatidil-etanolaminas.
(6) Metabolismo e interconversiones de neurotransmisores; por ejemplo, forma-

cin de adrenalina a partir de noradrenalina; O-metilacin de catecoles por la cate-
col-O-metil transferasa (COMT); metilacin de la N-acetil serotonina por la HIOMT
(hidroxiindol-O-metil transferasa) para dar melatonina, hormona muy abundante en la
glndula pineal y cuya actividad parece estar ligada a ritmos biolgicos cuyo perodo es
de 24 horas (ritmos circadianos).
4.3.7. Pantetenas
Estas coenzimas funcionan metablicamente como transportadores de grupos

acil. Dentro del grupo se distinguen dos coenzimas: la coenzima A y la protena trans-
portadora de acilos (ACP, Acyl Carrier Protein).
La coenzima A es una molcula de muy amplia distribucin en todas las clulas.

En realidad, podemos decir que las formas metablicamente activas de los cidos grasos
son derivados de coenzima A, un poco de la misma manera que los steres fosfricos son
la forma metablica activa de los azcares.
La coenzima A est relacionada con el requerimiento diettico de cido pantotnico

como factor vitamnico (Vitamina B5). Lipmann demostr la participacin del cido
pantotnico en la estructura de la coenzima A. Posteriormente, Vagelos caracteriz un
pptido requerido en la biosntesis citoplsmica de cidos grasos, llamado protena trans-
portadora de acilos (ACP segn las siglas inglesas) y cuyo grupo activo era otro derivado
de cido pantotnico, la 4-fosfopantetena.
124
El cido pantotnico (figura 4.21) es la pantoil -alanina. Es esta la parte de la

molcula que los organismos animales no pueden sintetizar y que es requerida por tanto
en la dieta. La unin del cido pantotnico con la cisteamina (producida por descar-
boxilacin de cistena) da lugar a la pantetena, que es la estructura comn en estas dos
coenzimas.
Figura 4.21 Estructura del cido pantotnico y de la pantetena.
La coenzima A se forma por unin de la pantetena a un 3-fosfo ADP (figura

4.22) dando lugar a una compleja estructura con muchos sitios reactivos potenciales; los
estudios de Lynen, sin embargo, demostraron que el grupo reactivo de la coenzima A es
el tiol (-SH) terminal. Como tantas otras coenzimas, pues, la coenzima A presenta una
estructura de nucletido de adenina.
Figura 4.22 Estructura de la coenzima A
125
La ACP es un pptido de un peso molecular de aproximadamente 8500 en E.coli.

El grupo prosttico es una pantetena unida por un enlace fosfodister a un residuo de
serina en el pptido.
4.3.7.2. Modo de accin
El aislamiento y caracterizacin de la coenzima A por parte de Lynen demostr

que la accin de la coenzima A es a travs de la formacin de tiolsteres. Estos steres
tilicos son compuestos de alta energa de hidrlisis. La coenzima A se une a los grupos
acil- a travs de este tipo de enlaces. Los acil-CoA (o acil-S-CoA) formados participan en
todo tipo de reacciones en los que se requiere un cido carboxlico activado. Esto nos da
idea de la gran importancia de la coenzima A en el metabolismo de cidos grasos.
La ACP opera en la sntesis de cidos grasos catalizada por el complejo de la cido

graso sintetasa citoplsmica. En este sentido, los derivados de ACP llevan a cabo reaccio-
nes muy parecidas a los derivados de coenzima A.
4.3.8. Carnitina
La carnitina (-hidroxi -butirobetana, figura 4.23) es un transportador de acilos

con una funcin muy concreta: la translocacin de cidos grasos a travs de la membrana
mitocondrial. Los derivados de CoA y la propia CoA son molculas muy grandes que no
atraviesan dicha membrana. Por ello las enzimas 2.3.1.7 y 2.3.1.8 (acil-CoA: carnitina
aciltransferasas) forman los correspondientes derivados acil-carnitina. En este caso el en-
lace formado es un O-acil de alta energa con el carboxilo de la carnitina.
Figura 4.23 Estructura de la carnitina.
No parece que la carnitina tenga carcter vitamnico. Ahora bien, su sntesis re-
quiere lisina y S-adenosilmetionina, por lo que algunos autores recomiendan su adicin
126
a la dieta, sobre todo a deportistas; parece que en muchos casos la concentracin de car-
nitina es limitante en cuanto a la oxidacin mitocondrial de los cidos grasos.
4.3.9. 3-Fosfoadenosil 5-fosfosulfato (PAPS)
Esta coenzima es el principal donador de grupos sulfato en el metabolismo, al

tiempo que en los organismos capaces de reducir sulfato a sulfuro (vegetales y algunos
microorganismos), el PAPS es la forma primitiva de entrada del azufre en el metabolis-
mo. Su estructura aparece en la figura 4.24.
Figura 4.24 Estructura del fosfoadenilil fosfosulfato (PAPS).
El PAPS no tiene carcter vitamnico. Esta coenzima opera con todas las sulfo-
transferasas del grupo 2.8.2. Algunas de las funciones ms importantes de este proceso
son las siguientes:
(a) Transferencia de grupos sulfato a polisacridos en la formacin de condroitin

sulfatos, heparina, heparan- y dermatan sulfatos, etc.
(b) Formacin de sulftidos por sulfatacin de glicolpidos.
127
4.3.10. Adenosina 5 trifosfato (ATP)
Toda la energa libre producida o captada en los procesos de fermentacin, respi-

racin y fotosntesis adopta en todos los organismos conocidos la forma de ATP. El papel
de este nuclesido trifosfato fue establecido por Lipmann, y la variedad de procesos en
los que participa a todos los niveles metablicos impide una discusin completa en el
presente contexto. La estructura del ATP se presenta en la figura 4.25. Toda la molcula
puede ser sintetizada por cualquier organismo; no tiene, pues, ningn carcter vitam-
nico.
Figura 4.25 Estructura del adenosin-5-trifosfato (ATP).
Las reacciones en que participa ATP pueden clasificarse dentro de dos grandes
grupos: transferencia de alguna porcin de la molcula de ATP a un aceptor adecuado, o
bien rotura de los enlaces pirofosfato del ATP para suministrar energa libre a reacciones
en principio desfavorables energticamente.
(a) Reacciones de transferencia ligadas al ATP
La gran mayora de las enzimas de los grupos 2.7.1-4 (fosfotransferasas o kinasas)

utilizan ATP para la transferencia de un fosfato a un aceptor adecuado.
(b) Suministro de energa para otras reacciones
El ATP participa tambin en procesos que normalmente no tendran lugar por

sus caractersticas energticas. En este caso, el proceso en cuestin aparece acoplado a la
hidrlisis de algn enlace del ATP que provee un intercambio energtico favorable.
128
4.3.11. Otros nucletidos que operan como coenzimas
En el metabolismo de los monosacridos son fundamentales los derivados de uri-

rindifosfato. Los UDP-monosacridos son los substratos preferentes de las enzimas del
grupo 2.4.1 (hexosil transferasas). Estos derivados operan normalmente en la forma-
cin de glicsidos (hetersidos y polisacridos) y de glucuronoconjugados en los procesos
de destoxificacin, as como en reacciones de transformacin del azcar (intercambio
UDP-glucosa por UDP-galactosa, por ejemplo).
Otros nucletidos participan tambin en reacciones similares. As, en los vegetales

los nucletidos de adenina sustituyen a los de uracilo en todas estas reacciones. En otros
procesos operan como coenzimas de transferencia los CDP-derivados (por ejemplo,
CDP-colina y CDP-etanolamina en la sntesis de lpidos complejos). Otros derivados
nucleotdicos lo son de GDP (p.e. GDP-manosa o GDP-fucosa) o de CMP (CMP-N-
acetilneuramnico).
129
CAPTULO 5
CINTICA DE LAS REACCIONES ENZIMTICAS

5.1. Introduccin
5.1.1. Inters de los estudios cinticos
Con mucha frecuencia la cintica de reacciones enzimticas es un tema que para

estudiantes de Biologa o Medicina parece algo innecesariamente formalista, adems de
tedioso. Este punto de vista se ve reforzado cuando, al pasar al laboratorio, vemos que
el comportamiento real de las enzimas dista a veces mucho de la pretendida claridad de
las explicaciones cinticas. En particular, en el campo de la regulacin enzimtica, vemos
muy a menudo que cada enzima agota su especie; es decir, los modelos generales para
explicar comportamientos regulatorios se aplican, y con dificultades, a un nmero redu-
cido de casos.
Sin embargo, la importancia de los estudios cinticos bien merece emplear un

tiempo considerable en su estudio. Trataremos a continuacin de ofrecer algunas razo-
nes; veamos primero las ms generales:
(a) En la Biologa actual falta todava un tratamiento rigurosamente cuantitativo de

los fenmenos. Como veremos, la cintica de la accin enzimtica se describe mediante
relaciones cuya importancia transciende el marco relativamente restringido de los bioca-
talizadores para dar lugar a una primera aproximacin cuantitativa al fenmeno viviente,
en tanto en cuanto una gran cantidad de hechos biolgicos pueden reducirse a una inte-
raccin protena-ligando. De todas estas interacciones, la que tiene lugar entre enzima y
substrato es, de lejos, la ms y mejor estudiada.
(b) El conocimiento del mecanismo de reaccin implica llegar a niveles atmicos y

moleculares, lo cual no es siempre posible, a pesar de todos los progresos instrumentales.
En estos casos, un estudio cintico detallado es la nica va de que disponemos para ob-
tener algn dato sobre el mecanismo de la reaccin. Incluso cuando es posible un estudio
ms estructural del mecanismo, el estudio cintico es una condicin previa; cualquier
camino propuesto para la reaccin deber concordar con los datos experimentales cin-
ticos.
(c) De todos es conocida la sensibilidad de los sistemas biolgicos a variables como pH

y temperatura, particularmente en organismos pluricelulares. Esta sensibilidad no solo se
aprecia a nivel qumico, sino tambin, y a veces dramticamente, en aspectos fisiolgicos
132
y fisiopatolgicos. La constancia del medio interno, principio bsico en la fisiologa, no

es ms que el prerrequisito para el correcto funcionamiento de las enzimas (o en sentido
amplio, de los receptores). De ah la importancia del estudio de las variables cinticas
mencionadas.
(d) El fenmeno de la inhibicin enzimtica es la base y fundamento de toda la Tera-

putica farmacolgica y de todo tipo de accin qumica selectiva sobre el medio biolgico,
como por ejemplo el control de plagas en la agricultura. Por tanto, el diseo racional y
la evaluacin de todos los compuestos potencialmente tiles requieren necesariamente el
estudio cintico de la reaccin que inhiben.
Pasemos a continuacin a ofrecer razones de tipo ms concreto:
(e) En muchas ocasiones es necesario conocer la actividad enzimtica de una de-

terminada muestra biolgica, tanto en el terreno tecnolgico como en la investigacin
pura. El diseo de un sistema eficiente de ensayo de actividad es una condicin inelu-
dible para que la medida tenga garanta. Y para ello, es imprescindible el conocimiento
del efecto que tienen las distintas variables cinticas: concentracin de enzima, concen-
tracin de substrato, pH, temperatura, etc. En la misma lnea, la definicin correcta de
unidades pasa siempre por un conocimiento cintico detallado de la reaccin enzimtica.
(f ) El empleo creciente de reactivos enzimticos en procesos industriales exige ge-

neralmente un diseo cuidadoso antes de su incorporacin a los reactores donde vayan
a ser empleados. El estudio cintico de las enzimas es por tanto condicin previa a todo
tipo de aplicacin industrial de los mismos.
(g) Cuando acometemos la purificacin de una enzima a partir de un material bio-

lgico la nica fuente vlida de informacin sobre la misma nos la da su estudio cintico,
ya que dentro de ciertos lmites, puede dar datos interesantes para la identificacin de la
enzima aun en preparaciones no purificadas.
La velocidad de las reacciones enzimticas se estudia tradicionalmente en funcin

de cuatro variables: concentracin de enzima, concentracin de substrato, pH y temperatura.
Aun cuando constituyen captulos aparte, la inhibicin enzimtica y la regulacin enzi-
mtica se consideran parte del estudio cintico. Antes de pasar a estudiar estas variables
conviene establecer el concepto de velocidad inicial.
133
5.1.2. Concepto de velocidad inicial
Cuando a travs de algn mtodo de monitorizacin continua de la reaccin se-

guimos la marcha en el tiempo de una reaccin enzimtica, obtenemos, con tiempos
suficientemente largos, curvas como la que aparece en la figura 5.1. En la misma se pre-
senta el curso temporal (o curva de progreso) de una reaccin enzimtica S P. Se ilustra
el concepto de velocidad inicial como la tangente a tiempo t=0.
En estas grficas representamos la desaparicin del substrato o la aparicin del

producto en funcin del tiempo. Puede apreciarse que la curva va aplanndose progresi-
vamente a medida que transcurre el tiempo de reaccin, lo cual significa que la velocidad
va hacindose cada vez menor. Pueden ser muchas las razones de este fenmeno; pero
entre ellas es obvio que la desaparicin del substrato es la razn principal.
Figura 5.1
134
Por esta razn, las medidas de actividad enzimtica (recurdese que en Enzimo-
loga actividad es sinnimo de velocidad) solo son vlidas en los primeros tramos de la
curva de progreso. En rigor, la velocidad vlida para la medida es la pendiente a tiempo
cero, que es la llamada velocidad inicial (en la figura 5.1 la medicin vlida de velocidad
es la tangente a la curva para t=0). Normalmente los ensayos enzimticos son diseados
de manera que el tramo lineal de la curva de progreso sea lo ms largo posible, con lo
que se facilita la medicin de la velocidad inicial. Ahora bien, cuando se trata de puntos
experimentales reales, trazar una tangente a t=0 puede ser mucho ms difcil de lo que la
figura 5.1 muestra. En lo sucesivo, y mientras no se especifique lo contrario, siempre que
hablemos de velocidad, queremos decir velocidad inicial.
En los apartados que siguen estudiaremos muy someramente la cintica de las

reacciones enzimticas. En el contexto del presente curso, no tendra sentido discutir,
por ejemplo, la cintica multisubstrato o las cinticas de estado inicial (o pre-estado
estacionario), as como los efectos de pH y temperatura desde un punto de vista cuan-
titativo. Por esa razn nos centraremos en la cintica monosubstrato y, con preferencia,
bajo las suposiciones de Michaelis-Menten (ver ms abajo).
5.2. Efecto de la concentracin de enzima
La velocidad de una reaccin enzimtica, segn muestran las determinaciones ex-

perimentales, y siendo constantes el resto de las condiciones, es directamente proporcio-
nal a la concentracin de enzima, segn se muestra en la figura 5.2.
Figura 5.2
135
Dicho de otro modo, la reaccin enzimtica es de primer orden en relacin a la

concentracin de enzima [E]; k es una constante de velocidad.
[1]
En general, este es un resultado propio de todos aquellos procesos que, como la ca-
tlisis, son de ndole regenerativa, tal y como aparece expresado grficamente en la figura
5.3, y no es atribuible a ninguna caracterstica especfica de las enzimas.
Figura 5.3
De hecho, uno de los argumentos que utiliz Krebs para postular el ciclo de
los cidos tricarboxlicos que lleva su nombre era la relacin lineal entre el consumo
136
de oxgeno y la concentracin de una serie de aniones orgnicos que, como el citrato,

succinato, malato y oxalacetato, son intermediarios del mismo, y que por lo tanto se
regeneran en cada ciclo de reaccin (figura 5.4).
Figura 5.4
Un fenmeno parecido tiene lugar en la biosntesis citoplsmica de cidos grasos,

proceso enteramente dependiente de la presencia de CO2 y cuya velocidad es proporcio-
nal a la concentracin del mismo (normalmente en forma de ion bicarbonato HCO3-).
El CO2 se incorpora mediante la acetil-CoA carboxilasa y posteriormente se regenera
al condensarse la unidad malonil- con la unidad acil- en la superficie de la sintetasa de
cidos grasos (figura 5.5).
137
Figura 5.5
No obstante, nos encontramos en el laboratorio muchas situaciones experimenta-

les en las que no podemos evidenciar esta relacin lineal entre concentracin de enzima
y velocidad de reaccin. Esto es debido generalmente a artefactos experimentales, como
veremos seguidamente.
Algunas veces, particularmente en preparaciones muy activas, la representacin

de actividad frente a concentracin de enzima, da lugar a curvas que progresivamente
se aplanan (ver figura 5.6). La razn ms comn para este fenmeno es el agotamiento
del substrato. Al ser muy alta la actividad, la concentracin de substrato disminuye muy
rpidamente hasta hacerse limitante.
138
Figura 5.6
Este efecto es particularmente importante cuando en el laboratorio clnico medi-

mos actividades enzimticas muy altas (por ejemplo, la alanina aminotransferasa en las
hepatitis vricas) en las que si no repetimos la medicin con el suero (que es donde est
la enzima) convenientemente diluido, se corre el peligro de subestimar la verdadera ac-
tividad enzimtica presente en el mismo y, por tanto, dar un informe equivocado a efec-
tos diagnsticos o pronsticos. En general, cuando obtenemos un aplanamiento de la
relacin entre concentracin de enzima y velocidad se trata de un defecto metodolgico.
5.3. Efecto de la concentracin de substrato
Cuando ensayamos la actividad de una enzima en funcin de la concentracin de

substrato, manteniendo constantes todas las dems condiciones, como concentracin
de enzima, pH, temperatura y concentracin de otros substratos si los hubiere, obtenemos
una relacin como la que se presenta en la figura 5.7. En ella podemos ver que a bajas
concentraciones del substrato la velocidad aumenta de forma casi lineal; esta dependencia
139
se va aplanando a medida que aumenta la concentracin y para concentraciones muy

altas, la curva se aproxima asintticamente a un lmite mximo, la velocidad mxima, que
no se modifica por mucho que aumentemos la concentracin de substrato.
Figura 5.7
En otras palabras, la velocidad de una reaccin enzimtica es de orden mixto

respecto a la concentracin de substrato: casi de primer orden a bajas concentraciones
y casi de orden cero a las concentraciones altas del mismo, siendo de orden fraccionario
entre 1 y 0 para las concentraciones intermedias. La forma geomtrica que resulta de esta
relacin, es decir, la grfica presentada en la figura 5.7, es la de una hiprbola rectangular.
En el captulo 3 hemos visto que la accin enzimtica puede interpretarse median-

te un modelo que supone al substrato fijndose a una regin especfica y complemen-
taria de la superficie de la enzima, el centro activo, en el que los grupos qumicos de la
protena transforman al substrato. Dado que la enzima est a una concentracin finita,
y que el nmero de centros activos por tanto tambin lo es, hay en total un nmero fijo
140
y determinado de sitios; cuando la concentracin del substrato es suficientemente alta,

todos los sitios estarn ocupados y la velocidad no aumentar aun cuando aumente la
concentracin del substrato. Se dice entonces que la enzima est saturada. En general, los
mecanismos que dan lugar a este tipo de curvas se denominan saturantes.
5.3.1. Estudio cintico de la interaccin enzima-substrato
Suponemos que las enzimas operan segn el siguiente mecanismo:
[2]
En donde E es la enzima, S el substrato, ES el complejo enzima-substrato y P el

producto. Para evitar confusiones en las letras, en lo sucesivo llamaremos e a la concen-
tracin de enzima libre, e0 a la de enzima total, s a la de substrato, x a la del complejo
enzima-substrato y p a la del producto. Igualmente, y para simplificar el tratamiento
matemtico del mecanismo, suponemos que el complejo ES (cuya concentracin es x)
se forma reversiblemente a partir de E y S, con constantes de velocidad de k+1 para la
reaccin directa y k-1 para la inversa; y que el complejo se descompone irreversiblemente
a E y P con constante de velocidad k+2. Si la cantidad inicial de enzima en la reaccin
es e0, en cualquier momento se cumplir que e0 = e + x. Asimismo, y por simplicidad,
supondremos que la concentracin de substrato es mucho mayor que la de enzima, esto
es, s >> e0. Con estas premisas podramos plantear el mecanismo como un conjunto de
ecuaciones diferenciales que no admiten solucin analtica (que se presentan, a efectos in-
formativos, en la figura 5.8).
141
Figura 5.8
Las nicas soluciones posibles son las numricas o bien aquellas que introducen
ciertas suposiciones simplificadoras del mecanismo. En cualquier caso, la velocidad de la
reaccin siempre ser
[3]
Donde v es la velocidad, k+2 la constante de velocidad de formacin de producto

P y x la concentracin de complejo enzima-substrato. La figura 5.9 representa una curva
de progreso para este mecanismo calculada numricamente.
142
Figura 5.9
5.3.2. Mecanismo de Michaelis y Menten
Brown y Henri en 1902 fueron los primeros en sugerir el mecanismo [2], es decir,
que la accin enzimtica tiene lugar formndose primero un complejo ES que posterior-
mente se descompone a E + P. En 1913, Michaelis y Menten postularon una suposicin
adicional sobre este mecanismo que conduce a una solucin sencilla que concuerda con
los datos experimentales en la mayora de los casos (suposicin de equilibrio rpido).
Estos autores introdujeron una nueva simplificacin (aadida a la suposicin de

que s >> e0) en este mecanismo al postular que la formacin del complejo ES a partir
de enzima y substrato es mucho ms rpida que su descomposicin ulterior a enzima y
producto; y, por tanto, se alcanza el equilibrio muy rpidamente. Dicho de otra forma,
k+1 k-1 >> k+2. En ese caso, y utilizando la misma nomenclatura que en el apartado an-
terior, podemos utilizar una ecuacin de equilibrio para obtener la concentracin x del
complejo ES:
143
[4]
En donde Km es la constante de equilibrio de disociacin del complejo ES, y por

tanto, igual al cociente de las constantes de velocidad k-1/k+1. Despejando x,
[5]
Pero la velocidad de la reaccin enzimtica, segn [3] es dp/dt = k+2x; por lo tanto,
al sustituir el valor de x por [5] obtenemos
[6]
Ahora bien: si el producto k+2x nos da la velocidad de la reaccin, el producto k+2e0

representa la mxima velocidad que puede alcanzar la misma; de hecho, este producto
sera la velocidad en el caso de que toda la enzima estuviera en forma de complejo ES (es
decir, cuando toda la enzima est saturada por el substrato, x = e0). Por esa razn, a partir
de ahora, llamaremos Vmax a dicho producto, con lo que la ecuacin [6] se transforma en:
[7]
Que es la relacin conocida como ecuacin de Michaelis-Menten. Representada

grficamente, vemos que se trata de una hiprbola rectangular cuya asntota es Vmax,
como la curva representada en la figura 5.10. Esta relacin nos da la velocidad inicial
obtenida para cualquier concentracin s del substrato siempre que conozcamos las dos
constantes Km y Vmax, cuyo significado analizaremos a continuacin.
144
5.3.3. Concepto de Km
1. La Km definida segn el tratamiento de Michaelis-Menten que acabamos de

exponer, es la constante de equilibrio de la disociacin del complejo ES:
[8]
considerando E, S y ES a sus concentraciones de equilibrio. Por tanto, un valor

grande de la Km significa que en el equilibrio predominan las formas libres [E] y [S], o en
otras palabras, que la afinidad de la enzima por el substrato es pequea. Por el contrario,
un valor pequeo de Km supone que la afinidad de la enzima por el substrato es grande,
ya que en el equilibrio predominar el complejo [ES] sobre las formas libres. Por otra
parte, de la ecuacin [8] se puede deducir que la Km se mide en unidades de concentra-
cin. Hemos de tener en cuenta asimismo que la Km es una constante que se define para
una pareja enzima-substrato; por ejemplo, en la reaccin de la hexokinasa
[9]
Glucosa + ATP Glucosa-6-fosfato + ADP
hablaremos de la Km de la glucosa, de la Km del ATP, de la Km de la glucosa-6-fos-

fato y de la Km del ADP (estas dos ltimas para la reaccin inversa).
Ahora bien, se debe tener presente que el concepto de Km como medida de afini-
dad es solamente vlido en aquellos casos en que el mecanismo obedezca a las condicio-
nes de Michaelis y Menten, es decir, cuando la formacin de complejo ES sea mucho
ms rpida que la descomposicin de este hacia el producto, lo cual es por lo general la
regla en muchas reacciones enzimticas.
2. La Km es independiente de la concentracin de enzima. Se obtienen experimen-

talmente los mismos valores de esta constante ante cualquier concentracin de enzima.
3. De [7] puede deducirse fcilmente que cuando la concentracin de substrato es

igual a su Km, la velocidad de la reaccin ser igual a Vmax/2. Otra forma, pues, de definir
145
la Km es la siguiente: aquella concentracin de substrato para la cual la velocidad es igual

a la mitad de la mxima. En la figura 5.10 se ilustra grficamente este concepto.
Figura 5.10
En este sentido, podemos denominar tambin a la Km como s0.5, es decir, concen-

tracin de substrato que da lugar a 0.5Vmax. En el caso de que la enzima obedezca al me-
canismo de Michaelis, s0.5 es la constante de disociacin del complejo enzima-substrato.
Como veremos ms adelante, la ecuacin de Michaelis-Menten, con las oportunas

salvedades, puede describir todos aquellos fenmenos en los que exista interaccin de un
ligando con un receptor. En ese caso, el parmetro s0.5, definido como la concentracin
de ligando que provoca un efecto igual a la mitad del mximo posible, se toma siempre
como una medida de afinidad del ligando con el receptor. Si es grande, la afinidad es
pequea, y si es pequea, la afinidad es grande. Por ejemplo, la afinidad de la hemoglo-
bina por el oxgeno (fijacin que, por cierto, no puede ser descrita por dicha ecuacin)
se mide en trminos de P50, parmetro que significa la presin parcial de oxgeno que da
146
lugar a un 50 % de saturacin; y que tiene, por lo tanto, el mismo significado que la s0.5
o la Km (bajo suposiciones de Michaelis-Menten).
4. En el captulo 2 vimos que podemos considerar al centro activo de las enzimas

como dotado de dos funciones: (1) la fijacin estereoqumicamente complementaria del
substrato y (2) su transformacin cataltica. Estas dos funciones no son necesariamente
independientes la una de la otra. Con las reservas oportunas, podemos decir que la Km
describe cuantitativamente la primera de estas dos funciones. Veremos este concepto con
ms detenimiento al hablar de la inhibicin enzimtica.
5. Cuando la concentracin de un substrato es aproximadamente igual o menor

a su Km, la dependencia de la velocidad respecto a la concentracin de substrato es ms
o menos lineal. Esto significa que en dicho intervalo de concentraciones las variaciones
que pueda haber en la concentracin de substrato dan lugar a variaciones aproximada-
mente proporcionales en la velocidad. Por ello, a estas concentraciones de substrato,
podemos considerar que las enzimas poseen una cierta autorregulacin; una acumulacin
de substrato conduce a un incremento en la velocidad de la enzima que lo transforma, y
viceversa. Se ha pretendido que las concentraciones intracelulares de estado estacionario
de los substratos tienden a estar en los niveles prximos a su Km. No se puede dar una
norma general a este respecto, pero este hecho es cierto para muchos metabolitos.
5.3.4. Concepto de Vmax
1. La Vmax representa la velocidad que se consigue cuando la concentracin de

substrato tiende a infinito, es decir, es la asntota superior de la ecuacin de Michaelis-
Menten; o bien, la velocidad conseguida cuando toda la enzima presente est en forma
de complejo enzima-substrato. Esta constante tiene dimensiones de velocidad, y por
tanto, en cintica enzimtica se expresa en UI o en kat (v. captulo 2).
2. La propia definicin de Vmax como k+2e0 (en el mecanismo [2]) nos permite
deducir que la Vmax es directamente proporcional a la concentracin de enzima. En este
contexto se prefiere denominar a la constante k+2 como kcat que es el nmero de recambio
o de turnover de la enzima, es decir, el nmero de moles de substrato transformadas en la
unidad de tiempo por mol de enzima, y sus dimensiones son de t-1. e0 es la concentracin
molar de enzima. Por tanto, Vmax queda establecida como el producto kcate0. Al ser kcat
independiente de la concentracin de enzima, hoy da se prefiere el uso de esta constante
en lugar de Vmax.
147
3. A partir de la consideracin anterior, podemos suponer a la Vmax como la me-

dida cuantitativa de la intensidad de transformacin cataltica del substrato, de la misma
manera que la Km representaba la funcin de fijacin al mismo.
5.3.5. Aproximacin de estado estacionario
Las suposiciones de Michaelis y Menten no son de aplicacin a todas las enzimas.

