Preparacin y anlisis de RNA SECCIN V

Esta unidad presenta cuatro mtodos para la preparacin de ARN a partir de clulas eucariotas. Para todos los protocolos, el rendimiento de

ARN a partir de clulas de cultivo de tejidos es dependiente de la salud de las clulas. Es til para alimentar o dividir celdas de 12 a 24 horas

antes de la cosecha ellos para la extraccin de RNA y luego estar seguros de que las clulas estn en la fase logartmica de crecimiento. El

primer protocolo bsico, el mtodo de fenol caliente, es simple, eficaz, no requiere una ultracentrfuga, y el procesamiento de muchas muestras

puede llevarse a cabo en paralelo. Las clulas se homogeneizaron en el fenol fra y luego inmediatamente expuesto a SDS y calor para reducir

al mnimo la degradacin por RNasa. El segundo protocolo bsico describe un mtodo en el que los ncleos se retiran despus de la lisis de

detergente de la clula y citoplsmico se extrae el ARN; tambin no requiere una ultracentrfuga. En el tercer protocolo bsico, las clulas se

lisan utilizando 4M isotiocianato de guanidinio y el ARN se purifica por centrifugacin en gradiente de densidad. Este protocolo requiere muy

pocas manipulaciones, da ARN limpia de muchas fuentes, y es el mtodo de eleccin cuando se trabaja con tejidos que tienen altos niveles de

RNasa endgena. Sin embargo, requiere una carrera de ultracentrfuga de alta velocidad, lo que limita el nmero de muestras que se pueden

preparar al mismo tiempo. En el protocolo alternativo, las clulas se lisaron en guanidinio, fenol y cloroformo, y el ARN se precipita

diferencialmente a partir de isopropanol. se requiere una carrera de ultracentrfuga de alta velocidad, lo que limita el nmero de muestras que se

pueden preparar al mismo tiempo. En el protocolo alternativo, las clulas se lisaron en guanidinio, fenol y cloroformo, y el ARN se precipita

diferencialmente a partir de isopropanol. se requiere una carrera de ultracentrfuga de alta velocidad, lo que limita el nmero de muestras que se

pueden preparar al mismo tiempo. En el protocolo alternativo, las clulas se lisaron en guanidinio, fenol y cloroformo, y el ARN se precipita

diferencialmente a partir de isopropanol.

Los cuatro mtodos se pueden utilizar para la preparacin de ARN para transferencias Northern ( UNIDAD 10,12), proteccin de RNasa, o
como molde para la sntesis de ADNc. Dependiendo de la fuente de clula o tejido, el ARN puede ser til como una plantilla para la
transcripcin inversa antes de la reaccin en cadena de polimerasa de amplificacin (PCR). El segundo protocolo bsico es probable
que proporcione RNA con menos contaminacin de ADN. Un protocolo de apoyo para el tratamiento de DNasa de preparaciones de
ARN se proporciona si la contaminacin de ADN es un problema.

Estos protocolos producen ya sea ARN citoplsmico celular o total total, que contiene RNA principalmente ribosomal y
ARN de transferencia. Muchas tcnicas requieren ARN mensajero que es en gran parte libre de contaminacin de
ARNr y ARNt. El aislamiento de poli (A) + ARN, que est altamente enriquecida en ARNm, se describe en la cuarta
protocolo bsico.

Preparacin de ARN a partir de tejidos y clulas UNIDAD 10.11

La fuente principal de fallo en cualquier intento de producir ARN es la contaminacin por ribonucleasa. RNasas son
enzimas muy estables y por lo general no requieren cofactores para funcionar. Por lo tanto, una pequea cantidad de
RNasa en una preparacin de ARN crear un problema real. Para evitar problemas de contaminacin, los siguientes se
pueden tomar precauciones:

1. Soluciones. Cualquier agua o soluciones de sal utilizada en la preparacin de ARN deben ser tratados con dietilpirocarbonato
(DEPC). Este producto qumico inactiva ribonucleasas por modificacin covalente. Las soluciones que contienen Tris no
pueden ser tratados eficazmente con DEPC porque Tris reacciona con DEPC para inactivar ella. Ver reactivos y soluciones
en esta unidad para obtener instrucciones para el tratamiento DEPC.

