CORTE Y UNIN DE LAS MOLECULAS DE ADN

MOLECULAS DE ADN DE CORTE (CLEAR DE LA MOLECULA DE ADN)

A principios de los aos sesenta, no existan procedimientos disponibles para cortar el ADN en puntos especficos. Los mtodos
para fragmentar el ADN disponible no eran muy especficos. Las endonucleasas disponibles tenan poca especificidad de sitio y se
produjeron fragmentos muy pequeos de ADN mediante mtodos qumicos. Sin embargo, el corte mecnico fue el mtodo ms
comn de cortar el ADN. Las molculas de ADN dplex estn formadas por hilos largos y delgados que son bastante rgidos. Por
lo tanto, estos no se pueden romper fcilmente a travs de las fuerzas de corte en solucin. A travs de una sonicacin intensa con
ultrasonido, la longitud del ADN tambin puede reducirse a aproximadamente 300 pares de nucletidos. Se puede realizar un corte
ms controlado mediante agitacin a alta velocidad en una mezcladora. Al azar, la rotura se produce esencialmente con respecto a
la secuencia de ADN. Los terminales incluyen ADN de cadena corta que pueden tener que tenerse en cuenta en procedimientos de
unin adicionales.
Algunos aos despus, los bilogos de fagos explicaron las bases bioqumicas del fenmeno de restriccin y modificacin del
husped. La endonucleasa de restriccin de E. coli K12 fue aislada por Meselson y Yuan en el ao 1968. Esta endonucleasa corta
el ADN no modificado en grandes fragmentos especficos, y se razon que debe reconocer una secuencia diana. As, este fue el
comienzo de la bsqueda de la manipulacin controlada del ADN. Desafortunadamente, la endonucleasa K12 result ser perversa
en sus propiedades. La escisin se produce en un sitio 'aleatorio' a varios kilobases de distancia, mientras que la enzima se une a
una secuencia de reconocimiento diferente. El descubrimiento tan necesario finalmente lleg en 1970 con un descubrimiento en
Haemophilus influenzae de una enzima que se comporta de manera ms sencilla. Esto significa que la enzima reconoce una
secuencia diana particular en una molcula de ADN dplex, y para dar lugar a fragmentos especficos de longitud y secuencia
exactas, rompe la cadena polinucleotdica dentro de esa secuencia.
Restriction Endonucleases
Las enzimas que se utilizan para escindir molculas de ADN en lugares especficos se denominan endonucleasas de restriccin.
Recibieron sus nombres del fenmeno de restriccin y modificacin controlada por el anfitrin. Esto puede ocurrir cuando una
preparacin de bacterifagos crecida, usando una cepa bacteriana se utiliza para infectar una cepa diferente. Por ejemplo, los fagos
obtenidos usando la cepa C de E. coli infectarn la cepa K de E. coli muy ineficientemente. El crecimiento del fago obtenido de E.
coli C est restringido por E. coli K. La razn de esta restriccin del crecimiento de fago es que E. coli K produce endonucleasas,
que es por lo tanto denominada endonucleasa de restriccin. Corta el ADN en pedazos, de modo que el ADN del fago entrante se
descompone rpidamente y slo ocasionalmente escapa para producir la progenie del fago. El ADN husped debe estar protegido
contra la accin de la endonucleasa, y esto es alcanzado por una segunda enzima que modifica el ADN, por metilacin, que se une
a la secuencia de reconocimiento, no es atacada por la endonucleasa.
Restriccin y modificacin (R-M) Clasificacin del sistema
Cuatro tipos diferentes de sistemas RM son conocidos - tipo I, tipo II, tipo III y tipo II.
(a) Tipo I Una enzima con diferentes subunidades para la escisin de reconocimiento y la metilacin. Reconoce y metila
una sola secuencia pero corta el ADN hasta 1000 bp de distancia.
(b) Tipo II Dos enzimas diferentes que reconocen la misma secuencia diana, que es simtrica. Las dos enzimas cortan o
modifican la secuencia de reconocimiento.
(c) Tipo III Una enzima con dos subunidades diferentes, una para el reconocimiento y la modificacin y otra para el corte.
Reconoce y metila la misma secuencia pero escinde 24-26 pb.
(d) Tipo-lIs Dos enzimas diferentes, pero la secuencia de reconocimiento es asimtrica. La escisin se produce en un lado
de la secuencia de reconocimiento hasta 20 pb de distancia.
El sistema de tipo I fue el primero en ser sistematizado. El ejemplo ms conocido de esto es E. coli K12. La enzima activa tiene dos
subunidades de restriccin-dos subunidades de modificacin (metilacin) y una subunidad de reconocimiento. Estas subunidades
son los productos de los genes hsdR, hadM y hsdS. El ATP y la S-adenosilmetionina son ambos necesarios de las reacciones de
metilacin y corte como co-factor. Las secuencias de reconocimiento son bastante largas sin caractersticas reconocibles como
simetra. La enzima tambin corta ADN no modificado a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento. Sin embargo, el ADN
diana se puede modificar antes de que se escinde porque la reaccin de metilacin se realiza por la misma enzima que media la
escisin. Estas caractersticas sugieren que los sistemas de tipo I son de poco valor para la manipulacin de genes. Sin embargo, en
cepas de E. coli, su presencia puede efectuar la recuperacin de recombinantes. Las enzimas de tipo III tienen secuencias de
reconocimiento asimtricas, pero de otro modo se asemejan a sistemas de tipo I y son de poco valor.
La mayora de los sistemas R-M tiles son del tipo II. Tienen varios beneficios sobre los sistemas de tipo I y III. En primer lugar, la
restriccin y la modificacin se realizan por enzimas separadas, por lo que es posible escindir el ADN sin modificacin. En segundo
lugar, las actividades de restriccin no requieren cofactores como ATP o S-adenosilmetionina, hacindolos ms fciles de usar. Lo
ms importante de todo, las enzimas de tipo II reconocen una secuencia definida, usualmente simtrica y cortan dentro de ella. La
mayora de ellos tambin hacen una ruptura escalonada en el ADN. En el sistema tipo lIs, los cofactores y la estructura
macromolecular son similares a los de los sistemas de tipo II.