En particular, cuando se trata de sistemas multisubstrato, la disociacin de productos a
partir del complejo puede ser tan rpida como la fijacin de substratos al mismo.
Volvamos a la figura 5.9, en la que se presentaba la solucin numrica del siste-

ma de ecuaciones diferenciales que describan la accin enzimtica (figura 5.8). Puede
observarse que durante un perodo de tiempo muy apreciable la concentracin del com-
plejo enzima-substrato x permanece prcticamente constante (es decir, dx/dt = 0). Esta
fue la base para que Briggs y Haldane propusieran en 1925 el mecanismo de estado
estacionario para derivar una relacin entre velocidad y concentracin de substrato que
no estuviera sometida a las restricciones del mecanismo de Michaelis, particularmente
en lo que a los valores relativos de constantes de velocidad se refiere. Si exceptuamos los
primeros momentos de la reaccin, la concentracin de complejo ES (representada por
x) permanece prcticamente constante. En estas condiciones, tenemos:
La cintica enzimtica formal se describe a partir de una serie de ecuaciones dife-

renciales que aparecen en la figura 5.8. La ecuacin que describe la dinmica del com-
plejo enzima-substrato x es la siguiente:
[10]
dx/dt= k+1es -(k-1+ k+2) x
El sistema de ecuaciones que aparece en la figura no tiene solucin analtica, pero

se pueden hacer aproximaciones numricas, una de las cuales aparece en la figura 5.9. En
ella se aprecia que durante un perodo muy apreciable de tiempo la concentracin de x
permanece constante (lo que llamamos estado estacionario). Por lo tanto, podemos decir
que en ese caso,
[11]
dx/dt= k+1es -(k-1+ k+2) x = 0
148
Entonces,
[12]
Pero sabemos que
[13]
e0 = e + x || e = e0 - x
Es decir, la enzima total e0 es igual a la enzima libre e ms el complejo enzima-

substrato x. Y la enzima libre es igual a e0 menos el complejo x.
Sustituyendo el valor de e en la ecuacin [2] y desarrollando trminos,
[14]
k+1e0s xs = (k-1 + k+2)x
Despejando x,
[15]
Llamando Km al cociente [(k-1 + k+2)/k+1],
[16]
149
La velocidad de la reaccin ser
[17]
Pero k+2e0 = Vmax, y por lo tanto,
[18]
Ecuacin anloga a la de Michaelis-Menten (ecuacin [7]) pero en la que Km

tiene un significado distinto. Si bajo condiciones de equilibrio rpido (condiciones de
Michaelis-Menten), Km puede ser descrita como el cociente k-1/k+1, en condiciones
de estado estacionario ser (k-1+k+2)/k+1. Por tanto, bajo la suposicin de estado esta-
cionario, Km no mide la afinidad de la enzima por el substrato. Sin embargo, Km sigue
siendo la s0.5, es decir, la concentracin de substrato para la cual se alcanza una velocidad
igual a Vmax/2.
La hiptesis de estado estacionario es la que normalmente se emplea cuando tra-

tamos con sistemas multisubstrato, ya que la derivacin de ecuaciones de velocidad por
este procedimiento es fcil y directa. No la trataremos aqu.
5.3.6. Eficiencia cataltica de las enzimas
La velocidad de una reaccin enzimtica correspondiente al mecanismo estudiado

viene dada por la ecuacin de Michaelis-Menten (ecuacin [7]). Para concentraciones
altas de substrato (s >> Km), esta ecuacin se reduce a:
[19]
150
En la cual no aparece ningn trmino en s, lo que nos indica que en estas condi-
ciones la reaccin enzimtica es orden cero respecto al substrato. Sin embargo, a concen-
traciones bajas de substrato (s << Km), la ecuacin de Michaelis-Menten toma la forma
[20]
en la que vemos que la reaccin es primer orden respecto a substrato y segundo

orden global (ya que depende de dos trminos de concentracin, e0 y s, siendo la cons-
tante kcat/Km la constante de velocidad de segundo orden. Esta constante representa la
eficiencia cataltica de la enzima, y su valor ser tanto mayor cuanto ms eficiente sea
esta. Pero enzimas y substratos se encuentran normalmente en un medio acuoso, y en
ltimo trmino la velocidad de la reaccin llegara a estar controlada por la velocidad de
difusin de enzimas y substratos en dicho medio. La estructura molecular de las enzimas
puede llegar a hacerse extremadamente eficiente en la catlisis, pero es obvio que no
tiene ningn sentido evolutivo obtener eficiencias catalticas superiores a la velocidad de
difusin. Esta se ha calculado en un orden de magnitud de 108 moles/segundo; por ello,
esta cifra representa un lmite mximo a la eficiencia cataltica de las enzimas. Muchas
enzimas conocidas alcanzan esta cifra: se dice que son enzimas controladas por difusin, o
bien enzimas plenamente evolucionadas. Algunas se presentan en la tabla I:
Tabla I
Eficiencia cataltica de algunas enzimas
Enzima kcat Km kcat/Km
Catalasa 4 x 107 1.1 3.63 x 107

Fumarasa 8 x 102 5 x 10-6 1.6 x 108
Anhidrasa carbnica 106 1.2 x 10-2 8.3 x 107
5.3.7. Determinacin experimental de Km y Vmax
Km y Vmax son constantes empricas, es decir, deben necesariamente determinarse

a partir de experimentacin. Para ello, seleccionamos un intervalo adecuado de
151
concentraciones de substrato y ensayamos la actividad enzimtica para cada concentracin,

manteniendo todas las dems condiciones de ensayo constantes: pH, temperatura, fuerza
inica y concentracin de enzima. Normalmente las determinaciones se hacen como
mnimo por duplicado o triplicado, y para cada condicin determinamos la velocidad
inicial.
Por lo general, antes de proceder a la determinacin de las constantes cinticas se

requieren experimentos previos. Por ejemplo, un rango adecuado de concentraciones de
substrato es aquel en el que vaya incluida la Km; concentraciones demasiado pequeas
daran lugar a una recta de pendiente positiva; concentraciones demasiado altas daran
lugar a una recta de pendiente cero; en ninguno de los dos casos podramos determinar
eficazmente las constantes cinticas. Por ello, en experimentos previos se debe deter-
minar al menos el orden de magnitud en el que se encuentra la Km. Si se trata de una
enzima multisubstrato, debemos asimismo experimentar con la concentracin ptima
de los otros substratos. La seleccin de la concentracin de enzima es asimismo impor-
tante. Una concentracin demasiado alta puede dar dificultades a la hora de determinar
velocidades iniciales (vase ms arriba); una concentracin demasiado baja puede crear
problemas con la sensibilidad del mtodo de seguimiento o con el tiempo necesario para
cada ensayo. Las condiciones de pH y temperatura deben tambin ser objeto de experi-
mentos previos.
Una vez realizado el ensayo, representamos en una grfica los resultados obteni-
dos; la concentracin de substrato en el eje X, y la velocidad inicial obtenida para cada
condicin en el eje Y. Un resultado tpico se presenta en la figura 5.10, en la que los
resultados parecen seguir claramente la ecuacin de Michaelis. A partir de ella podemos
determinar la Vmax (como la asntota superior) y a continuacin la Km como concentra-
cin de substrato que da lugar a una velocidad igual a Vmax/2.
Ahora bien, este tipo de grficas no nos permite una determinacin precisa de
Vmax, y por tanto de Km. El error de los puntos experimentales hace muy difcil situar
exactamente la asntota; por otra parte, ajustar los puntos a una hiprbola es ms difcil
que hacerlo a una lnea recta. Por estas razones se prefiere hacer transformaciones lineales
de la ecuacin de Michaelis-Menten.
152
5.3.7.1. Transformaciones lineales de la ecuacin de Michaelis-Menten
Si transformamos la ecuacin de Michaelis-Menten en las siguientes expresiones:
[21]
[22]
[23]
Podemos ver que se trata de otras tantas ecuaciones de una recta. En el primer caso
[21], tenemos que la representacin de 1/v en funcin de 1/s nos da una lnea recta cuya
pendiente es Km/Vmax; su corte en ordenada es 1/Vmax y el corte en abscisa es -1/Km, tal
y como aparece en la figura 5.11. Este tipo de representacin se llama recproca doble, o
bien representacin de Lineweaver y Burk.
Figura 5.11
153
A partir de cualquiera de ellas, mediante una regresin de mnimos cuadrados, o

bien grficamente sobre papel milimetrado, pueden obtenerse los valores de Km y de
Vmax. En los tres casos se procede de una manera parecida: obtenidos los puntos experi-
mentales, se traza la lnea de regresin; esta lnea nos brinda el valor de la pendiente y el
corte en ordenadas, a partir de los cuales calculamos los valores de Km y de Vmax. Por lo
general, los puntos se ponderan respecto a la dispersin obtenida en los correspondientes
duplicados o triplicados de cada punto.
El uso cada vez ms generalizado de ordenadores en el anlisis de datos cinticos

hace que el inters de estos mtodos sea cada vez ms reducido. En general, hoy da los
programas cinticos parten de regresiones no lineales, lo que les hace mucho ms eficientes
y verstiles. Existen hoy da paquetes de programas adaptados al clculo de las constantes
cinticas que brindan una gran cantidad de informacin adicional.
5.4. Efecto del pH sobre la velocidad de las reacciones enzimticas
5.4.1. Bases moleculares
El pH del medio es una de las variables a las que ms sensible es la accin enzim-
tica. En general, cuando representamos el efecto del pH sobre la actividad de una enzima
se suelen obtener grficas como la presentada en la figura 5.12.
Figura 5.12
154
Se trata de una curva acampanada que muestra una regin de actividad mxima
(el pH ptimo de la enzima) con regiones de actividad decreciente a uno y otro lado. En
algunos casos falta una de las dos ramas descendentes; en otros, la regin ptima est ex-
tendida en una amplia gama de pH; pero la forma ms usual de dependencia es la citada
en primer lugar.
En algunos casos un estudio detenido de los efectos del pH puede dar informacin
muy valiosa sobre los grupos presentes en el centro activo. Pero los efectos del pH son,
por lo general, mucho ms complejos. Teniendo en cuenta que el pH determina el estado
de ionizacin de los grupos qumicos tanto del substrato como de la enzima, el efecto de
esta variable puede ejercerse sobre: (a) la ionizacin del substrato; (b) la ionizacin de los
grupos enzimticos del centro activo, que a su vez pueden determinar variaciones sobre
la fijacin del substrato o sobre la actividad cataltica, o ambas a la vez; (c) la ionizacin
de grupos en la molcula de enzima no directamente relacionados con la actividad enzi-
mtica, pero s con el mantenimiento de su estructura tridimensional, y de ah su efecto
indirecto sobre los grupos del centro activo.
Podemos entender estos efectos analizando la dependencia de pH de la enzima

succinato deshidrogenasa. Esta enzima cataliza la transformacin de succinato en fumara-
to, una importante reaccin del ciclo de Krebs de los cidos tricarboxlicos. Tiene un pH
ptimo en torno a 7. La fijacin de substrato a la enzima media a travs de interacciones
inicas entre los grupos carboxilo del substrato y aminocidos dibsicos (lisina y argini-
na) situados en la superficie de la enzima.
1. A pH 7 (figura 5.13) podemos ver cmo el estado de ionizacin es tal que los
dos carboxilos del succinato estn disociados (con carga negativa) y los dos aminocidos
de la superficie de la enzima protonados (con carga positiva). La interaccin enzima-
substrato es ptima en estas condiciones.
155
Figura 5.13
2. A pH 2 (figura 5.14), inferior al pK de los carboxilos del substrato, este se pre-

senta en estado protonado, y por tanto no tiene carga elctrica, lo que impide su fijacin
al centro activo de la enzima.
Figura 5.14
156
3. A pH 13 (figura 5.15), superior al pK de los grupos bsicos laterales de lisina y

arginina, stos aparecen en su forma de base conjugada, que en este caso no tiene carga
elctrica. En estas condiciones tampoco se puede fijar el substrato.
Figura 5.15
En muchas enzimas est presente el aminocido histidina en el centro activo. Por

lo general, la forma activa de las histidina en este contexto es la disociada (sin carga
elctrica, dejando libre el par electrnico del nitrgeno imidazlico). Es obvio que el
descenso de pH provocar la protonacin de este grupo (figura 5.16), impidiendo as su
funcionamiento como reactivo (ver captulo 7).
157
Figura 5.16
Podramos citar de esta manera ejemplos para casi todas las enzimas en las que
conocemos la estructura y el mecanismo cataltico.
5.4.2. Significado biolgico del efecto del pH
En los organismos pluricelulares, una de las constantes ms cuidadosamente man-

tenidas es el pH del medio interno, en el que unas pocas dcimas de variacin pueden
llegar a ser incompatibles con la vida. La razn fundamental de esta falta de tolerancia
radica precisamente en la sensibilidad de las enzimas del metabolismo celular hacia el
pH. Por otra parte, pequeas variaciones locales del pH pueden dar lugar a alteracio-
nes delicadas en la actividad enzimtica, lo que supone una posibilidad de regulacin
intracelular de la actividad enzimtica. Si tenemos en cuenta que los principales grupos
implicados en la catlisis enzimtica son el imidazol de la histidina, el hidroxilo de serina,
carboxilos de aspartato y glutamato, tiol de cistena y amino de lisina, no es de extraar
que las variaciones de pH afecten a la actividad enzimtica puesto que todos estos gru-
pos son susceptibles de disociacin cido-base. Si a esto aadimos que las interacciones
de tipo salino pueden ser determinantes en la unin del substrato a la enzima, y estas
dependen de grupos con carga elctrica, estaremos en condiciones de comprender la
importancia del efecto del pH sobre la actividad enzimtica (tal como hemos visto en el
ejemplo del apartado anterior).
158
El interior celular posee una alta concentracin protenica y sin duda es esta la
defensa principal del citoplasma ante cambios del pH. No ocurre as, sin embargo, en el
medio interno (es decir, el medio extracelular) de organismos pluricelulares; de ah que
en el curso de la evolucin hayan surgido complejos sistemas de regulacin cido-
base. En los mamferos, estos sistemas implican a la sangre (plasma y glbulos), al apa-
rato respiratorio, al rin, al sistema nervioso y al sistema endocrino. Su estudio queda
fuera de contexto en este manual, pero no est de ms recordar su existencia a efectos de
una mejor comprensin del efecto del pH.
Ahora bien, una vez ms debemos ampliar el significado de la interaccin enzima-

substrato. Esta unin no es ms que un caso del modelo ms general de interaccin entre
protenas y ligandos (Modelo de Interaccin Estereoqumica). En este modelo generaliza-
do, el pH cumple el mismo papel que hemos visto en el caso de la cintica enzimtica;
de ah que todo tipo de interaccin protena-ligando (receptores hormonales, receptores
nerviosos, sistemas de transporte, efectos farmacolgicos, etc.) sea extremadamente sen-
sible a variaciones del pH.
5.5. Efecto de la temperatura sobre las reacciones enzimticas
5.5.1. Bases moleculares
Cuando estudiamos en el laboratorio el efecto de la temperatura sobre la velocidad

de las reacciones enzimticas normalmente se obtienen curvas parecidas a la representada
en la figura 5.17, es decir, una curva acampanada, no muy diferente en aspecto a la que
se observa al comprobar el efecto del pH. Por esa razn hablamos de la existencia de
una temperatura ptima para la actividad enzimtica, que corresponde al mximo de la
curva.
159
Figura 5.17
El efecto de la temperatura es mucho ms complejo de lo que esta simple curva

pudiera sugerir. Dos son los componentes principales en juego: por una parte, el efecto
cintico de la temperatura sobre las constantes individuales de velocidad en la catlisis
enzimtica; por otra parte, el efecto de la temperatura sobre la estructura enzimtica.
Estos dos factores operan en sentido inverso; una mayor temperatura acelera la
velocidad de las reacciones individuales, tal como establece la ecuacin de Arrhenius:
[15]
pero al propio tiempo, el aumento de temperatura promueve la desnaturaliza-

cin de la protena, fenmeno que va acompaado de la disminucin y eventual pr-
dida total de la actividad enzimtica.
160
Respecto a este ltimo efecto, podemos ver que la temperatura inactiva a las en-
zimas casi de forma generalizada. Temperaturas de 70 C son suficientes para hacer des-
aparecer la actividad en unos pocos minutos; la fosfatasa alcalina del tejido seo presenta
un semiperodo de inactivacin a 56 C de escasamente dos minutos. Las enzimas ter-
morresistentes conocidas proceden de microorganismos habituados a altas temperaturas
ambientales, como Bacillus stearotermophilus (entre las Bacterias) o bien las Arqueas ter-
moacidfilas que se encuentran en manantiales termales o en los fondos marinos cerca-
nos a la crestas medioocenicas, en las que la actividad volcnica permite temperaturas
locales extremadamente altas para las que se observan normalmente en dichos ambientes.
5.5.2. Significado biolgico del efecto de la temperatura
Podemos hacer respecto a la temperatura consideraciones finales anlogas a

las que se hicieron sobre el pH en el apartado anterior. El margen de temperaturas
sobre el que se desarrollan los seres vivos es, en trminos relativos, casi tan estrecho
como el de pH. Desde los seres que viven a temperaturas rticas hasta los microor-
ganismos termfilos, el margen es ligeramente superior a los 100 C. Para los ani-
males homeotermos, lo es de hecho mucho ms reducido. La base molecular de esta
restriccin est en el efecto de la temperatura sobre las reacciones enzimticas, en el
sentido amplio a que antes nos referamos, esto es, el efecto de la temperatura sobre
todo tipo de interaccin protena-ligando.
161
CAPTULO 6
INHIBICIN ENZIMTICA
6.1. Concepto e importancia
Se denomina inhibidor a todo agente capaz de hacer disminuir la actividad de una

enzima. En el estudio de la Enzimologa, sin embargo, el trmino inhibidor posee un
significado algo ms restringido. Dentro de la definicin que hemos adelantado es lgico
que podamos considerar, por ejemplo, al ion H+ como inhibidor, dado que muchas en-
zimas pierden actividad por el lado cido de la escala de pH, o bien al ion OH- por una
razn similar; las temperaturas elevadas seran tambin inhibitorias; los agentes desnatu-
ralizantes de la protena enzimtica tambin lo seran, y as sucesivamente.
Por esta razn vamos a restringir el uso del trmino inhibidor a aquellos agentes que
hacen disminuir la actividad enzimtica al interaccionar con los grupos especficos responsa-
bles de la accin cataltica o de su regulacin. Esta accin cataltica la concebimos en un
doble sentido: fijacin especfica del substrato y su transformacin qumica. Ntese que
podamos haber establecido esta restriccin a los agentes que actan sobre el centro ac-
tivo. No lo hemos hecho as porque, como veremos, pueden existir regiones en la mol-
cula de la enzima no directamente relacionadas con el mismo y que sin embargo pueden
modular su accin cataltica (los centros alostricos). Aun cuando los agentes capaces de
actuar sobre centros alostricos pueden perfectamente ser denominados inhibidores en
el sentido de esta definicin, dejaremos su estudio para un captulo ulterior.
El estudio de la inhibicin enzimtica es de una enorme importancia tanto en

Enzimologa bsica como en sus aplicaciones:
1. El empleo de inhibidores es un instrumento ampliamente utilizado en el estudio

de los mecanismos cinticos. Las medidas de velocidad inicial no pueden por s solas llevar
al conocimiento completo de un mecanismo, y muy particularmente, en el estudio de la
cintica multisubstrato.
2. Los inhibidores brindan una informacin valiossima acerca de las caractersticas

moleculares del centro activo. Hay inhibidores de estructura parecida al substrato cuyo es-
tudio sirve para determinar las caractersticas estricas de aquel. Otros inhibidores atacan
de forma especfica a los diferentes grupos que pueden estar implicados en la transforma-
cin cataltica. A veces esta ltima interaccin es muy especfica. As, los organofosfricos
atacan al residuo de serina del propio centro activo de las serin-enzimas, dejando intactos
todos los dems residuos de este aminocido que pudiera haber en la molcula. Por otra
parte, el estudio de la fijacin de un inhibidor especfico nos puede dar amplia infor-
164
macin sobre el nmero de centros activos presentes en una muestra enzimtica. En la

actualidad, una lnea muy importante de inhibidores est constituida por los llamados
anlogos de estado de transicin, que como su nombre indica, tienen una forma molecular
parecida a la conformacin energizada del substrato cuando ocupa el centro activo de
la enzima. En esta lnea, hoy da es posible el diseo altamente especfico de frmacos y
drogas a partir del conocimiento de la estructura del centro activo y del complejo activo.
Un tipo especial de inhibidores, los substratos suicidas, son un arma fundamental de la
Teraputica moderna.
3. El empleo de inhibidores que bloquean una enzima especfica ha sido deter-

minante en el estudio de vas metablicas: as, el empleo de yodoacetato, inhibidor de
grupos -SH, fue crucial en el enunciado de la va glicoltica y el de malonato, inhibidor
competitivo de succinato, en el del ciclo de Krebs de los cidos tricarboxlicos.
4. Muchos inhibidores son tan especficos como el substrato. De esta forma, se

pueden disear inhibidores que afectan solamente a una determinada enzima sin alterar para
nada a ninguna otra. Esto constituye la base de toda la teraputica qumica o Farmaco-
loga. Podemos apreciar claramente este concepto cuando ampliamos el modelo enzima-
substrato a toda interaccin entre una protena y su ligando especfico. De esta forma, el
modo de accin de los frmacos llega en ltimo trmino a interpretarse siempre como
una competicin entre el frmaco y el ligando fisiolgico (que es el substrato en el caso
de las enzimas). Hay que hacer notar que esta competicin no tiene por qu ser necesa-
riamente inhibitoria; en muchos casos, es, de hecho, agonstica. Por ejemplo: el ligando
fisiolgico del receptor colinrgico muscarnico es la acetilcolina; el alcaloide muscarina
(obtenido del hongo Amanita muscaria) excita al receptor de la misma manera que la
acetilcolina (es decir, la muscarina es un agonista) mientras que el alcaloide atropina (ob-
tenido de la planta Atropa belladonna) se fija al receptor pero bloquendolo (por lo que
la atropina es un antagonista). De un modo parecido actan los receptores hormonales y,
en general, los receptores a todas las seales qumicas.
5. Al igual que los frmacos, muchos otros agentes de gran importancia econmica
son inhibidores enzimticos. Por ejemplo, los insecticidas, tanto clorados como organo-
fosforados; los herbicidas, defoliantes y todo tipo de fitosanitarios; muchos aditivos de la
industria alimentaria, etc.
Por estas razones, el estudio de la inhibicin enzimtica es un tema central en toda

exposicin sistemtica de la Enzimologa. Este estudio se hace tanto en trminos cinti-
cos como desde el punto de vista estructural.
165
6.2. Tipos de inhibidores
Dentro de la restriccin que establecimos ms arriba, se consideran dos tipos ge-

nerales de inhibidores: reversibles e irreversibles.
6.2.1. Inhibidores reversibles
Los inhibidores reversibles son aquellos cuyo efecto desaparece cuando los elimi-
namos de la solucin por dilisis o cualquier otro procedimiento. La inhibicin se ejerce
a travs de su fijacin reversible a la enzima segn el proceso
[1]
en el que el equilibrio se alcanza muy rpidamente. Para este equilibrio definimos

una constante de disociacin, Ki (obsrvese que se trata de una K mayscula, lo que
indica una constante de equilibrio), que tiene respecto al inhibidor el mismo significado
que la Km en la teora de Michaelis respecto al substrato. Por tanto, una Ki pequea
supondr una afinidad grande del inhibidor hacia la enzima, y viceversa. Tengamos en
cuenta tambin que la fijacin del inhibidor puede tener lugar a los diferentes complejos
que aparecen en el curso de la accin enzimtica. As, habr inhibidores que se fijan a la
forma libre de la enzima E (como en [1]); otros lo harn al complejo ES; y otros pueden
hacerlo a ambos, E y ES.
La actividad de una enzima viene descrita por dos constantes, Km y kcat. En este
sentido, los inhibidores pueden actuar sobre una de ellas o sobre las dos. Segn este
criterio, se distinguen tres tipos bsicos de inhibidores reversibles: Inhibidores compe-
titivos, cuando su efecto consiste en un aumento aparente de la Km respecto al substrato
sin efecto sobre Vmax (o ms propiamente, sobre la kcat); Inhibidores no competitivos,
cuando disminuyen el valor de la Vmax sin afectar al valor de la Km; e Inhibidores
mixtos, cuando ambas constantes aparecen afectadas. Dentro de este ltimo grupo se
suele hacer distincin entre los inhibidores mixtos y los inhibidores acompetitivos o an-
ticompetitivos. En esta exposicin estudiaremos con cierto detenimiento los primeros.
166
Atendiendo a la forma enzimtica afectada, los tipos de inhibidores descritos en el

prrafo anterior tienen las siguientes correspondencias: los inhibidores competitivos solo
pueden fijarse a la enzima libre, compitiendo en ello con el substrato de forma que la fi-
jacin es mutuamente exclusiva; los inhibidores no competitivos se fijan indistintamente
a la enzima libre E y al complejo enzima-substrato ES; los inhibidores anticompetitivos
solo pueden hacerlo al complejo enzima-substrato ES; y los mixtos operan como los no
competitivos pero alterando de alguna manera la fijacin del substrato a la enzima.
6.2.2. Inhibidores irreversibles
Los inhibidores irreversibles son aquellos que reaccionan con la enzima, modifi-
cndola de forma covalente, de tal manera que aunque eliminemos al inhibidor la accin
del mismo persiste. En contraste con los inhibidores reversibles, cuyo equilibrio se esta-
blece rpidamente, una caracterstica distintiva de los inhibidores irreversibles es que su
accin es dependiente del tiempo; es decir, el grado de inhibicin depende del tiempo a
que haya sido expuesta la enzima al inhibidor. Por ello, su accin se describe a partir de
una ecuacin de velocidad:
[2]
En la que ki (obsrvese que se trata de una k minscula, constante de velocidad)

es la constante de velocidad del proceso tal que
[3]
vi = ki[E][S]
donde vi es la velocidad de inactivacin. Ntese que en este caso (a) no consi-

deramos la existencia de un equilibrio: esta inhibicin es irreversible; (b) el proceso se
describe por una constante de velocidad de segundo orden ki, y no por una constante de
disociacin Ki como en el caso de los inhibidores reversibles.
Ahora bien, conviene no tomar el trmino irreversible demasiado al pie de la letra.

Una enzima atacada por un inhibidor irreversible puede en ocasiones reactivarse me-
167
diante un tratamiento qumico que produzca el efecto inverso al del inhibidor. As, los
grupos -SH transformados en disulfuro -S-S- por un agente oxidante pueden reactivarse
mediante un agente reductor. Por ello hay quien prefiere llamar a la inhibicin irreversi-
ble inactivacin, y al proceso contrario, reactivacin.
A continuacin, discutiremos algunos aspectos de los inhibidores competitivos, de

los inhibidores irreversibles y de los llamados substratos suicidas.
6.3. Inhibicin competitiva
Es aquella inhibicin reversible en la cual el inhibidor impide o dificulta la fijacin

del substrato al centro activo de la enzima, sin afectar a su transformacin cataltica; es
decir, el substrato, si llega a fijarse al centro activo, es transformado con toda normalidad.
6.3.1. Cintica de la inhibicin competitiva
Cinticamente, la inhibicin competitiva corresponde al mecanismo
[4]
en el cual vemos que tanto el substrato como el inhibidor pueden fijarse a la enzi-
ma siendo esta fijacin mutuamente exclusiva; el inhibidor impide la fijacin del substra-
to, y este, la del inhibidor (es decir, ambos compiten por la fijacin a la enzima). Es por
esta competicin entre uno y otro por lo que este tipo de inhibicin recibe su nombre.
Naturalmente, el complejo EI es improductivo y no da lugar a productos. A partir de
estos dos equilibrios podemos fcilmente darnos cuenta de que para una concentracin
dada de inhibidor, las concentraciones altas de substrato harn desaparecer la inhibicin,
168
alcanzndose la misma Vmax que en la reaccin no inhibida. Eso s, har falta una mayor
concentracin de substrato para llegar a este nivel; y, por tanto, una mayor concentra-
cin de substrato para llegar a Vmax/2, lo que nos muestra el principal dato cintico de la
inhibicin competitiva: un aumento aparente de la Km hacia el substrato en presencia del
inhibidor, y sin que se modifique la Vmax.
1. Tratando el mecanismo por una suposicin de equilibrio rpido (segn Michae-

lis y Menten), veramos que los complejos ES y EI se forman mucho ms rpidamente
que la evolucin de ES hacia enzima libre y producto. En ese caso, definimos las cons-
tantes respectivas de equilibrio de disociacin Km y Ki de la siguiente forma:
[5]
Llamando (como en el captulo anterior) e0 a la concentracin de enzima total, e

a la enzima libre, x a la del complejo ES, y a la del complejo EI, s a la concentracin de
substrato, e i a la de inhibidor, y suponiendo que tanto la concentracin de substrato
como la de inhibidor son mucho mayores que la de enzima total, tendremos que
[6]
para obtener una ecuacin de velocidad en funcin de las concentraciones de

substrato e inhibidor, sabiendo que v = k+2x, resolveramos el sistema de ecuaciones [6]
para x y obtendramos
[7]
169
que multiplicado por k+2 nos dara la siguiente ecuacin de velocidad:
[8]
en la que vemos que Km aparece multiplicada por el factor (1 + i/Ki), en donde i

es la concentracin de inhibidor y Ki es la constante de disociacin del complejo EI, tal
como se defini en 6.5. Esta expresin nos muestra todas las caractersticas de la inhibi-
cin competitiva: un aumento aparente de la Km y la desaparicin del efecto inhibidor a
altas concentraciones de substrato. Obsrvese que para una concentracin de inhibidor
igual a su Ki, la Km aparente toma un valor de dos veces la Km real. Asimismo, podemos
ver que la eficiencia del inhibidor como tal ser tanto ms grande cuando menor sea el
valor de Ki; y al igual que en el caso de la Km, sus dimensiones son de concentracin.
Para concentraciones muy altas de s, la inhibicin desaparece.
En un tratamiento de estado estacionario del mecanismo [4], llegaramos a un re-

sultado idntico (con la salvedad del distinto significado de la Km).
6.3.2. Diagnstico cintico de la inhibicin competitiva
Grficamente, el efecto del inhibidor competitivo aparece en la figura 6.1. En la

representacin directa (v frente a s) vemos que la presencia del inhibidor hace disminuir
la pendiente de la curva en todos sus puntos, pero tiende a alcanzar la asntota Vmax, lo
que tiene lugar a concentraciones suficientemente altas de substrato.
170
Figura 6.1
En la representacin recproca doble vemos cmo el corte en ordenada (1/Vmax) no

se modifica, pero la pendiente de la recta (Km/Vmax) es mayor en presencia que en ausen-
cia de inhibidor, siendo el corte en abscisa igual a -1/ Km =1/[Km(1+i/Ki)] (figura 6.2).
Figura 6.2
171
6.3.3. Aspectos estructurales de la inhibicin competitiva
Por regla general, los inhibidores competitivos son todos ellos anlogos estructura-
les del substrato, es decir, molculas muy parecidas. Si a esto unimos el hecho de que la
inhibicin competitiva es tan especfica como la interaccin enzima-substrato, as como
las peculiaridades cinticas de la inhibicin competitiva, surge inmediatamente la idea de
que el inhibidor en este caso es un falso substrato que ocupa el lugar de este en el cen-
tro activo, pero que no reacciona. Es decir, tiene la suficiente similitud con el substrato
como para poder fijarse a los grupos complementarios (impidiendo la fijacin del subs-
trato normal), pero tambin las suficientes diferencias como para no poder reaccionar.
La accin de un inhibidor competitivo se representa esquemticamente en la figura 6.3.
Figura 6.3
Es importante, sin embargo, no llevar demasiado lejos esta equivalencia entre an-
logo e inhibidor competitivo. El concepto de inhibicin competitiva es puramente cin-
tico, y se refiere al aumento aparente de la Km por el substrato. Que muchos inhibidores
competitivos sean anlogos qumicos del substrato no significa necesariamente que todos
los anlogos vayan a ser inhibidores o viceversa. Como veremos, muchos inhibidores fi-
siolgicos, es decir, efectores de la normal regulacin de una enzima, se comportan como
inhibidores competitivos en el sentido de aumentar la Km aparente, pero sin que tengan
ningn parecido estructural con el substrato (y por esa razn se les llama alostricos, en
contraposicin a los aqu tratados, que seran isostricos).
172
En general, los anlogos de substrato caen en alguna o varias de las siguientes cla-
ses: enantiomricos, cuando se trata de la imagen especular de una molcula asimtrica;
anomricos, referidos a las formas o del enlace glicosdico; ismeros posicionales, is-
meros geomtricos; productos de reaccin, que en muchos casos compiten con el substrato
por la enzima libre, o bien, en general, compuestos con parecido estructural por el subs-
trato. As, en el bien conocido caso de la succinato dehidrogenasa, han sido descritos como
inhibidores competitivos, entre otros, los compuestos que aparecen en la figura 6.4. La
analoga estructural de uno de ellos (oxalacetato) se ilustra en la figura 6.5.
Figura 6.4
Figura 6.5
173
En el caso de la succinato deshidrogenasa, el estudio de las constantes de inhibi-

cin nos muestra que los inhibidores ms potentes son aquellos con carboxilos termina-
les situados a una distancia parecida a la del substrato; as, la Ki por oxalacetato es de 1.6
mM mientras que por malonato es de 40 mM. Por tanto, este estudio nos indica que la
presencia de los dos grupos carboxlicos (ambos ionizados al pH de ensayo) es impor-
tante para la fijacin al centro activo de la enzima, y la distancia entre ambos tambin
(malonato es peor inhibidor que oxalacetato). Esto implica, adems, la existencia en el
centro activo de dos grupos electropositivos. Ntese que es perfectamente posible que la
enzima pueda tener mayor afinidad por el inhibidor que por el propio substrato normal.
Cada enzima tiene, lgicamente, sus propios inhibidores competitivos. Una lnea
muy importante de stos son los anlogos de base o anlogos de nuclesido, que interfieren
en todos los procesos asociados al DNA o al RNA (replicacin, transcripcin, transcrip-
cin inversa, etc.).
Adems de los anlogos de substrato, un grupo de compuestos muy importante

son los anlogos de cofactor o coenzima, sobre todo por su uso teraputico; por ejemplo,
las sulfonamidas (anlogos del cido 4-aminobenzoico, figura 6.6) o los antiflicos como
el methotrexate (figura 6.7); otros anlogos de cofactores son piridin-3-sulfonato (anlogo
de nicotinamida), desoxipiridoxol fosfato (anlogo de piridoxal fosfato), piritiamina (an-
logo de tiamina), etc.
Figura 6.6
174
Figura 6.7
Otro grupo muy interesante de inhibidores, que se suelen comportar como

competitivos (o como inhibidores suicidas, v. ms adelante), son los inhibidores naturales.
Entre stos tenemos la avidina, protena presente en la clara de huevo capaz de fijar
biotina (un cofactor enzimtico, cap. 4) con extraordinaria afinidad (Kd 10-15 M); la
1-1-antitripsina y protenas relacionadas, que inhiben la actividad de serinproteasas
(llamadas genricamente serpinas); las cistatinas, que inhiben las tiolproteasas, etc.
6.3.4. Anlogos de estado de transicin
Segn vimos en el captulo 2, el modo de accin de las enzimas puede explicarse

en el sentido de que la complementariedad estereoqumica tiene lugar no entre la enzi-
ma y el substrato, sino ms bien entre la enzima y el estado de transicin de la reaccin
catalizada. El estado de transicin es una especie molecular de vida media muy corta, y
representa un mximo en el perfil energtico de la reaccin. No obstante, se han podido
sintetizar anlogos estables de estructura parecida al estado de transicin para multitud
de enzimas, y que reciben el nombre de anlogos de estado de transicin (AET). El concep-
to de inhibidor competitivo se ampla, pues, con la inclusin de estos anlogos.
La primera caracterstica de los anlogos de estado de transicin es su extraordi-

naria afinidad hacia la enzima, con Ki en el orden nM; de hecho, en muchas ocasiones,
varios rdenes de magnitud menor que la Km del substrato natural. Sin embargo, la ve-
175
locidad de fijacin (medida por la constante de velocidad k+1) es en ocasiones bastante