2. Material de vidrio y plstico. Los aparatos de laboratorio utilizados en la preparacin de ARN debe ser tratada para eliminar la actividad

de RNasa residual. El tratamiento en autoclave no inactivar totalmente muchos RNasas. Material de vidrio se pueden hornear a 300 C

durante 4 h. Plasticware recta fuera del paquete es generalmente libre de contaminacin y se puede utilizar de inmediato.

3. Las manos son una fuente importante de contaminacin de RNasa. Usar guantes.

Biologa Molecular

10.11.1
Copyright 1992 Current Protocols Suplemento 4 CPI
 Protocolo HOT extraccin con fenol DE ARN
bsico
Este mtodo es una tcnica rpida, simple para el aislamiento de ARN a partir de tejidos o clulas. El ARN resultante se
puede purificar adicionalmente para generar poli (A) + ARN (cuarto protocolo bsico), o puede ser utilizado para las
transferencias Northern ( UNIDAD 10.12) o anlisis de proteccin de nucleasa. Adems, se puede a transcripcin inversa, o
amplificado por PCR. Hay muy poca contaminacin de ADN y sin degradacin aparente de ARN durante el procedimiento.
Tejido o clulas se colocan en acetato de sodio enfriada con hielo, se homogeneiz, y se trataron inmediatamente con SDS y
60 C fenol. Despus de enfriar, la extraccin de cloroformo elimina el fenol y el ARN es entonces etanol precipitado.

materiales

Tejido o clulas
tampn de acetato de sodio, el hielo fro de solucin salina tamponada con fosfato (PBS; APNDICE

2), fro como hielo o

medio libre de suero, hielo fro 10% de

SDS
saturada de acetato de sodio de fenol, en 60 C
Cloroformo 95% y 70% de etanol, - 20 tampn C TE,
pH 8.0 ( APNDICE 2)

15- y 50-ml homogeneizador tubos de polipropileno tejido

(Brinkman Polytron o tipo) 60 bao de agua C

1a. Si a partir de tejido, colocar el tejido en un tubo de polipropileno de 15 ml. Aadir ~ 5 ml de hielo-fro
tampn de acetato de sodio. Mantener tubo en hielo, homogeneizar 10 seg con homogeneizador de tejidos.

1b. Si a partir de clulas de cultivo de tejidos, eliminar 10 6 a 10 8 las clulas en medio de cultivo tisular
(Si clulas de la monocapa, por tripsinizacin o raspado) a un tubo de polipropileno de 15 ml. Sedimentar las clulas por
centrifugacin de 5 min a 800 gramo y descartar el sobrenadante. Enjuagar las clulas con PBS enfriado en hielo o fro en
hielo medio libre de suero, centrifugar y desechar el sobrenadante. Resuspender las clulas en ~ 5 ml de hielo tampn de
acetato de sodio fro.

2. Aadir 0,05 vol de SDS al 10% y aadir inmediatamente 1 vol de 60 C de sodio de etilo
fenol saturado. Inmediatamente vrtice 5 a 10 seg.

Aadir la fase inferior de la mezcla de fenol acuoso bifsico.

3. Colocar el tubo en 60 C bao de agua. Por cada ml de muestra de partida, se incuba 1 min y
vrtice cada 30 a 60 segundos para 5 a 10 seg-reemplazar en 60 bao C.