Especificidad
Mientras que la manipulacin de ADN, una gran cantidad de endonucleasas de restriccin de tipo II se presentan y tambin se
utilizan. En primer lugar, se identifican por el nombre del organismo del que se obtienen, utilizando la primera letra del gnero y
las dos primeras letras del nombre de la especie, acompaadas de un sufijo que indica la enzima especfica de esa especie. As, PstI
indica una enzima especfica obtenida de la bacteria prooidencia stuartii y Hael, Haell y HaeIII indica tres enzimas diferentes con
diferentes especificidades, de Haemophilus aegypticus. La convencin es escribir la primera parte de la cursiva, tal como se hace
con el nombre de la especie.
Nomenclatura
Para un sistema uniforme de nomenclatura, se necesita el descubrimiento de un gran nmero de restricciones y modificaciones.
Smith y Nathans (1973) propusieron un sistema adecuado cuya versin simplificada se utiliza hoy en da. Sus caractersticas
importantes son las siguientes:
(a) El nombre de la especie del organismo husped se identifica por la primera letra del nombre del gnero y las dos
primeras letras del epteto especfico para generar una abreviatura de tres letras. Esta abreviatura se escribe siempre en cursiva.
(b) Cuando una cepa particular ha sido la fuente, entonces esto se identifica.
(c) Cuando una cepa husped particular tiene varios sistemas R-M diferentes, stos se identifican por nmeros romanos.
Secuencias de reconocimiento
La mayora de las endonucleasas de restriccin de tipo II (pero no todas) reconocen y cortan ADN dentro de secuencias particulares
de cuatro a ocho nucletidos que poseen un eje de simetra de rotacin de dos haces. Estos tipos de secuencias, debido a su similitud
con palabras que leen lo mismo hacia atrs como hacia adelante, se llaman generalmente pallindromes. Por ejemplo, las enzimas de
restriccin y modificacin R.EcoRI y M.EcoRI reconocen la secuencia:

Eje de simetria

El smbolo '/' determina la posicin en la que, los cortes de la enzima de restriccin y los nucletidos metilados por la enzima de
modificacin se marcan generalmente con un asterisco. Para EcoRI se mostraran como:

Es una prctica habitual por comodidad simplificar la descripcin de las secuencias de reconocimiento mostrando slo una hebra
de ADN, la que se extiende en la direccin 5 'a 3'. Por lo tanto, la secuencia de reconocimiento de EcoRI se mostrara como G / AA
TTC. A partir de la informacin anterior, se puede observar que EcoRI hace que las divisiones monocatenarias se separen cuatro
bases en las cadenas opuestas de su secuencia diana. De este modo, se generan fragmentos con terminales 5 'prominentes.

Entre los extremos 5 'superpuestos, estos fragmentos de ADN pueden estar asociados por unin de hidrgeno, o los fragmentos
pueden circularizarse por reaccin intramolecular.

No todas las enzimas de tipo II escinden sus sitios diana como EcoRI. Algunos, como PstI (CTGCA / G), producen fragmentos con
3 'sobresalientes, mientras que otros, como SmaI (CCC / GGG), producen extremos romos o enrasados.
Isosquizmeros
A partir de la existencia de varias enzimas que reconocen la misma secuencia de bases, surge un elemento adicional de flexibilidad.
Estos se llaman isoschizomers (griego iso, igual, skhizo, para dividir). En la mayora de los casos, los isosquizmeros no slo tienen
el mismo sitio de reconocimiento, sino que se cortan en el mismo lugar dentro de esa secuencia de reconocimiento. Aunque esto
puede ser de alguna utilidad, por razones tcnicas, no necesitamos entrar en detalles, ms importantes son los ejemplos de
isosquizmeros que reconocen la misma secuencia pero se cortan en una posicin diferente dentro de esa secuencia. Por ejemplo,
Acc65I y Kpnl reconocen la secuencia GGT ACC, pero la cortan en un lugar diferente. Por lo tanto, pueden generar diferentes
extremos pegajosos. Esto le da la opcin de obtener virtualmente el mismo fragmento de ADN pero con diferentes extremos
pegajosos que pueden ser ligados a otros fragmentos. Otro ejemplo es el par de isosquizmeros. XmaI y SmaI. XmaI corta
asimtricamente y produce extremos pegajosos que pueden ser ligados a otros fragmentos XmaI, mientras que SmaI, como se
mencion anteriormente, generar fragmentos de extremos romos en el mismo sitio, permitiendo ligar el fragmento a otras
secuencias de ADN de extremos romos.
Nmero y tamao de los fragmentos de restriccin

El nmero y tamao de los fragmentos producidos por una enzima de restriccin dependen de la frecuencia de aparicin del sitio
diana en el ADN a escindir. Suponiendo que una molcula de ADN con un contenido de 50% de G + C y una distribucin aleatoria
de las cuatro bases, un sitio de reconocimiento de cuatro bases se produce cada 44 (256) pb. De forma similar, se produce un sitio
de reconocimiento de seis bases cada 46 (4096) pb y una secuencia de reconocimiento de ocho bases cada 48 (65.536) pb. En la
prctica, no existe una distribucin aleatoria de las cuatro bases y muchos organismos pueden ser ricos en AT o GC, p. el genoma
nuclear de los mamferos es 40% G + C y el dinucletido CG es cinco veces menos comn de lo esperado estadsticamente. De
forma similar, CCG y CGG son los trinucletidos ms raros en la mayora de los genomas bacterianos ricos en A + T y CTAG es
el tetranucletido ms raro en genomas bacterianos ricos en G + C. Por tanto, diferentes endonucleasas de restriccin con sitios de
reconocimiento de seis bases pueden generar tamaos de fragmentos medios significativamente diferentes de los 4096 pb esperados.