menor que la correspondiente a aquel. Este resultado se corresponde con lo que hoy se
piensa sobre el modo de accin de las enzimas, en un sentido de ajuste inducido: la fija-
cin distorsiona la estructura del substrato para aproximarla a la del estado de transicin;
por ello, este y el substrato son especies estructuralmente distintas y las enzimas han evo-
lucionado para fijar el substrato, y no a su estado de transicin; aunque una vez fijado es
mucho ms difcil desplazarlo de la unin a la enzima.
Los AET son unos inhibidores muy potentes de la accin enzimtica; lo que unido
a su especificidad, hace que exista una investigacin muy activa en este campo para el di-
seo de frmacos, lo cual, a su vez, impulsa el estudio del modo de accin de las enzimas
para el conocimiento de los diferentes estados de transicin.
Como ejemplo de AET tenemos el fosfonoacetil-L-aspartato (PALA), sobre la as-

partato transcarbamilasa, enzima limitante de la biosntesis de pirimidinas. Esta enzima
transfiere el grupo carbamil fosfato al aspartato, formando carbamil aspartato, que poste-
riormente dar lugar al anillo pirimidnico. En la figura 6.8 se representan las estructuras
de los substratos, del estado de transicin de la enzima y del AET.
Figura 6.8
176
Muchos frmacos utilizados en clnica humana son AETs. Por ejemplo, el Capto-
pril, utilizado ampliamente como agente antihipertensivo, es un AET de la enzima con-
vertidora de angiotensina. Esta enzima cataliza la produccin de angiotensina II, pptido
cuya accin vasoconstrictora es muy potente (figura 6.9).
Figura 6.9
6.3.5. Anticuerpos catalticos
Por otra parte, los AET se han utilizado para la produccin de anticuerpos catal-
ticos o inmunoenzimas. Se trata de anticuerpos monoclonales desarrollados contra hapte-
nos que son anlogos de estado de transicin de determinadas reacciones qumicas. Los
anticuerpos as producidos presentan una complementariedad estereoqumica con el
estado de transicin de la reaccin, lo que en determinadas circunstancias permite que
el anticuerpo tenga actividad cataltica. Tal es el caso de la 4-nitrofenil fosforilcolina,
que es anlogo del estado de transicin de la hidrlisis del correspondiente carbonato
(figura 6.10). Un anticuerpo monoclonal producido contra 4-nitrofenil fosforilcolina
(como hapteno) es capaz de catalizar la hidrlisis del carbonato.
177
Figura 6.10
6.3.6. Importancia prctica de la inhibicin competitiva
El modelo de interaccin entre una protena y un ligando constituye uno de los

fundamentos de la Biologa actual. Hemos visto cmo esta interaccin explica multi-
tud de fenmenos biolgicos que no estn directamente relacionados con la catlisis
enzimtica. Por ello hablamos de seales qumicas en un sentido mucho ms general. La
accin de los neurotransmisores sobre sus receptores es un ejemplo. En ltimo trmino,
la accin de stos consiste en alterar el comportamiento de una neurona en sentido exci-
tatorio o inhibitorio; pero el efecto molecular inmediato, del que deriva todo lo dems,
es la interaccin del neurotransmisor con su receptor, interaccin estereoqumicamente
complementaria que se rige por las mismas relaciones que la catlisis enzimtica, y que
participa de toda su fenomenologa.
La inhibicin competitiva representa una manera de inhibir de forma especfica

una enzima, o en un sentido ms amplio, de inhibir la fijacin de un ligando determina-
do a su receptor, y tambin de forma especfica. Por esta razn, los inhibidores competi-
tivos constituyen el principal contingente de compuestos que utiliza la Farmacologa, y
el fenmeno de competicin, en su forma ms general, la base y fundamento de toda la
Teraputica qumica. En la mayora de casos en los que se conoce el modo de accin de
una droga encontramos una competicin como razn ltima de la accin del frmaco.
178
Pero adems, al ser este fenmeno especfico, por estar mediado a travs de una interac-
cin estereoqumica complementaria, la inhibicin competitiva permite la supresin o
atenuacin de un proceso concreto sin alterar en principio ningn otro. Claro est que
nos estamos refiriendo aqu a una generalizacin, con todos sus inconvenientes. No to-
dos los frmacos son inhibidores; los hay que actan como agonistas, es decir, produciendo
los mismos efectos que el ligando fisiolgico; aunque en estos casos el efecto del frmaco
suele ser ms persistente que el de aquel, al no ser metabolizado eficientemente. De la
misma forma, no todas las drogas teraputicas (o de abuso) son estrictamente inhibido-
res competitivos, en el sentido cintico del trmino; las hay con modos de inhibicin
mucho ms complejos, o que operan como inhibidores irreversibles (v. ms adelante).
Asimismo, este sentido restrictivo que hemos dado a la Farmacologa excluye, sin razn
aparente, a todo tipo de teraputica sustitutiva. La idea que realmente pretendemos
comunicar es que las acciones farmacolgicas que emprendemos sobre un organismo, y
que se hacen con compuestos muchas veces radicalmente extraos al mismo, en ltimo
trmino van dirigidas a la modificacin de una interaccin entre un ligando y su recep-
tor. Las ms de las veces esta modificacin es una inhibicin competitiva.
6.4. Otras formas de inhibicin reversible
Mencionaremos en este apartado la inhibicin no competitiva y la inhibicin anti-

competitiva. Ambos tipos de inhibicin son tiles en los estudios cinticos de velocidad
inicial, pero tienen muy poca aplicacin prctica. A continuacin se resumen las princi-
pales caractersticas de estos tipos de inhibidores.
6.4.1. Inhibicin no competitiva
Llamamos inhibidores no competitivos a aquellos que no impiden la fijacin del

substrato, pero que inhiben su transformacin cataltica, y se corresponden con el me-
canismo descrito en la figura 6.11. En un sentido cintico, la inhibicin no competitiva
pura se manifiesta por una disminucin de la Vmax aparente sin modificacin de la Km
por los substratos.
A partir de consideraciones de equilibrio (es decir, en las condiciones de Michae-

lis-Menten) en las que la formacin de producto a partir de ES es mucho ms lenta que
el establecimiento del equilibrio entre E, S e I), la inhibicin no competitiva puede des-
cribirse por la relacin
179
[9]
en la que vemos que Vmax aparece dividida por el factor (1+i/Ki). Esto nos mues-
tra el carcter cintico de la inhibicin no competitiva, a saber: un descenso del valor
de Vmax (o ms propiamente, de la kcat) sin alteracin de la Km. Por tanto, aun cuando
la concentracin de substrato suba indefinidamente, la inhibicin no desaparece. Este
efecto, como veremos, puede tambin ser visto en los inhibidores irreversibles, en los que
se aprecia una disminucin aparente de Vmax; pero, en este caso, el efecto se realiza sobre
e0, la enzima total; mientras que el de los inhibidores no competitivos reversibles tiene
lugar sobre kcat.
Al representar grficamente los resultados de una inhibicin no competitiva, ve-

mos que en la grfica directa el valor de Vmax se hace menor, y la inhibicin no desaparece
por mucho que aumente la concentracin de substrato. En la grfica recproca doble
vemos cmo el sistema inhibido se caracteriza por un corte en ordenada y una pendiente
mayores en el sistema inhibido que en el sistema control, sin que se modifique el corte
en abscisa, que en esta representacin es igual a -(1/Km) (figura 6.11).
Figura 6.11
180
6.4.2. Inhibicin acompetitiva o anticompetitiva
Una forma cintica interesante de inhibicin mixta es la que llamamos acompeti-

tiva o anticompetitiva. Este nombre pretende ser una traduccin del ingls uncompetiti-
ve. En realidad, la palabra anticompetitiva responde mejor al carcter cintico de esta in-
hibicin. La inhibicin competitiva desaparece ante concentraciones altas del substrato,
mientras que este tipo de inhibicin que nos ocupa se hace ms intensa ante el aumento
en la concentracin de substrato. De ah el nombre de anticompetitiva. Corresponde a
un mecanismo en el cual el inhibidor solo puede fijarse al complejo ES, no pudiendo
hacerlo a la forma libre de enzima (figura 6.12). La consecuencia del mismo es que la
fijacin de inhibidor depende de la fijacin previa de substrato, por lo cual una mayor
concentracin de este favorecer la inhibicin (y de ah el nombre de anticompetitiva).
Figura 6.12
Bajo suposiciones de equilibrio, este tipo de inhibicin se comporta segn la ecua-

cin
[10]
181
En la que vemos que el efecto de un inhibidor anticompetitivo consiste en reducir

Km y Vmax por el mismo factor (1+i/Ki). Las representaciones directa y recproca doble
de este tipo de inhibicin se presentan en la figura 6.12. En la grfica recproca doble se
aprecia que las lneas correspondientes al sistema inhibido tienen la misma pendiente
que la del control, con lo cual son rectas paralelas.
6.5. Inhibicin irreversible
6.5.1. Generalidades
A diferencia de todos los modos inhibitorios que hemos tratado hasta ahora, la
inhibicin irreversible consiste en una reaccin qumica entre el inhibidor y la enzima,
de tal manera que se alteran los grupos funcionales de esta, bien sean los encargados de
la fijacin del substrato o de su transformacin cataltica, o de ambos. La inhibicin irre-
versible corresponde en general al mecanismo
[11]
en el que la molcula enzimtica reacciona con el inhibidor para dar una forma
inactiva (o menos activa) E, dependiendo este proceso de una constante de velocidad ki (y
que por ello representamos con k minscula). Cinticamente, la inhibicin irreversible
se describe con una ecuacin de segundo orden como
[12]
este mecanismo nos muestra la caracterstica ms tpica de la inhibicin irreversi-

ble: su dependencia del tiempo. Con el paso de este la inhibicin va hacindose ms y ms
patente hasta que se puede llegar a la desaparicin total de la actividad. La efectividad del
inhibidor no se mide en trminos de una Ki, que corresponde a una constante de equili-
brio, sino en trminos de una constante de velocidad ki. A veces los estudios cinticos de
un inhibidor irreversible dan un patrn parecido a la inhibicin no competitiva, cuando
182
los ensayamos sobre tiempos muy cortos de incubacin con la enzima. La caracterstica
propia de la inhibicin no competitiva es una disminucin aparente de la Vmax. Siendo
esta constante el producto kcate0, podemos decir que los inhibidores no competitivos
actan sobre kcat y los irreversibles sobre e0, pero la accin de unos y otros puede parecer
similar. Para diferenciarlos, no hay ms que estudiar la dependencia de la inhibicin con
respecto al tiempo. La inhibicin irreversible aumenta con el paso del tiempo; igualmen-
te, una inhibicin reversible no competitiva desaparece cuando sometemos la mezcla de
reaccin a dilisis u otro procedimiento similar.
Conviene sealar asimismo lo relativo de la denominacin irreversible. Con ello

se quiere decir que la reaccin de la enzima con el inhibidor es irreversible, estando la
posicin de equilibrio muy hacia la derecha en [11]. Ahora bien, en muchas ocasiones
podemos reactivar a la enzima por otro tratamiento qumico. Quiz fuera ms adecuado
referirse a los inhibidores irreversibles como inactivadores.
Otra caracterstica general de los inhibidores irreversibles es que suelen ser

sustancias muy txicas para los organismos. La especificidad enzimtica est sobre todo
determinada por los grupos encargados de la fijacin del substrato a la enzima. Los
grupos reactivos del centro activo, por su parte, son comunes a muchsimas enzimas.
Como tendremos ocasin de ver ms adelante, estos grupos son, por ejemplo, el -OH de
la serina, el imidazol de la histidina, el -SH de la cistena, y el -amino de la lisina, aparte
de metales que puedan desempear un papel importante en el mecanismo cataltico. Por
ello, todos los agentes que puedan reaccionar con estos grupos se comportarn como
inhibidores irreversibles no solo de una enzima (que sera el caso de los inhibidores
competitivos) sino de todas las enzimas que tuvieran en su centro activo el grupo en
cuestin. Su accin por tanto se extiende a muchas enzimas a la vez; y por eso suelen ser
altamente txicos in vivo. Dentro de este tipo de inhibidores estudiaremos los reactivos
de grupo SH, los metales pesados y los agentes quelantes de cationes esenciales.
Ahora bien, el concepto de especificidad en la fijacin de substrato o de anlogo

competitivo puede ser adoptado tambin en el diseo de inhibidores irreversibles. Se tra-
tara de seudosubstratos capaces de fijarse especficamente al centro activo de una deter-
minada enzima y que son adems capaces de reaccionar covalentemente con los grupos
cercanos al centro activo. Es as como han surgido potentes inhibidores muy especficos,
que encuentran un gran nmero de aplicaciones tanto en el estudio de los mecanismos
enzimticos como en aplicaciones clnicas o tecnolgicas. Dentro de este grupo tenemos
los reactivos especficos de grupo y los marcadores de afinidad, capaces de reaccionar con
grupos situados en las cercanas del centro activo o en el mismo centro activo tras una
fijacin especfica.
183
6.5.2. Reactivos de grupo -SH
La cadena lateral del aminocido cistena desempea un papel muy importante

tanto en el mantenimiento de la estructura tridimensional de una protena, a travs del
grupo disulfuro (-S-S-) como en el centro activo de una enzima, a travs de las propie-
dades del grupo -SH. En forma de tiolato -S- se trata de un nuclefilo potente con pro-
piedades muy parecidas al -OH de la serina. Hay muchos agentes capaces de reaccionar
con este grupo. Entre los principales, tenemos:
1. Reactivos que promueven la alquilacin de grupos -SH, como por ejemplo:

halocidos y sus derivados (yodoacetato, yodoacetamida), mostazas S y N, cloroacetofenona,
cloropicrina, bromobencilcianuro, fluoropiruvato. Estos agentes inducen la formacin de
un tiolter estable a hidrlisis, y por lo tanto las enzimas no son susceptibles de reactiva-
cin. Esta reaccin es dependiente de pH, ya que el grupo reaccionante es el ion -S-. En
la figura 6.13 se presenta el modo de accin del yodoacetato.
Figura 6.13
2. Reaccin con dobles enlaces, como por ejemplo el cido maleico y la N-etil-
maleimida (NEM). Se trata de una reaccin parecida a la anterior, dado que se forma un
tiolter estable, siendo la reaccin dependiente de pH (figura 6.13)
184
3. Agentes formadores de mercptidos: HgCl2, mercuriales, arsenito, arsenicales

trivalentes y metales como Cu, Pb, Cd y Ag. Uno de los agentes ms utilizados es el
p-cloromercuribenzoato (que en solucin acta como p-hidroximercuribenzoato) (figura
6.14). La accin de estos agentes puede ser revertida con compuestos -SH como cistena,
ditiotreitol, o mercaptoetanol.
Figura 6.14
4. Agentes oxidantes, que promueven la oxidacin del grupo tiol -SH a disulfuro
-S-S- (figura 6.15): glutation oxidado, sulfito, tetrationato, c.perfrmico, perxido de hi-
drgeno, aloxana, ferricianuro y ditio(bis)nitrobenzoico.
185
Figura 6.15
6.5.3. Metales pesados
Adems de la formacin de mercptidos que veamos en un apartado anterior, los

metales pesados como Ag, Pb, Tl, Hg y Cd pueden reaccionar con otros grupos de la
protena enzimtica: carboxilo de aspartato y glutamato, imidazol, serina, fenol, amino,
arginina, indol, etc. A concentraciones superiores a 1 mM los metales pesados se com-
portan como precipitantes.
6.5.4. Inhibidores que combinan con cationes esenciales
Estos inhibidores ejercen su accin a travs de la formacin de complejos o quela-

tos de tomos metlicos indispensables en la accin enzimtica y que as son eliminados
del centro activo.
1. Los iones cianuro (CN-), sulfuro (S-), las azidas y el monxido de carbono deben
su accin inhibitoria a la formacin de complejos con metales. Por tanto, todas las meta-
loenzimas son susceptibles de ser inactivados por estos agentes. En particular, es llamati-
va la inactivacin en sistemas que contienen Fe, Cu y Zn; en menor medida, Mn y Co.
El efecto txico del cianuro se debe a la inactivacin de la citocromo oxidasa al ocupar la
186
sexta posicin de coordinacin de un hemo a, grupo prosttico de los citocromos a (ver

captulo. 4).
2. Los agentes como el EDTA (etilendiamino tetraactico) tienen la particularidad

de formar quelatos con metales de valencia igual o superior a 2; por tanto, pueden inhi-
bir sistemas que dependan de Fe, Cu. Mg, Ca, y Mo (en particula Ca y Mg). El EDTA
y compuestos parecidos inhibirn dependiendo de la estabilidad relativa del quelato res-
pecto a la metaloenzima. Por otra parte, los agentes quelantes son bastante sensibles al
pH.
6.5.5. Reactivos especficos de grupo y marcadores de afinidad
Reaccionan con un grupo especfico que est en el centro activo o sus proximida-
des, sin reaccionar con otros aminocidos iguales presentes en la misma protena.
6.5.5.1. Organofosfricos
Los inhibidores organofosforados forman un grupo muy interesante en el sentido

de que son capaces de reaccionar con la serina activa de muchas enzimas; es decir, reac-
cionan con la serina especfica encargada de la formacin de acil-enzimas en el centro
activo (ver captulo 7), que forma parte de una trada cataltica (Ser-His-Asp, Cap. 7),
y no con las dems serinas que pudiera haber en el resto de la cadena polipeptdica. La
accin inhibitoria de los organofosfricos es ejercida a travs de una reaccin qumica
con el centro activo que remeda enteramente el mecanismo normal de catlisis. En este
sentido, los inhibidores organofosforados podran ser considerados como substratos sui-
cidas (ver ms adelante). Si no lo son, se debe a su carcter relativamente inespecfico, ya
que actan sobre un amplsimo grupo de enzimas.
El prototipo de estos inhibidores es el DFP (diisopropilfosfofluoridato), cuyo

modo de accin se presenta en la figura 6.16.
187
Figura 6.16
Existe una gran variedad de derivados organofosfricos, particularmente los em-

pleados como insecticidas (Parathion, Malathion) que operan por la inhibicin de la
acetilcolinesterasa de las uniones neuromusculares. Igualmente son derivados organofos-
fricos los llamados neurogases, desarrollados con fines blicos y de extremada toxicidad
(Sarin, Soman, Tabun, etc.).
6.5.5.2. Marcadores de afinidad
Son agentes que en su estructura incluyen grupos qumicos susceptibles de reac-

cionar con los residuos de aminocidos presentes en las proximidades del centro acti-
vo. El prototipo de los marcadores de afinidad son los derivados clorometilcetona. Las
halometilcetonas reaccionan con los grupos tiol e imidazol cercanos al centro activo y
pueden ser fcilmente introducidas en compuestos con estructura anloga a substratos
de enzima. En la figura 6.17, la estructura derivada de la reaccin de una histidina activa
(esto es, perteneciente a una trada Ser-His-Asp) con el marcador de afinidad tosil-L-
fenilalanina clorometilcetona (TPCK) (tosil es la abreviatura de 4-toluenosulfonil).
188
Figura 6.17
Los marcadores de afinidad se han empleado sobre todo en estudios estructurales

del centro activo.
6.6. Substratos suicidas
En la idea de unir la especificidad de los inhibidores competitivos o anlogos de

estado de transicin con la eficiencia de los inhibidores irreversibles, un paso ulterior es
el de los substratos suicidas o inhibidores activados enzimticamente. Se trata de substratos
que se unen al centro activo enzimtico y son transformados por este en una especie
qumica altamente reactiva que inhibe irreversiblemente a la enzima. La diferencia con
los marcadores de afinidad es que, en stos, el grupo reactivo va unido al substrato;
en los substratos suicidas, la especie reactiva es producida por la propia accin cataltica
de la enzima, y en ausencia de esta son totalmente incapaces de reaccionar. Ntese que
decimos substrato suicida en el mismo sentido que en piloto suicida (es decir, quiz
fuera ms descriptivo decir substrato kamikaze). El mecanismo cintico de los substra-
tos suicidas puede representarse as:
[13]
189
En donde:
(a) el inhibidor suicida I se fija a la enzima E con la misma especificidad que un

substrato o un inhibidor competitivo (con constantes k+1 y k-1; la unin es reversible)
dando lugar a un complejo EI.
(b) El inhibidor I as fijado es transformado a una especie qumica muy reactiva

I* por accin de la propia enzima, con constante cataltica kcat (igual que un substrato).
(c) I* reacciona con los grupos qumicos del centro activo con constante de ve-
locidad ki (como los inhibidores irreversibles) dando paso a una forma inactivada de la
enzima E.
En resumen: la propia enzima transforma el inhibidor en una especie qumica que

la inactiva irreversiblemente.
Los criterios para definir un compuesto como substrato suicida seran: (a) debe
fijarse con la misma especificidad que un substrato o un inhibidor competitivo; (b) el
inhibidor no debe ser capaz de reaccionar en ausencia de enzima; (c) debe ser activado
especficamente por la enzima; (d) la presencia de substrato o de un inhibidor competi-
tivo convencional a concentracin alta dificulta o suprime la accin del inhibidor.
Como ejemplo veremos a continuacin la accin de los antibiticos -lactmicos

(penicilinas y cefalosporinas).
6.6.1. Modo de accin de los antibiticos -lactmicos
La teraputica antibacteriana utiliza muy ampliamente los antibiticos

-lactmicos. Desde la introduccin en Teraputica de la penicilina durante la dcada
de 1940, se han sintetizado nuevas molculas parecidas (penicilinas semisintticas) y se
han introducido antibiticos qumicamente afines a las penicilinas, las cefalosporinas. Las
penicilinas semisintticas eliminan o atenan varios de los inconvenientes de estos an-
tibiticos (ampliacin del espectro antibacteriano, supresin de resistencias, posibilidad
de administracin por va oral, etc.).
190
Todos ellos operan inhibiendo la ltima reaccin en la sntesis de peptidoglicano

bacteriano, catalizada por la enzima transpeptidasa, y ello es debido a su similitud qu-
mica con el terminal D-alanil-D-alanina del precursor de peptidoglicano. Esta enzima
une el pentapptido al puente pentaglicina convirtindose en tetrapptido y uniendo
covalentemente dicho tetrapptido a la pentaglicina. Se presenta la estructura de una
penicilina semisinttica, la ampicilina, en la figura 6.18.
Figura 6.18
Los antibiticos -lactmicos son inhibidores suicidas de la transpeptidasa. Una

vez unidos al centro activo, el ciclo -lactmico es atacado y roto por la enzima y reac-
ciona con la serina del centro activo, inactivando irreversiblemente a la transpeptidasa
(figura 6.19). Se impide as la sntesis normal del peptidoglicano. Al no disponer de
pared celular, las fuerzas osmticas del medio destruyen a la bacteria (son, por tanto,
antibiticos bactericidas).
191
Figura 6.19
Estos antibiticos solamente operan a travs de su unin al centro activo de la

transpeptidasa, siendo transformados por esta en la especie qumica que inactiva la enzi-
ma por reaccin con la serina activa. Son, por tanto, inhibidores suicidas.
6.6.2. Resistencia a los antibiticos -lactmicos: la -lactamasa
Las bacterias han desarrollado progresivamente resistencia a los antibiticos

-lactmicos desde el mismo momento de su introduccin en Teraputica. En principio
este inconveniente se elimin mediante el uso de derivados semisintticos de la penici-
lina (como la ampicilina); pero poco a poco las resistencias se han desarrollado tambin
frente a estas. La razn de la resistencia estriba en la produccin por las bacterias de la
enzima -lactamasa, que rompe el anillo -lactmico para dar lugar a derivados del cido
peniciloico (inactivo), tal como se muestra en la figura 6.20.
192
Figura 6.20
Para potenciar el efecto de los antibiticos -lactmicos se han desarrollado in-

hibidores suicidas de la -lactamasa, que aaden a las formulaciones convencionales de
penicilinas semisintticas activas por va oral. De esta manera se inhibe la enzima inacti-
vadora de los antibiticos -lactmicos. Un ejemplo de estos inhibidores es el cido cla-
vulnico, que se fija al centro activo de la -lactamasa, la cual rompe el anillo lactmico
y da lugar a un producto que reacciona covalentemente con la serina activa de la enzima,
inactivndola (figura 6.21).
Figura 6.21
193
En resumen, hemos visto hasta aqu cmo unos inhibidores suicidas de una se-
rin-enzima (los antibiticos -lactmicos sobre la transpeptidasa) son potenciados por
otro inhibidor suicida que opera sobre otra serin-enzima (el cido clavulnico sobre la
-lactamasa).
6.6.3. Otros inhibidores suicidas
El principio de la inhibicin suicida se utiliza muy ampliamente hoy da, tanto en

la Teraputica establecida como en el diseo de nuevos frmacos.
As, se han desarrollado, entre otros muchos, inhibidores suicidas de la monoami-

nooxidasa cerebral (antidepresivos y antiparkinsonianos); de la aromatasa (antiestrog-
nicos); de las serin-proteinasas (como la proteasa del VIH); de la ornitina descarboxilasa
(antineoplsicos); de las lipo- y ciclooxigenasas (antiinflamatorios, por ejemplo, los salici-
latos); de la yoduro peroxidasa (antitiroideos); de la dopamina -hidroxilasa (neurolpti-
cos). Podemos decir que la investigacin actual sobre frmacos parte del principio de la
inhibicin suicida, unido a mtodos informatizados de diseo molecular virtual.
194
CAPTULO 7
EL CENTRO ACTIVO ENZIMTICO. MECANISMOS DE

LA ACCIN ENZIMTICA
7.1. El centro activo
7.1.1. Concepto
Hemos visto en los captulos anteriores que todos los modelos aceptados hoy da
para explicar la accin enzimtica dan por sentado que las enzimas ejercen su accin a
travs de la formacin de un complejo ES (complejo enzima-substrato), de naturaleza
estequiomtrica y en muchos casos no covalente. Cuando a esta generalizacin aadimos
el hecho de la especificidad enzimtica, se llega a la conclusin de que la fijacin del subs-
trato se hace a un lugar especfico de la enzima, cuya configuracin espacial, determina-
da por las cadenas laterales de los aminocidos que la integran o por la presencia de un
grupo prosttico, es tal que solo el substrato o compuestos anlogos del mismo pueden
fijarse. Por otra parte, de esta fijacin resulta la transformacin cataltica del substrato.
Llamamos centro activo a esta zona especfica de la molcula enzimtica. Hasta este mo-
mento hemos tratado del centro activo en un sentido puramente cintico; los datos ex-
perimentales apuntan a la existencia de un centro activo. En este captulo trataremos en
primer lugar de la evidencia estructural que nos lleva a esta conclusin. El conocimiento
detallado de la estructura de muchos centros activos permite que hoy da conozcamos
asimismo multitud de mecanismos de accin enzimtica, que tambin sern estudiados
en el presente captulo.
La existencia del centro activo enzimtico presupone que cualquier descripcin

del mismo deba necesariamente explicar:
- La configuracin especfica de los grupos moleculares encargados de la fijacin del

substrato, dando cuenta de los fenmenos de especificidad y competicin por anlogos
estructurales.
- La configuracin especfica de los grupos moleculares encargados de la transformacin

cataltica del mismo. Estos grupos no coinciden necesariamente con los citados en el
prrafo anterior. La descripcin de estos grupos ha de ser coherente con el mecanismo
cintico conocido de la enzima y debe dar cuenta de los efectos de inhibidores irreversi-
bles, del pH, de la temperatura, etc., observados para la misma.
- Adems, cualquier descripcin del centro activo debe explicar la eficiencia cata-
ltica de las enzimas. Los nmeros de recambio tan enormes que encontramos a veces en
196
la catlisis enzimtica no encuentran una explicacin satisfactoria hasta que no se llega

a conocer en detalle la estructura del centro activo. En este sentido, el conocimiento del
mismo puede brindar claves extraordinariamente tiles en el diseo e implementacin
de enzimas artificiales, tema abordado por la moderna Biotecnologa.
7.1.2. Pruebas experimentales de la existencia del centro activo
1. El modelo cintico de Michaelis y Menten se fundamenta en la formacin de un

complejo estequiomtrico enzima-substrato, y ello explica la mayor parte de la fenome-
nologa enzimtica. De esta interaccin resulta la transformacin cataltica del substrato
y la formacin de producto. Como se dijo ms arriba, si a este concepto aadimos el fe-
nmeno de la especificidad, se llega a concebir la existencia de un centro activo con capa-
cidad de fijar y transformar al substrato. Hasta el momento actual, no se ha descubierto
ninguna enzima cuya actividad no est de acuerdo con este modelo; todas las enzimas
conocidas hasta ahora dan lugar a cinticas saturantes (de orden cero a concentraciones
altas del substrato, de orden uno a bajas concentraciones) y presentan un mayor o menor
grado de especificidad.
2. Muchas enzimas son protenas conjugadas a un grupo prosttico, y en estos casos

puede demostrarse fcilmente que la actividad cataltica est en parte o en su totalidad
ligada al mismo. El grupo prosttico ocupa una parte especfica de la molcula, y su acti-
vidad est condicionada por el entorno de la molcula proteica. Hoy sabemos que en la
mayora de estos casos el grupo prosttico no es capaz per se de llevar a cabo el proceso ca-
taltico completo. As, en las hemoenzimas (enzimas con grupo prosttico de tipo hemo)
el entorno proteico es absolutamente fundamental en la accin cataltica, y lo mismo
podemos decir de las flavoenzimas y de todas las dems.
3. El fenmeno de la inhibicin competitiva nos indica que compuestos con es-

tructura anloga al substrato pueden en ocasiones bloquear la accin enzimtica. La
asociacin de los conceptos similitud estructural con inhibicin lleva intuitivamente
a pensar que la accin del inhibidor consiste en que este ocupa el lugar destinado al subs-
trato, lo que ha sido ampliamente corroborado por la investigacin.
4. Muchos de los inhibidores irreversibles conocidos (organofosfricos, reactivos

-SH, etc.) deben su actividad a una reactividad especfica frente a determinadas cadenas
laterales de aminocidos. El caso de los organofosfricos es particularmente ilustrativo
dado que reacciona con el hidroxilo de la serina, pero no con todas las serinas, sino solo
197
con aquella implicada en la actividad cataltica. Para ello, sabemos que en la vecindad de
la serina activa tiene necesariamente que haber una cadena lateral de histidina y una de
aspartato (trada cataltica) con una orientacin precisa. Los organofosfricos reaccionan
nicamente con las serinas que presentan esta configuracin.
5. El estudio filogentico de las secuencias de aminocidos de enzimas homlogas

(serin proteinasas, por ejemplo) ha permitido ver la existencia de zonas altamente con-
servadas en la estructura primaria de las mismas. Se muestran a continuacin algunos
ejemplos de estas secuencias:
Secuencias homlogas en torno a la serina activa en serin proteinasas
Tripsina bovina Cys.Gln.Gly.Asp.Ser.Gly.Gly.Pro.Val

Quimotripsina bovina A Cys.Met.Gly.Asp.Ser.Gly.Gly.Pro.Leu
Quimotripsina bovina B Cys.Met.Gly.Asp.Ser.Gly.Gly.Pro.Leu
Elastasa porcina Cys.Gln.Gly.Asp.Ser.Gly.Gly.Pro.Leu
Trombina bovina Cys.Glu.Gly.Asp.Ser.Gly.Gly..Pro.Phe
Plasmina humana Cys.Gln.Gly.Asp.Ser.Gly.Gly.Ser.Trp
Proteinasa de Sorangium Gly.Arg.Gly.Asp.Ser.Gly.Gly.Ser.Trp
Proteinasa de St. griseus Cys.Gln.Gly.Asp.Ser.Gly.Gly.Pro.Val
Secuencias homlogas en torno a la histidina activa en serin proteinasas
Tripsina bovina Ser.Ala.Ala.His.Cys.Tyr