4. Enfriar rpidamente en hielo por agitacin 5 min en hielo-agua.

5. Centrifugar 5 min a 800 gramo. Retire fase acuosa (superior) a un nuevo 15-ml
tubo de polipropileno.

6. Aadir igual cloroformo volumen, mezclar por inversin, y se centrifuga como en el paso 5.

7. Repetir extraccin con cloroformo como en el paso 6 y eliminar la fase acuosa a un tubo de polipropileno de 50 ml.

8. El precipitado mediante la adicin de 2,5 vol de etanol al 95% durante la noche a - 20 DO.

9. Centrifugar 15 min en una centrfuga de mesa a 1500 gramo para obtener ARN de pellets. lavar
Preparacin de ARN
sedimentar brevemente con etanol al 70% - 20 DO.
a partir de tejidos
y clulas

10.11.2

suplemento 4 Current Protocols in Immunology

10. Permitir pellet se seque al aire y resuspender en tampn TE, pH 8,0. Determinar la concentracin de ARN, donde UN 260
de 1,0 40 g / ml de cadena simple de ARN.

La A 260 / UN 280 relacin debe ser de 1,9 a 2,0 para el ARN altamente purificado (Gallagher, 1989).

PREPARACIN DE CITOPLSMICA ARN a partir de clulas de cultivo Protocolo

tisular bsico
Las clulas se lavan con solucin salina tamponada con fosfato enfriada con hielo y se mantuvo en hielo durante todas las
manipulaciones posteriores. El sedimento de clulas cosechadas se resuspende en un tampn de lisis que contiene el
detergente no inico Nonidet P-40. La lisis de las membranas plasmticas se produce casi inmediatamente. Los ncleos
intactos se eliminan mediante un breve centrifugado de microcentrfuga, y se aade dodecilsulfato de sodio al sobrenadante
citoplasmtico para desnaturalizar la protena. La protena se digiere con proteasa y se retira por extracciones con fenol /
cloroformo y cloroformo. El ARN citoplsmico se recupera por precipitacin con etanol y se cuantific midiendo su
absorbancia a 260 y 280 nm.

materiales

solucin salina dietilpirocarbonato (DEPC) tamponada con fosfato (PBS; APNDICE

2), hielo tampn de lisis fro, enfriado en hielo

20% de dodecil sulfato de sodio (SDS) 20 mg / ml

de proteinasa K
25: 24: 1 de fenol / cloroformo / alcohol isoamlico ( UNIDAD 10.1)
24: 1 de cloroformo / alcohol isoamlico acetato
de sodio 3 M, pH 5,2 100% de etanol

/ 25% de acetato de sodio 0,1 M etanol al 75%, pH 5,2 agua tratada

con DEPC

Beckman JS-4,2 rotor (o equivalente) polica

de goma

Agua y acetato de sodio deben ser tratados con DEPC para inhibir la actividad de RNasa. Ver reactivos y soluciones
para las instrucciones. PRECAUCIN: DEPC es un posible carcingeno y debe ser manejado con cuidado.

1. Lavar las clulas libres de medio con PBS enfriado en hielo. Para cultivos en monocapa, enjuagar tres veces. Para los
cultivos en suspensin, pellet por centrifugacin 5 min a 300 g ( 1000 rpm en JS-4,2 rotor), resuspender en medio
volumen de cultivo original PBS, y pellet de nuevo.

Este procedimiento, como est escrito, se utiliza para un mximo de 2 10 7 clulas (dos placas de 10 cm, dos 75-cm 2
matraces de cultivo tisular, o ~ 20 ml de cultivo en suspensin). El procedimiento se puede escalar hacia arriba para las cantidades
de clulas ms grandes mediante el aumento de los volmenes de forma apropiada y usando, tubos cnicos ms grandes.

2. Para cultivos en monocapa, raspe en un pequeo volumen de PBS fro con una goma de polica. Transferir a un tubo de
centrfuga en hielo. Recoger las clulas por centrifugacin de 5 min a 300 gramo o 15 segundos en una microcentrfuga.
Mantener las clulas en fro.

Con una placa de 10 cm o de 75 cm 2 matraz de cultivo tisular, recoger las clulas en 1 ml. Con un plato de 15 cm, recoger en 3 a 5
ml.

3. Resuspender las clulas en 375 l-hielo fro tampn de lisis. Incubar 5 min en hielo. La suspensin
debe borrar rpidamente, indicando lisis celular.

Las clulas se suspendieron mejor por agitacin vigorosa, pero cuidado. Evitar la formacin de espuma.