Hay algunos sitios en la misma molcula de ADN donde ciertas endonucleasas de restriccin muestran escisin preferencial. Por
ejemplo, el ADN del fago J tiene cinco sitios para EcoRI, pero los diferentes sitios se escinden de forma no aleatoria. El sitio ms
cercano al extremo derecho es escindido 10 veces ms rpido que los sitios en el centro de la molcula. Existen cuatro sitios para
SacII en J .. ADN, pero los tres sitios en el centro de la molcula se escinden 50 veces ms rpido que el sitio restante. Hay un grupo
de tres enzimas de restriccin que muestran una preferencia de sitio an ms dramtica. Estos son NarI, NaeI y SacII y requieren la
interaccin simultnea con dos copias de su secuencia de reconocimiento antes de que escindan el ADN. De este modo, Narl
escindir rpidamente dos de los cuatro sitios de reconocimiento en el ADN del plsmido pBR322, pero rara vez escindir los dos
sitios restantes.
Variaciones en el corte y unin de molculas de ADN
Para unir dos fragmentos de ADN juntos, no es necesario que se produzcan por la misma endonucleasa de restriccin. Existen varios
extremos cohesivos compatibles que son producidos por muchas endonucleasas de restriccin diferentes. Por ejemplo, Agel (AI
CCGGn y Aval (C / CCGGG) producen molculas con salientes 5 'idnticos y por lo tanto se pueden unir entre s.Lo que es ms, si
los extremos cohesivos fueran producidos por cortadores de seis bases, los productos de ligadura a menudo son recarregables Por
ejemplo, en el ejemplo citado anteriormente, el sitio hbrido ACCGGG puede ser escindido por Hpall (C / CGG), Ncil (CC / GGG)
o ScrFI (CC / NGG), llenando los salientes generados por endonucleasas de restriccin y unin de los productos en conjunto, se
pueden producir nuevos sitios de restriccin.Despus de llenar los extremos cohesivos producidos por EcoRI, la ligacin produce
sitios de restriccin reconocidos por otras cuatro enzimas.Existen varios ejemplos conocidos de creacin de nuevos sitios diana
mediante relleno y ligadura.
Tambin hay muchos ejemplos de combinaciones de endonucleasas de restriccin de extremos romos que producen productos de
ligacin recerrables. Por ejemplo, cuando las molculas generadas por la escisin con Alul (AG / Cn se unen a las producidas por
EcoRV (GAT I ATC), algunos de los sitios de ligacin tendrn la secuencia GATCT y otros tendrn la secuencia AGATC. Mbol
(GATC) Una metiltransferasa, M.SssI, que metila el dinucletido CpG se ha separado de Spiroplasma.Esta enzima se puede utilizar
para modificar in vitro sitios de destino de endonucleasa de restriccin que contienen la secuencia CG.Algunas de las secuencias
diana modificado a travs de este En el ADN genmico de muchos animales, incluidos los vertebrados y los equinodermos, el 90%
de los grupos metilo se producen como 5-metilcitosina en la secuencia CG. El M.Sss puede utilizarse para imprimir el ADN de otras
fuentes con un patrn de vertebrados.
Dam y Dcm Metilasas de E. coli
En la mayora de las cepas de laboratorio de E. coli, estn presentes tres metilas de ADN especficas del sitio. La metilasa codificada
por el gen dam transfiere un grupo metilo de S adenosilmetionina a la posicin N6 del residuo de adenina en la secuencia GATC.
La metilasa codificada por el gen dcm (la Dcm metilasa, anteriormente denominada Mec metilasa) modifica los residuos de citosina
internos en las secuencias CCAGG y CCTGG en la posicin C5. En el ADN en el que el contenido de GC es del 50%, los sitios
para estas dos metilasas aparecen, en promedio, cada 256 - 512 pb. La enzima M.EcoKI es la tercera metilasa, pero los sitios para
esta enzima son mucho ms raros y ocurren aproximadamente una vez cada 8 kb. Debido a dos razones principales, estas enzimas
son de gran importancia. En primer lugar, algunos o todos los sitios para una endonucleasa de restriccin pueden ser resistentes a la
escisin cuando se aslan de cepas que expresan las metilas Dcm o Dam. Esto se produce slo cuando se metila una base particular
en el sitio de reconocimiento de una endonucleasa de restriccin. La base relevante puede ser metilada por una de las metilasas de
E. coli si el sitio de reconocimiento de metilasa se superpone al sitio de reconocimiento de endonucleasa. Por ejemplo, el ADN
separado de Dam + E. coli es completamente resistente a la escisin por MboI, pero no Sau3AI, los cuales identificaron la secuencia
GATC. De la misma manera, el ADN de una cepa Dcm + ser cortado por BstNI pero no por EcoRII, aunque ambos reconocen la
secuencia CCATGG. Es de INorth notar que la mayora de las cepas de clonacin de E. coli son Dam + Dcm +, pero los mutantes
dobles estn disponibles.
La segunda razn por la que estas metilasas son importantes es que el estado de modificacin del ADN plasmdico puede afectar la
frecuencia de transformacin en situaciones especiales. Cuando el ADN del plsmido modificado con la barrera se introduce en
Dam-E. coli o se introduce ADN modificado con Dam o Dcm en otras especies, la precisin de la transformacin disminuye. Lo
mejor es utilizar una cepa que carezca de las metilas Dam y Dcm siempre que el ADN se traslade de E. coli a otra especie. Como
se ver ms adelante, es difcil obtener un ADN de clon estable que contenga secuencias recurrentes cortas y directas. La delecin
de las unidades recurrentes se produce rpidamente, incluso cuando la cepa husped es deficiente en recombinacin. Sin embargo,
parece que la metilacin de la presa incluye el mecanismo de delecin, ya que no ocurre en dam mutantes.
Importancia de la eliminacin de sistemas de restriccin en cepas de E. coli usadas como huspedes para
Molculas Recombinantes
Si se introduce ADN extrao en un husped de E. coli, puede ser atacado por sistemas de restriccin activos en la clula husped.