Quimotripsina bovina A Thr.Ala.Ala.His.Cys.Gly
Quimotripsina bovina B Thr.Ala.Ala.His.Cys.Gly
Elastasa porcina Thr.Ala.Ala.His.Cys.Val
Trombina bovina Thr.Ala.Ala.His.Cys.Leu
Proteinasa de Sorangium Thr.Ala.Gly.His.Cys.Gly
Proteinasa de St. griseus Thr.Ala.Ala.His.Cys.Val
(En rojo, posiciones invariantes; en azul, sustituciones conservadoras).
Esta convergencia estructural en enzimas de muy diversa procedencia habla a favor

de una configuracin altamente especfica de la molcula enzimtica que, al conservarse,
implica una zona de la molcula fundamental para su actividad cataltica.
198
6. Los estudios de fijacin de substratos (o ms frecuentemente, anlogos de subs-

trato) a enzimas muestran inequvocamente un nmero entero y limitado de molculas
del mismo que se fijan a la enzima. Si en muchos casos hay ms de uno, ello indica la
existencia de ms de un centro activo, lo que es ms bien regla que excepcin en la cat-
lisis enzimtica, particularmente en lo que se refiere a enzimas intracelulares.
7. Por ltimo, podemos mencionar los estudios fsicos, estructurales, realizados

sobre complejos enzima-substrato (o una vez ms, anlogos de substrato). Entre ellos los
ms significativos son los realizados por cristalografa de rayos X. En 1965, Phillips publi-
c sus resultados sobre la co-cristalizacin de la lisozima con su substrato, y la estructura
a alta resolucin del complejo. Ya el hecho de que el complejo ES (o EI, en el caso de un
anlogo competitivo) pueda co-cristalizar indica que la fijacin del substrato tiene nece-
sariamente que hacerse a un grupo especfico, el mismo en todas las molculas enzimti-
cas. Pero la estructura resultante de estos estudios va an ms all; no solo se demuestra
claramente la existencia de un lugar de fijacin especfico del substrato, sino que explica
con todo detalle los pormenores de la actividad cataltica del mismo. En la actualidad se
ha logrado la cocristalizacin de muchos complejos ES y se ha podido estudiar su estruc-
tura por cristalografa de rayos X, con el mismo resultado que en el caso de la lisozima.
7.1.3. Nmero de centros activos
1. Cuando la protena presenta un grupo prosttico o un metal esencial para la ac-

tividad cataltica, el nmero de centro activos equivale obviamente al de stos. Tal es el
caso, por ejemplo, de las flavoenzimas, biotinil-enzimas, hemoenzimas, metaloenzimas,
etc.
2. Los estudios convencionales de fijacin mediante anlogos de substrato debida-

mente marcados (por radioactividad, fluorescencia, etc.) nos pueden dar una idea muy
exacta del nmero de molculas fijadas a la enzima, as como de su afinidad intrnseca.
En esencia, estos mtodos consisten en la incubacin de la enzima con el anlogo mar-
cado durante un tiempo determinado, a diversas concentraciones del ligando y perma-
neciendo todas las dems condiciones constantes, seguida de la separacin del ligando
libre del complejo protena-ligando por algn mtodo fsico-qumico. La determinacin
cuantitativa de uno y otro nos lleva, a travs de diversos procedimientos en los que no
vamos a entrar, al conocimiento del nmero de centros activos.
3. El centro activo de muchas enzimas contiene grupos qumicos que pueden reac-
cionar con reactivos especficos. Por ejemplo:
199
- En las enzimas que contienen serinas reactivas en el centro activo podemos de-
terminar el nmero de stos mediante reaccin con organofosfricos (por ejemplo, DFP,
diisopropil fosfofluoridato, figura 7.1). Es obvio, en este caso, que el nmero de moles
de DFP consumidas equivaldr al nmero de centros activos de la enzima. En este caso
es importante hacer notar que los organofosfricos reaccionan nicamente con la serina
activa, sin hacerlo con las dems serinas que pudiera haber en el resto de la molcula
enzimtica.
Figura 7.1
- Lo mismo puede hacerse con otros inhibidores irreversibles, y muy particular-

mente con substratos suicidas.
- En general, todas aquellas enzimas cuya accin proceda a travs de la formacin

de intermediarios covalentes (v. ms adelante) son susceptibles de este tipo de estudios.
Siempre se pueden encontrar condiciones experimentales en las que el intermediario
covalente sea suficientemente estable como para ser aislado y cuantificado.
200
7.1.4. Aminocidos y grupos qumicos implicados en el centro activo
La identificacin de las cadenas laterales implicadas en la actividad cataltica de la

enzima no es tarea fcil, aunque hoy da disponemos de mtodos cada vez ms podero-
sos que sern tratados de forma general a continuacin. Como siempre, son los estudios
estructurales, cuyo paradigma es la cristalografa de rayos X, los que tienen por el mo-
mento la ltima palabra en este contexto.
Cuando encontramos en una protena un aminocido que es fundamental en la

actividad cataltica, se ha de determinar cuidadosamente si lo es por pertenecer real-
mente al centro activo, o bien si su papel estriba en mantener una estructura terciaria o
cuaternaria de vital importancia para la correcta configuracin del mismo. Igualmente
se debe determinar si el aminocido forma parte del centro activo (a) contribuyendo a la
correcta fijacin del substrato; (b) suministrando un grupo reactivo para su transforma-
cin cataltica; (c) realizando ambas funciones a la vez. Por lo que sabemos actualmente,
los aminocidos implicados en la fijacin del substrato pueden ser prcticamente todos,
a travs de interacciones dbiles (hidrofbicas o polares) establecidas entre el substrato y
sus cadenas laterales. Pero los aminocidos que participan en la transformacin cataltica
han resultado ser un nmero mucho ms limitado (por ejemplo serina, histidina, ciste-
na, lisina, aspartato, glutamato) hasta el punto de que muchos mecanismos de accin
enzimtica han resultado ser muy similares a pesar de que corresponden a reacciones
aparentemente muy distintas.
Histricamente, los primeros estudios se hacan observando el efecto del pH sobre

la fijacin del substrato o sobre su transformacin cataltica, tratando de localizar algn
pH especfico que diera lugar a un cambio en la actividad cataltica y que se correspon-
diera con el pKa conocido de un aminocido concreto. Ahora bien, estos estudios solo
podan tomarse como orientativos, ya que el pKa de los grupos disociables presentes en
las cadenas laterales de los aminocidos vara en funcin del entorno, y nunca podemos
llegar a identificar inequvocamente un aminocido por este criterio.
1. Efecto de inhibidores irreversibles. Ya hemos visto la utilidad de este tipo de

inhibidores en el estudio de nmero de centros activos. Como es lgico, la accin de este
tipo de inhibidores nos informa sobre determinados aminocidos. As, la sensibilidad
a organofosfricos es caracterstica de las serin-enzimas (es decir, las que presentan una
configuracin serina-histidina-aspartato en el centro activo); la sensibilidad a reactivos
de grupos -SH informa sobre la presencia de cistena; el efecto de agentes quelantes
201
(EDTA, EGTA) o de ligandos de coordinacin (CN-, CO, etc.) indica la presencia de

iones metlicos.
2. Marcaje de afinidad. Esta tcnica, descrita en el captulo 6, ha sido amplia-

mente utilizada para determinar los aminocidos situados en o en las proximidades del
centro activo. Consiste en tratar a la enzima con un compuesto formado por la unin
del substrato, o un anlogo del mismo, a un grupo qumico suficientemente reactivo
como para marcar, en el momento de la unin ES, a grupos de la protena que estn en
el entorno del centro activo.
El ejemplo clsico de marcador de afinidad ha sido el marcaje de histidinas acti-

vas mediante la toluenosulfonil-L-fenilalanina clorometil cetona (TPCK), que vimos en el
captulo 6, y cuya accin se presenta en la figura 7.2. Este marcaje opera sobre las serin-
enzimas.
Figura 7.2
202
3. Substratos suicidas. El concepto de substrato suicida, que vimos en el captulo

anterior, vale tambin para la identificacin de residuos presentes en el centro activo.
Precisamente, estos inhibidores fueron diseados por Konrad Bloch para estudiar la in-
activacin de la -hidroxi decanoil deshidratasa (enzima implicado en la sntesis de cidos
grasos insaturados). Para ello dise un derivado que en el curso de la actividad cataltica
era transformado a un producto altamente reactivo con la consiguiente modificacin e
inactivacin de la protena. Desde entonces se han desarrollado una gran cantidad de
substratos suicidas, empleados tanto en Teraputica como en la identificacin de ami-
nocidos presentes en el centro activo.
4. Estudios filogenticos. La comparacin de estructuras primarias de enzimas,

segn vimos antes, nos brinda informacin muy til en la identificacin de aminocidos
presentes en el centro activo (aunque tambin muchos invariantes estn implicados en
el mantenimiento de la estructura global de la molcula, y no en el centro activo propia-
mente dicho).
5. Mutagnesis dirigida. Se trata de una poderossima tcnica mediante la cual se

pueden introducir mutaciones a voluntad en secuencias peptdicas de enzimas cuyos ge-
nes hayan podido ser clonados con anterioridad. Para ello, se sintetiza un oligonucleti-
do de 10-12 residuos complementarios a la secuencia nucleotdica en torno al codon del
aminocido que se pretende variar. Precisamente en este codon, en lugar del aminocido
que ocupa la posicin en la enzima nativa, se introduce el del aminocido que queramos
poner en su lugar. Veamos esta tcnica con un ejemplo concreto:
(a) Supongamos que se desea sustituir la serina activa de la quimotripsina por

otro aminocido. Para ello, se sintetiza un oligonucletido de unos 15 nucletidos de
secuencia complementaria al DNA original, excepto en una sola base, correspondiente a
la segunda del codon de serina (TCT, cuyo complementario sera AGA y sin embargo
hemos puesto AAA). Por ello, serina (TCT) se ver sustituida por TTT (fenilalanina)
(figura 7.3). Es obvio que el apareamiento Watson-Crick entre la secuencia del oligonu-
cletido y la del gen clonado que se pretende mutar no es perfecto; pero llevando a cabo
la hibridacin en condiciones de alta concentracin salina se obtiene el apareamiento a
pesar de la zona imperfecta.
203
Figura 7.3
(b) Se procede a entonces a tratar el hbrido con DNA polimerasa, con lo que pro-
ducimos DNA con la secuencia mutante deseada. Este DNA, propagado por la reaccin
en cadena de la polimerasa (PCR), se transcribe a un mRNA, que expresado en un siste-
ma de sntesis de protena dar lugar a la enzima con el aminocido mutado (figura 7.4).
204
Figura 7.4
6. Estudios fsicos. Se conoce hoy da la estructura tridimensional de miles de

enzimas. En muchos casos se puede obtener la cocristalizacin de las mismas con su
substrato o un anlogo del mismo, con lo que se hace accesible al estudio por difraccin
de rayos X, lo cual supone el estudio ms completo que cabe hacer tanto del centro acti-
vo como del mecanismo cataltico de las enzimas. Ms adelante en este mismo captulo
estudiaremos, a modo de ejemplo, una serie de mecanismos determinados por esta y
otras tcnicas.
7.2. Mecanismos de la accin enzimtica
Uno de los problemas ms interesantes que plantea la enzimologa es determinar

las causas de la gran eficiencia cataltica de las enzimas. La catalasa, por ejemplo, trans-
forma substrato en el orden de 108 molculas de substrato por segundo y centro activo.
Estas velocidades corresponden a una disminucin de la energa de activacin (v. captu-
lo 1) de varios rdenes de magnitud. La explicacin de estas activaciones tan intensas no
radica en una sola causa. Muy esquemticamente podemos cifrar la accin enzimtica en
los siguientes mecanismos:
205
(a) Yuxtaposicin en un sentido estereoqumicamente correcto de todos los grupos

reactivos sobre una superficie especfica: efectos de proximidad y orientacin.
(b) Presentacin de grupos con reactividades especficas (cido, base, nuclefilo,

electrfilo, etc.) presentes en la molcula enzimtica y que determinan la accin catal-
tica.
(c) Disminucin de la estabilidad del estado basal de las molculas e incremento

de la misma en el estado de transicin.
(d) Formacin de intermediarios covalentes entre el substrato y la enzima que fa-

vorecen la accin cataltica.
(e) Otros muchos efectos; por ejemplo, efectos mecanocunticos.
Si bien estos efectos, uno por uno, no llegan a explicar las enormes velocidades de
la accin enzimtica, en conjunto pueden dar una idea relativamente aproximada de los
mecanismos intrnsecos de la accin enzimtica.
7.2.1. Efectos de proximidad y orientacin
La catlisis enzimtica tiene en comn con la catlisis heterognea, en general,

el hecho de que los reactivos se renen sobre una superficie; en nuestro caso, una zona
especfica de la molcula proteica conocida como centro activo. Por tanto, lo primero
que hemos de suponer es que la accin enzimtica tiene lugar (entre otras cosas) por la
proximidad que se establece entre los distintos reactivos (con el consiguiente aumento de
la concentracin local de los mismos). Hay clculos tericos que cifran la aceleracin de
una reaccin debido a este factor de proximidad en alrededor de un factor de 5 para reac-
ciones monosubstrato; pero este factor puede incrementarse enormemente al aumentar
la molecularidad de la reaccin (reacciones multisubstrato).
Igualmente, el factor de aceleracin se incrementa de manera notoria si al efecto

de proximidad unimos el efecto de orientacin. En el caso de las reaccin en solucin
libre, sin catalizadores presentes, podemos suponer que la colisin entre molculas sola-
mente es productiva en el caso de que las molculas participantes lleguen al choque en
206
una orientacin correcta, tal y como se indica en la figura 7.5. En el centro activo de la
enzima los substratos se fijan desde el principio en la orientacin correcta.
Figura 7.5
7.2.2. Catlisis cido-base
Existen muchos aminocidos en las protenas cuyas cadenas laterales son suscep-
tibles de disociacin cido-base, pudiendo actuar como catalizadores generales cidos o
bsicos. Pero adems, el entorno en el interior de la molcula altera el pKa de los grupos
disociables, llevndolos a zonas de pH ms cercanas al del interior celular, de forma que
grupos qumicamente idnticos pueden actuar como cido y como base en la misma
molcula.
En muchas enzimas es habitual el mecanismo de sustraccin protnica (ingl. proton

abstraction). Ilustraremos este mecanismo detallando la accin cataltica de la ribonuclea-
sa pancretica.
207
En el mecanismo de la ribonucleasa pancretica, la accin cataltica se desarrolla

gracias a los estados alternantes de protonacin de dos histidinas presentes el centro
activo, la His 12 (libre) y las His 119 (protonada), a cuyo conjunto se une el substrato,
un polirribonucletido (figura 7.6, 1). La catlisis comienza con la sustraccin de un
protn del grupo 2-OH del substrato por el par electrnico del imidazol de la His 12 y
una cesin del protn de la His 119 al substrato. Esto da lugar a un estado de transicin
inestable con fosfato pentacovalente, que es estabilizado por otros grupos presentes en el
centro activo (figura 7.6, 2).
Este estado se resuelve quedando la His 119 libre (no protonada), liberndose el
fragmento 3 del polinucletido y con el fragmento 5 en estado de nucletido 2,3 c-
clico (figura 7.7, 3).
Figura 7.6
208
Figura 7.7
Al centro activo accede una molcula de agua (figura 7.7, 4) a la que la His 119
sustrae un protn, produciendo un grupo OH- libre que ataca al nucletido cclico (fi-
gura 7.8, 5). Esto produce un nuevo estado de transicin pentacovalente (figura 7.8, 6).
209
Figura 7.8
el cual es roto por el protn de la His 12, liberndose as el fragmento 5 del polinu-
cletido primitivo y volviendo el centro activo a su configuracin original (figura 7.9, 7).
Figura 7.9
210
Reacciones de sustraccin y cesin protnicas como la citada, llevadas a cabo por

bases (generalmente por el par electrnico de la histidina), tienen una enorme importan-
cia no solo en esta enzima, sino en toda la catlisis enzimtica en general.
7.2.3. Grupos nuclefilos y electrfilos
Se llaman grupos nuclefilos aquellos que tienen abundancia de electrones (por

ejemplo, grupos con N, O y S) y por lo tanto presentan afinidad hacia los ncleos (y de
ah el nombre). Los ataques nuclefilos tienen una gran importancia en multitud de me-
canismos enzimticos. Nuclefilos muy potentes son el -OH de la serina (cuando est en
las proximidades de una histidina que tiende a retirar un protn H+ del grupo alcohlico
y se transforma en grupo enolato O- de gran reactividad), el N de la histidina (en estado
de base conjugada, es decir, con el par electrnico libre) y el -SH de la cistena (en pre-
sencia asimismo de un grupo bsico que induzca en esta una sustraccin protnica y lo
transforme en tiolato, -S-).
Son grupos electrfilos los que con pocos electrones tienen afinidad por estos; no
hay en las protenas grupos electrfilos potentes; pero s lo son los tomos e iones met-
licos (Zn2+, Cu2+, etc.) que con mucha frecuencia aparecen formando parte en las mo-
lculas enzimticas con diversas geometras de coordinacin y mucha importancia en el
mecanismo de catlisis.
7.2.4. Formacin de intermediarios covalentes con la enzima
En general, todas las serin-enzimas actan mediante la formacin de un interme-

diario covalente en el curso del proceso de catlisis. A veces este intermediario es sufi-
cientemente estable como para que podamos encontrar condiciones especficas para su
aislamiento y caracterizacin.
El caso mejor estudiado, que ya hemos tenido ocasin de examinar, es el de las

serin proteinasas. La accin cataltica en estas enzimas consiste en una sustraccin pro-
tnica llevada a cabo por la histidina activa y que convierte al -OH sernico en un
fuerte nuclefilo que ataca al grupo carbonilo del enlace amida con formacin de una
acil-enzima que puede aislarse fcilmente. Se describe al final de este captulo el mecanis-
mo detallado de accin de una serinproteinasa, la quimotripsina.
211
Los intermediarios covalentes no solo se forman a partir de serina. Un intermedia-

rio covalente de gran importancia en la catlisis enzimtica, adems de otros muchos, es
la formacin de bases de Schiff. El grupo carbonilo -CO- de aldehdos o cetonas reacciona
con aminas primarias (por ejemplo, la cadena lateral de la lisina) con prdida de agua
para formar las llamadas bases de Schiff. Tal es el caso de la aldolasa, enzima que ataca a
la fructosa 1,6 bisfosfato para dar dos triosa-fosfatos en la glicolisis (figura 7.10).
Figura 7.10
7.2.5. Efectos mecanocunticos
Las reacciones enzimticas tienen lugar en unas dimensiones comparables a la lon-

gitud de onda del electrn (2.7 nm) o del protn (0.063 nm) considerados ambos desde
el punto de vista de la dualidad onda-partcula. Por tanto, podemos esperar que la accin
cataltica de las enzimas presente en ocasiones efectos cunticos, como por ejemplo el
efecto tnel; dado que la longitud de onda asociada es comparable a las dimensiones
fsicas de los sistemas en los que tiene lugar la transferencia de protones y electrones en
las reacciones enzimticas, podr existir una incertidumbre apreciable en la posicin de
estas dos partculas dentro de un centro activo. Para nosotros tiene gran inters la in-
212
certidumbre asociada al protn, dada la frecuencia con que los mecanismos de catlisis
enzimtica implican sustraccin protnica, tal como hemos visto. Ello hace que a esta
escala dimensional (nm) el protn pueda oscilar entre dos grupos moleculares con una
cierta probabilidad, obviando la barrera energtica.
Los efectos mecanocunticos son objeto de muy activa investigacin en la actua-

lidad.
7.3. Estudio del centro activo de la quimotripsina
A lo largo de esta discusin hemos podido comprobar que las serin proteinasas son
quiz las enzimas cuyo mecanismo conocemos mejor. Para terminar este captulo, estu-
diaremos el mecanismo reactivo de la quimotripsina (EC 3.4.21.1), que es el prototipo
de las serin proteinasas. Se presenta su estructura en la figura 7.11.
Figura 7.11
213
La quimotripsina hidroliza los enlaces peptdicos del interior de una protena es-
tablecidos de la siguiente manera: Tyr-X, Trp-X, Phe-X y Leu-X, siendo X cualquier
aminocido. Es una enzima producida en las clulas acinares del pncreas en forma de
quimotripsingeno (precursor inactivo) y al ser segregada a la luz intestinal se convierte
en quimotripsina activa, participando muy activamente en el proceso de digestin de las
protenas.
El centro activo de la quimotripsina est formado por una trada cataltica serina-
histidina-aspartato (figura 7.12, 1), propio de las serinproteinasas y de muchas otras
enzimas. La presencia de esta trada la hace sensible a inhibidores organofosfricos, entre
otros.
Figura 7.12
La investigacin sobre inhibidores de serin proteinasas es un campo muy activo,

dada la importancia que tienen las roturas proteolticas mediadas por estas enzimas en
multitud de procesos celulares y fisiolgicos (desde la apoptosis hasta la coagulacin de
la sangre, pasando por la formacin de protenas de cubierta vricas).
214
A este centro activo accede el substrato (figura 7.12, 2). En el caso de la quimo-
tripsina, se trata del interior de un pptido, fijndose con la especificidad propia de esta
enzima (ver ms arriba).
La accin cataltica comienza con la sustraccin de un protn por parte del par
electrnico libre de la histidina activa (figura 7.13, 3) cuyo grupo imidazol pasa a imi-
dazolio, con carga positiva, y el -OH de la serina se convierte en enolato -O-. El enola-
to, un nuclefilo potente, ataca al enlace peptdico dando lugar a un primer estado de
transicin, con el grupo carbonilo -C=O del enlace convertido transitoriamente en un
carbono tetradrico (figura 7.13, 4). La carga negativa del aspartato estabiliza al grupo
imidazolio de la histidina.
Figura 7.13
La histidina, a continuacin, cede el protn captado previamente al estado de

transicin, rompindose el enlace y liberndose el primer producto (el fragmento C-
terminal del pptido atacado), mientras que el fragmento C-terminal queda unido cova-
lentemente a la serina, dando lugar al complejo acil-enzima (figura 7.14, 5).
215
Figura 7.14
A continuacin entra en el centro activo una molcula de agua (figura 7.14, 6) que
es atacada a su vez por el par electrnico de la histidina libre, que sustrae un protn del
agua para dar un hidroxilo reactivo (figura 7.15, 7) y nuevamente un imidazolio, estabi-
lizado por el aspartato. El hidroxilo ataca al enlace acil-enzima. Este ataque produce un
segundo estado de transicin con carbono tetradrico (figura 7.15, 8).
Figura 7.15
216
Este estado de transicin se resuelve liberndose el segundo producto (figura 7.16,

9), que es el fragmento N-terminal del pptido. El centro activo vuelve a su estado inicial
gracias a la cesin del protn del grupo imidazolio de la histina a la serina (figura 7.16,
10).
Figura 7.16
217
CAPTULO 8
REGULACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA, 1

8.1. Generalidades
Una elemental consideracin de las capacidades de los seres vivos nos lleva a ad-
mitir sin gnero de dudas la necesidad de un control de sus funciones, tanto a nivel fisio-
lgico como a nivel celular. El concepto de homeostasis de Cannon, heredero de la fixit
du milieu intrieur de Claude Bernard, lleva implcito la existencia de mecanismos de
control que mantengan todas las funciones a un nivel fijo y de referencia. Pero an hay
ms: una de las caractersticas ms notables de los seres vivos es su capacidad de adapta-
cin a circunstancias ambientales cambiantes; y as como determinadas funciones deben
mantenerse a su nivel de referencia homeosttico, otras deben necesariamente alterarse
en respuesta a un ambiente en cambio y potencialmente hostil. Los varios millares de
reacciones metablicas que pueden tener lugar en un ser vivo no han de estar necesaria-
mente siempre en funcionamiento; es obvio que el escenario ambiental ha de determinar
en ltimo trmino las capacidades metablicas. No es lo mismo, por ejemplo, un cultivo
bacteriano creciendo en un medio mnimo que el mismo cultivo en un medio comple-
to; ni un animal herbvoro paciendo tranquilamente que el mismo animal sometido al
ataque de un predador; ni la actividad de una planta iluminada que la misma en la oscu-
ridad. En todos estos casos podemos desentraar una cadena de acontecimientos fisiol-
gicos que en ltimo trmino vienen determinados por variaciones en el metabolismo; y
como son las enzimas la condicin necesaria y suficiente de este, encontraremos que es
precisamente la variacin de la actividad y la concentracin de enzimas el causante lti-
mo de todas las adaptaciones fisiolgicas. Actividad y concentracin enzimticas, pues,
estn sometidas a mltiples controles relacionados con la adaptabilidad del ser vivo a su
entorno.
8.1.1. Tipos de regulacin enzimtica
El incremento o disminucin de la actividad enzimtica puede hacerse de dos

maneras distintas, no necesariamente excluyentes entre s. Por una parte, puede variar
la concentracin de enzima: estos sistemas de control actuarn, preferentemente, sobre
la biosntesis o degradacin de enzimas. Pero tambin existen controles sobre la actividad
intrnseca de la enzima. A su vez, las variables controladas en este ltimo caso pueden ser
la funcin de fijacin del substrato o la de su transformacin cataltica, o ambas. En los
seres vivos encontramos un amplio repertorio de regulaciones de todos estos tipos.
Podemos intentar una clasificacin de los distintos tipos de regulacin enzimtica

de la forma siguiente:
220
I. Controles sobre la concentracin enzimtica
(a). Controles sobre la expresin gentica
Este tipo de controles se ejerce sobre el aparato de expresin gentica de la clula,

incrementando o disminuyendo la intensidad de la transcripcin del DNA en forma de
mRNA en genes y sistemas genticos especficos.
Las enzimas celulares pueden ser clasificadas en dos grandes grupos: (a) Enzimas
constitutivas, que se mantienen siempre al mismo nivel independientemente de las va-
riaciones ambientales. El ejemplo tpico de estas enzimas son las de la va glicoltica. (b)
Enzimas inducibles, que solo son producidas en respuesta a estmulos del medio ambien-
te. A estas ltimas se refiere esencialmente este tipo de control. Por ejemplo, una bacteria
puede utilizar varias fuentes de carbono. En un momento dado la bacteria est creciendo
en glucosa y sbitamente se le cambia a un medio con lactosa. Existen sistemas que in-
ducen la sntesis de las enzimas implicadas en la degradacin de la lactosa. Anlogamente,
una clula bacteriana creciendo en un medio mnimo debe sintetizar todos los amino-
cidos proteicos. Si en un momento dado suplementamos el medio con un determinado
aminocido, por ejemplo, histidina, existen sistemas que reprimen la sntesis de enzimas
encargadas de la produccin de histidina. En los eucariotas existen sistemas de induccin
y represin mucho ms complejos, pero que ejercen su accin asimismo sobre el aparato
de transcripcin de la clula. No hay que olvidar que, en este caso, los controles trascien-
den del mbito restringido del metabolismo, dando paso a la accin de seales qumicas
tales como hormonas, neurotransmisores, factores de crecimiento, etc.
(b). Controles sobre la degradacin enzimtica
Este tipo de controles, mucho peor conocidos que los anteriores, se ejercen acele-
rando o enlenteciendo el ritmo de degradacin proteoltica de las enzimas celulares.
Aqu no vamos a tratar estos tipos de controles, puesto que se suelen estudiar for-
mando parte de la Gentica Molecular, ya que estn todos ellos ntimamente relaciona-
dos con los procesos de expresin gentica.
221
II. Controles sobre la actividad enzimtica
Van a ser el objeto principal de estudio en este captulo y en el siguiente. Este tipo
de controles se ejerce sobre la actividad intrnseca de la enzima, e implican por lo general
alteraciones conformacionales de la molcula enzimtica. Los controles sobre la activi-
dad enzimtica pueden a su vez realizarse sobre (a) la funcin de fijacin del substrato,
haciendo variar la Km aparente hacia el mismo; (b) la funcin de transformacin catal-
tica del substrato, lo que lleva a alteraciones en la kcat de la enzima; (c) ambas funciones.
La clasificacin de estos controles la hacemos en funcin del mecanismo molecu-

lar de control.
Podemos clasificarlos as:
(a). Control alostrico o alosterismo
Consiste en la regulacin de la actividad enzimtica a travs de cambios conforma-

cionales inducidos en la molcula de enzima por distintos efectores positivos o negativos.
No hay en este caso modificacin covalente de la enzima. Se trata de un tipo de control
de ajuste fino de la actividad enzimtica, ejercido en el interior de la propia clula. Toma
la forma de retroalimentacin negativa.
(b). Modificacin covalente de las enzimas
En muchos casos las enzimas pueden ser modificadas covalentemente por otros
sistemas enzimticos, resultando variaciones en su actividad con significado regulatorio,
y que muchas veces son activaciones on-off, es decir, todo o nada. Se van conociendo cada
da ms y ms modificaciones covalentes de esta naturaleza. Las ms generalizadas, aun-
que ni mucho menos las nicas, consisten en fosforilacin o defosforilacin de la protena
enzimtica. Las modificaciones covalentes suelen darse en respuesta a seales fisiolgicas,
y son frecuentes las activaciones en cascada de estos sistemas. El cambio en actividad
enzimtica puede variar en rdenes de magnitud, a diferencia del control alostrico, que
induce variaciones relativamente pequeas en la actividad del sistema.
222
Dentro del control por modificacin covalente podemos incluir la activacin por
modificacin proteoltica. Algunas enzimas son producidas como zimgenos, es decir, pre-
cursores inactivos que pueden ser activados por la rotura de un enlace peptdico especfi-
co. En estos sistemas es regla la activacin o inactivacin en cascada, y suelen aparecer en
aquellos procesos que en un momento dado deben ponerse en funcionamiento rpida e
intensamente, como por ejemplo la coagulacin sangunea.
Estudiaremos en este captulo la regulacin alostrica y en el siguiente la regula-

cin por modificacin covalente. Controles que se ejercen todos ellos sobre la actividad
intrnseca de la enzima.
Antes de pasar a la descripcin detallada de los sistemas de control, conviene fa-

miliarizarnos con una idea central en este estudio. La ciencia experimental siempre ha
tratado de explicar los fenmenos naturales con el mnimo posible de variables y de
modelos (principio conocido como navaja de Occam). La regulacin de la actividad
enzimtica no ha sido excepcin a esta regla y desde siempre se ha tratado de encontrar
una explicacin unitaria a los fenmenos de regulacin. Ya desde ahora debemos saber
que estos intentos han sido, hasta el momento, vanos. El panorama que emerge de los
estudios actuales sobre regulacin enzimtica es que hay una gran cantidad de sistemas
posibles; no tanto como para llegar a decir que cada enzima tiene su propio y peculiar
sistema de regulacin, pero s que podemos constatar una gran variedad entre los mis-
mos. Las grandes ideas que se han vertido con considerable esfuerzo e ingenio sobre el
campo de la regulacin enzimtica, como alosterismo, modificacin covalente, coopera-
tividad, teora del operon, histresis enzimtica, etc. han resultado ser aspectos parciales
del control enzimtico. Y en la descripcin de los mismos tenemos necesariamente que
bajar a los ejemplos concretos. El o los modelos postulados para un determinado sistema
de control pierden muchas veces su validez cuando se intentan trasladar a otro. Hay, no
obstante, algunos principios generales; pero se trata de principios ms cibernticos que
mecansticos, y que son vlidos no solo en el mundo del control enzimtico, sino en
la teora de control considerada en abstracto, como hace la Ingeniera. El ms general
de estos principios es, sin lugar a dudas, el control por realimentacin negativa (negative
feedback control).
8.2. Control por retroalimentacin negativa
El mundo tecnolgico en el que vivimos es tal gracias al control por retroalimen-

tacin negativa (Ingl., negative feedback). Con este nombre conocemos sistemas que en
abstracto pueden ser descritos mediante el esquema de la figura 8.1.
223
Figura 8.1
Por ejemplo, la mquina de vapor fue posible cuando James Watt invent un
dispositivo que regulaba la presin del vapor en funcin de la velocidad de la mquina,
y al que dio el nombre de gobernador (governor). El trmino gobernador o gobier-
no procede de la misma raz griega (, kybernetes, el piloto de una nave) que
Ciberntica, ciencia que estudia el comportamiento de los sistemas de control en abs-
tracto.
En la figura 8.1, vemos que el efector o planta transforma una entrada en una sali-
da. Esta salida, a travs del lazo de retroalimentacin, se compara a una seal de referencia
en el comparador. Para ello se requiere que exista un transductor que convierta la seal de
salida a una magnitud directamente comparable a la seal de referencia. Como resultado
de la comparacin se enva una seal de control a un regulador que aumenta o disminu-
ye la entrada en respuesta a la seal de control. El trayecto entre la salida y el regulador
se conoce como lazo de retroalimentacin (Ingl., feedback loop).
Veamos este mismo esquema con un ejemplo concreto: un bao termostatizado

de laboratorio (figura 8.2).
224
Figura 8.2
La entrada es el suministro elctrico. El efector, una resistencia elctrica que ca-

lienta el agua. La salida, la temperatura del agua del bao. La seal de referencia es
la propia temperatura. El transductor convierte la temperatura en una seal elctrica
(puede ser, por ejemplo, un par termoelctrico). El comparador, la seal de control y el
regulador, un circuito electrnico que dependiendo de la seal de referencia (el nivel de
temperatura previamente programado) corta (mediante un interruptor) o en otros casos
modifica (mediante un reostato) la corriente elctrica que llega a la resistencia.
Como veremos, este mismo esquema, con las oportunas modificaciones, puede ser
aplicado al control de la actividad enzimtica en muchas ocasiones.
8.2.1. Retroalimentacin negativa en sistemas enzimticos
Durante la dcada de los 50 del siglo pasado se descubrieron diversos sistemas

enzimticos controlados por retroalimentacin negativa. Umbarger, por una parte, y
Yates y Pardee, por otra, demostraron la existencia de este tipo de control en cadenas
metablicas.
Un caso bien documentado desde el principio fue la biosntesis del aminocido

isoleucina en bacterias. La isoleucina se produce a travs de la va metablica que aparece
esquematizada en la figura 8.3.
225
Figura 8.3
Puede observarse que la sntesis de este aminocido tiene lugar a partir de otro,
la treonina. La primera enzima de esta transformacin es la treonina deshidratasa (tam-
bin llamada treonina desaminasa, EC 4.2.1.16) que cataliza la reaccin de formacin de
-cetobutirato a partir de treonina.
Se observ que esta enzima es fuertemente inhibida por el producto final de la va

metablica en cuestin, la isoleucina, sin que ningn otro aminocido se comportara
como inhibidor y siendo el fenmeno perfectamente reproducible in vitro. El objetivo
de esta va metablica no es otro que mantener una determinada concentracin de iso-
leucina para que pueda tener lugar la sntesis proteica. Por lo tanto, un aumento en la
concentracin de isoleucina conduce a la inhibicin de la primera enzima de su cadena
biosinttica; la disminucin de la misma retira lgicamente esta inhibicin y favorece la
sntesis del aminocido. El control de la sntesis de isoleucina podra describirse como en
la figura 8.4 en los mismos trminos que hemos sealado en las figuras anteriores.
226
Figura 8.4
Otra de las primeras observaciones de regulacin por retroalimentacin negativa

en vas metablicas fue la sntesis de pirimidinas. Esta va est sometida a un control si-
milar a travs del producto final, el nucletido CTP (5-Citidintrifosfato). En este caso,
la primera reaccin propia de la biosntesis de pirimidinas es la unin de carbamilfosfato
al aminocido aspartato para dar lugar a carbamilaspartato, proceso catalizado por la
aspartato transcarbamilasa (EC 2.1.3.2).
Esta reaccin se ve fuertemente inhibida por CTP, nucletido que bien puede
considerarse uno de los productos finales de esta concreta va metablica. Nuevamente
el nivel de producto final es el determinante ltimo de su biosntesis (es decir, CTP se
comporta como la isoleucina en el caso anterior, inhibiendo su propia biosntesis). Pero
en este caso concreto, hay otro hecho de importancia: el ATP, nucletido purnico, se
comporta como un activador de esta misma reaccin (figura 8.5). El significado fisiolgi-
co de este hecho es claro: la sntesis de pirimidinas debe necesariamente estar concertada
con la de purinas; en el caso concreto del DNA, conforme a las reglas de Chargaff, la
cantidad de purinas debe ser exactamente igual que la de pirimidinas.
227
Estos descubrimientos fueron los primeros de toda una serie que condujo al esta-
blecimiento de ciertas generalizaciones sobre el control enzimtico por realimentacin, y
que veremos seguidamente.
Figura 8.5
8.2.2. Caractersticas generales del control enzimtico por retroalimentacin negativa
1. En general, la prctica totalidad de las rutas metablicas estn controladas por

retroalimentacin negativa mediada por el producto final de las mismas. La tabla II
muestra algunos ejemplos.
228
Tabla II
Rutas metablicas controladas por realimentacin negativa
Proceso Primera enzima Inhibidor