4. Si las clulas no estn ya en un tubo de microcentrfuga, transferirlos en uno. Microcentrfuga 2 min a 4 DO.

Biologa Molecular

10.11.3
Current Protocols in Immunology suplemento 3
 5. Retirar el lquido sobrenadante a un tubo limpio que contiene 4 l de SDS al 20%. Mezcla
inmediatamente por agitacin.

El lquido sobrenadante es el extracto citoplsmico. Por lo general es ligeramente turbia y de color amarillo-blanco, dependiendo
de las clulas. El sedimento, que contiene los ncleos y algunos restos de clulas, debe ser considerablemente ms pequeo
que todo el sedimento celular obtenido en la etapa 2 y de color blanco.

6. Aadir 2,5 l de 20 mg / ml de proteinasa K. Se incuba 15 min a 37 DO.

7. Aadir 400 l de fenol / cloroformo / alcohol isoamlico. Vortex a fondo> 1 min y

microcentrfuga 5 minutos. Las extracciones y centrifugaciones se realizaron a temperatura ambiente.

Con el tratamiento de proteasa, no debe haber slo una pequea cantidad de precipitado en la interfase entre las dos fases,
aunque esto puede variar dependiendo del tipo de clula. Para algunas clulas, el paso de la proteasa se puede omitir con
seguridad. En este caso, el precipitado blanco en la interfase puede ser considerable. Si un muy grandes forma un
precipitado despus de la primera extraccin orgnica y poca o ninguna fase acuosa se pueden recuperar, tratar primero
girar durante unos minutos ms. Si el precipitado no colapsar a la interfaz, retirar y desechar la fase orgnica de la parte
inferior del tubo. Aadir 400 l de cloroformo / alcohol isoamlico. as vrtice y centrifugado ~ 2 minutos. El precipitado debera
haber desaparecido en gran parte. Recuperar la fase acuosa superior y proceder.

8. Retirar la fase acuosa (superior) a un tubo limpio, evitando material precipitado desde la interfaz. Aadir
400 l de fenol / cloroformo / alcohol isoamlico y repetir la extraccin.

9. Retirar la fase acuosa a un tubo limpio. Aadir 400 l de cloroformo / alcohol isoamlico.
Vortex 15 a 30 seg y de microcentrfuga de 1 min.

10. De nuevo, eliminar la fase acuosa (superior) a un tubo limpio.

11. Aadir 40 l de acetato de sodio 3 M, pH 5,2, y 1 ml de etanol al 100%. Mezclar por inversin.
Incubar 15 a 30 min en hielo o almacenar durante la noche a - 20 DO.

12. Microcentrfuga 15 min a 4 C y el sobrenadante de descarte.

13. Enjuague el sedimento con 1 ml de 75% de etanol / 25% de acetato de sodio 0,1 M, pH 5,2.

14. Secar el pellet y resuspender en 100 l de agua tratada con DEPC. diluir 10 l en 1 ml
agua para determinar la UN 260 y UN 280. Almacenar el ARN restante en - 70 DO.

PROTOCOLO Eliminacin de ADN contaminantes de un ARN PREPARACIN

DE SOPORTE
Si se asla el ARN a partir de clulas transfectadas transitoriamente con ADN clonado, cantidades sustanciales de este ADN se
copurifican con el ARN en este procedimiento. Este ADN contaminante se interfiere con el anlisis del ARN mediante ensayos
de proteccin de nucleasa, especialmente si se usan sondas marcadas de manera uniforme, y puede ser un problema en la
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) basados tambin. Para eliminar este ADN, realice los pasos siguientes despus del
paso 12 del segundo protocolo bsico.