En estos sistemas, una caracterstica importante es que el destino del ADN entrante en el husped restrictivo depende no slo de la
secuencia del ADN, sino tambin de su historia: la secuencia de ADN podra o no estar restringida, dependiendo de su fuente
inmediatamente antes de transformar la cepa husped de E. coli. Las modificaciones post-replicacin del ADN estn usualmente en
la forma de metilacin de residuos de adenina o citosina particulares en la secuencia diana. Esto proporciona proteccin contra
sistemas de restriccin afines, pero no, en general, contra diferentes sistemas de restriccin. Es bastante normal utilizar una cepa
K12 de E. coli de deficiencia de restriccin K como husped en transformacin con molculas recombinantes recin formadas
porque la restriccin proporciona una defensa natural contra la invasin por ADN extrao. Por ejemplo, cuando, por ejemplo, el
ADN de mamfero se ha ligado a un vector plasmdico, la transformacin del husped deficitario en restriccin EcoK elimina la
posibilidad de que la secuencia entrante est restringida, incluso si la secuencia de mamfero contiene un sitio diana EcoK no
modificado. Si el husped pasa a ser EcoK restriccin deficiente, pero EcoK modificacin-proficiente, la propagacin en el husped
conferir metilacin de modificacin. De este modo, si se desea, se permite la propagacin subsiguiente del recombinante en cepas
EcoK restringidas.
Mientras que el sistema de restriccin EcoKI, codificado por los genes hsdRMS, corta el ADN que no est protegido por metilacin
en el sitio diana, el McrA. Las endonucleasas McrBC y Mrr cortaron el ADN que se metil en posiciones especficas. Las tres
endonucleasas restringen el ADN modificado por CpC metilasa (M.SssJ) y la endonucleasa Mrr atacar ADN con metiladentina en
secuencias especficas. La importancia de estas enzimas de restriccin es que el ADN de muchas bacterias, y de todas las plantas y
animales superiores, est ampliamente metilado. En experimentos de clonacin, su recuperacin se reducir considerablemente si
la actividad de restriccin no se elimina. No hay ningn problema con el ADN de Saccharomyces cereulsiae o Drosophila
melanogaster ya que hay poca metilacin de su ADN.
En E. coli, todos los sistemas de restriccin se agrupan en una regin de control de inmigracin de aproximadamente 14 kb de
longitud. Algunas cepas llevan mutaciones en uno de los genes. Por ejemplo, las cepas DH1 y DH5 tienen una mutacin en el gen
hsdR y por lo tanto son defectuosas para la endonucleasa EeoKI pero todava median la modificacin de EeoKI de ADN. La cepa
DP50 tiene una mutacin en el gen hsdS y, por tanto, carece tanto de la restriccin de EeoKi como de las actividades de modificacin.
Otras cepas, como E. coli C y la cepa de clonacin ampliamente utilizada HB101, consisten en una delecin de toda la regin merC
- mrr y, por lo tanto, carecen de todas las actividades de restriccin.
Importancia de la calidad enzimtica
Existen varias fuentes de mercado diferentes a partir de las cuales se pueden obtener enzimas de restriccin. Al seleccionar una
fuente de enzima, es importante considerar la calidad de la enzima suministrada. Las enzimas de alta calidad se purifican
ampliamente para eliminar las exonucleasas y endonucleasas contaminantes y las pruebas para la ausencia de tales contaminantes
forman parte del control de calidad rutinario (QC) sobre el producto terminado. La ausencia de exonucleasas es particularmente
importante. Esta presencia puede mordiscar los salientes de extremos cohesivos, eliminando o disminuyendo de este modo la
produccin de recombinantes posteriores. Las fosfatasas contaminantes pueden eliminar los residuos fosfato terminales, evitando
as la ligadura. El producto resultante puede contener pequeas deleciones, incluso cuando se logra la ligadura de subsegmento. Un
procedimiento tpico de control de calidad es el siguiente. A travs de una sobredigestin excesiva de ADN de sustrato con cada
endonucleasa de restriccin se forman fragmentos de ADN. Estos fragmentos se ligan luego y se recubren con la misma
endonucleasa de restriccin. La ligadura puede ocurrir solamente si los terminales 3 'y 5' se dejan intactos, y solamente las molculas
con un sitio de reconocimiento perfectamente restaurado pueden ser recleaved. Despus de la escisin, la aparicin de un patrn de
bandas normal indica que ambos terminales 3 'y 5' estn intactos y la preparacin enzimtica est libre de exonucleasas y fosfatasas
detectables. El ensayo de deteccin azul / blanco es un ensayo de control de calidad adicional. El material bsico en este caso es un
plsmido que lleva el gen laeZ de E. coli en el que hay un nico sitio de reconocimiento para la enzima sometida a ensayo. Con la
ayuda de la enzima de restriccin, el plsmido se sobre-digiere, se religa y se transforma en una cepa lacZ- de E. colt. Los
transformantes se sembraron en placas sobre medio que contena el sustrato Xgal de \ beta - galactosidasa. Si el gen IaeZ permanece
intacto despus de la digestin y la ligadura, dar lugar a una colonia azul. Se producir una colonia blanca si aparece alguna
degradacin de los extremos cortados.
LIGACION
En la clonacin gnica, el siguiente paso es unir el fragmento de ADN a una molcula vectorial, como plsmido o bacterifago, que
puede ser replicada por la clula husped tras la transformacin. Hay una enzima llamada DNA ligase, que facilita la unin o
ligadura de fragmentos de ADN. Para reparar las rupturas monocatenarias en el esqueleto de fosfato de azcar de una molcula de
ADN de doble hebra es el papel natural de la ADN ligasa. Por ejemplo, puede ocurrir a travs del dao al ADN (o despus de la
reparacin de dicho dao), as como la unin de los fragmentos cortos formados como resultado de la replicacin de la "cadena
retardada" durante la replicacin del ADN. La accin de la ligasa requiere que la rotura exponga un grupo 3'-OH y un 5'-fosfato. La
digestin con endonucleasas de restriccin corta el ADN de esta manera, es decir, "deja el fosfato en la posicin 5 'de la
desoxirribosa. El apareamiento inestable de dos fragmentos de restriccin con extremos pegajosos compatibles puede por lo tanto
ser considerado como una molcula de ADN de doble hebra con una muesca en cada hebra, muy juntas, por lo tanto, sirve como un
sustrato para la accin de la ADN ligasa.