Glicolisis Fosfofructokinasa ATP
Neoglucognesis Fructosa bisfosfato fosfatasa AMP
Biosnt. cidos grasos Acetil-CoA carboxilasa Acil-CoA
Biosnt. colesterol HMG-CoA reductasa Colesterol
Biosnt. de isoleucina Treonina deshidratasa Isoleucina
Biosnt. de metionina Homoserina deshidrogenasa Metionina
Biosnt. de purinas PRPP sintetasa AMP, GMP, IMP
AMP Adenilosuccinato sintetasa AMP
GMP IMP deshidrogenasa GMP
Biosnt. de pirimidinas Aspartato transcarbamilasa CTP
2. El control consiste en una inhibicin de la primera enzima o enzima limitante

de la va metablica, siendo el producto final el inhibidor. Por lo general, las enzimas so-
metidas a regulacin son aquellas que catalizan pasos limitantes, por lo que el flujo total
a travs de la va depende de la velocidad con que funciona dicha enzima.
3. Los tipos de inhibicin observados, desde el punto de vista cintico pueden ser
competitivos, no competitivos y mixtos, aunque los primeros suelen aparecer con ms
frecuencia. Por las razones que veremos ms adelante, y siguiendo a Monod, Wyman y
Changeux, se prefiere denominar efectos K y efectos V a las inhibiciones de tipo competi-
tivo o no competitivo, respectivamente, en este contexto.
4. En muchos casos, las enzimas sometidas a regulacin por retroalimentacin

negativa exhiben cinticas no-michaelianas; en muchos casos se trata de cinticas de
tipo sigmoide, que sugieren la presencia de cooperatividad positiva. En la figura 8.6 puede
apreciarse la dependencia sigmoide (crculos azules) de la velocidad de reaccin respecto
a la concentracin de substrato que aparece en algunas enzimas regulatorias.
229
Figura 8.6
Comprese con la dependencia hiperblica de una enzima michaeliana (cuadra-

dos blancos). Ambas curvas son comparables, asimismo, con la saturacin de oxgeno en
la hemoglobina y en la mioglobina.
5. Al lado de la inhibicin por el producto final aparecen asimismo fenmenos

de activacin mediados por otros metabolitos. Por ejemplo, el ATP activa a la aspartato
transcarbamilasa (biosntesis de pirimidinas), o el AMP que activa a la fosfofructokinasa
(glicolisis).
La dificultad estriba, a veces, en discernir qu es lo que se entiende por producto

final de una va metablica. Por ejemplo, tal y como estudiamos sistemticamente la gli-
colisis en un curso de Bioqumica General, consideramos a la glucosa como producto de
partida y al lactato como producto final. Pero no es el lactato el inhibidor fisiolgico de la
glucolisis, sino el ATP. Aqu la interpretacin es obvia; la glucolisis es una va metablica
productora de energa, en la que el lactato es un producto de desecho; y por lo tanto, es
230
la energa libre utilizable, en forma de ATP, lo que es el verdadero producto final de la

glicolisis. En otros casos, sin embargo, el reparto de papeles regulatorios no es tan claro.
Algo parecido ocurre con el concepto de primera enzima de una va metablica.

En el caso de la biosntesis de isoleucina, la treonina desaminasa abre una ruta que por
lo que sabemos est nicamente comprometida en la sntesis de isoleucina. Sin embargo,
en otros casos no est tan claro este concepto. En el ya mencionado de la glucolisis, la
primera enzima tal y como la estudiamos, sera la hexokinasa; sin embargo, la enzima
regulada por el producto final es la fosfofructokinasa. Lo que ocurre es que esta ltima
enzima cataliza el primer paso que de verdad compromete al substrato a su degradacin;
los intermediarios anteriores pueden ser origen de otros destinos metablicos como, por
ejemplo, las interconversiones de hexosas. Por ello hay quien prefiere hablar de punto
de ramificacin metablica en lugar de primera enzima.
En resumen, muchas vas metablicas estn reguladas por su producto final, que se
comporta como inhibidor de una enzima de la misma que por lo general tiene un papel
limitante en el flujo a su travs, y que muchas veces puede fcilmente etiquetarse como
primera enzima o como primer paso comprometido o como enzima limitante. A
continuacin trataremos de estudiar los mecanismos moleculares que determinan estos
fenmenos. El mecanismo mejor estudiado y ms generalizado en este contexto es el
alosterismo.
8.3. Alosterismo
8.3.1. Definicin
En 1959, Jacob, Monod y Changeux elaboraron una teora sobre la regulacin

enzimtica que pretenda explicar con un modelo unitario el tipo de regulacin enzim-
tica visto en el apartado anterior. En muchos de los casos estudiados el comportamiento
del inhibidor se traduca en un aumento aparente de la Km. Sin embargo, estos autores
constataron que no poda hablarse de inhibicin competitiva dado que el inhibidor, en
muchos casos, no era anlogo estructural del substrato. Tal es el caso, por ejemplo, de la
inhibicin ejercida por la isoleucina sobre la treonina desaminasa. Estos dos compuestos
(treonina e isoleucina) tienen en comn el grupo -aminocido, pero este grupo no era
obviamente el responsable de la inhibicin puesto que ningn otro -aminocido pro-
duca este efecto; y por lo dems, las cadenas laterales son estructuralmente muy distin-
tas. An ms acentuada era esta disimilitud en el caso de la aspartato transcarbamilasa;
231
el inhibidor, CTP, se comportaba como competidor del substrato normal aspartato. Este
hecho llev a la idea de que los efectores negativos (inhibidores), as como los efectores
positivos (activadores), se fijaban a un lugar de la molcula enzimtica distinta del centro
activo, en contraste con los inhibidores competitivos clsicos. Por ello, preferan hablar
de un efecto K en lugar de una competicin.
Surgi as el concepto de efectores alostricos, palabra esta ltima derivada de races

griegas que dan a entender un significado de distinto relieve, distinta geometra en
contraposicin a los inhibidores convencionales, que al actuar sobre el propio centro
activo, seran efectores isostricos. Los efectores alostricos se fijan, segn esta teora, a un
centro alostrico distinto del centro activo. Las enzimas sometidas a este tipo de control
seran enzimas alostricas, y el conjunto de todos estos fenmenos, alosterismo. En resu-
men, la teora del alosterismo podra ser expresada as:
1. Las enzimas sometidas a regulacin por producto final poseen dos tipos de sitios
para la fijacin de substratos y efectores: el centro activo, lugar de la fijacin normal de
substratos y efectores isostricos, y un centro alostrico responsable de la fijacin de efec-
tores reguladores, como la isoleucina en el caso de la treonina deshidratasa y el CTP en
el de la aspartato transcarbamilasa.
2. La fijacin del efector alostrico a su correspondiente centro induce un cambio

conformacional en la protena enzimtica, de tal modo que altera la fijacin del substrato
al centro activo, bien sea dificultndola (en el caso de inhibidores) o facilitndola (en el
de los activadores). Este efecto se presenta esquemticamente en la figura 8.7 (inhibi-
cin) y en la figura 8.8 (activacin).
232
Figura 8.7
Figura 8.8
233
3. Aun cuando la teora fue postulada sobre el comportamiento competitivo

de algunos inhibidores alostricos (es decir, de la presencia de efectos K), los autores no
excluan la posibilidad de efectos V, esto es, que la fijacin al centro alostrico y el cambio
conformacional subsiguiente de la protena enzimtica diera lugar a un cambio en la
eficiencia cataltica de la enzima, que se traducira en un efecto no competitivo (dismi-
nucin de la Vmax aparente) o mixto (alteracin simultnea de Km y Vmax).
8.3.2. Pruebas experimentales
A favor de la teora del alosterismo estaban los siguientes datos experimentales:
1. Las enzimas alostricas pueden, mediante manipulaciones experimentales, in-

sensibilizarse a la accin de los efectores sin perder su actividad cataltica. Esto indica
que substrato y efectores alostricos se fijan a sitios distintos de la enzima.
2. Pueden obtenerse formas mutantes de la enzima en las que se conserva intacta

la actividad cataltica de la misma y sin embargo se atena o desaparece la sensibilidad a
efectores.
3. Las enzimas alostricas son por lo general difciles de purificar; en el curso de las
maniobras de purificacin es bastante frecuente que se pierda la sensibilidad a efectores
mientras que la actividad cataltica permanece intacta.
4. Por estudios directos de fijacin se ha comprobado en muchos casos que subs-

trato y efectores se fijan a zonas diferentes de la protena enzimtica. En el caso de la
aspartato transcarbamilasa, la fijacin de los efectores tiene lugar incluso sobre una subu-
nidad de la enzima distinta de la que porta el centro activo cataltico.
5. En ocasiones, el efector protege a la actividad cataltica frente a la accin de

agentes desnaturalizantes, indicando este hecho la accin del efector sobre la estructura
de la protena enzimtica.
El modelo alostrico as propuesto ha resultado ser una idea muy fecunda en el

campo de la regulacin de la actividad enzimtica y sus extensiones naturales a la regu-
lacin de las interacciones protena-ligando en general. No han tenido la misma suerte
234
los distintos modelos que se han propuesto para explicar el comportamiento alostrico.
Ahora bien, la idea de efectores fijndose a un lugar distinto del centro activo e inducien-
do con ello cambios conformacionales en la protena enzimtica que resultan en varia-
ciones de su actividad sigue siendo un modelo plenamente aceptado por la Enzimologa
actual.
8.3.3. Alosterismo y cooperatividad
8.3.3.1. Concepto de cooperatividad
Muchas enzimas sometidas a control alostrico presentan cinticas no michaelianas

cuando representamos la curva de velocidad en funcin de la concentracin de substrato.
En particular, algunos sistemas alostricos presentan una cintica sigmoide (figura 8.6),
que traduce la existencia de un fenmeno de cooperatividad en la fijacin de substrato.
No es esta la nica ocasin en que aparecen cinticas sigmoides en la Bioqumica. Recor-
demos, a este respecto, la desnaturalizacin de protenas y del DNA; y en un contexto
que como veremos est muy prximo al que estamos discutiendo, la fijacin de oxgeno
a la hemoglobina. En todos estos casos se trata de fenmenos cooperativos. La coope-
ratividad en la desnaturalizacin de macromolculas consiste en que la rotura de una
interaccin dbil que mantiene la estructura de la misma favorece o facilita la rotura de la
siguiente, y as de forma sucesiva hasta que llegamos a la rotura de todas las interacciones
dbiles que conforman la estructura de orden superior.
Cuando hablamos de cooperatividad en la cintica enzimtica, nos referimos a

que la fijacin de una molcula de substrato al centro activo favorece la fijacin de otra
molcula del mismo a otro centro activo, lo que facilita an ms la fijacin siguiente,
y as hasta que la molcula enzimtica llega a estar plenamente saturada. En el caso de
la hemoglobina, la fijacin de oxgeno a uno de los cuatro grupos hemo de la molcula
favorece la fijacin al siguiente, y as hasta que la molcula presenta sus cuatro sitios
ocupados. En otras palabras, la Km vara en funcin de las molculas de substrato fijadas
por la enzima.
La cooperatividad as descrita corresponde a lo que recibe el nombre de coope-

ratividad positiva, es decir, aquella en la que una fijacin favorece a la siguiente. Puede
darse el caso (y de hecho se da en algunos sistemas) de cooperatividad negativa, en la que
la fijacin de una molcula de ligando dificulta la fijacin del siguiente. En la presente
discusin trataremos nicamente de la cooperatividad positiva.
235
8.3.3.2. Implicaciones estructurales de la existencia de cooperatividad
Tal como lo hemos descrito, el fenmeno de cooperatividad implica, desde el pun-

to de vista molecular, lo siguiente:
1. Que en la misma molcula hay ms de un sitio de fijacin de substrato.
2. Que la afinidad de la enzima por el substrato no puede ser descrita por una
simple constante como la Km en las condiciones de Michaelis-Menten, sino que en todo
caso habra que describir tantas constantes como sitios de fijacin haya en la molcula;
en el caso de la hemoglobina, cuatro.
3. Que necesariamente tiene que haber un mecanismo de interaccin entre sitios

de manera que la fijacin a uno de ellos repercuta en la fijacin a otro; excluidas las ac-
ciones a distancia, hemos de pensar en enzimas con mltiples sitios para el substrato;
y por lo tanto, en enzimas con estructura cuaternaria, es decir, compuestas por varias
subunidades.
8.3.3.3. Efectores positivos y negativos y cooperatividad
En los sistemas alostricos en los que la fijacin del substrato es cooperativa se ha

podido constatar que la accin de los efectores (positivos o negativos) consiste en alterar
el grado de cooperatividad en la fijacin de substrato. As, tenemos:
- Los efectores negativos, o inhibidores, aumentan el grado de cooperatividad en la

fijacin.
- Los efectores positivos, o activadores, disminuyen dicho grado de cooperatividad,

de tal manera que en algunos casos la presencia de un activador a concentraciones satu-
rantes del mismo normaliza el comportamiento de la enzima hacindola plenamente
michaeliana (figura 8.9).
236
Figura 8.9
En esta figura se ilustran los efectos de inhibidores y activadores alostricos sobre

la dependencia de la velocidad respecto a la concentracin de substrato. La ausencia de
efectores (0) muestra la cooperatividad positiva en la fijacin de substrato. La presencia
de inhibidor (-) acenta el carcter sigmoide de la curva. La accin del activador (+)
hace desaparecer este carcter sigmoide, haciendo que la enzima se comporte como mi-
chaeliana. Para una misma concentracin de substrato S, la enzima presenta velocidades
distintas v+, v0 y v- segn est en presencia de activador, en ausencia de efectores, o en
presencia de inhibidor, respectivamente.
De esta manera, a sugerencia de Monod, Wyman y Changeux, se distinguen en

las enzimas alostricas con comportamiento cooperativo dos tipos de efectos:
- Efectos homotrpicos, que aluden a la influencia que un ligando (substrato o efec-

tor) tiene sobre la fijacin de s mismo, y que en el caso del substrato se traduce en cin-
ticas sigmoides (caso de cooperatividad positiva).
237
- Efectos heterotrpicos, que son los ejercidos por los distintos ligandos sobre la fi-
jacin de otros ligandos, y que se traduce en incrementos (inhibidores) o disminuciones
(activadores) de la cooperatividad del sistema.
Esta distincin es til cuando se constata en muchos casos que la fijacin es coo-
perativa no solo en el caso del substrato, sino tambin de los efectores.
8.3.3.4. Modelo alostrico restringido
Teniendo en cuenta los efectos cooperativos en la fijacin de ligandos a las enzimas

alostricas, el modelo alostrico restringido (a diferencia del generalizado que se present
ms arriba) queda establecido as:
1. Las enzimas sometidas a regulacin alostrica tienen no solo un centro activo,

sino que disponen de otros tantos sitios para la fijacin de efectores (centros alostricos).
2. La fijacin de un efector a su centro alostrico altera la conformacin tridimen-

sional de la enzima y, por tanto, de su centro activo, facilitando (en el caso de los acti-
vadores) o dificultando (en el caso de los inhibidores) la fijacin del substrato al mismo.
3. La fijacin de ligandos (substrato o efectores) a sus sitios respectivos es coopera-

tiva. La fijacin cooperativa del substrato se traduce en cinticas sigmoides.
4. La cooperatividad en la fijacin requiere necesariamente la interaccin entre

sitios y, por ello, las enzimas alostricas deben tener ms de un centro activo (en el caso
de substrato) y ms de un centro alostrico (para cada uno de los efectores). Lo ms
probable es pensar que todas las enzimas alostricas poseen subunidades, es decir, tienen
estructura cuaternaria. A su vez, esto explica:
- El fenmeno de desensibilizacin que veamos antes; es obvio que la prdida de

la estructura cuaternaria destruira las interacciones entre sitios, y por tanto, la coopera-
tividad en la fijacin de ligandos.
- La dificultad de purificacin de las enzimas alostricas; al tener estructura cua-

ternaria, esta puede fcilmente destruirse con las manipulaciones experimentales de la
purificacin; as el enzima quedara desensibilizado a los efectores.
238
5. La accin de los efectores consiste en modificaciones de la cooperatividad en la

fijacin del substrato. Los inhibidores alostricos aumentan este grado de cooperativi-
dad; los activadores alostricos lo disminuyen; en algunos casos la presencia de activador
a concentracin alta puede llegar a hacer michaeliana la cintica de fijacin del substrato.
Aunque el modelo as propuesto es bastante restrictivo (excluye la posibilidad de

efectos V y no habla para nada de la cooperatividad negativa); y que por otra parte hoy
sabemos que no todas las enzimas regulatorias se comportan de esta manera, explica
bastante satisfactoriamente el comportamiento de muchas enzimas o sistemas de fijacin
de ligandos.
8.3.4. Interpretacin cuantitativa del alosterismo
Es obvio que toda teora que trate de dar una interpretacin mecanstica de los
fenmenos alostricos, en el sentido restringido discutido hasta aqu, debe explicar, por
una parte, los fenmenos comunes a todas las enzimas (cinticas saturantes y efectos
isostricos) al tiempo que por otra parte ha de dar cuenta asimismo de la fenomenologa
especfica de aquellos (cooperatividad, cintica sigmoide, efectos homotrpicos y hete-
rotrpicos, etc.). Se han propuesto muchos modelos para la explicacin del alosterismo;
pero el nico que ha ofrecido hasta ahora concordancia con los datos experimentales es
el que se expone resumidamente a continuacin.
8.3.4.1. El modelo de Monod, Wyman y Changeux
El modelo propuesto por estos autores pretende explicar globalmente el compor-

tamiento de los sistemas alostricos segn las siguientes suposiciones:
1. Las protenas con comportamiento alostrico son oligmeros formados por va-
rios protmeros, y existiendo en la estructura cuaternaria resultante al menos un elemento
de simetra. La palabra protmero alude no estrictamente a subunidad, sino al menor
elemento de la estructura que puede fijar substrato y efectores (ntese que un protmero
puede constar de varias subunidades, aunque no necesariamente).
2. El sistema puede estar en dos estados diferentes, llamados R (de relajado) y T

(de tenso). Entre las protena en forma R y la protena en forma T se establece un equili-
brio cuya constante es L, definida de esta forma (ec.[1]):
239
[1]
Siendo R0 y T0 las concentraciones de enzima en formas R y T, respectivamente,

en ausencia de ligandos.
3. Los elementos de simetra que hay en la molcula se conservan en las transicio-

nes entre R y T. La transicin es concertada, es decir, todo o nada, no existiendo estados
intermedios.
4. El substrato y los efectores positivos o activadores tienen afinidad preferente por

el estado R, mientras que los efectores negativos o inhibidores tienen afinidad preferente
por T. Puede darse el caso de afinidades no solo preferentes, sino exclusivas.
5. La accin de substratos y efectores tiene lugar a travs de los desplazamientos

del equilibrio a que dan lugar por su afinidad preferente o exclusiva por los diferentes
estados de la protena. De esta manera, la presencia de substrato o activador hace que el
equilibrio se desplace hacia el estado R, mientras que el inhibidor lo desplaza hacia T,
segn se indica en la figura 8.10. En ella la protena en forma R se representa mediante
crculos; la forma T, como cuadrados. El substrato (s) tiene solamente afinidad por la
forma R; el inhibidor (i) por la forma T.
Figura 8.10
240
A partir de estas premisas, llegan a una expresin para la funcin de saturacin

(cociente [sitios ocupados]/[sitios totales])que es la siguiente (ec. [2]):
[2]
En la que L es la constante de equilibrio entre los estados R y T que vimos arriba;

es la concentracin normalizada de substrato [s/KR] (esto es, expresada en unidades de
su constante de disociacin KR) y n, el nmero de protmeros del sistema. Esta ecuacin
es una forma simplificada en la que suponemos que el substrato solo tiene afinidad por
el estado R.
Para los efectos heterotrpicos, la constante alostrica L quedara alterada, en caso

de fijacin exclusiva, dando lugar a una constante L cuyo valor sera (ec. [3]):
[3]
En la que representa la concentracin normalizada de inhibidor, [i/KI] y la

concentracin normalizada de activador [a/KA].
De las caractersticas del modelo se deduce que el comportamiento del sistema

ser tanto ms cooperativo cuanto mayor sea el valor de la constante alostrica L, lo que
indicara que ,en ausencia de substrato y efectores, prcticamente todo el sistema est en
forma T. Al calcular los valores de estas constantes para la aspartato transcarbamilasa y
la hemoglobina se ha encontrado un acuerdo prcticamente perfecto con los datos expe-
rimentales. A continuacin veremos con cierto detalle la aplicacin del modelo a estos
sistemas.
241
8.3.5. La aspartato transcarbamilasa
La aspartato transcarbamilasa (ATCasa) cataliza el primer paso comprometido de

la biosntesis de pirimidinas (figura 8.5) y el sistema mejor estudiado hasta el momento
es el de la enzima de Escherichia coli, gracias a los estudios de Lipscomb y colaboradores.
Como ya vimos ms arriba, est sometida a una regulacin por retroalimentacin nega-
tiva mediada por los productos finales de la va metablica (UTP y CTP) y otra positiva
por ATP, trmino de la biosntesis de purinas.
8.3.5.1. Comportamiento alostrico de la aspartato transcarbamilasa
En trminos del modelo alostrico restringido antes citado, tenemos para esta
enzima los siguientes datos:
1. La enzima muestra una curva sigmoide de saturacin para ambos substratos,

carbamilfosfato y aspartato, por lo que, en los trminos definidos ms arriba, se trata de
un sistema con cooperatividad homotrpica positiva.
2. Por estudios de fijacin y por estudios estructurales de la enzima, se sabe que

los substratos y los efectores se fijan a sitios distintos. Tiene, pues, centro activo y centros
alostricos.
3. La enzima es asimismo afectada heterotrpicamente por CTP y UTP (produc-

tos finales de la biosntesis de pirimidinas), por una parte, y ATP, producto final de la
biosntesis de purinas. Los nucletidos pirimidnicos producen una disminucin de la
velocidad, mientras que el ATP lleva a un aumento de la misma.
8.3.5.2. Adecuacin de la aspartato transcarbamilasa al modelo MWC
Gracias a los estudios citados de Lipscomb y colaboradores conocemos la estruc-

tura de esta enzima a alta resolucin mediante cristalografa de rayos X.
1. La holoenzima de la ATCasa tiene un peso molecular de 310 kDa y est com-

puesta por doce subunidades, 6 catalticas iguales entre s (c) y 6 regulatorias tambin
iguales entre s (r). Las catalticas se disponen formando dos trmeros (2c3) y las regu-
242
latorias forman tres dmeros (3r2), de manera que la estructura cuaternaria puede ser
representada como (3r2 + 2c3). La estructura tridimensional de la enzima se presenta en
la figura 8.11 (enzima completa); la estructura global presenta un eje ternario de simetra
y tres ejes binarios perpendiculares al ternario.
Figura 8.11
Las figuras 8.12 y 8.13 presentan el trmero cataltico y el dmero regulatorio, res-
pectivamente. En este ltimo se aprecia el lugar de fijacin del CTP.
2. Comparando la cintica de las subunidades aisladas con la de la holoenzima, se

comprueba que (a) la actividad especfica del trmero cataltico aislado es aproximada-
mente un 50 % superior que la de la holoenzima; (b) la curva de saturacin del substrato
en el caso del trmero cataltico aislado es hiperblica (michaeliana) en lugar de sigmoide.
243
Figura 8.12
Figura 8.13
244
3. La ATCasa puede existir en dos conformaciones diferentes. En ausencia de

substrato o en presencia de CTP, la enzima tiene la estructura general que se presenta
en la figura 8.11. La unin del anlogo de substrato PALA (fosfonoacetil-L-aspartato)
induce un cambio conformacional en la molcula que se ilustra en la figura 8.14.
- De las dos formas, una de ellas (forma R) corresponde a la presencia de un li-

gando en el centro cataltico (no se ve en la imagen) y un activador (ATP) en el
centro alostrico; y la otra a la ausencia de substrato y a la presencia de CTP en el
correspondiente centro alostrico de la subunidad regulatoria (forma T).
- Todos los elementos de simetra que existen en la molcula (un eje ternario y tres
ejes binarios) se conservan en la transicin, y no han podido ser detectados estados
intermedios.
Figura 8.14
245
4. La fijacin de substrato o anlogo determina cambios en la disposicin de las

subunidades regulatorias de tal manera que CTP no puede fijarse a la estructura. De ah
se deduce que el efector alostrico negativo solo tiene afinidad por el estado T.
5. A su vez, la fijacin de CTP en ausencia de otros ligandos determina cambios

en la disposicin de la subunidades catalticas de manera que impiden la fijacin de
substrato.
Por todo ello se considera que este sistema sigue casi al pie de la letra el modelo de
Monod, Wyman y Changeux.
8.3.6. La hemoglobina
La hemoglobina es un transportador de oxgeno que aparece en el interior de clu-

las especializadas, los hemates o glbulos rojos. Es una de las protenas mejor estudiadas
y presenta un comportamiento alostrico clsico respecto a la fijacin de su substrato,
el oxgeno molecular. La afinidad de la hemoglobina hacia el oxgeno se ve afectada por
determinados ligandos, particularmente el protn H+, el CO2 y el 2,3 bisfosfoglicerato
(2,3-BPG). Todos ellos producen una disminucin en la afinidad de la hemogobina por
el oxgeno. Gracias a los estudios pioneros de Max Perutz conocemos con gran detalle la
anatoma molecular de esta protena y sus relaciones estructura-funcin.
8.3.6.1. Comportamiento alostrico de la hemoglobina
La hemoglobina es un sistema alostrico clsico, que puede interpretarse segn el

modelo restringido expresado ms arriba de la siguiente forma:
1. Tanto las subunidades aisladas como la mioglobina se diferencian de la mol-

cula completa 22 en que la curva de saturacin de oxgeno no es sigmoide, sino hiper-
blica (figura 8.15).
246
Figura 8.15
2. La fijacin de oxgeno sigue una curva sigmoide caracterstica de un efecto

homotrpico positivo (cooperatividad positiva), y esta curva se afecta por los efectores
negativos en la forma indicada en la figura 8.16. En ella representamos el efecto del pH
sobre la curva de disociacin de la hemoglobina.(A), pH 7.8; (B), pH 7.2; (C), pH 6.8;
el protn es un efector negativo en el sistema de la hemoglobina. Un efecto similar pue-
de ser apreciado con concentraciones crecientes de 2,3 bisfosfoglicerato o de CO2 (no
representados). La accin de dichos efectores consiste en un incremento en el carcter
sigmoide de la curva. se trata, pues, de inhibidores alostricos que incrementan la coope-
ratividad en la fijacin del substrato (O2).
3. El centro activo de la hemoglobina sera el lugar de fijacin del oxgeno mo-

lecular, que es la sexta posicin de coordinacin del ion ferroso que ocupa el centro del
grupo hemo. Los efectores H+, CO2 y 2,3-BPG se fijan a sitios distintos de la molcula.
4. Los efectores H+, CO2 y 2,3-BPG afectan heterotrpicamente a la fijacin del

O2. Todos ellos se comportan como inhibidores alostricos, disminuyendo la afinidad de
247
la hemoglobina por el oxgeno, provocando un incremento en la P50. Recurdese que la

P50 representa la presin parcial de oxgeno con la que se alcanza un 50 % de saturacin
de la hemoglobina, siendo por tanto un parmetro comparable a la Km de los sistemas
enzimticos michaelianos.
Figura 8.16
8.3.6.2. Adecuacin de la hemoglobina al modelo MWC
Los estudios de Perutz sobre la estructura de la hemoglobina a alta resolucin, han

mostrado que:
248
1. La hemoglobina posee estructura cuaternaria. La hemoglobina A1, la ms abun-

dante en el organismo humano adulto, consta de cuatro subunidades, iguales dos a dos,
llamadas y ; la estructura cuaternaria de la misma se puede representar, pues, como
22. Estas subunidades poseen una gran similitud estructural y a los efectos que nos
interesan, se pueden considerar idnticas.
2. La hemoglobina presenta dos formas distintas, segn la naturaleza del ligando

coordinado a la sexta posicin del ion ferroso. La forma llamada oxi (estado R) aparece
cuando en esta posicin existe un ligando de campo fuerte, como el oxgeno molecular,
el ligando fisiolgico, o el monxido de carbono. La forma llamada desoxi (estado T)
se presenta ante la ausencia de ligandos en esta sexta posicin de coordinacin del ion
ferroso o ante ligandos de campo dbil (figura 8.17).
3. Las dos subunidades estn en la forma T bastante ms separadas que en la

forma R. Lo contrario, aunque en menor medida, ocurre con las subunidades Esta
separacin entre las subunidades en la forma T permite que se fije el ligando 2,3 BPG
(efector negativo) (figura 8.17).
Figura 8.17
249
4. Faltan en la forma R (oxi-) determinados enlaces inicos presentes en la forma

T (desoxi). Estos enlaces se presentan en las figuras 8.18 (contacto -), 8.19 (contacto
-) y 8.20 (contacto -). El cambio estructural de la hemoglobina, al pasar de forma
desoxi- a oxi-, induce la rotura de todos estos enlaces mostrados.
Figura 8.18
Figura 8.19
250
Figura 8.20
5. El ion ferroso ocupa el centro geomtrico del plano de la porfirina en la forma R

(oxi), y aparece ligeramente desplazado del mismo en la forma T (desoxi). Este fenmeno
tiene que ver con la naturaleza del ligando que ocupa la sexta posicin de coordinacin:
el dimetro del ion es un 20 % mayor en el caso de ligandos de campo dbil o ausencia
de los mismos (forma T, desoxi) que en la forma R (oxi), segn se puede apreciar en el
esquema de la figura 8.21.
Figura 8.21
251
CAPTULO 9
REGULACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA, 2.