Materiales adicionales

tampn TE, pH 7.4 ( APNDICE 2)

MgCl 100 mM 2 / ditiotreitol 10 mM (DTT)
2,5 mg / ml de DNasa I libre de RNasa

Preparacin de ARN inhibidor de ribonucleasa de placenta (por ejemplo, ARNsin de Promega Biotec) mezcla parada DNasa
a partir de tejidos
y clulas

10.11.4

suplemento 3 Current Protocols in Immunology

 1. Se vuelve a disolver el ARN en 50 tampn TE l, pH 7,4.

2. Preparar en hielo de un cctel que contiene (por muestra) 10 l de mM MgCl 100 2 / 10 mM

TDT, 0,2 l de 2,5 mg / ml de ADNasa libre de ARNasa, 0,1 l inhibidor de ribonucleasa placentaria (25 a 50 U / l),
y 39,7 tampn TE l, pH 7,4. Aadir 50 l de este cctel a cada muestra de ARN. Mezclar e incubar 15 min a 37 DO.

3. Detener la reaccin mediante la adicin de DNasa 25 l DNasa mezcla de parada.

4. Extracto de una vez con fenol cloroformo / alcohol / isoamlico y una vez con cloroformo / alcohol isoamlico.

5. Aadir 325 l de etanol al 100% y precipitar 15 a 30 min en hielo o durante la noche a - 20 DO.

Reanudar segundo protocolo bsico en el paso 12.

Guanidinio MTODO PARA ARN total PREPARACIN Protocolo

bsico
Las clulas se lavan libre de medio y se lisan mediante la colocacin en una solucin de guanidinio 4 M. La viscosidad de
la solucin se reduce mediante la elaboracin del lisado a travs de una aguja 20-G. El ARN se sediment a travs de un
gradiente de etapa CsCl y el sobrenadante de este gradiente luego se retira cuidadosamente para permitir la separacin
completa del ARN, encontrado en la pella, del ADN contaminante y de la protena. El ARN en el sedimento se disuelve, se
precipit con etanol, y se cuantific espectrofotomtricamente a UN 260.

materiales

Tamponada con fosfato salino (PBS; APNDICE 2)

solucin de guanidinio
5,7 M de cloruro de cesio solucin
(CsCl) TES
acetato de sodio 3 M, pH 5,2 100%
de etanol

Beckman JS-4.2 y SW-55 rotores (o equivalentes) polica de

goma
jeringa 6-ml con aguja 20-G 13 51-mm silanizado ( APNDICE 3) y el tubo de ultracentrfuga polialmero
autoclave

NOTA: Las siguientes soluciones deben ser tratados con DEPC para inhibir la actividad de RNasa: acetato de sodio,
agua, y 5,7 M de CsCl (ver reactivos y soluciones).

PRECAUCIN: DEPC es un posible carcingeno y debe ser manejado con cuidado. 1a. Si a partir de un cultivo en monocapa,

lavar las clulas a temperatura ambiente mediante la adicin de 5 ml

PBS por placa, girando los platos, y vertiendo fuera. Repetir el lavado. 1b. Si a partir de un cultivo en suspensin, pellet 10

8 las clulas por centrifugacin de 5 min a 300

g ( 1000 rpm en JS-4,2 rotor) y descartar el sobrenadante. Lavar las clulas una vez a temperatura ambiente
resuspendiendo el sedimento en una cantidad de PBS igual a la mitad del volumen original y centrifugacin.
sobrenadante Descartar.

Llevar a cabo los pasos 1 a 4 a temperatura ambiente.

2a. Para el cultivo de monocapa, aadir solucin de 3,5 ml de guanidinio para 10 8 clulas, dividiendo el
solucin en partes iguales entre los platos. Las clulas deben lisar inmediatamente en su lugar. Recuperar el lisado

viscosa raspando los platos con un polica. Eliminar lisado de platos utilizando una aguja 20-G montado en una

jeringa de 6 ml. Combinar lisados. 2b. Para los cultivos en suspensin, aadir 3,5 ml de solucin de guanidinio al

tubo de centrfuga. Biologa Molecular

10.11.5
Current Protocols in Immunology suplemento 3
 3. Dibujar la resultante solucin extremadamente viscoso arriba y hacia abajo cuatro veces a travs de una jeringa 6-ml con
aguja 20-G. Transferir la solucin a un tubo limpio.