Algunas ligas de ADN, como la ligasa de ADN de T4 (codificada por el bacterifago T4), son tambin capaces de ligar fragmentos
de extremos romos, pero mucho menos eficientemente, mientras que otras (notablemente la ADN ligasa de E. coli) no lo son;
requieren el emparejamiento de extremos solapados. Con el fin de mantener las cosas simples, slo se considera la accin de T4
ADN ligasa, que es de lejos el ms extenSively utilizado. Nos referiremos a esta enzima como ligasa de T4 (o simplemente ligasa)
aunque tambin hay mucho menos comnmente utilizada T4 ARN ligasa.
Se necesita ATP como co-sustrato para la ligasa T4. En el primer paso, la ligasa reacciona con ATP para formar un complejo
enzima-AMP covalente. Esto, a su vez, reacciona con el 5'-fosfato en un lado de la muesca, transfiriendo la AMP al grupo de fosfato.
En la etapa final, el grupo 3'-OH ataca y conduce a la formacin de un nuevo enlace fosfodister covalente (restableciendo as la
integridad del esqueleto azcar-fosfato) y liberando AMP. Para el 5'-fosfato, el requisito absoluto es extremadamente importante;
eliminando el 5'-fosfato. Por lo tanto, se puede prevenir la aparicin de ligacin no deseada.
Condiciones ptimas para la ligadura
En el proceso de clonacin, la ligadura puede ser una de las etapas ms impredecibles. Los factores que pueden comprometer el
xito de la ligacin incluyen la presencia de material inhibidor que contamina las preparaciones de ADN y la degradacin de la
enzima o del ADN. Adems, las condiciones deben ser ajustadas correctamente para lograr el efecto ptimo. Entre estas condiciones,
la temperatura es la ms controvertida. Originalmente, se pens que puesto que la ligadura era en efecto una reparacin de mechas
de una sola cadena. En una molcula de doble hebra, deberamos optimizar el emparejamiento de los fragmentos. Por lo tanto, gran
parte de los primeros trabajos utilizaron la ligadura a 10 C (o incluso 4 C), que necesita una larga incubacin ya que la actividad
enzimtica es baja a esa temperatura. Muchos protocolos ahora recomiendan 16 C, pero esto es inconveniente a menos que tenga
un bao de agua enfriado a mano. La temperatura ambiente se utiliza a menudo como un compromiso. De acuerdo con los avances
tcnicos, los tampones estn ahora disponibles comercialmente que permiten ligaduras mucho ms rpidas y eficientes.
Puesto que la reaccin esperada normalmente implica dos molculas diferentes de ADN (ligadura intermolecular), sera
extremadamente sensible a la concentracin de ADN. Por lo tanto, es importante utilizar altas concentraciones de ADN; pero qu
componente de ADN?
Hay dos componentes: el vector y el inserto. Por lo tanto, hay una serie de posibles reacciones que pueden ocurrir. Por lo tanto, la
probabilidad de estas diferentes reacciones puede ser fcilmente influenciada simplemente ajustando la cantidad relativa de los
componentes, as como la concentracin global de ADN.
Es ms probable obtener los dos extremos de la misma molcula unindose (una reaccin intra molecular), a baja concentracin de
ADN. Dado que la velocidad de una reaccin que implica un componente estar linealmente relacionada con su concentracin, una
reaccin que involucre dos componentes diferentes ser proporcional al producto de las dos concentraciones. Es fcil obtener un
aumento mayor en la unin de dos molculas de vector juntas (que no queremos) que en la produccin del producto de insercin
vectorial recombinante si aumentamos la concentracin del vector, pero no el inserto. Por el contrario, el aumento de la
concentracin de inserto dar mayores niveles de dmeros de inserto-inserto (que tambin no queremos, aunque son menos
problemticos ya que no darn lugar a transformantes).
Por lo tanto, no slo es importante mantener la concentracin global de ADN elevada, sino que tambin es deseable la creacin de
una relacin vector-inserto ptima. Es difcil predecir con certeza cul debera ser esa proporcin, pero normalmente variara de 3:
1 a 1: 3. Obsrvese que estas son relaciones molares y tienen que tener en cuenta el tamao relativo del vector y el inserto. Por
ejemplo, si el vector es de 5 kb y el inserto es de 500 bases, entonces una proporcin molar de 1: 1 implicara 10 veces ms vector,
en peso, como inserto (por ejemplo, 500 ng de vector y 50 ng de inserto). Por el contrario, para el mismo vector de 5 kb pero con
un tamao de inserto de 50 kb, si us 500 ng de vector, necesitara 5 g de inserto para conseguir una relacin molar de 1: 1. En
general, para convertir la cantidad de ADN en peso en un valor que se puede usar para calcular la relacin molar, se divide la
cantidad utilizada (en peso) por el tamao del ADN. As, si Wv y WI son los pesos utilizados del vector y el inserto de ADN
respectivamente, y Sv, Sl son los tamaos de vector e inserto (por ejemplo, en kilobases), entonces la relacin vector: inserto es Wv
/ Sv: Wl / Sl.
Una complicacin adicional surge si el trabajo est procediendo con una coleccin heterognea de posibles fragmentos de inserto,
como sera el caso si estuviramos haciendo una genoteca. Poner ms ADN inserto en la mezcla de ligacin aumentar la posibilidad
de obtener mltiples insertos. En otras palabras, podemos producir plsmidos recombinantes que transportan dos o ms fragmentos
de ADN completamente diferentes. Esta no es una buena idea. Si llegamos a caracterizar los clones en la biblioteca y tratar de
relacionarlos con la estructura del genoma de nuestro organismo de partida, puede conducir a resultados seriamente engaosos.
Por tanto, el ajuste de la cantidad relativa del vector y del inserto no slo influir en el xito de la ligadura, sino que tambin tendr
un efecto sobre la naturaleza de los productos formados. La ligacin intramolecular de molculas de vectores, o la formacin de
dmeros vectoriales, dar como resultado transformantes que no llevan nuestro inserto, mientras que la insercin en demasiada
insercin dar como resultado dmeros de inserto (que no darn transformantes) o plsmidos recombinantes que lleven insertos
mltiples. Afortunadamente, para obtener los resultados deseados, no necesitamos depender enteramente del ajuste de los niveles
de ADN.