MODIFICACIN COVALENTE DE LAS ENZIMAS.
ACTIVACIONES PROTEOLTICAS
9.1. Introduccin
9.1.1. Modificacin covalente: su importancia biolgica
Veamos en el captulo anterior que el fenmeno de la regulacin de la actividad

enzimtica se desarrolla a varios niveles. En el nivel intracelular, una gran cantidad de
reacciones metablicas se regulan a travs de retroalimentacin negativa, mediante me-
canismos alostricos. Esto supone un control de ajuste fino que mantiene las actividades
enzimticas dentro de mrgenes relativamente estrechos. Ahora bien, en ocasiones una
clula, sobre todo en los sistemas pluricelulares, tiene que responder con la puesta en
marcha de una ruta metablica o la supresin de otra en respuesta a estmulos ambien-
tales cuya magnitud puede perfectamente desbordar los niveles de respuesta obtenida
ante estmulos alostricos. Muy frecuentemente esta respuesta es de una enorme com-
plejidad y abarca no una sino muchas rutas metablicas, transcripcin y traduccin de
DNA, interacciones intercelulares, etc. Los procariotas, por lo general, responden en
este caso con variaciones en el nivel de sntesis enzimtica ejercidos normalmente sobre
la transcripcin (induccin o represin enzimtica); los eucariotas, por su parte, han
desarrollado adems todo un intrincado sistema de respuestas ante estmulos externos
que en su mayor parte se manifiestan como modificaciones covalentes de las enzimas, de
lo que resultan sus variaciones en actividad. La investigacin actual est comenzando a
comprender la extrema complejidad de estos sistemas de modificacin covalente. A travs
de la misma, por citar solo algunos ejemplos, se encuentra la respuesta celular a
1. Neurotransmisores. Son sustancias liberadas por los terminales presinpticos de

una neurona en respuesta al paso a su travs de un potencial de accin. Los neurotrans-
misores ejercen su funcin sobre receptores postsinpticos especficos determinando una
respuesta en la clula postsinptica. En ocasiones, los neurotransmisores operan asimis-
mo sobre receptores presinpticos, modulando la actividad de la sinapsis. En uno y otro
caso la accin puede mediar a travs de modificaciones covalentes de enzimas o altera-
ciones en la permeabilidad de canales inicos en la membrana.
2. Hormonas. Podemos tomar el concepto de hormona en un sentido amplio, en

cuyo caso es hormona todo tipo de seal qumica que ejerce su accin a travs de la in-
teraccin con un receptor especfico. En ese caso, tanto el apartado anterior como todos
los siguientes deberan esta refundidos en este. Pero aqu daremos al trmino su sentido
restringido, denominando hormona a la seal qumica generada dentro del conjunto
de rganos que constituyen el sistema endocrino, y que actan a travs de la interaccin
254
con un receptor especfico. En lneas generales podemos decir que la prctica totalidad
de hormonas que operan desde el exterior de la clula ejercen su accin por medio de la
modificacin covalente de enzimas. Aun cuando no se produzcan en rganos endocrinos
concretos, podemos considerar como hormonas a los mediadores locales, del tipo de las
kininas, eicosanoides, etc., producidos in situ ante diversos estmulos y cuya accin se
traduce asimismo con mucha frecuencia en la modificacin covalente de sistemas enzi-
mticos.
3. Factores de crecimiento. El estudio de los requerimientos de clulas eucariticas

cultivadas in vitro nos ha llevado al conocimiento de multitud de factores de naturaleza
proteica o peptdica, llamados factores de crecimiento, que inducen en la clula estmu-
los de reproduccin y diferenciacin (o des-diferenciacin), operando sobre el ciclo ce-
lular y todas las actividades qumicas normalmente asociadas al mismo (como, por ejem-
plo, sntesis de DNA); o bien, en algunos casos, induciendo apoptosis (muerte regulada
y programada de las clulas). El catlogo de factores de crecimiento aumenta de da en
da (p.e., factor de crecimiento neural o NGF; factor de crecimiento epidrmico o EGF;
factor de crecimiento plaquetario o PDGF; factores de crecimiento seudoinsulnicos o
ILGF, etc.etc.) y su accin, en trminos generales, y en la medida que nos es conocida, se
ejerce por modificacin covalente de enzimas u otros efectores (receptores, canales ini-
cos, etc.). En este mismo apartado podemos citar la accin de mitgenos, que estimulan
la entrada de la clula en ciclos de divisin (tal es el caso de determinadas lectinas, por
ejemplo), as como la accin de determinados efectores celulares como las citokinas.
4. Estmulos morfogenticos y de diferenciacin. La accin de los llamados genes ho-

meticos, que consiste en la determinacin ontognica de clulas no diferenciadas hacia
formas plenamente diferenciadas constituyendo una forma adulta, consiste en la puesta
en marcha de otros genes a nivel transcriptivo. Los factores proteicos que median estas
acciones pueden verse modificados covalentemente en respuesta a la accin de estos ge-
nes.
5. Estmulos antignicos. La compleja respuesta del sistema inmunitario ante la

aparicin de un antgeno, con activacin de diversas estirpes celulares, diferenciaciones,
ciclos de reproduccin clonal, produccin de mediadores especficos, etc., est en gran
parte determinada por la modificacin covalente de protenas efectoras, enzimticas o
no.
255
6. Interacciones protena-protena o protena-clula. Hoy da sabemos que una gran

parte de funciones orgnicas se establecen gracias a la interaccin entre protenas, bien
sea entre s o actuando sobre superficies celulares o sobre matrices intercelulares. Todas
estas interacciones pueden verse afectadas por la modificacin covalente de las mismas.
7. Luz y otros agentes fsico-qumicos. La respuesta de los fotorreceptores retinianos

al estmulo lumnico se traduce en modificaciones covalentes de determinados canales
inicos. Asimismo tiene lugar modificacin covalente de protenas en la respuesta a est-
mulos sensoriales olfatorios y gustativos.
Obsrvese que, a medida que progresaba esta sucinta descripcin, hemos ido aban-
donando el trmino enzima para sustituirlo por el de protena efectora. El fenmeno de la
modificacin covalente se extiende, por lo que sabemos, a todo tipo de interaccin entre
ligando y protena, enzimtica o no.
Resulta as una trama enormemente intrincada de acciones de unos sistemas so-

bre otros; pues no solo cabe la posibilidad de modificacin covalente del efector final,
sino que el propio receptor a la seal puede ser modificado por el mismo u otros siste-
mas; y todos los pasos intermedios hasta el efector final pueden ser asimismo asiento de
modificaciones covalentes. El conjunto de todos estos fenmenos constituye en s una
disciplina aparte dentro de la Bioqumica, conocida como Transduccin de seales, en el
mismo orden de importancia con el que estudiamos las Biomolculas, la Enzimologa,
el Metabolismo y la Informacin Gentica; y que a no dudar, en unos pocos aos repre-
sentar, por su carcter integrador, una disciplina diferenciada cuyas ramificaciones se
extendern a la Clnica y a la Biotecnologa. Dentro de los fenmenos de transduccin
de seales hay una serie de conceptos que requieren un estudio previo y que pasaremos
a discutir a continuacin: las diversas formas de modificacin covalente, el concepto de
segundo mensajero y el concepto de activacin en cascada.
9.1.2. Formas de modificacin covalente
En muchos casos, la modificacin covalente consiste en la fosforilacin de residuos

hidroxlicos de la protena: cadenas laterales de serina, treonina, tirosina y al parecer tam-
bin histidina. Esta fosforilacin est catalizada por enzimas especficas, llamadas protein
kinasas, que catalizan la trasferencia del fosfato de ATP o GTP al grupo hidroxilo en
cuestin. Para el caso de la serina, tenemos:
256
La fosforilacin de estos residuos determina en la protena cambios conformacio-

nales que alteran, normalmente de forma drstica, su funcin. Es decir, a diferencia de
las interacciones alostricas, que modulan la respuesta de la enzima de forma gradual
y continua, la fosforilacin resulta en la activacin de una forma previamente inactiva
o viceversa, con una respuesta de tipo todo o nada (on-off). En otros sistemas hay una
cierta gradacin puesto que las dos formas (fosforilada o defosforilada) son activas, pero
una mucho ms que otra.
Como es lgico, tan modificacin covalente es la fosforilacin como la defosfo-

rilacin. Y existen igualmente enzimas que catalizan este proceso, las protein fosfatasas.
Catalizan reacciones hidrolticas del tipo expuesto a continuacin:
y que son el objeto de influencias de tipo regulatorio de la misma manera que las
protein kinasas, por lo que su estudio es tan importante como el de estas.
La extraordinaria variedad de respuestas mediadas por protein kinasas o protein

fosfatasas se refleja en los siguientes hechos: (a) podemos estimar en un 3 % del genoma
las secuencias destinadas a la sntesis de protein kinasas y protein fosfatasas; (b) de los
257
miles de protenas distintas presentes en la clula, aproximadamente un tercio estn so-

metidas a fosforilacin/defosforilacin; y (c) en la actualidad conocemos las secuencias
de unos miles de protein kinasas y protein fosfatasas, y estos nmeros van constantemen-
te en aumento.
El fenmeno de fosforilacin/defosforilacin no es la nica forma de modifica-

cin covalente de la actividad enzimtica. Encontramos, por ejemplo, la adenilacin de
residuos de serina, con ATP como donador de adenilo y produccin de pirofosfato in-
orgnico:
o en otros casos, uridilacin (con UTP como donador) o ADP-ribosilacin (con

NAD+ como donador de ADP-ribosa).
Pero el otro orden de modificaciones covalentes de importancia generalizada es

el de proteolisis especfica. Muchas enzimas son producidas por la clula en estado de
zimgenos, formas inactivas de las mismas que son activadas por una rotura proteoltica
especfica. Un caso bien documentado es la produccin de enzimas digestivas (pepsina,
tripsina, quimotripsina, etc.), que son segregadas por las clulas productoras en forma de
los respectivos zimgenos, activndose por proteolisis una vez llegadas a la luz intestinal.
La regulacin por proteolisis especfica se hace especialmente llamativa en fenmenos
como la coagulacin de la sangre, la fibrinolisis y la activacin del complemento, procesos en
los que se necesita una activacin de varios rdenes de magnitud en tiempos muy cortos,
y que tienen lugar a travs del fenmeno de activacin en cascada (v. ms adelante).
9.1.3. Concepto de segundo mensajero
La gran mayora de seales qumicas producidas en organismos eucariticos ejer-

cen su accin a travs de la interaccin con receptores situados en la cara externa de la
membrana celular. La excepcin a esta regla general est constituida por la accin de
258
hormonas de tipo poliprenoide (esteroides, calciferoles, retinoides, etc.) y las hormonas

tiroideas, que actan a travs de la interaccin con receptores intracelulares, citoslicos
y/o nucleares, dando lugar a alteraciones en la transcripcin del DNA. En el resto de
seales qumicas conocidas, dicha seal no entra en la clula sino que desencadena su
accin a travs de la interaccin con un receptor de membrana.
Esta interaccin determina en el interior de la clula la alteracin en las concen-

traciones de determinadas molculas o iones que son las que realmente desencadenan la
respuesta intracelular a la seal. Estas molculas reciben el nombre de segundos mensajeros
(el primer mensajero sera la propia seal qumica que queda fuera de la clula). El con-
cepto de segundo mensajero se representa esquemticamente en la figura 9.1.
Figura 9.1
El segundo mensajero representa, por tanto, la seal qumica intracelular produ-

cida en respuesta a la seal qumica extracelular. Los segundos mensajeros determinan la
activacin de sistemas de modificacin covalente, en particular de fosforilacin/defosfo-
259
rilacin. Conocemos hoy da una serie de segundos mensajeros producidos en respuesta

a seales qumicas. Los ms importantes son los nucletidos cclicos (cAMP y en menor
medida cGMP), productos de degradacin de fosfolpidos de membrana (diacil glice-
rol, inositol fosfatos y otros), el ion Ca2+ e incluso radicales libres como el xido ntrico
(NO.), sin descartar la posibilidad de muchos otros. A su vez, el concepto de segundo
mensajero debe matizarse en el sentido de que, en determinados casos, la respuesta a una
seal qumica en la clula supone la aparicin de varios segundos mensajeros. El panora-
ma se complica cuando se constata que los sistemas enzimticos de produccin de segun-
dos mensajeros pueden ser asimismo asiento de modificaciones covalentes; por lo tanto,
la respuesta a seales qumicas en la clula eucaritica muestra una intrincadsima red de
influencias de unas seales sobre otras, dndose todo tipo de fenmenos de aditividad,
sinergismo y antagonismo de seales que hacen difcil la sistematizacin de acciones con-
cretas. Asimismo, observamos en estas redes de regulacin todo tipo de fenmenos de
realimentacin negativa y positiva, lo que conduce a sistemas complejos, obviamente no
lineales, en los que cabe todo tipo de comportamiento dinmico (estabilidad, estabilidad
marginal, metaestabilidad, oscilaciones e incluso dinmica catica).
9.1.3.1 Concepto de activacin en cascada
En la modificacin covalente de las enzimas hay un concepto central: el de acti-

vacin en cascada. Como tal conocemos la activacin producida a travs de una serie
de pasos enzimticos sucesivos y encadenados de tal manera que una enzima activa a la
siguiente en la cadena, esta a la siguiente, esta a la siguiente, etc. Dado que la actividad
enzimtica presenta una dependencia lineal respecto a la concentracin de enzima, cada
paso representar, pues, una multiplicacin sobre el anterior, dando lugar a una dinmi-
ca exponencial (y no lineal) en el proceso de activacin.
Supongamos que la enzima E1 activa a la E2, esta a la E3 y as sucesivamente. Una

molcula de E1 activar a muchas E2; cada una de estas a muchas E3; cada E3 a muchas
E4 y as sucesivamente. El proceso de activacin en cascada es tal que una sola molcula
de E1 podr dar lugar a una activacin en rdenes de magnitud; por ejemplo, una mol-
cula de E1, segn esta misma dinmica, podra llegar a una activacin de 107 molculas
de E8 suponiendo un modesto ritmo de activacin de 10 a cada paso. Se consigue as una
enorme amplificacin de la seal primitiva. No es de extraar, por tanto, que los sistemas
de regulacin por modificacin covalente acten, por lo general, a escala de organismo
y no meramente de clula. Asimismo esa es la razn por la cual los sistemas de modifi-
cacin covalente son de gran complejidad, tal como veremos en el caso de la glucgeno
fosforilasa y de la coagulacin de la sangre, que son los ejemplos que estudiaremos ms
detenidamente en este captulo (figura 9.2).
260
Figura 9.2
9.2. Regulacin de la glucgeno fosforilasa
9.2.1. Reaccin catalizada y formas moleculares de la glucgeno fosforilasa
Histricamente, el primer sistema sometido a modificacin covalente que se des-

cubri fue el de la glucgeno fosforilasa (EC 2.4.1.1) de hgado y msculo, descubierto
por Sutherland en el ao 1969. La glucgeno fosforilasa es una enzima esencial en los
animales pluricelulares ya que permite un aporte fijo de glucosa segn las necesidades de
cada momento y en particular en los perodos interalimentarios. Cataliza la fosforolisis
de un extremo no reductor de la molcula de glucgeno liberando glucosa-1-fosfato, y
requiere como cofactor esencial el piridoxal fosfato:
261
La enzima es un punto importantsimo del metabolismo, dado que regula la canti-

dad de glucosa circulante a partir de la reserva heptica de glucgeno, as como la canti-
dad de glucosa a disposicin del msculo esqueltico. Ante situaciones de emergencia, el
organismo requiere un aporte de glucosa constante para hacer frente a cualquier peligro
potencial. Por ello esta enzima ha de ser capaz de activarse en lapsos de tiempo muy
cortos, razn por la cual est sometida a una regulacin en cascada, como tendremos
ocasin de estudiar.
Se trata de una enzima muy grande y muy compleja. Normalmente se presenta

como un homotetrmero (cuatro subunidades iguales), pero la forma funcional es el homo-
dmero: dos subunidades iguales, cada una de 842 aminocidos y un P.M. de alrededor de
96 kDa. Gracias a los trabajos del grupo de L. N. Johnson, de la universidad de Oxford,
conocemos muy detalladamente las relaciones estructura-funcin de esta enzima.
La fosforilasa existe en dos formas diferentes: la fosforilasa a y la fosforilasa b. La

primera es una forma muy activa de la misma y se distingue de la fosforilasa b por tener
fosforilado el residuo Ser 14. La forma b, mucho menos activa, se convierte en forma a
a travs de fosforilacin mediada por ATP y una enzima especfica, la fosforilasa kinasa,
que cataliza la siguiente reaccin:
262
Fosforilasa b (dmero) + 2 ATP Fosforilasa a (dmero) + 2 ADP
Con lo que se consigue un incremento sustancial de actividad. La fosforilasa a, a

su vez, puede ser convertida en fosforilasa b por hidrlisis mediada a travs de otra enzi-
ma, la protein fosfatasa 1 (PP1):
Fosforilasa a (dmero) + 2 H2O Fosforilasa b (dmero) + 2 Pi
De esta forma, la accin de la fosforilasa kinasa equivale a la activacin de la enzi-

ma y la de la protein fosfatasa 1 a la inactivacin.
Ahora bien, la forma b, que es la forma menos activa, est, adems, regulada alos-
tricamente. Presenta, por una parte, cooperatividad positiva en la fijacin de substratos
(glucgeno y fosfato inorgnico). La enzima tambin presenta efectos heterotrpicos.
As, la enzima muscular es activada por AMP (que a concentracin elevada indica que
existe un bajo nivel energtico en la clula, al ser producto de la hidrlisis de ATP) mien-
tras que es inhibida por indicadores de un alto nivel energtico (ATP y glucosa-6-fosfa-
to). El comportamiento de la fosforilasa b se aproxima bastante al modelo de Monod-
Wyman-Changeux que vimos en el captulo 8 (con sus estados R y T, como veremos). La
fosforilasa a, fosforilada en el residuo Ser 14, puede ser considerada como una fosforilasa
b bloqueada en el estado R (mucho ms activo) e insensible a efectores alostricos.
Pero la fosforilasa es el punto de control del metabolismo energtico en todo el

organismo, en particular la enzima heptica, y est sometida a controles que regulan
su actividad a partir de seales generadas sistmicamente. As, las hormonas adrenalina
(producida por la mdula adrenal ante estados de alerta del organismo) o glucagon (pro-
ducido por las clulas A del islote de Langerhans en el pncreas ante un descenso de la
glucemia) estimulan la actividad de la glucgeno fosforilasa a travs de un mecanismo
en cascada que concluye con la fosforilacin de la enzima, y que analizaremos a conti-
nuacin.
9.2.2. Cascada de activacin en la glucgeno fosforilasa
La figura 9.3 ilustra la primera parte de la cascada de activacin covalente de la

glucgeno fosforilasa. Las primeras etapas de dicha activacin son otras tantas fosforila-
ciones de enzimas. Estas etapas son las siguientes:
263
1. El glucgeno es degradado por la accin de la fosforilasa. En estado fosforilado,

es decir, bajo la forma de fosforilasa a, degrada activamente al glucgeno.
2. La fosforilasa a es el producto de la fosforilacin, en el residuo Ser 14, de la

fosforilasa b. Esta reaccin es dependiente de ATP y est catalizada por la forma activa
de la fosforilasa kinasa, como hemos visto antes.
3. La forma activa de la fosforilasa kinasa se produce asimismo por fosforilacin

dependiente de ATP de una forma inactiva de misma. La enzima responsable de esta
fosforilacin es la forma activa de la protein kinasa A.
Figura 9.3
4. La protein kinasa A es activada por un segundo mensajero, el AMP cclico

(cAMP), producto a su vez de la adenilato ciclasa, enzima que produce cAMP a partir de
ATP (figura 9.4).
264
Figura 9.4
La activacin de la protein kinasa, a diferencia de las tres etapas anteriores, no se

produce por fosforilacin de la enzima. En estado inactivo, la protein kinasa A consta de
cuatro subunidades iguales dos a dos: dos catalticas (C) y dos regulatorias (R) de modo
que la estructura cuaternaria puede ser descrita como R2C2. En presencia de cAMP, este
se une a las subunidades en razn de dos molculas de cAMP por cada subunidad R,
dando lugar al complejo [(cAMP)2R]2. Esta unin resulta en la disociacin de las dos
subunidades catalticas (2C) que son activas en la fosforilacin de la fosforilasa kinasa.
5. El cAMP es producido por la forma activada de la adenilato ciclasa, enzima

asociada a la membrana celular y que es activada por protenas G. Las protenas G re-
presentan un sistema muy difundido en la transduccin de seales (ver ms adelante)
y que opera como amplificador y temporizador de la seal. En el caso del sistema de la
fosforilasa, las protenas G son el puente entre el receptor externo y la adenilato ciclasa.
265
En la figura 9.5 se esquematiza el funcionamiento de las protenas G. Se trata de

una protena heterotrimrica compuesta de tres subunidades, , y . La subunidad
es capaz de fijar nucletidos de guanina (GDP o GTP) con muy alta afinidad.
Figura 9.5
En estado de reposo, las tres subunidades estn unidas y la subunidad est ocu-
pada por GDP. Cuando un ligando L se une al receptor R (1), la subunidad intercam-
bia GDP por GTP (2). Al fijarse el GTP a la subunidad esta se disocia de las otras
dos, que quedan formando un dmero (3) mientras que -GTP se une a la adenilato
ciclasa (AC), activndola de manera que convierte ATP en cAMP (4). Esta activacin
dura mientras el nucletido unido a la subunidad sea GTP. Ahora bien, esta subunidad
tiene actividad GTPasa, de manera que el GTP fijado va convirtindose en GDP poco
a poco (5). Cuando esto ocurre, la subunidad -GDP se disocia de la adenilato ciclasa
y vuelve a unirse al dmero (6), con lo que se restablece la situacin de reposo. Si el
ligando L persiste unido al receptor R, se producira un nuevo ciclo de activacin.
Recapitulemos ahora la cascada de activacin de la glucgeno fosforilasa pero en

sentido inverso:
266
1. El ligando L (puede ser, por ejemplo, adrenalina o glucagon) se une al receptor R.
2. La unin ligando-receptor determina el intercambio de GDP por GTP en la

subunidad de la protena G.
3. La subunidad de la protena G, unida a GTP, se disocia de las otras dos ().

la subunidad -GTP, por su parte, se une a la adenilato ciclasa (AC) y la activa, produ-
cindose cAMP a partir de ATP.
4. La adenilato ciclasa funcionar mientras persista el GTP unido a la subunidad

. Esta tiene actividad GTPasa que va hidrolizando poco a poco el GTP para dar GDP.
En ese momento, la subunidad se disocia de la AC y vuelve a unirse al dmero .
5. El cAMP provoca la disociacin de las subunidades regulatorias de las catalticas

en la protein kinasa A. Estas, una vez separadas, promueven la activacin por fosforila-
cin de la fosforilasa kinasa.
6. La fosforilasa kinasa fosforila a la Ser 14 de la fosforilasa, que queda as bloquea-

da en su estado R, plenamente activada e insensible a efectores alostricos.
9.2.3. Mecanismos moleculares en el sistema de la glucgeno fosforilasa
9.2.3.1. Glucgeno fosforilasa
Ya vimos antes que cuando la enzima es aislada de fuentes naturales se presenta

normalmente en la forma de homotetrmero. Ahora bien, se cree que la forma plena-
mente activa en la clula es el homodmero, esto es, dos subunidades iguales relacionadas
a travs de un eje binario de simetra. Cada subunidad tiene 842 aminocidos y un peso
molecular en torno a los 96 kDa. Vimos tambin que la enzima tiene dos formas: la
fosforilasa a, fosforilada en el residuo Ser 14, y fosforilasa b, defosforilada. Esta ltima,
por su parte, es una enzima alostrica, con cooperatividad en la fijacin de substratos
y efectos heterotrpicos mediados por AMP (activador) e as como por ATP y glucosa-
6-fosfato (inhibidores). La fosforilasa b sigue el modelo de Monod-Wyman-Changeux
y se presenta por tanto en dos formas: la forma T, inactiva, que fija efectores negativos, y
la forma R, activa, capaz de fijar activadores.
267
Por los estudios del grupo ya citado de L. N. Johnson, tenemos una visin bastan-
te clara de la estructura y funcin de esta enzima. Los resumimos a continuacin.
1. La figura 9.6 muestra la comparacin entre la fosforilasa b al estado T y la fosfo-

rilasa a. El cambio conformacional se aprecia en la posicin de los residuos Ser 14 y Arg
43, muy separados en la fosforilasa b (estado T). La fosforilacin de la serina introduce
un grupo fuertemente electronegativo (el fosfato) y se produce un cambio conformacio-
nal de tal manera que Arg 43, con carga electropositiva, pasa a estar adyacente al grupo
negativo del fosfato.
Figura 9.6
2. Este mismo cambio conformacional se puede apreciar (aunque no entraremos

en detalles) en el sitio del substrato (figura 9.7), con piridoxal fosfato fijado al mismo
en la fosforilasa a, y sobre todo, en el sitio alostrico (figura 9.8), cuya configuracin es
completamente distinta en la fosforilasa b que en la fosforilasa a.
268
Figura 9.7
Figura 9.8
269
3. Cuando la fosforilasa b es activada alostricamente por AMP, sufre un cambio

conformacional y pasa al estado R. En ese estado, la estructura molecular es prctica-
mente idntica a la de la fosforilasa a, tal como se ilustra para el sitio de fosforilacin (fi-
gura 9.9), para el de fijacin de substrato (figura 9.10) o el sitio alostrico (figura 9.11).
Figura 9.9
270
Figura 9.10
Figura 9.11
271
9.2.3.2. Fosforilasa kinasa
La fosforilasa kinasa es una protena muy grande. La enzima muscular tiene una
estructura cuaternaria ()4 y est sometida a dos tipos de control:
- Por una parte, la propia fosforilasa kinasa puede ser fosforilada por una protein
kinasa (protein kinasa A), siendo esta reaccin dependiente de cAMP, como veremos a
continuacin. La forma fosforilada es de alta actividad frente a la defosforilada.
- La actividad enzimtica radica en la subunidad (figura 9.12) En condiciones de

defosforilacin, las subunidades y ejercen un efecto inhibitorio sobre la subunidad
cataltica . Cuando la protein kinasa fosforila a las subunidades y se elimina esta
influencia inhibitoria.
Figura 9.12
272
- La enzima puede tambin ser activada por el sistema Ca2+-calmodulina (en con-
creto, la subunidad es la protena conocida como calmodulina). Esta activacin tiene
particular importancia en el caso de la enzima muscular (figura 9.13). Recurdese, a este
respecto, que es el Ca2+ quien desencadena la contraccin muscular a nivel intracelular.
Asimismo, el ion Ca2+ es segundo mensajero en muchos otros sistemas de transduccin
de seal.
Figura 9.13
9.2.3.3. Protein kinasa A
De entre las aproximadamente mil protein kinasas conocidas hasta ahora, reciben
el nombre de protein kinasas A las que son activadas por cAMP (35 adenosin monofosfato
cclico, figura 9.4).
Esta enzima se mantiene en estado inactivo en ausencia de cAMP. La holoenzima

inactiva es un tetrmero que consta de cuatro subunidades, iguales dos a dos, que son
273
las subunidades R (regulatorias) y las subunidades C (catalticas), por lo que podemos

representar su estructura cuaternaria como R2C2. En presencia de cAMP la enzima se
disocia segn la reaccin
R2C2 + 4 cAMP [(cAMP)2R]2 + 2C
siendo las subunidades C liberadas las formas catalticamente activas de la enzima.