Es crtico que el ADN cromosmico ser cortado en este paso con el fin de reducir la viscosidad. Esto permite la
eliminacin completa del ADN en la etapa de centrifugacin.

4. Colocar 1,5 ml de 5,7 M CsCl en un 13 51-mm silanizado y polialmero autoclave

tubo de ultracentrfuga. Capa de 3,5 ml de lisado celular en la parte superior de la almohadilla de CsCl para crear un gradiente de

paso. La interfaz debe ser visible.

Silanizacin del tubo disminuye la cantidad de material que se adhiere a los lados del tubo y por lo tanto disminuye el
nivel de contaminacin del ARN final.

5. Centrifugar 12 a 20 horas a 150 000 g ( 35.000 rpm en SW-55 rotor), 18 C. Conjunto de centrfuga para la
aceleracin y desaceleracin lenta para evitar perturbar el gradiente.

6. Eliminar el sobrenadante con mucho cuidado. Coloque el extremo de la pipeta Pasteur en la parte superior de la solucin
y lo baja que el nivel de los inferiores solucin. Salir ~ 100 l en la parte inferior, Invertir el tubo con cuidado, y se vierte
el lquido que queda fuera.

No debe haber una banda blanca de ADN en la interfase se debe tener cuidado para eliminar esta banda por completo, ya
que contiene el ADN celular.

7. Vaciar el pellet de 5 a 10 min, a continuacin, volver a suspender en 360 l TES solucin por repetidamente

dibujar la solucin arriba y abajo en una pipeta. Dejar que el precipitado para resuspender 5 a 10 min a temperatura
ambiente. Transferir a un tubo de microcentrfuga limpio.

Es crtico para permitir tiempo suficiente para la resuspensin de este grnulo o el rendimiento de ARN se reducir
significativamente.

8. Aadir 40 l de acetato de sodio 3 M, pH 5,2, y 1 ml de etanol al 100%. ARN precipitado

30 min en hielo seco / etanol. Microcentrfuga 10 a 15 minutos y desechar el sobrenadante.

9. Resuspender el sedimento en 360 l de agua y repita el paso 8.

RNA se disuelve ms fcilmente en agua que en una solucin de sal.

10. Vaciar el pellet 10 min y se disuelve en ~ 200 l de agua. Cuantificar mediante la dilucin de 10 l
a 1 ml y la lectura de la UN 260 y UN 280 ( UNIDAD 10.2). ARN tienda en - 70 C, ya sea como una solucin acuosa o como
un precipitado en etanol.

Este protocolo produce ARN que es lo suficientemente limpia para el norte ( UNIDAD 10,12), S1, o el anlisis de SP6. Si se desea
ARN limpiador, paso 7 puede ser modificado con la siguiente: Despus de resuspender el sedimento en solucin TES,
extraer con 360 l de 4: 1 (v / v) de cloroformo / 1-butanol y guardar el sobrenadante. Extraer el cloroformo mediante la
adicin de 360 l de solucin de TES. Combinar los sobrenadantes, aadir 0,1 vol de acetato sdico 3 M, pH 5,2, y
precipitado en etanol como en el paso 8.

Preparacin de ARN
a partir de tejidos
y clulas

10.11.6

suplemento 3 Current Protocols in Immunology

Un solo paso de aislamiento de ARN de clulas o tejidos cultivados PROTOCOLO
ALTERNOS
clulas o tejidos cultivados se homogeneizan en una solucin desnaturalizante que contiene 4 M de tiocianato de
guanidinio. El homogeneizado se mezcl secuencialmente con acetato de sodio 2 M, fenol y cloroformo / alcohol
isoamlico. La mezcla resultante se centrifuga, dando una fase acuosa superior que contiene el ARN total. En esta
extraccin de una sola etapa, el RNA total se separa de protenas y el ADN que permanecen en la interfase y en la fase
orgnica. Despus de precipitacin con isopropanol, el sedimento de ARN se vuelve a disolver en solucin (que contiene 4
M de tiocianato de guanidinio), se volvi a precipitar con isopropanol desnaturalizante, y se lav con etanol al 75%.