Fosfatasa alcalina
El proceso de ligacin depende absolutamente de la presencia de un 5 '-fosfato en el sitio de corte. Es imposible ligar el sitio sin la
eliminacin de este grupo fosfato. La eliminacin de los grupos 5 '-fosfato se realiza con una enzima conocida como fosfatasa
alcalina (debido a su pH ptimo) - la enzima ms comnmente utilizada es la fosfatasa intestinal de ternera (CIP). Antes de la
ligadura, el tratamiento de la molcula del vector con CIP eliminar los 5 '-fosfatos, y por lo tanto hace imposible la autoligacin
del vector. Sin embargo, la ligadura del vector al inserto puede ocurrir, ya que el inserto an tiene sus 5 '- fosfatos. Por supuesto, es
importante eliminar el CIP antes de la ligadura, y esto es mejor hacer. por extraccin con fenol y posterior precipitacin con etanol
como inactivacin por calor no es suficientemente fiable. Si se utiliza el mismo vector una y otra vez, es posible llevarlo a cabo a
mayor escala y almacenar el vector tratado no utilizado para experimentos adicionales. Esto es deseable ya que el tratamiento con
CIP no es totalmente confiable, y una preparacin masiva de vector desfosforilado que ya ha utilizado con xito es un activo
considerable en experimentos subsiguientes. Si se utiliza un vector estndar, se puede comprar un vector desfosforilado preparado
y probado.
Sin embargo, una mayor inspeccin de la situacin demostrar que no es tan simple. Hay dos cortes presentes en cada funcin entre
los dos fragmentos de ADN. Estos cortes requieren reparacin. En uno de estos, el 5 '- fosfato es suministrado por el inserto, y que
se puede ligar normalmente. Sin embargo, en el otro nick, debe haber un 5 'fosfato en el vector, y que se ha eliminado. As que el
segundo nick no puede ser reparado.
En realidad no es un problema real. En su ADN, el plsmido recombinante tendr muescas no reparadas, es decir, una en cada
extremo del fragmento insertado. Pero en virtud del emparejamiento de bases a lo largo del fragmento de ADN insertado, se
mantendr unido de manera muy estable. As que tenemos cientos o miles de pares de bases que sostienen los dos hilos juntos. Se
mantendr estable a 37 C, como una molcula de doble hebra.
Cuando esta molcula cortada es introducida en una clula bacteriana por transformacin, las enzimas dentro de la clula repararn
rpidamente los cortes restantes, aadiendo los fosfatos faltantes y ligando los extremos rotos. Sin ninguna dificultad, el plsmido
se replicar. Potencialmente, algunos de los otros problemas persisten. Habr an dmeros de inserto, o insertos mltiples. Sin
embargo, puesto que ya no tenemos que preocuparnos por la autoligacin del vector, podemos aumentar la concentracin del vector
con respecto al inserto y as impulsar la reaccin en la direccin que deseamos.
Aun as, si estamos haciendo una biblioteca de genes, cuando la posibilidad de mltiples inserciones es en su ms grave como un
problema, es posible que desee tum esta estrategia para nuestro beneficio. El tratamiento con fosfatasa del inserto en lugar del vector
evitar mltiples inserciones y utilizando vectores especiales que son inestables para producir clones a menos que porten un
fragmento de ADN insertado, la aparicin de transformantes no recombinantes (que transportan vector autoligado en lugar de vector-
insertar recombinantes) no se pueden prevenir.
Doble digesto
Si es posible, debemos tratar de evitar el uso de fosfatasa alcalina. El tratamiento se excreta fcilmente, no slo eliminando el grupo
de fosfato, sino modificando y desactivando el extremo pegajoso. Adems, la extraccin de fenol requerida y la precipitacin con
etanol son procesos largos y tambin pueden dar lugar a prdida o dao del ADN. Si simplemente se intenta hacer un plsmido
recombinante especfico, y tiene formas eficientes de diferenciar los vectores auto-ligados, no es esencial una ligacin perfectamente
ptima. Slo un clon se requiere finalmente, y mientras pueda ser identificado sin arrastrar a travs de cientos de otros, ser
contenido.
Sin embargo, hay situaciones en las que es necesario asegurar que una alta proporcin de las colonias obtenidas sean recombinantes
genuinos. Por ejemplo, si se intenta crear una biblioteca de ADN representativa, los vectores autoligados y las inserciones mltiples
son un problema real. Incluso simples ligaduras binarias pueden ser a veces problemticas, en particular si sucede hacer una ligadura
donde no hay una manera fcil de diferenciar rpidamente los plsmidos recombinantes de los vectores auto-ligados. Si es esencial
evitar el uso de fosfatasa alcalina, un mtodo alternativo para evitar la autoligacin del vector y del inserto es cortar ambos
componentes con dos enzimas de restriccin diferentes. La mayora de los vectores modernos tienen mltiples sitios de clonacin
para que podamos cortar el vector con, por ejemplo, EcoRI y BamHI. Siempre que ambas enzimas hayan cortado eficientemente (y
que hayamos eliminado el pequeo fragmento entre los dos sitios), entonces la ligadura del vector ser imposible. Si nuestro
fragmento de inserto ha sido digerido con las mismas dos enzimas, entonces prcticamente todas las colonias obtenidas sern
recombinantes, es decir, contendrn el fragmento de inserto. Todava en la actualidad, hay algunas otras posibles reacciones como
la ligadura de las dos molculas de vectores juntos. Pero, comparativamente, estos tipos de eventos ocurren rara vez. Con la digestin
doble, hay dos tipos de problemas. El primero es encontrar condiciones ptimas que permitan que ambas enzimas funcionen. Los
catlogos de los proveedores contienen a menudo tablas de tampones recomendados para una variedad de combinaciones de enzimas
de restriccin. Las enzimas que requieren temperaturas muy diferentes son ms difciles, y puede que tenga que usar las enzimas
una tras otra. Si los dos sitios estn juntos, entonces aparece el segundo problema. Algunas enzimas de restriccin no cortan muy
eficientemente en un sitio de reconocimiento que est cerca del extremo de una molcula de ADN.