Estas subunidades son capaces de fosforilar, en una reaccin dependiente de ATP, a la
fosforilasa kinasa. Los estudios cristalogrficos de la protein kinasa A nos han permitido
conocer su estructura, que se presenta en la figura 9.14. La subunidad C (cataltica) apa-
rece con un substrato fijado (ATP) y el ion Mn2+. La subunidad R (regulatoria) aparece
con dos molculas de cAMP (activador) fijadas a la misma.
Figura 9.14
274
9.2.3.4. Adenilato ciclasa
Cataliza la reaccin de formacin del nucletido cclico cAMP a partir de ATP, tal
como se presenta en la figura 9.4.
La adenilato ciclasa es una protena integral de membrana, y se activa a travs de la

interaccin con el sistema de protenas G, en concreto con la subunidad de las mismas
unidas a un GTP, tal y como se describe en el apartado siguiente. Conocemos la estruc-
tura molecular de la adenilato ciclasa, que se presenta en la figura 9.15. Consta de dos
dominios (C1A y C2A). El centro activo est localizado en la unin de los dos dominios,
y se presenta cocristalizado con AMP y Pi (fosfato inorgnico) y con la subunidad de
las protenas G con un anlogo de GTP fijado (ver a continuacin), que es el elemento
activador de la enzima.
Figura 9.15
275
9.2.3.5. Protenas G
Las protenas G son una familia de protenas heterotrimricas, constituidas por

tres subunidades distintas: subunidad (39-46 kDa), subunidad (37 kDa) y subu-
nidad (8 kDa). La subunidad puede fijar con gran afinidad nucletidos de guani-
na (GDP o GTP). La estructura se presenta en la figura 9.16. Las sutbunidades y
funcionan normalmente como si fueran una sola. El estado inactivo de la protena G
consiste en la asociacin de las tres subunidades, hecho que se da cuando el sitio de alta
afinidad de la subunidad est ocupado por GDP. El funcionamiento del sistema est
descrito en la figura 9.5.
Se conocen muchas otras protenas G cuyo funcionamiento es bsicamente el

mismo, aunque los efectos desencadenados pueden ser muy diferentes (por ejemplo,
los impulsos nerviosos ligados a la visin o a la olfacin, la reproduccin sexual de las
levaduras, los movimientos del hongo Dyctiostelium, etc.). En general, suele ser la subu-
nidad la que determina los diversos tipos conocidos de protenas G. Entre los sistemas
efectores activados o inhibidos por protenas G, tenemos la adenilato ciclasa (el caso que
estamos estudiando), canales inicos (de Na+, K+ y Ca2+), fosfolipasas A2 y C, cGMP
fosfodiesterasa, etc. Otras protenas G caracterizadas hasta la fecha son las Gi (siendo el
prototipo la presente en los fotorreceptores retinianos, que recibe el nombre especfico de
Gt, transducina), las Gq (presentes en linfocitos B y T) y las G12 (de amplia distribucin).
Como es lgico, en una misma clula pueden coexistir diversos tipos de protenas G,
asociados al mismo o a distintos receptores de membrana.
276
Figura 9.16
De forma caracterstica, la actividad de las protenas G se ve alterada por ciertas

toxinas bacterianas. As, la toxina colrica (de Vibrio cholerae, agente productor del cle-
ra) cataliza una ADP-ribosilacin de un residuo de Arg especfico en la subunidad . La
subunidad modificada queda activada constitutivamente (es decir, de forma continua),
puesto que la actividad GTPasa queda inhibida. La toxina pertussis (de Bordetella per-
tussis, agente causal de la tosferina) afecta asimismo a las protenas G promoviendo la
ADP-ribosilacin de un residuo de Cys, lo cual impide la activacin del sistema mediada
por el receptor.
Las protenas G estn encuadradas en una superfamilia de protenas fijadoras de

GTP, como por ejemplo el factor de elongacin EF-Tu y las protenas oncognicas ras.
La actividad de las protenas G est asociada a la ocupacin o no de receptores

especficos de membrana. En el caso que nos ocupa, existen protenas G asociadas tanto
al receptor de adrenalina (receptor -adrenrgico) como al receptor de glucagon.
277
9.2.4. Otras actividades ligadas al sistema de la glucgeno fosforilasa
No daramos una idea cierta de la verdadera complejidad del mecanismo descrito

hasta ahora si no mencionramos otros sistemas enzimticos que participan en la re-
gulacin de la actividad de la glucgeno fosforilasa. En concreto hemos de estudiar las
protein fosfatasas y la cAMP fosfodiesterasa. Pero adems, el sistema de degradacin de
glucgeno posee muchos puntos de regulacin comunes al sistema de sntesis; por tanto,
la descripcin del sistema sera incompleta si no analizramos asimismo la regulacin de
la glucgeno sintetasa.
9.2.4.1. Protein fosfatasas
Con niveles de especificidad y respuesta a seales similares a las de las protein ki-
nasas, existen en la clula multitud de protein fosfatasas especficas. Las protein fosfatasas
catalizan la defosforilacin hidroltica de los residuos hidroxlicos de protenas fosfo-
riladas por protein kinasas. Se conocen varios tipos de protein fosfatasas (PP1, PP2A,
PP2B, PP2C y tirosin fosfatasas) y en el caso que nos ocupa, la glucgeno fosforilasa
puede ser defosforilada por la protein fosfatasa propia de este sistema, conocida como
PP1. En condiciones de receptores desocupados, la protein fosfatasa es activa y mantiene
prcticamente a cero los niveles de fosforilasa activada. Cuando el receptor se ocupa por
las seales fisiolgicas que hemos visto (adrenalina y glucagon), la propia protein kinasa
A inactiva a la PP1.
La PP1, por su parte, es activada por la insulina, hormona que a este nivel presen-
ta efectos antagnicos a los de adrenalina y glucagon. Esta activacin de la insulina est
mediada por protein tirosin kinasas.
9.2.4.2. cAMP fosfodiesterasa
La accin de esta enzima consiste en el ataque hidroltico al cAMP para dar 5-

AMP:
278
Por lo tanto, el nivel intracelular de cAMP es la resultante de dos acciones enzi-

mticas contrapuestas: por una parte, la adenilato ciclasa que lo sintetiza a partir de ATP;
por otra, la cAMP fosfodiesterasa que lo degrada a 5-AMP con la consiguiente prdida de
actividad. A su vez, la fosfodiesterasa puede tambin ser inhibida a travs de fosforilacin
mediada por protein kinasa A (PKA).
De manera caracterstica, la cAMP fosfodiesterasa es inhibida por las metil xanti-

nas (cafena, teofilina y teobromina), de donde deriva la actividad farmacolgica de estos
compuestos, consistente en el mantenimiento de niveles altos de cAMP al estar inhibida
la cAMP fosfodiesterasa, causante de su hidrlisis.
9.2.4.3. Glucgeno sintasa
La glucgeno sintasa cataliza la transferencia de un residuo de glucosa desde

UDPG (uridin difosfato glucosa) al extremo no reductor de una cadena de glucgeno:
279
Sntesis de glucgeno mediada por la glucgeno sintasa
Esta enzima se presenta en dos formas, que por analoga con la glucgeno fosfo-
rilasa denominamos glucgeno sintasa a y glucgeno sintasa b. La forma b presenta una
actividad muy reducida y es activada alostricamente por glucosa-6-fosfato. Esta forma
de la enzima se presenta fosforilada en un residuo de serina, siendo la protein kinasa A
la responsable de esta fosforilacin. La glucgeno sintasa a, por su parte, tiene niveles
muy altos de actividad y no est fosforilada. Puede observarse aqu cmo las diferentes
seales tienen efectos antagnicos: la fosforilacin mediada por protein kinasa A activa a
la fosforilasa e inactiva a la sintasa. Esta es la respuesta normal a adrenalina y glucagon;
por el contrario, la respuesta a insulina consiste en la inactivacin de la fosforilasa y la
activacin de la sintasa, gracias al efecto estimulador de esta hormona sobre la protein
fosfatasa 1 (PP1).
Un resumen de estas actividades coordinadas se presenta en la figura 9.17. La acti-

vacin por protein kinasa mediada por cAMP activa a la fosforilasa e inhibe a las protein
fosfatasas y a la glucgeno sintasa.
280
Figura 9.17
9.3. Otros sistemas de fosforilacin de protenas
Como ya se dijo anteriormente, la fosforilacin de residuos especficos en la pro-

tena (enzimtica o no) es el modo preferente de regulacin de actividad por modifica-
cin covalente. En el apartado anterior hemos estudiado con cierto detalle el sistema de
la glucgeno fosforilasa. Este sistema fue histricamente el primero en ser descrito y nos
ha valido para la introduccin de muchos conceptos tiles en la regulacin por modifi-
cacin covalente y en la transduccin de seales. Ahora bien, no es, ni mucho menos, el
nico. A lo largo de los apartados que siguen analizaremos los principales sistemas cono-
cidos de fosforilacin de protenas, con la advertencia previa de que aunque sean presen-
tados por separado, las interacciones entre los mismos son extremadamente frecuentes y
por tanto difciles de sistematizar.
9.3.1. Protein kinasas A
Las protein kinasas A (PKA) son enzimas que responden caractersticamente a la

accin del cAMP, y la fosforilasa estudiada en el apartado anterior es el ejemplo clsico
de las mismas.
281
9.3.2. Protein kinasas G
Son un tipo de protein kinasas que responden a la elevacin intracelular del segun-
do mensajero cGMP (3,5 Guanosina monofosfato cclico). El sistema mejor estudiado
es el del msculo liso. La guanilato ciclasa existente en el msculo liso (en particular el
vascular) es activada por el radical libre xido ntrico (NO.); el cGMP producido enton-
ces induce la relajacin muscular (y de ah el efecto hipotensor del NO.)
El sistema de la protein kinasa G participa asimismo en la transduccin del est-

mulo visual. En condiciones basales, el cGMP mantiene abierto un canal inico de Na+.
La activacin por la rodopsina excitada de un sistema de protenas G (conocida en este
caso como transducina) da lugar a la activacin de una fosfodiesterasa que hidroliza el
cGMP a 5-GMP. De esta manera baja el nivel intracelular de cGMP y se cierra el canal
de Na+, dando lugar al impulso nervioso. (Ver Biomolculas, cap. 6, Retinoides).
9.3.3. Protein kinasas C
La protein kinasa C es una enzima de 77 kDa, y fosforila residuos de serina y

treonina en muchas protenas diana. Consta de un dominio cataltico y otro regulatorio.
Responden a una gran variedad de seales, entre las que destacan el estmulo a la pro-
liferacin celular, y de ah su potencial oncognico (productor de cncer). La actividad
de la PKC queda enmarcada en un sistema complejo de regulacin en el que participan
varios segundos mensajeros, especialmente DAG (diacilglicerol), inositolfosfatos y calcio.
La interaccin de la seal primaria con el receptor de membrana extracelular es-

timula la accin de la fosfolipasa C, que al actuar sobre fosfoinostidos de membrana
libera diacilglicerol, por un lado, e inositol-1,4,5-trisfosfato (IP3), por otro. Este ltimo
acta liberando iones de calcio a partir de sus depsitos intracelulares.
El DAG activa directamente a la protein kinasa C, siendo esta accin mimetizada

por los steres de forbol, compuestos carcingenos presentes en el aceite de crotn y que
se emplean experimentalmente para inducir una activacin sostenida de la protein kinasa
C, ya que no se degradan con la rapidez del DAG, del que actan como anlogos.
La actividad de la protein kinasa C sobre la diferenciacin y proliferacin celular

se comprende precisamente por la accin de estos compuestos.
282
9.3.4. Protein kinasas dependientes de calcio-calmodulina
La unin de calcio a la protena calmodulina activa la funcin de diversas protein

kinasas, entre otras muchas enzimas. Las protein kinasas activadas por calcio fosforilan a
un gran nmero de protenas intracelulares. Aqu estudiaremos brevemente las funciones
de dos sistemas muy relacionados: el sistema calcio-calmodulina y los inositolfosfatos.
9.3.4.1. El sistema calcio-calmodulina
Los niveles intracelulares de calcio inico (Ca2+) son bajos por la abundancia de
steres fosfricos en el interior de la clula, ya que el producto de solubilidad de fosfatos
clcicos tiene un valor muy reducido. Todas las clulas poseen bombas de Ca2+, esto es,
sistemas de transporte encargados del mantenimiento del nivel intracelular de este ion.
Las bombas de Ca2+ operan tanto en la membrana plasmtica como en las membranas
organelares (mitocondrial, sarcoplsmica, etc.).
Muchas funciones celulares pueden activarse a travs de un incremento en la con-

centracin intracelular de Ca2+ causado por (a) la apertura de canales en la membrana
plasmtica o (b) la movilizacin del calcio secuestrado en las vesculas del retculo endo-
plsmico. El ejemplo clsico de la modalidad (a) es la liberacin de neurotransmisores in-
ducida por Ca2+ en los terminales sinpticos de las neuronas. La contraccin del msculo
esqueltico, por su parte, es un ejemplo del segundo de los mecanismos citados.
El Ca2+ participa como segundo mensajero en muchos otros procesos: movili-

zacin de glucgeno y lpidos, liberacin de neurotransmisores, contraccin muscular
y motilidad de cilios y flagelos. La concentracin de Ca2+ libre en el citoplasma es del
orden de 10-7 M; pero unido a lo que est en reservorios sube a 1 mM. Muchos mensajes
hormonales inducen la liberacin de este calcio secuestrado.
El Ca2+ se fija con gran afinidad a grupos de oxgeno cargados (p.e. aniones car-
boxlicos) y no cargados (carbonilos), lo que le permite inducir cambios conformaciona-
les importantes en las protenas. Gran parte de las acciones desencadenadas por el Ca2+
se deben a su unin con una protena especfica, la calmodulina (figura 9.13) Bien sea
como entidad aislada o formando parte de protenas oligomricas (como el caso ya visto
de la fosforilasa kinasa), la calmodulina sufre un importante cambio conformacional al
fijar Ca2+ del que resultan sus diversas acciones. La calmodulina es una protena fijadora
283
de calcio de 17 kDa; consiste en dos dominios globulares unidos por un tramo largo en
-helicoide; cada dominio tiene dos manos EF, motivo estructural propio de muchas
protenas fijadoras de Ca2+. La mano EF consiste en dos tramos en -helicoide separados
por un tracto de 12 aminocidos, cinco de los cuales son dicarboxlicos (Asp o Glu).
La calmodulina consta de cuatro manos EF, formando dos lbulos con dos manos cada
uno separados de una tracto largo en -helicoide. La unin del Ca2+ a los aminocidos
dicarboxlicos de cada una de las cuatro manos EF induce un importante cambio con-
formacional en el calmodulina que de esta manera transmite el mensaje a otras protenas
(figura 9.13).
9.3.4.2. Inositolfosftidos
Los inositolfosftidos de la membrana plasmtica participan de forma muy activa

en la transduccin de seales hormonales a travs de la membrana plasmtica. El fosfati-
dil inositol 4,5 bisfosfato (PIP2), que constituye hasta un 8 % de los lpidos de membrana
da lugar a travs de hidrlisis a tres segundos mensajeros hormonales (figura 9.18): (a)
Inositol 1,4,5 trisfosfato (IP3); (b) diacilglicerol (DAG); y eventualmente tambin a (c)
cido araquidnico, presente en la posicin sn-2, que puede ser substrato de la ciclooxi-
genasa (dando lugar a prostaglandinas y tromboxanos) o de la lipooxigenasa (con forma-
cin de leucotrienos) (v. Biomolculas, cap. 4).
Figura 9.18
284
El IP3 liberado se une a una receptor especfico del retculo endoplsmico, segn
hemos visto ms arriba, lo que conduce a una liberacin de iones Ca2+ desde el mismo
hacia el citoplasma, los cuales llevan a cabo diferentes efectos, entre ellos la activacin
de protein kinasas calcio-calmodulina dependientes. El DAG, por su parte, activa a la
protein kinasa C segn hemos visto anteriormente.
9.3.5. Protein tirosin kinasas
Otro tipo de protein kinasas son las protein tirosin kinasas (PTK), que se caracte-
rizan precisamente porque la fosforilacin dependiente de ATP se lleva a cabo sobre resi-
duos fenlicos de tirosina y no sobre serina o treonina como los vistos hasta ahora. Una
caracterstica distintiva de estas protein kinasas es su capacidad de autofosforilacin. Las
protein tirosin kinasas son activadas por factores de crecimiento e insulina, y responden
por autofosforilacin en mltiples residuos de Tyr.
Varios experimentos han demostrado un papel de las protenas ras (producto del
protooncogen del mismo nombre) en la transduccin de seales ligada a receptores PTK.
Se requiere activacin de estas para la mitognesis inducida por diversos factores de cre-
cimiento (y de ah su potencial oncognico).
Son receptores PTK asimismo muchos productos genticos asociados a la ontoge-

nia de Drosophila y del nematodo Coenorhabditis elegans.
9.4. Otras formas de modificacin covalente
9.4.1. ADP-ribosilacin
Se trata de un proceso de modificacin covalente de enzimas y protenas en ge-

neral que consiste en la transferencia de ADP-ribosa desde NAD+ a grupos aceptores
presentes en las protenas, liberndose el anillo de nicotinamida en el proceso, y que est
catalizada por las llamadas ADP-ribosil transferasas, segn se indica en la figura 9.19. En
el proceso se libera nicotinamida.
285
Figura 9.19
El grupo transferido se une a diversos grupos de la protena: cadenas laterales de

glutamato, arginina o cistena o bien al carboxilo terminal de la protena, y la transfe-
rencia se hace normalmente de forma mltiple, apareciendo molculas de poli(ADP-
ribosa)-protena. Parece ser que esta forma polimrica es la habitual; la enzima modifica-
da puede aparecer unida hasta un total de ms de 1000 residuos de ADP-ribosa.
Las ADP-ribosil transferasas se encuentran en el ncleo y en el citoplasma de

clulas eucariticas, como componentes de toxinas bacterianas y como parte de un me-
canismo que inactiva la sntesis proteica en ciertas bacterias infectadas por fagos. Los
procesos que son objeto de ADP-ribosilacin son suficientemente importantes y bsi-
cos en la clula como para asignar una gran relevancia al proceso de ADP-ribosilacin;
no obstante, la significacin fisiolgica de este proceso, salvo algunas excepciones, es
por hoy desconocida. Vamos a ver brevemente alguna de las reacciones modificadas por
ADP-ribosilacin.
1 La reparacin del DNA. Los mecanismos de reparacin de anomalas en la mo-

lcula de DNA son un proceso importantsimo, que tiene lugar de forma constante en
la clula debido a la relativa fragilidad de la molcula. Estos mecanismos tienen que ver
tambin con los procesos de envejecimiento. La ADP-ribosilacin forma parte de los
mismos.
286
2 Se ha comprobado asimismo que la ADP-ribosilacin de histonas produce cam-

bios en el estado de condensacin de la cromatina; parece ser que la ADP-ribosilacin
disminuye el grado de interaccin entre histonas y DNA en el nucleosoma, haciendo as
que aquel sea accesible a enzimas de reparacin u otros procesos.
3 La ADP-ribosilacin de protenas citoplsmicas parece ser un mecanismo ms

de control de la sntesis proteica ribosmica.
4 La accin de toxinas bacterianas est en muchos casos ligada a procesos de ADP-

ribosilacin. As, la toxina diftrica (de Corynebacterium diphteriae) promueve la ADP-
ribosilacin del factor de elongacin EF-2 en eucariotas y EF-G en bacterias, inactivan-
do de esta forma la sntesis proteica en la clula atacada. Ya vimos anteriormente tambin
la accin de la toxina colrica y de la toxina pertussis.
9.4.2. Adenilacin y Uridilacin
La enzima glutamina sintetasa (EC 6.3.1.2, Glutamato-amonio ligasa) cataliza la

incorporacin de amonaco NH3 al grupo carboxilo de la cadena lateral de cido glut-
mico en una reaccin dependiente de ATP, dando lugar a glutamina:
Accin de la Glutamina sintetasa
287
Esta reaccin es central en el metabolismo del nitrgeno, ya que el aminocido

glutamina opera como donador de nitrgeno en una gran cantidad de reacciones meta-
blicas, por lo que el papel biosinttico de esta reaccin es importantsimo. A ttulo de
ejemplo, y entre otras, la glutamina participa en los siguientes procesos:
- Biosntesis del anillo purnico, incorporando el N3 y N9 del anillo.
- Biosntesis de GMP a partir de IMP, en la va de sntesis de nucletidos purni-

cos.
- Biosntesis de carbamilfosfato en el ciclo de la urea y en la formacin del anillo

pirimidnico
- Formacin de CTP a partir de UMP en la biosntesis de nucletidos pirimid-

nicos.
- Biosntesis de diversos aminocidos, en las que participa directa o indirectamen-

te: histidina, triptfano, alanina, serina y glicina.
- Biosntesis de glucosamina-6-fosfato en el proceso de formacin de oligo- y po-

lisacridos complejos.
Igualmente, la reaccin de la glutamina sintetasa tiene un papel fundamental en

la destoxificacin del NH3. El dficit de esta actividad enzimtica contribuye de manera
decisiva al desarrollo del coma heptico en las insuficiencias terminales de este rgano.
No es de extraar, pues, que el papel central de esta enzima en el metabolismo ni-

trogenado requiera un control muy estricto de su actividad. La enzima es muy compleja
y est formada por doce subunidades idnticas, cada una con una masa molecular de 51
kDa, que se agrupan en dos hexmeros apilados uno sobre otro (figura 9.20).
288
Figura 9.20
Adems de diversos controles alostricos, la glutamina sintetasa est asimismo so-

metida a un control covalente de su actividad. Por accin de la enzima glutamina sintetasa
adenil transferasa (GSATasa) se transfiere el grupo adenil (AMP) desde el ATP al residuo
de Tyr 397 presente en cada una de las subunidades, segn la reaccin que se presenta en
la figura 9.21. La enzima adenilada se hace mucho ms sensible a los efectores alostri-
cos, por lo que esta modificacin se traduce en un descenso significativo de su actividad.
289
Figura 9.21
A su vez, la accin de la GSATasa est controlada por otra protena, la protena

P, cuya accin est regulada a su vez por modificacin covalente. Esta protena existe en
dos estados, PA y PD.
La forma PA estimula la adenilacin, y consiguiente inactivacin, de la glutamina

sintetasa. La diferencia entre las dos formas de esta ltima protena estriba en que PD
contiene un residuo de cido uridlico (UMP) unido a una cadena lateral de Tyr en cada
una de sus cuatro subunidades. Es decir, otra modificacin covalente que en este caso
es una uridilacin.
9.5. Activaciones proteolticas: Zimgenos digestivos
Muchos sistemas enzimticos del organismo deben permanecer en estado de in-

actividad por diversas razones. Tal es el caso de las enzimas proteolticas digestivas que se
producen en el estmago (pepsina) y en el pncreas (tripsina, quimotripsina, elastasa y
carboxipeptidasas A y B), as como los diversos factores de la coagulacin de la sangre.
290
De no ser as se correra el riesgo de una destruccin generalizada de los tejidos, en el pri-

mer caso, y de una coagulacin intravascular diseminada en el segundo. Pero al mismo
tiempo estos sistemas deben poder ser activados rpidamente ante diversas seales, y a
una escala fisiolgica, superior en magnitud a la celular. Por ello se trata, particularmente
en el segundo caso, de complejos sistemas en cascada capaces de pasar al estado activo en
perodos de tiempo muy cortos. En uno y otro sistema las formas inactivas corresponden
a proenzimas o zimgenos, protenas de mayor tamao que la enzima activa. El fenmeno
de activacin consiste en una rotura proteoltica del zimgeno, altamente especfica, que
expone al exterior un centro activo que estaba oculto, y acompaada a veces de un reor-
denamiento molecular bastante considerable.
9.5.1. Pepsina
La pepsina es una enzima digestiva producida por las clulas principales de la

mucosa gstrica en forma de un zimgeno inactivo, el pepsingeno. La pepsina es el pro-
totipo de las proteasas cidas, caracterizadas por tener varios residuos cidos en el centro
activo y tener ptimos de pH muy bajos. A este respecto, la pepsina es excepcional por
cuanto su pH ptimo de accin est alrededor de 2. En su centro activo hay dos residuos
de aspartato.
El pepsingeno, por su parte, contiene toda la secuencia de aminocidos de la

pepsina y un segmento precursor N-terminal de 44 aminocidos. Este segmento debe ser
eliminado para dar lugar a la enzima activa. La eliminacin es espontnea a pH menor
de 5. El centro activo enzimtico aparece en la conformacin correcta en el pepsingeno,
pero queda oculto por el segmento precursor. En este encontramos seis cadenas laterales
de aminocidos dibsicos (Lys y Arg) en interaccin salina con residuos de asprtico y
glutmico presentes en el segmento enzimtico de la molcula. Al disminuir el pH los
grupos cidos se protonan, pierden carga y cesan las interacciones salinas; en ese mo-
mento, el propio centro activo hidroliza un enlace peptdico especfico separando al
precursor del segmento enzimtico. Este mecanismo explica la activacin espontnea de
la pepsina a pH cido.
9.5.2. Tripsina
La tripsina y el resto de las enzimas digestivas pancreticas se producen en las clu-

las acinares de este rgano, muchas de ellas en forma de zimgenos inactivos y almacena-
dos en grnulos de zimgeno que se sitan en la porcin apical de la clula acinar. Ante un
291
estmulo adecuado (como la hormona gastrointestinal colecistoquinina/pancreozimina),

los grnulos son secretados al duodeno, donde se activan los distintos zimgenos. De la
necesidad del almacenamiento en forma inactiva de las enzimas proteolticas da idea
la destruccin del pncreas que puede tener lugar en las pancreatitis agudas.
La activacin de las enzimas pancreticas corre a cargo de la propia tripsina, para

lo cual esta debe ser activada previamente por un mecanismo distinto. El tripsingeno
secretado a la luz intestinal sufre un ataque proteoltico por parte de la enzima entero-
peptidasa que producen las clulas de la mucosa duodenal. La activacin consiste en una
rotura altamente especfica entre los residuos Lys 6 e Ile 7 del tripsingeno, con lo cual se
libera el hexapptido N-terminal VDDDDK. Es precisamente la carga negativa de este
pptido quien atrae a la enteropeptidasa. La tripsina liberada, por su parte, activa a todos
los dems zimgenos pancreticos, incluido el propio tripsingeno.
En los tejidos existen asimismo otros mecanismos de defensa contra la proteolisis

inducida por serinproteasas. Tal es el caso de la 1-antitripsina, protena de 53 kDa pro-
ducida por los granulocitos neutrfilos. A pesar de su nombre, esta enzima protege a la
elastina de los tejidos conjuntivos de su digestin por elastasa. Se conocen deficiencias
genticas diversas en la molcula de 1-antitripsina; una consecuencia caracterstica de
todas ellas es la presencia de enfisema pulmonar al no poderse prevenir la accin de las
elastasa sobre los alvolos pulmonares. La 1-antitripsina pertenece a la superfamilia de
las serpinas, inhibidores naturales de las serinproteasas.
9.5.3. Quimotripsina
El quimotripsingeno es una protena de 245 aminocidos y cinco disulfuros pro-

ducida en el pncreas y es activada (como todos los zimgenos pancreticos) por la trip-
sina. En este caso, la activacin es bastante compleja, en pasos sucesivos que culminan
en la forma -quimotripsina y comprende un importante reagrupamiento de la cadena
polipeptdica.
9.6. Activaciones proteolticas: Coagulacin de la sangre
Para terminar este resumen sobre la regulacin covalente, consideramos a conti-

nuacin un proceso de suma importancia para la integridad del organismo, la coagula-
cin de la sangre. Est organizada en gran parte sobre la base de activacin en cascada de
292
los llamados factores de la coagulacin, que no son sino zimgenos de otras tantas serin
proteinasas. En el proceso participan otras protenas cuya accin por el momento no se
conoce con certeza, as como otros factores y unas clulas especializadas, las plaquetas.
En esta discusin nos centraremos sobre todo en los aspectos puramente enzimticos de
la coagulacin.
Existen en el organismo otros procesos organizados asimismo como cascadas de

activacin proteoltica, en los que no entraremos: La fibrinolisis (proceso de destruccin
del cogulo una vez formado) y la activacin del complemento, proceso desencadenado a
partir de reacciones antgeno-anticuerpo cuyo objeto es la destruccin del antgeno.
9.6.1. El proceso de coagulacin: generalidades
La integridad fsica del sistema vascular de los animales es una condicin indis-
pensable para el mantenimiento de su homeostasis. Tanto las grandes arterias y venas
como en particular los capilares estn sometidos continuamente a una gran cantidad de
traumas mecnicos que de no solventarse daran lugar a una prdida irreversible de pre-
sin en el sistema vascular incompatible con la vida. Pero, por otra parte, la formacin
intravascular de cogulos puede representar asimismo un grave peligro, sobre todo en
rganos con vascularizacin terminal como el miocardio o en rganos que a pesar de po-
der desarrollar vascularizacin alternativa tienen funciones tan crticas como para no
poder interrumpir su actividad, como es el caso del cerebro y del tejido nervioso en ge-
neral. Por todo ello, tanto los fenmenos de coagulacin de la sangre como de fibrinolisis
(destruccin del cogulo) son sistemas de modificacin covalente (ataque proteoltico)
organizados como activaciones en cascada. Ello permite su rpida puesta en marcha y su
actuacin en dimensiones espaciales muy superiores a las celulares.
Bsicamente, la coagulacin de la sangre consiste en las siguientes fases (presenta-

das en sentido cronolgico inverso):
1. Formacin de una trama polimrica covalente llamada fibrina formada por la

aposicin de monmeros de fibrina. A su vez, los monmeros de fibrina se forman por
la accin de una serinproteinasa, la trombina, que acta sobre una protena plasmtica
denominada fibringeno, que es incapaz de polimerizarse per se.
2. Formacin de trombina a partir de su precursor inactivo, la protrombina. Este

paso est catalizado por el llamado complejo protrombinasa, que como veremos no es una
nica actividad enzimtica.
293
3. Formacin del complejo protrombinasa. El complejo protrombinasa puede

formarse por dos vas distintas, denominadas Ruta de Activacin por Contacto (va in-
trnseca) y Ruta del Factor Tisular (va extrnseca). La va intrnseca se produce intra-
vascularmente, cuando la sangre entra en contacto con una superficie anmala. La va
extrnseca se activa cuando la sangre se extravasa, y es significativamente ms rpida que
la va intrnseca. Ambas vas convergen en las reacciones finales de esta fase, dando lugar
al complejo protrombinasa.
En todas estas fases existen activaciones en cascada de enzimas proteolticas. En la

coagulacin de la sangre, los distintos factores proteicos que intervienen se denominan
(entre otras formas) con nmeros romanos: factor I, factor II, factor III, etc. Los factores
activados proteolticamente reciben el mismo nmero con el aadido de la letra a; as, el
factor XIIa, por ejemplo, representa la forma activada proteolticamente del factor XII.
Un esquema general del proceso de coagulacin se presenta en la figura 9.22. Hay

que hacer notar que el esquema completo de la coagulacin presenta interacciones entre
las tres fases a travs de factores comunes. Esta distincin se hace, sobre todo, a efectos
didcticos.
Figura 9.22
294
9.6.2. Polimerizacin del fibringeno
El fibringeno (o factor I) es una protena fibrosa cuyo p.m. es de 340 kDa. Al mi-
croscopio electrnico presenta forma de bastn con una longitud de 46 nm. Su estructu-
ra cuaternaria consiste en seis subunidades, iguales dos a dos, llamadas A, B y ; por
ello el fibringeno puede representarse como (A)2(B)22, estando estas subunidades
unidas por puentes disulfuro. La molcula consta de dos dominios globulares en ambos
extremos y otros dos en el centro. Estos dominios estn unidos por tramos elongados en
forma de -helicoide. Las subunidades A y B reciben estos nombres porque tras el
ataque por la trombina A da lugar al fibrinopptido A y la subunidad , mientras que la
B rinde fibrinopptido B y subunidad :
(A)2(B)22 2A + 2B + 222
En la molcula intacta, los fibrinopptidos A y B aparecen en el dominio globular

central. Estos dos fibrinopptidos son ricos en residuos aninicos (Asp y Glu) as como
residuos de tirosina sulfatada, lo que confiere a los mismos una importante densidad
de carga electronegativa. Al estado nativo, esta carga negativa del fibringeno es la que
impide la agregacin intermolecular del mismo por repulsin electrosttica de unas mo-
lculas a otras.
La molcula de fibringeno, en el curso del proceso de coagulacin, es atacada por

la enzima trombina (llamada tambin factor IIa), una serinproteinasa que escinde cuatro
enlaces Arg-Gly, situados en las subunidades A y B, de manera que se separan dos
fibrinopptidos A (de 18 residuos cada uno) y otros dos fibrinopptidos B (de 20 resi-
duos cada uno), quedando la molcula de fibringeno convertida en monmero de fibrina
(factor Ia), cuya estructura es 222, y cuya estructura tridimensional (figura 9.23) se ha
podido resolver por cristalografa de rayos X.
295
Figura 9.23
La separacin de los fibrinopptidos elimina la repulsin electrosttica que se da

entre las molculas nativas de fibringeno. Los monmeros forman entonces agregados
no covalentes, segn se indica en la figura 9.24.
Figura 9.24
296
La formacin definitiva del cogulo de fibrina tiene lugar cuando se establecen en-
laces covalentes entre los distintos monmeros de fibrina. Estos enlaces se establecen entre
cadenas laterales de Lys y Gln, en un proceso catalizado por la transglutaminasa, tambin
llamada factor XIIIa o factor estabilizador de la fibrina. La transglutaminasa es asimismo
activada por la trombina, que acta sobre el factor XIII, zimgeno precursor de la trans-
glutaminasa, para dar lugar al factor XIIIa. La estabilizacin del cogulo se representa en la
figura 9.25.
Figura 9.25
9.6.3. Formacin de trombina
La trombina o factor IIa se forma por activacin proteoltica de la protrombina

(factor II) catalizada por el complejo protrombinasa. La protrombina es una protena de
582 aminocidos y un peso molecular de 66 kDa. 10 de los 33 aminocidos N-termi-
nales de la protrombina son residuos de cido -carboxiglutmico. La presencia de estos
residuos permite la fijacin de Ca2+ a la protrombina, que de esta manera interacciona
con el complejo protrombinasa, formado en la superficie de las plaquetas (cuyos fosfol-
pidos son indispensables en el proceso) y que consta adems de los factores Va y Xa. El
297
complejo protrombinasa escinde la molcula de protrombina dando lugar a la trombina

(figura 9.26) y exponiendo el centro cataltico. La trombina, de esta forma, activa no solo
al fibringeno, sino tambin a otros factores.
Figura 9.26
El cido -carboxiglutmico presente en 10 residuos del segmento N-terminal

de la protrombina se forma mediante modificacin postraduccional de residuos de ci-
do glutmico presentes en la protena mediante una reaccin compleja, no del todo
conocida, en la que participan las naftoquinonas o vitaminas K. La accin anticoagu-
lante de los derivados cumarnicos se debe precisamente a su actuacin como anlogos
competitivos de las vitaminas K. En presencia de estos compuestos, no se forma cido
-carboxiglutmico. La falta de este en la porcin N-terminal de la protrombina impide
la fijacin de calcio, lo que a su vez imposibilita la unin de la protrombina al complejo
protrombinasa en la superficie plaquetaria. La presencia de cido -carboxiglutmico es
asimismo esencial para la accin de los factores VII, IX y X.
El complejo protrombinasa se forma en la superficie de las plaquetas y presenta,

como elementos esenciales el factor Xa, una serinproteinasa, el factor Va (que no tiene
actividad enzimtica pero acelera unas 10000 veces la activacin de protrombina), los
298
fosfolpidos de la superficie plaquetaria y el complejo protrombina-Ca2+. El factor Va se

produce por la activacin del factor V catalizada por la trombina y el factor Xa. El factor
Xa, a su vez, por los mecanismos que veremos a continuacin.
9.6.4. Formacin del complejo protrombinasa
El factor Xa, como hemos visto, es un elemento fundamental en la activacin de la

protrombina. La activacin del mismo a partir de su zimgeno, el factor X, puede tener
lugar de dos maneras distintas, que son las dos vas a que antes aludamos, la extrnseca
y la intrnseca.
9.6.4.1. La va extrnseca
Recibe este nombre por desarrollarse fuera de los vasos sanguneos, y es significati-
vamente ms rpida que la va intrnseca (y en general tiene mayor importancia en el me-
canismo hemosttico). La activacin del factor X tiene lugar mediante el VIIa, Ca2+ y el
factor III (tambin llamado factor tisular; es una lipoprotena del endotelio vascular). La
activacin del factor VII requiere calcio y una superficie fosfolipdica. A este respecto re-
cordemos que tambin los factores VII y X poseen residuos de cido -carboxiglutmico.
Un esquema de la va extrnseca se presenta en la figura 9.27.
Figura 9.27
299
9.6.4.2. La va intrnseca
Es la que se tiene lugar cuando se producen discontinuidades en el endotelio vas-

cular. Esta discontinuidad expone el colgeno del tejido vascular. El colgeno fija las pla-
quetas circulantes a travs de una glicoprotena especfica. La adhesin plaquetaria es a su
vez activada por el factor von Willebrand, que forma enlaces entre la superficie plaquetaria
y el colgeno. Las plaquetas activadas liberan factores que reclutan a otras plaquetas hacia
el tapn primario, y exponen su fosfolpido para la formacin del complejo protrombi-
nasa. en este complejo formado sobre el colgeno interviene tambin otra serinproteina-
sa, la kalicrena, y de esta manera se produce la activacin del factor XII.
El factor XIIa activa al XI; el XIa al IX; el IXa, junto con el VIIIa, activan al factor
X. El factor VIII (o factor antihemoflico), es activado en un proceso que tambin re-
quiere Ca2+, una superficie plaquetaria y trombina. La carencia congnita de factor VIII
da lugar a la enfermedad conocida como hemofilia A, que se transmite de forma ligada al
sexo. El resumen de la va intrnseca se presenta en la figura 9.28.
Figura 9.28
300
Resumiendo, la coagulacin de la sangre presenta las siguientes particularidades:
- Son enzimas proteolticas la trombina (IIa), y los factores Xa, VIIa, IXa, XIa,
XIIa, y kalicrena. Todas ellas son serinproteinasas y activan proteolticamente a sus subs-
tratos.
- Presentan restos de cido -carboxiglutmico los factores II (protrombina), VII,