Materiales adicionales

solucin desnaturalizante 2 M de
acetato de sodio, pH 4 fenol en agua
saturada
49: 1 (v / v) de cloroformo / alcohol isoamlico 100% de
isopropanol
75% de etanol (preparado con agua tratada con DEPC)
0,5% de SDS, Sorvall SS-34 rotor tratada con
DEPC (o equivalente)

NOTA: Llevar a cabo todas las medidas a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario. 1a. Para el tejido, aadir 1 ml de

desnaturalizacin solucin / 100 mg de tejido y homogeneizar con unos pocos

golpes en un homogeneizador de tefln de vidrio.

1b. Para las clulas cultivadas, ya sea clulas en suspensin de centrfuga y desechar el sobrenadante, o
eliminar el medio de cultivo de las clulas cultivadas en cultivos en monocapa. Aadir 1 ml de desnaturalizacin solucin /
10 7 clulas y pasan el lisado a travs de una pipeta de siete a diez veces.

No lavar las clulas con solucin salina. Las clulas cultivadas en cultivos en monocapa se pueden lisar directamente en la placa de
cultivo o frasco.

El procedimiento puede llevarse a cabo en, tubos estriles, desechables de fondo redondo de polipropileno con tapas; ningn
tratamiento adicional de los tubos es necesario. Antes de utilizar, probar si los tubos pueden soportar centrifugacin a 10.000
g con la mezcla de solucin de desnaturalizacin y fenol / cloroformo.

2. Transferir el homogeneizado en un tubo de polipropileno de 5 ml. Aadir 0,1 ml de acetato sdico 2 M, pH 4, y

mezclar bien por inversin. Aadir 1 ml de fenol saturado con agua, mezclar a fondo, y aadir 0,2 ml de 49: 1
de cloroformo / alcohol isoamlico. Mezclar bien e incubar la suspensin 15 min a 0 para 4 DO.

Asegrese de que las tapas estn bien cerradas cuando se mezclan. Los volmenes utilizados son por 1 ml de solucin de
desnaturalizacin.

3. Centrifugar 20 minutos a 10.000 g ( 9000 rpm en el rotor SS-34), 4 C. Transferencia de la fase acuosa superior a un
tubo nuevo.

La fase acuosa superior contiene el ARN, mientras que el ADN y las protenas estn en la interfase y la fase de
fenol / cloroformo inferior. El volumen de la fase acuosa es ~ 1 ml, igual al volumen inicial de solucin de
desnaturalizacin.

4. precipitar el ARN mediante la adicin de 1 ml (1 vol) de isopropanol al 100%. Colocar las muestras 30 min a - 20 C.
Centrifugar 10 minutos a 10.000 gramo, 4 C, y desechar el sobrenadante.

Para el aislamiento de ARN a partir de tejidos con un alto contenido de glucgeno (por ejemplo, hgado), se recomienda una
modificacin del mtodo de un solo paso para disminuir la contaminacin de glucgeno (Puissant y Houdebine, 1990).
Despus de esta precipitacin con isopropanol, lavar la glucgeno a partir del sedimento de ARN mediante agitacin en 4 M
LiCl. Sedimentar el ARN insoluble 10 min a 5000 gramo. Disolver el precipitado en solucin desnaturalizante y seguir el resto
del protocolo. Biologa Molecular

10.11.7
Current Protocols in Immunology suplemento 3
 5. Disolver el sedimento de ARN en 0,3 ml de solucin y la transferencia de desnaturalizacin en un tubo de microcentrfuga de 1,5 ml.

6. precipitar el ARN con 0,3 ml de isopropanol al 100% (1 vol) durante 30 min a - 20 C. Centrifugar 10 minutos a
10.000 gramo, 4 C, y desechar el sobrenadante.

7. Resuspender el pellet de ARN en etanol al 75%, vrtice, y se incuba de 10 a 15 min a temperatura ambiente para
disolver cantidades residuales de guanidinio que contaminan el pellet.