MODIFICACIN DE LOS RESTRICCIONES DE FRAGMENTO
Los fragmentos de restriccin con extremos pegajosos son tiles ya que pueden ligarse fcilmente. Sin embargo, en su utilidad, hay
una limitacin, ya que slo pueden ser ligados a otro fragmento con fines compatibles. Sq un fragmento EeaRJ puede ligarse a otro
fragmento EeaRI, pero no a uno generado por BamHI. No slo perdemos la ventaja de los extremos cohesivos, sino que el ADN no
apareado se interpone en el camino, hacindonos mejores con fragmentos de extremos romos. Este es un problema potencial, ya
que los vectores que estamos usando slo tendrn un nmero limitado de posibles sitios en los que podemos insertar el ADN (y
podemos especficamente querer poner nuestro inserto en una posicin particular), y puede que no sea posible para producir un
inserto adecuado con la misma enzima. En esta seccin, vamos a ver las maneras en que los extremos de un fragmento de ADN
podra ser modificado para permitir que se ligated con otros sitios.
Recorte y relleno
Conversin de los extremos pegajosos en extremos romos, ya sea rellenando la hebra complementaria o recortando la secuencia no
apareada, es la nica estrategia que permite un uso ms flexible de fragmentos de restriccin. Si el fragmento de restriccin tiene
un saliente 5 '(tal como los generados por EcoRn, el grupo 3' OH proporciona un sitio de cebador que puede extenderse por ADN
polimerasas, llenando as el extremo rebajado y convirtindolo en doble hilado.Sin embargo, algunas ADN polimerasas (tales como
la ADN polimerasa I de E. coli) tambin tienen actividad exonucleasa 5'-3 ', que eliminara el saliente 5' (y puede ser ms), estas
enzimas no son adecuadas para llenar los extremos, para este propsito, usara una enzima que carezca de esta actividad exonucleasa
5'-3 'tal como el fragmento Klenow de ADN polimerasa I de E. coli (un producto proteoltico de ADN polimerasa I de E. coli en el
que la regin responsable de la 5' Los fragmentos de restriccin con extremos pegajosos 3 ', tales como los producidos por PstI, no
se pueden rellenar, pero las secuencias no apareadas se pueden recortar, usando la actividad exonucleasa 3' - 5 'de una actividad
exonucleasa 3' enzima tal como ADN polimerasa T4.
Enlaces y adaptadores
Ambos procedimientos, que se completan o se recortan, dan como resultado la conversin de los extremos que pueden ser ligados
a cualquier otro fragmento de extremos romos, sin embargo producido. Esto es un comienzo, pero todava es un poco corto de la
versatilidad completa que es nuestra meta, especialmente como ligadura de extremo romo es tan ineficiente, y requiere una
concentracin mucho mayor de ADN (que puede ser difcil de encontrar). Mediante el uso de enlazadores, este proceso puede
hacerse mucho ms eficiente y mucho ms verstil. Se trata de trozos sintticos cortos de ADN que contienen un sitio de restriccin.
Por ejemplo, la secuencia CCGGATCCGG contiene el sitio BamHI (GGATCC). Adems, es auto complementario, por lo que slo
necesita sintetizar (o comprar) una hebra; dos molculas de ella se hibridan para producir un fragmento de ADN de doble hebra de
10 pares de bases de largo. Si esto se une a un fragmento de insercin potencial de extremos romos mediante ligadura de extremos
romos, su fragmento ahora tendr un sitio BamHI cerca de cada uno: "end.
BamHI generar un fragmento con extremos pegajosos BamHI, que se pueden ligar con un vector cortado con BamHI. Si su
insercin ya tiene un sitio BamHI interno, esto no es posible. La alternativa es utilizar adaptadores en lugar de enlazadores. Puede
objetar el hecho de que para unir el enlazador al inserto potencial, esto todava requiere una ligadura de extremos romos. Sin
embargo, la eficacia de la ligadura de extremos romos puede mejorarse notablemente utilizando altas concentraciones de al menos
uno de los componentes. En este caso, puede producir y utilizar fcilmente grandes cantidades del vinculador. Adems, puesto que
el enlazador es muy pequeo (por ejemplo, 10 bases), y es la concentracin molar que es importante, incluso cantidades modestas
del enlazador en masa representarn un enorme exceso de enlazador en trminos molares. Por ejemplo, si utiliza 100 ng de un inserto
de 1 kb, entonces 10 ng de enlazador representar una relacin de enlazador: inserto de 10: 1. La reaccin podra ser impulsada
eficazmente por la alta concentracin molar de los enlazadores. Por supuesto, es probable que esta ligacin eficiente aada mltiples
copias del enlazador a los extremos de su inserto, pero esto no es un problema; la digestin de restriccin subsiguiente los eliminar.
Adems, la versatilidad puede obtenerse mediante el uso de adaptadores. Estos son pares de oligonucletidos cortos que estn
diseados para recolectarse juntos de tal manera que crean un fragmento corto de ADN de doble cadena con diferentes extremos
pegajosos (o con un extremo pegajoso y uno romo). Por ejemplo, las secuencias S'GATCCCCGGG y S 'AAITCCCGGG se
recolectan para producir un fragmento con un extremo pegajoso BamHI en un extremo y un extremo pegajoso EcoRI en el otro, sin
necesidad de ser cortados por una enzima de restriccin. La ligacin de este adaptador a un fragmento de restriccin generado por
digestin con BamHI producir un fragmento de ADN con extremos EcoRI que ahora pueden ligarse con un vector de corte EcoRI.
Alternativamente, se puede usar un adaptador con un extremo pegajoso y un extremo romo para convertir fragmentos de ADN
bluntended, tales como los generados por sntesis de cDNA, en fragmentos con un extremo pegajoso, lo que aumenta
sustancialmente la eficiencia de clonacin. Al igual que con los enlazadores, puede utilizar concentraciones molares elevadas, de
adaptadores para conducir la ligacin de manera muy eficiente, y el uso de adaptadores con extremos pegajosos no fosforilados
asegura que no obtendr mltiples adiciones del adaptador al final de su fragmento de ADN.