IX y X.
- Se requiere Ca2+ y al parecer una superficie fosfolipdica en la activacin de la

protrombina, del factor VII en la va extrnseca y del factor VIII en la intrnseca.
- Adems de promover la polimerizacin del fibringeno, la trombina (IIa) acta

en la activacin del factor XIII (estabilizador de la fibrina), del V y del VIII.
9.6.5. Anticoagulantes fisiolgicos
Todos los factores activados tienen una vida media muy corta. Adems de las
actividades antiserinproteinasa existentes en el medio plasmtico (1-antitripsina, etc.),
existen otros sistemas anticoagulantes:
1. La antitrombina III es una protena que se une irreversiblemente al sitio catal-

tico de la trombina tras unos pocos ciclos catalticos. Tiene una estructura parecida a la
1-antitripsina (pertenecen ambas a la superfamilia de las serpinas). Inhibe asimismo a
los factores IXa, Xa, XIa y XIIa. De manera caracterstica, la antitrombina III es activada
por la heparina, glicosaminoglicano sulfatado presente en las granulaciones de los mas-
tocitos o clulas cebadas.
2. La protena C es una proteinasa que ataca especficamente a los factores estimu-

ladores de la coagulacin (Va y VIIIa).
3. Existe tambin todo un sistema de activacin en cascada, la +, encargada de la

destruccin del cogulo una vez formado, en el que no entraremos, pero que presenta
una complejidad parecida a la coagulacin de la sangre.
301
CAPTULO 10
ENZIMAS EN MEDICINA
10.1. Las enzimas en el diagnstico clnico
Los grandes avances en los mtodos de determinacin de la actividad enzimtica

que tuvieron lugar en la segunda mitad del siglo pasado permitieron estudiar la presencia
de enzimas en una gran cantidad de fluidos biolgicos. De todos ellos nos interesan las
determinaciones enzimticas llevadas a cabo en el suero sanguneo, dada su trascenden-
cia en el diagnstico de muchas enfermedades. Hasta tal punto que podemos decir que
aproximadamente un 20 % de las determinaciones analticas rutinarias en el laboratorio
clnico son determinaciones enzimticas.
De la relacin
v= kcate
vista en el captulo 5 de este compendio, se deduce que la velocidad de una reac-

cin enzimtica es directamente proporcional a la concentracin de enzima. Por esta ra-
zn, las concentraciones enzimticas en fluidos biolgicos como el suero se miden como
actividad por unidad de volumen, es decir, UI.L-l o bien kat.L-1. En el suero existe una
gran cantidad de actividades enzimticas, aunque solo un nmero limitado de las mis-
mas tiene aplicaciones diagnsticas.
10.1.1. Procedencia de las enzimas sricas
Las enzimas presentes en el suero proceden siempre del interior de las clulas,
donde son sintetizadas. Ahora bien, la diferenciacin de clulas y tejidos hace que la con-
centracin intracelular de enzimas vare segn el tejido de procedencia. Por ejemplo, la
fosfatasa cida es mucho ms abundante en la prstata que en otros rganos o tejidos;
la creatin kinasa es propia del tejido muscular; la alanina aminotransferasa, aunque pre-
sente en muchos tejidos, es francamente abundante en el hepatocito. Por ello, aumentos
constatables en suero de dichas enzimas son indicativos de alteraciones en los respectivos
tejidos de procedencia, y de ah el inters general de las determinaciones enzimticas en
suero.
Asimismo, la diferenciacin celular se manifiesta muchas veces en diferentes for-

mas moleculares de enzimas (isoenzimas, ver captulo 2) lo cual hace que muy a menudo
no valga la mera determinacin de actividad, sino que son necesarias pruebas ulteriores
304
para ver el patrn de isoenzimas. As, un aumento en la fosfatasa alcalina puede ser de-
bido, entre otras cosas, a una alteracin hepatobiliar o a una alteracin sea. La discri-
minacin de estas actividades ha de hacerse por otros mtodos. En este caso, una simple
prueba de termolabilidad a 56 C puede discriminar la procedencia, ya que la isoenzima
sea es mucho ms termosensible que la heptica.
10.1.2. Alteraciones en la concentracin enzimtica en suero
Podemos considerar dos casos: aumentos de la actividad enzimtica y disminucio-

nes de la misma (mucho menos frecuentes).
10.1.2.1. Aumentos de la concentracin enzimtica
Las enzimas pueden estar aumentadas en el suero por alguna de las siguientes ra-
zones (en orden de importancia):
(a) Incremento patolgico de la permeabilidad de membrana
Cuando existe un dao celular, una de las primeras consecuencias es la alteracin

de la permeabilidad de la membrana. Esta, que en condiciones normales es impermea-
ble, ante una alteracin, y por diversas causas, puede ver aumentada su permeabilidad
de tal manera que componentes como las protenas pueden abandonar la clula. Tal es el
caso, por ejemplo, de la elevacin de la alanina aminotransferasa en las hepatitis agudas.
El incremento en permeabilidad es anterior a la muerte y destruccin celular (necrosis).
Por ello, un aumento en permeabilidad se traduce primeramente en la aparicin de enzi-
mas de procedencia citoslica en el suero, no apareciendo las enzimas ligadas a fracciones
celulares como mitocondrias, ncleos, etc.
(b) Muerte y destruccin celular
Si el dao celular es grande, la clula puede morir y todo su contenido pasa al

medio extracelular y de ah al plasma. En este caso, a diferencia del anterior, podemos
encontrar en el suero enzimas ligadas a fracciones particuladas (mitocondrias, membra-
nas, etc.) a veces ligadas a fracciones de muy alta masa molecular.
305
Tanto en el caso anterior como en este, la magnitud del aumento refleja la exten-
sin del dao celular.
(c) Induccin enzimtica
Muchas enzimas del organismo son inducibles, esto es, su sntesis aumenta ante
determinados estmulos ambientales. Y por ello puede aumentar su concentracin en el
suero. Tal es el caso de las enzimas hepticas relacionadas con diversos mecanismos de
destoxificacin. As, la g-glutamil transferasa es inducible por multitud de drogas que
han de ser metabolizadas por el hgado, como por ejemplo alcohol, antidepresivos tric-
clicos, fenitona, etc.
(d) Proliferacin celular
En algunas circunstancias, tanto fisiolgicas como patolgicas, la proliferacin

de un tejido hace que determinadas enzimas especficas del mismo aumenten su con-
centracin en suero. As, en individuos jvenes en los que tiene lugar un proceso activo
de proliferacin sea (actividad osteoblstica) es habitual un valor elevado de fosfatasa
alcalina sea.
Igualmente, en proliferaciones patolgicas celulares (neoplasias) pueden aparecer

aumentos de la actividad de determinadas enzimas. Por ejemplo, la fosfatasa cida pros-
ttica ve aumentada su actividad en suero ante la presencia de un carcinoma prosttico.
10.1.2.2. Disminuciones en la actividad enzimtica
Se ven con menor frecuencia que los aumentos. No obstante, en muchos casos
tienen inters diagnstico. Se citan a continuacin las principales causas de disminucin
de la actividad enzimtica.
(a) Intoxicaciones
La intoxicacin por organofosfricos (normalmente insecticidas utilizados en

Agricultura) produce una disminucin de la colinesterasa srica (tambin llamada seu-
docolinesterasa). Al tener esta enzima un centro activo con la trada cataltica serina-
histidina-asprtico es sensible a los organofosfricos (ver captulo 6).
306
(b) Enfermedades crnicas
Muchas enfermedades crnicas cursan con una actividad celular disminuida, lo

que se refleja en un descenso en determinadas actividades enzimticas del suero. Tal es el
caso, por ejemplo, de las aminotransferasas en la cirrosis heptica. Estas disminuciones
tienen poco valor diagnstico.
(c) Alteraciones del estado nutritivo
En ocasiones, un descenso en el aporte diettico (ayuno, por ejemplo) o un incre-

mento en las necesidades nutritivas del organismo (crecimiento, embarazo, etc.), causa
la disminucin de algunas actividades enzimticas. A veces esto es debido a una dismi-
nucin en la sntesis (por ejemplo, el descenso en -amilasa pancretica ante el ayuno) y
otras por carencia de coenzimas ante un aumento de necesidades (el caso de la disminu-
cin en las aminotransferasas en el embarazo por carencia de piridoxal).
10.1.3. Estudio de las principales enzimas con inters diagnstico
10.1.3.1. Aminotransferasas
Las aminotransferasas (antiguamente llamadas transaminasas) catalizan una reac-

cin fcilmente reversible de interconversin entre cetocidos y aminocidos. Son en-
zimas de una extraordinaria importancia metablica, puesto que representan un punto
central del metabolismo de aminocidos y de ah su amplia distribucin en todos los
tejidos y clulas. Utilizan como coenzima el piridoxal fosfato.
Las aminotransferasas que habitualmente se determinan en suero son dos: la as-

partato aminotransferasa (AST, antiguamente conocida como GOT, o glutamato-oxa-
lacetato transaminasa) y la alanina aminotransferasa (ALT, conocida igualmente como
GPT o glutamato-piruvato transaminasa). Las reacciones respectivas son las siguientes:
307
Las aminotransferasas son enzimas abundantes en todos los tejidos, pero lo son
particularmente en aquellos muy activos metablicamente, como el hgado y el msculo.
La AST est repartida indistintamente en los compartimentos citoslico y mitocondrial;
la ALT, por su parte, aparece casi exclusivamente en el citosol.
Los aumentos en actividad aminotransferasa del suero aparecen cuando hay altera-
ciones del parnquima heptico o de las clulas miocrdicas. En este sentido, suele haber
un aumento de AST en el infarto de miocardio y en menor medida, en las hepatitis. La
ALT, por su parte, se considera casi especfica de la clula heptica. Por ello es un exce-
lente marcador de lesin hepatocelular y su nivel no solo tiene valor diagnstico, sino
tambin como ndice de seguimiento de la evolucin de la enfermedad. No lo es tanto
la AST en el infarto de miocardio, puesto que su elevacin es bastante ms tarda que la
de otras enzimas, en especial la creatin kinasa (CK).
Se han descrito (aunque con mucho menos inters diagnstico) disminuciones en

la actividad de las aminotransferasas. Al ser enzimas dependientes de piridoxal fosfato,
en casos de alteracin del estado nutritivo (embarazo, malnutricin, alcoholismo, etc.) el
nivel srico de estas enzimas puede caer debido a falta relativa del cofactor.
308
10.1.3.2. Creatinkinasa
La creatin kinasa (CK, tambin llamada creatin fosfokinasa o CPK) cataliza la fos-
forilacin dependiente de ATP de la creatina para dar lugar a fosfocreatina, un fosfgeno
de alta energa utilizado como reservorio energtico sobre todo en el tejido muscular. La
reaccin catalizada es la siguiente:
Se trata de un dmero de dos polipptidos que pueden pertenecer a dos clases,

llamadas M y B (de muscle, msculo y brain, cerebro). As, las tres formas moleculares
(isoenzimas) de la creatin kinasa podrn ser MM, MB y BB. La forma BB predomina en
cerebro e hgado, y la forma MM en el msculo esqueltico. En el msculo miocrdico
existe la forma MM y la forma MB. Esta ltima es bastante caracterstica de este tejido.
En los infartos agudos de miocardio, el contenido de las clulas musculares muer-

tas pasa a la sangre y en esta se puede detectar la presencia de una actividad creatin kinasa
muy aumentada de manera muy precoz (se hace patente entre 2 y 4 horas, y alcanza un
mximo a las 24 horas). Adems, la presencia de la isoenzima MB (entre un 6 y un 25
% de la actividad CK total) es fuertemente indicativa de lesin miocrdica, y tiene asi-
mismo valor pronstico (la evolucin del infarto es tanto ms grave cuanto mayor sea la
actividad ligada a la isoenzima MB).
La isoenzima MM aparece asimismo en enfermedades que cursan con afectacin

de las clulas musculares esquelticas (miopatas, traumatismos), pero tiene menor valor
diagnstico que la isoenzima MB en el infarto miocrdico agudo.
309
10.1.3.3. Fosfatasa alcalina
La fosfatasa alcalina, aunque descrita habitualmente como una fosfomonoesterasa

de baja especificidad, es en realidad una enzima que cataliza transfosforilaciones entre un
dador y un aceptor. Cataliza la siguiente reaccin:
Cuando el aceptor es agua, la actividad evidenciada es una hidrlisis de un ster

fosfato. Esta enzima posee un ptimo de actividad a un pH alto (aproximadamente 10)
y de ah su nombre, a diferencia de la fosfatasa cida. Se trata de una enzima de muy am-
plia distribucin en la naturaleza, aunque su funcin exacta no es del todo clara. Existen
en el organismo humano varias isoenzimas de la misma, conocidas por el nombre de su
rgano de procedencia: heptica, sea, renal, intestinal y placentaria. Estas isoenzimas
pueden diferenciarse por electroforesis, por su sensibilidad al calor o por la inhibicin
ejercida por la fenilalanina.
Desde el punto de vista diagnstico tienen especial importancia las isoenzimas

heptica y sea. La isoenzima heptica (mejor la llamaramos hepatobiliar) es una enzima
ligada a las membranas de las clulas del rbol biliar, de las que se desprende caracte-
rsticamente en las colestasis u obstrucciones biliares. Por lo tanto, la fosfatasa alcalina
aparece aumentada en las ictericias obstructivas; y la elevacin de la misma en otras en-
fermedades hepticas (como hepatitis) indica el grado de afectacin del rbol biliar. La
isoenzima hepatobiliar de la fosfatasa alcalina es ms termorresistente que la isoenzima
sea. El calentamiento a 56 C provoca la inactivacin de la isoenzima heptica con un
semiperodo de unos 8 minutos, mientras que la isoenzima sea tiene un semiperodo de
menos de dos minutos.
La isoenzima sea aparece aumentada (a) de forma fisiolgica en los individuos

jvenes, por una actividad osteoblstica aumentada; y (b) en enfermedades del hueso que
cursan con neoformacin sea: enfermedad de Paget, metstasis seas de neoplasias, etc.
310
10.1.3.4. -Glutamil transferasa
La -glutamil transferasa (-GT, GGT, tambin llamada -glutamil transpepti-

dasa) es una enzima que cataliza la transferencia de restos de glutamilo desde un dador
(normalmente glutatin reducido) a un aceptor (normalmente otro aminocido).
-Glu-Cys-Gly + aa -Glu-aa + Cys-Gly
Esta enzima tiene un importante papel en el transporte de aminocidos a travs de

membranas. Por ello, al igual que la fosfatasa alcalina hepatobiliar, aparece unida a frac-
ciones de membrana, y en especial a las del rbol biliar, por lo que se presenta elevada, al
igual que aquella, en las colestasis, pero con la ventaja de ser bastante ms especfica ya
que no presenta isoenzimas.
La -glutamil transferasa es una enzima inducible, cuya sntesis se ve aumentada

en respuesta a xenobiticos (txicos externos) como el alcohol y otras drogas (barbitri-
cos, fenitona, antidepresivos tricclicos, clofibrato, gestgenos de sntesis, etc.).
10.1.3.5. -Amilasa
La -amilasa es una glicosidasa que hidroliza enlaces -1,4 situados en el interior

de las cadenas polisacridas de almidn y glucgeno. Se trata de una enzima de gran
importancia digestiva, ya que el almidn es uno de los principales contingentes de la
dieta, tanto animal como humana. La -amilasa est presente en la saliva y en el jugo
pancretico, dando lugar a dos formas moleculares distintas, S (de saliva) y P (de pn-
creas), distinguibles por electroforesis. En ambos casos, la -amilasa es una protena de
pequeo tamao, y por ello puede fcilmente pasar a la orina, donde es posible detectar
actividad amilsica (amilasuria) en enfermedades que cursan con incremento srico de
esta actividad.
De manera caracterstica, la -amilasa aumenta varios rdenes de magnitud en

las pancreatitis agudas, donde su presencia casi puede considerarse diagnstica de esta
afeccin. Asimismo, vemos aumentos de la amilasemia en la cetoacidosis diabtica, en el
alcoholismo y en la insuficiencia renal crnica.
311
Por el contrario, las afecciones crnicas del pncreas, como las pancreatitis crni-
cas y la fibrosis qustica del pncreas cursan con disminuciones de la amilasemia.
Algunas afecciones de las glndulas salivares cursan con aumentos de la isoenzima S.
10.1.3.6. Fosfatasa cida
La fosfatasa cida es una fosfomonoesterasa que cataliza la hidrlisis de fosfomo-

nosteres de la misma manera que la fosfatasa alcalina; pero, a diferencia de aquella, su
pH ptimo de actividad est del lado cido (pH 5-6). Esta enzima tiene una amplia
distribucin, ya que aparece tpicamente asociada a los lisosomas celulares. No obstante,
es muy abundante en hemates y, sobre todo, en la prstata, rgano del que esta enzima
puede considerarse como marcador especfico, dada la existencia de una isoenzima pros-
ttica.
Por ello, la fosfatasa cida aparece aumentada en las afecciones prostticas (prosta-
titis, adenomas y neoplasias malignas de prstata, etc.).
10.1.3.7. Lactato deshidrogenasa
La lactato deshidrogenasa (LDH) es una enzima de muy amplia distribucin; por

ello sus elevaciones son poco especficas de rgano. Cataliza la siguiente reaccin:
Esta enzima presenta un interesante patrn isoenzimtico. La molcula consta de

cuatro polipptidos que pueden pertenecer a dos tipos, H (de Heart, corazn) y M (de
Muscle, msculo), dando lugar a cinco isoenzimas diferentes llamadas LDH-1 (H4),
LDH-2 (H3M). LDH-3 (H2M2,) LDH-4 (HM3) y LDH-5 (M4), distribuidas de tal
312
manera que la LDH-1 predomina en el msculo cardiaco y la LDH-5 en el msculo

esqueltico, teniendo los dems rganos un patrn intermedio. Las isoenzimas pueden
ser separadas muy fcilmente por electroforesis.
La LDH-1 puede utilizar como substrato el cido 2-hidroxibutrico, adems del

cido lctico, por lo que esta isoenzima tambin recibe el nombre de hidroxibutirato
deshidrogenasa o HBDH.
Su valor diagnstico es relativo, y nicamente ayuda a corroborar los datos puestos

de manifiesto por otras enzimas ms especficas, como la CK.
10.2. Enzimas en Teraputica
La reposicin o incremento de una actividad metablica insuficiente puede ser, en

muchos casos, correctora de una determinada patologa o al menos coadyuvante. Por ello
se ha intentado el empleo de enzimas en la teraputica prcticamente desde su mismo
descubrimiento. Sin embargo el progreso en este campo ha sido bastante lento debido
a las peculiares caractersticas de las molculas enzimticas. En primer lugar, la enzima
que se pretende inyectar puede muy bien ser una protena extraa al organismo que la
recibe y, por lo tanto, antignica; dado el origen bacteriano o fngico de muchas de las
enzimas que hemos visto en el presente captulo, y sobre todo al producirse gran canti-
dad de enzimas por tecnologa de DNA recombinante, se puede suscitar en el receptor
una reaccin inmune que neutraliza la actividad de las mismas. Adems, un problema
central en la teraputica enzimtica es hacer llegar a la enzima all donde se necesita, lo
cual no siempre es posible. Otro inconveniente radica en la insuficiente purificacin de
algunas de las enzimas utilizadas. As, en el tratamiento de la hemofilia por factor VIII
purificado a partir de plasma humano, una trgica consecuencia fue la infeccin por
VIH (virus de inmunodeficiencia humana causante del SIDA) de una gran nmero de
hemoflicos. Por ltimo, las enzimas inyectadas a un organismo pierden rpidamente
actividad debido, entre otras cosas, a las actividades proteolticas de enzimas endgenas;
y en el caso de proteinasas, a las actividades antienzimticas de muchas protenas, y muy
abundantes, en el organismo (por ejemplo, la a1-antitripsina).
Por todo ello, la teraputica enzimtica ha avanzado ms lentamente que otras

aplicaciones tecnolgicas de las enzimas. Quiz una de las aplicaciones ms interesantes
estriba en las teraputicas sustitutivas, en las que se pretende suministrar un enzima para
paliar una actividad defectuosa o inexistente en el organismo. Pero aun as, el porvenir
313
no parece estar en la administracin de enzimas, sino en la reposicin de los genes encar-

gados de sintetizarlas, por tcnicas de ingeniera gentica que quedan fuera del contexto
de este resumen.
10.2.1. Teraputicas sustitutivas
La reposicin de actividades enzimticas deficientes es el objetivo bsico de las

teraputicas sustitutivas. En ellas se debe hacer una distincin clara consistente en si
las enzimas se dirigen al espacio extracelular o bien han de ir al interior de las clulas. En
el primer caso, contamos con algunas enfermedades en las que se han obtenido buenos
resultados. En el segundo, los problemas mencionados en el prrafo anterior se hacen
particularmente agudos y el resultado de estas teraputicas no est tan claro, sobre todo
por la dificultad de dirigir especficamente las enzimas hacia las clulas diana. En este
apartado veremos fundamentalmente este segundo caso.
Se conocen muchas enfermedades causadas por la deficiencia en determinadas

actividades enzimticas, lo que da lugar a los llamados errores congnitos del metabolis-
mo. Existen bsicamente dos clases de errores metablicos: errores anablicos, en los que
falta una enzima imprescindible para la sntesis de un determinado compuesto o proceso
(hemofilia, albinismo, hipotiroidismos congnitos, etc.) y catablicos, en los que la falta
de una enzima perteneciente a una va degradativa conduce a la acumulacin anmala de
determinados compuestos que en condiciones normales aparecen a concentraciones mu-
cho menores. En uno y otro caso se ha intentado la teraputica sustitutiva por enzimas.
La inyeccin sin ms de la enzima deficiente en el sistema vascular del sujeto no

tiene aplicacin ms que en muy contados casos (como la coagulacin de la sangre, v.
ms adelante), debido a los problemas inmunolgicos y proteolticos que vimos ms
arriba. En la mayora de los errores congnitos de metabolismo interesa llevar la enzima
deficiente a clulas muy especficas del organismo de tal manera que se sean invisibles
para el sistema inmunolgico o las proteinasas. De forma experimental se han ensayado
los siguientes sistemas:
1. Liposomas. Son vesculas mono- o multilamelares de fosfolpidos, de manera

que cada vescula est formada por una estructura en bicapa y que pueden estar conteni-
das unas en otras de manera concntrica.
314
Los liposomas pueden formarse en presencia de la enzima que queremos dirigir

hada las clulas afectadas. Una vez inyectados en el organismo, la bicapa del liposoma se
funde con la de la clula, liberando al interior de esta el contenido del mismo. El proble-
ma principal en el empleo de liposomas estriba en alcanzar las clulas especficas a las que
va dirigida la enzima. Una lnea muy prometedora en este sentido radica en el estudio
de los marcadores de superficie, oligosacridos complejos presentes como glicolpidos o
glicoprotenas en la superfde celular y que en muchos casos son especificos de la clula
objetivo. Intercalando en los liposomas ligandos complementarios de estos oligosacri-
dos (anticuerpos, lectinas, etc.) se puede conseguir la interaccin especfica de aquellos
con las clulas diana.
2. Hemates. Mediante maniobras osmticas, podemos hacer que la membrana

de los hemates se rompa y libere al medio todo el contenido celular. Aislando las clulas
vaciadas (que reciben el nombre de ghosts, espectros) pueden volver a sellarse en una
solucin que contenga la enzima que se pretende dirigir a una clula determinada. La
fusin de la membrana del hemate con estas clulas liberar su contenido al interior.
Como es obvio, en este caso pueden utilizarse tambin marcadores de superficie como
en el caso de los liposomas.
3. Enzimas inmovilizadas. En cepas de ratn acatalasmicas (que carecen de acti-

vidad catalasa y no destoxifican el H2O2) se ha intentado con cierto xito la inyeccin en
la cavidad peritoneal de microcpsulas conteniendo catalasa.
En cualquier caso, los avances en la manipulacin gentica permiten prever un

gran progreso en el tratamiento de estas enfermedades a travs de la reposicin del gen,
y no de la enzima, como ya sealbamos antes.
Cuando la reposicin ha de hacerse en un medio extracelular (como la luz del tu-

bosdigestivo, por ejemplo), muchos de los problemas asociados a la teraputica sustituti-
va desaparecen. Por ejemplo, en la insuficiencia pancretica se han empleado preparados
de enzimas digestivas en cpsulas entricas, particularmente amilasa, lipasa, tripsina y
quimotripsina. En estos casos se han empleado asimismo enzimas de procedencia vegetal
o fngica: papana, bromelana y extractos de Aspergillus oryzae (Taka-diastasa). Todas
estas preparaciones estn indicadas en la insuficiencia pancretica completa, y no en
trastornos digestivos menores.
315
10.2.2. Enzimas en Ciruga
Se han empleado enzimas proteolticas (plasmina bovina, tripsina y colagenasa)

para el desbridamiento de heridas, combinadas con antibiticos, en preparados de uso
tpico. Son particularmente tiles en la eliminacin del tejido necrtico en quemaduras,
asiento muy frecuente de infecciones.
10.2.3. Trastornos de la circulacin
El preparado AncrodR, es una preparacin proteoltica obtenida de veneno de ser-

piente. Su accin consiste en romper la molcula de fibringeno, pero de forma diferente
a como lo hace la trombina, con lo cual no queda en condiciones de polimerizacin. Con
ello mejora la reologa de la sangre. Como es obvio, sus efectos secundarios (hemorra-
gias) pueden llegar a ser graves.
En las enfermedades de las arterias perifricas se emplea kalicrena.
10.2.4. Trastornos de la coagulacin sangunea
La plasmina es una enzima que degrada proteolticamente la fibrina, en un pro-

ceso fisiolgico conocido como fibrinolisis o trombolisis. Se produce por activacin de
un zimgeno, el plasmingeno. Este sistema se utiliza en aquellos trastornos producidos
por una coagulacin intravascular, extraordinariamente frecuentes en Patologa huma-
na (infarto de miocardio, accidentes cerebrovasculares). Para la trombolisis se emplean
generalmente activadores del plasmingeno. Se trata de enzimas naturales con actividad
serinproteinasa. Los ms utilizados actualmente son la estreptokinasa, la urokinasa y el
activador tisular del plasmingeno (PTA) obtenido por ingeniera gentica.
La estreptokinasa es un activador del plasmingeno obtenido a partir de estrep-

tococos b-hemolticos. Activa el plasmingeno formando un complejo 1:1 que genera
plasmina a partir del plasmingeno residual. El principal inconveniente que plantea es
que se trata de un potente antgeno que genera anticuerpos muy rpidamente y su em-
pleo requiere por lo general pretratamiento con corticoides. Es efectivo en infartos de
miocardio antes de las tres primeras horas.
316
La urokinasa es un activador de plasmingeno obtenido a partir de orina huma-

na o de cultivos celulares. No presenta, como es obvio, los problemas antignicos de la
estreptokinasa. Hoy da se obtiene tambin mediante ingeniera gentica por clulas de
Escherichia coli recombinantes.
En ocasiones la teraputica ha de ir dirigida en sentido contrario, es decir, a pro-

mover la coagulacin de la sangre en tratamientos antihemorrgicos o en la teraputica
de enfermedades genticas de la coagulacin como la hemofilia. Para ello se utilizan
trombina y otros factores de la coagulacin producidos hoy da casi exclusivamente por
ingeniera gentica.
10.2.5. Enzimas en teraputica antineoplsica
En la quimioterapia de la leucemia lnfoctica se emplea L-asparraginasa. Esta

aplicacin se fundamenta en el hecho de que la L-asparragina es un aminocido esencial
para clulas tumorales de esta estirpe.
10.2.6. Otros usos teraputicos de enzimas
Hoy da se est intentado el tratamiento incruento de la hernia discal mediante la

digestin por quimopapana en inyeccin directa al ncleo pulposo de los discos inter-
vertebrales.
Tambin se ha utilizado experimentalmente a la superxido dismutasa como anti-

inflamatorio.
317
MANUALES UNIVERSITARIOS, 88

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1. Bioqumica. 2. Biologa molecular. 3. Biomolculas

Captulo 1 Las reacciones qumicas: criterios de espontaneidad y cintica................... 27

Captulo 2 Catlisis enzimtica: trminos, conceptos y caractersticas generales.......... 47

Captulo 3 Clasificacin y nomenclatura de las enzimas. Reacciones enzimticas........ 65

Captulo 4 Coenzimas o cofactores ............................................................................. 91

Captulo 5 Cintica de las reacciones enzimticas........................................................ 131

Captulo 6 Inhibicin enzimtica................................................................................ 163

Captulo 7 El Centro Activo enzimtico. Mecanismos de la accin enzimtica............ 195

Captulo 8 Regulacin de la actividad enzimtica, 1.................................................... 219

Captulo 9 Regulacin de la actividad enzimtica, 2. Modificacin covalente de las enzi-

Captulo 10 Enzimas en Medicina............................................................................... 303

Si algo distingue realmente a la Bioqumica del resto de las disciplinas qumicas,

No es de extraar, por tanto, que los espectaculares avances de la Bioqumica habi-

Y ya en la esfera puramente terica, el estudio de las reacciones enzimticas nos ha

En el momento actual quiz es posible que el trmino Enzimologa pueda sonar

El pensamiento yatroqumico que floreci a partir de Paracelso, en el s. xvi, es el

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Otro campo, el de las reacciones qumicas, se desarrollaba ampliamente por aquel

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J. L. Gay-Lussac (1778-1850) reconoci como productos el etanol y el CO2,

Los experimentos de Louis Pasteur (1822-1895) parecieron dar la razn entera-

...El acto qumico de la fermentacin es esencialmente un fenmeno correlativo a un

A consecuencia de este punto de vista, se estableci la distincin entre fermentos

En 1897 E. Bchner (1860-1917) dio con la clave final al preparar un extracto

Y por fin, Arthur Harden (1865-1940) utiliz el sistema de Bchner mediante

A partir de entonces, el desarrollo histrico de la Enzimologa se confunde con

A lo largo de esta obra, trataremos de presentar la Enzimologa de acuerdo con la

-- Pasamos a continuacin a una visin introductoria de la catlisis enzimtica. Para

-- En el captulo 3 se describen las reacciones enzimticas, con las normas vigentes de

-- Los dos captulos siguientes se refieren a la cintica de las reacciones enzimticas y a

chas circunstancias un estudio de los pasos individuales. La inhibicin, que se estudia

-- El siguiente captulo (7) trata de la estructura molecular de las enzimas. Se contempla

-- La regulacin de la actividad enzimtica, que se presenta en el siguiente captulo (8),

-- Se estudian a continuacin (captulo 10) algunos aspectos de la Enzimologa aplicada

Mencionamos a continuacin algunas referencias bibliogrficas y de Internet que

Barrow, G. M. Qumica Fsica, 3 ed. Ed. Revert, Barcelona, 1975.

Cornish-Bowden, A. Fundamentals of Enzyme Kinetics. Portland Press, London,1984.

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Nez de Castro, I. Enzimologa. Pirmide, Madrid, 2001.

Price, N. C. & Stevens, L. Fundamentals of Enzymology. Oxford University Press,

Prigogine, I & Stengers, I. La Nueva Alianza. Metamorfosis de la Ciencia. Alianza Edi-

Voet, D. & Voet J. G. Bioqumica. Panamericana, 2006.

LAS REACCIONES QUMICAS: CRITERIOS DE

Los organismos vivientes mantienen de forma constante y simultnea varios miles

1.1. En qu circunstancias tiene lugar espontneamente una reaccin?

La funcin bsica de toda ciencia natural es la prediccin de fenmenos, y los fe-

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