Homopolymer Tailing
Para unirse a las molculas de ADN se hace un mtodo general y el uso del recocido de secuencias homopolmeras complementarias.
Por lo tanto, mediante la adicin de secuencias oligo (dA) a los extremos 3 'de una poblacin de molculas de ADN y oligo (bloques
dll a los extremos 3' de otra poblacin, los dos tipos de molculas pueden hibridar para formar un crculo dimrico mixto, purificado
a partir de timo de ternera, desoxinucleotidiltransferasa terminal, proporciona los medios mediante los cuales se pueden sintetizar
las extensiones homopolimricas, porque si se presentan con un nico desoxinucletido trifosfato, se repetirn y nucletidos a los
extremos 3 '- OH de una poblacin de molculas de ADN.
El ADN con grupos 3 'OH expuestos, tal como procedente del pretratamiento con la exonucleasa del fago o restriccin con una
enzima tal como PstI, es un sustrato muy bueno para la transferasa. Sin embargo, se han encontrado condiciones en las que la enzima
extender incluso el 3 'OH protegido de 5' terminales cohesivos generados por EcoRI.
Las reacciones de transferasa terminal se han caracterizado en detalle con respecto a su uso en la manipulacin de genes.
Tpicamente, se aaden 10 - 40 residuos homopolmeros a cada extremo.
La insercin de una pieza de ADN \ lambda en ADN viral SV40 es uno de los primeros ejemplos de la construccin de molculas
recombinantes. Hizo uso de la cola del homopolmero. En los experimentos, los huecos de una sola hebra que permanecieron en las
dos hebras en cada unin se repararon en uitro con ADN polimerasa y ADN-ligasa para producir molculas circulares cerradas
covalentemente. Despus de esto, los recombinantes se transfectaron en clulas de mamferos susceptibles. Posteriormente, se utiliz
ampliamente el mtodo del homopolmero, usando homopolmeros dA.dT o Dg.DC para construir plsmidos recombinantes para
clorar en E. coli. En los ltimos aos, debido a la disponibilidad de una gama mucho ms amplia de endonucleasas de restriccin y
otras enzimas modificadoras de ADN, el homopolmero ha sido reemplazado en gran parte. Sin embargo, para el cDNAcloning,
sigue siendo importante.
Unirse a Productos de Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Para la clonacin de fragmentos de ADN, la mayora de las estrategias no funcionan bien con los productos de PCR. La razn de
esto 'es que las polimerasas usadas en el peR tienen una actividad transferasa terminal. Por ejemplo, la polifierase Taq aade un
nico sobresaliente 3 'A a cada extremo del producto de PCR. Por lo tanto, los productos de PCR no pueden ser ligados con extremos
romos a menos que los extremos sean pulidos (embotados). Se puede usar una polimerasa de ADN como Klenow para llenar los
extremos. Alternativamente, la ADN polimerasa Pfu se puede usar para eliminar bases extendidas con su actividad de exonucleasa
3 'a 5'. Sin embargo, incluso cuando los fragmentos de PCR son pulidos, la ligadura de extremos romos en un vector todava puede
ser muy ineficiente. Una solucin a este problema es utilizar la clonacin T / A. El fragmento de PCR en este mtodo se liga a una
molcula de ADN vector con una sola extensin 3 'de desoxitimidilato.
Incorporacin de secuencia extra en el extremo 5 'de un cebador en ADN amplificado
Se puede disear un cebador de PCR que, adems de la secuencia requerida para la hibridacin con el ADN de entrada, incluye una
secuencia extra en su extremo 5 '. La secuencia adicional no participa en la primera etapa de hibridacin -slo la porcin 3 'del
cebador se hibrida- pero posteriormente se incorpora al fragmento de ADN amplificado. La gran flexibilidad est disponible aqu
porque la secuencia adicional se puede elegir en la voluntad del experimentador. En este principio, una aplicacin comn es la
incorporacin de sitios de restriccin en cada extremo del producto amplificado. Con el fin de asegurar que los sitios de restriccin
son buenos sustratos para las endonucleasas de restriccin, se colocan cuatro nucletidos entre los sitios de restriccin de
hexanucletidos y los extremos extremos del ADN. La incorporacin de estos sitios de restriccin proporciona un mtodo para
clonar fragmentos de ADN amplificados.
Unir Molculas de ADN sin ADN Ligasa
Se requeran dos componentes de protena separados en todas las reacciones de corte y unin descritas anteriormente - una
endonucleasa especfica del sitio y una ADN ligasa. Shuman (1994) ha descrito un nuevo enfoque para la sntesis de molculas
recombinantes en las que una nica enzima, la topoisomerasa de ADN de vaccinia, escinde y vuelve a unirse a molculas de ADN.
La colocacin del motivo de escisin de CCCTT para la topoisomerasa de vaccinia cerca del extremo de un ADN dplex permite
la generacin eficiente de una protena altamente recombingena estable. protena que slo puede relegar a ADN aceptor que
contienen extensiones complementarias de una sola cadena. Los ADN lineales que contienen sitios de escisin de CCCTT en ambos
extremos pueden ser activados por topoisomerasa e insertados en un vector plasmdico.
Heyman et al. (1999) han utilizado las propiedades de la topoisomerasa vaccinia para desarrollar una tecnologa libre de ligasa para
la unin covalente de fragmentos de ADN a vectores plasmdicos. Mientras que la unin de molculas con ADN ligasa requiere una
incubacin durante la noche, la ligacin mediada por topoisomerasa ocurre en cinco minutos. El mtodo es particularmente adecuado
para clonar fragmentos de PCR. Un vector linealizado con extensiones 3 'T individuales se activa con la topoisomerasa. En la adicin
del producto de PCR con salientes 3 'A, la ligacin es muy rpida. La alta especificidad de sustrato de la enzima adems significa
que existe una baja tasa de formacin de vectores sin insertos.