8. Centrifugar 5 min a 10000 gramo y desechar el sobrenadante. Se seca el sedimento de ARN en una

vaco durante 5 a 15 min.

9. Disolver el sedimento de ARN en 100 a 200 l de agua tratada con DEPC o en tratada con DEPC
0,5% de SDS, dependiendo de la utilizacin posterior de ARN. Cuantificar como se describe en el paso 10 de la tercera
protocolo bsico. almacenar muestras congeladas a - 70 C o en etanol a - 20 DO.

Protocolo Preparacin de poli (A) + RNA

bsico
Este protocolo separa poli (A) + RNA del resto de RNA total, que es en gran parte rRNA y tRNA. El ARN total se
desnaturaliza para exponer el poli (A) (poliadenilados) las colas. El poli (A) ARN que contiene es entonces
obligado a oligo (dT) celulosa, y el resto del lavado de ARN a travs de. El poli (A) + ARN se eluye mediante la
eliminacin de la sal de la solucin, desestabilizando as la dT: rA hbrido. La columna luego se puede repetir para
quitar poli contaminante (A) - ARN.

materiales

Dietilpirocarbonato (DEPC) 5 M
NaOH Oligo (dT) celulosa

0,1 M NaOH Poli (A) tampn de

carga M LiCl medio tampn de
lavado 10

EDTA 2 mM / 0,1% de dodecilsulfato de sodio (SDS) acetato de

tampn TE silanizado columna de RNasa libre de sodio 3 M ( APNDICE

3)

SW-55 tubos de centrfuga silanizados ( APNDICE 3)

rotor Beckman SW-55 (o equivalente)

Las siguientes soluciones deben ser tratados con DEPC para inhibir la actividad de RNasa: agua, 10 M LiCl, acetato de
sodio 3 M.

PRECAUCIN: DEPC es un posible carcingeno y debe ser manejado con cuidado.

columna de oligo (dT) Verter

1. Lavar una columna silanizada con 10 ml de NaOH 5 M, luego enjuague con agua.

Una pipeta de Pasteur de vidrio silanizado enchufado con lana de vidrio silanizada o una pequea columna desechable con una
capacidad de 2 ml se puede utilizar. Es importante silanizar la columna para evitar que el ARN se pegue a la de vidrio o de plstico.

2. Aadir 0,5 g de polvo seco oligo (dT) celulosa para 1 ml de NaOH 0,1 M. Se vierte la suspensin en la columna y
lavar la columna con ~ 10 ml de agua.
Preparacin de ARN
a partir de tejidos 3. equilibrar la columna con 10 a 20 ml de tampn de carga. El pH de la salida debe estar cerca de 7,5 al
y clulas final del lavado.

10.11.8

suplemento 3 Current Protocols in Immunology

Fraccionar poli (A) + RNA
4. Caliente ~ RNA 2 mg en total en agua a 70 C durante 10 min. Aadir 10 M LiCl a 0,5 M final.

El calentamiento de la ARN es necesario interrumpir cualquier estructura secundaria que pudiera formarse. Es importante no tener
una columna demasiado grande para la cantidad de ARN seleccionado debido a que el final de poli (A) + RNA sern tan diluidos que
la precipitacin y tratamiento final de la muestra sern muy ineficiente. Por lo tanto, utilizar una columna mucho ms pequea cuando
el poli (A) + - seleccionar 500 g ARN, y la escala hacia abajo todos los pasos en consecuencia. Generalmente, 1 ml de oligo (dT)
celulosa es suficiente para 5 a 10 mg de ARN de entrada.

5. Pasar la solucin de ARN a travs de la columna de la oligo (dT). Lavar la columna con tampn de 1 ml de poli (A) de
carga. Asegrese de guardar el eluyente de esta etapa de carga.

6. Pasar el eluyente a travs de la columna dos veces ms.

El RNA de partida se hace pasar a travs de la columna tres veces para asegurar que todo el poli (A) + ARN se ha pegado a la
oligo (dT).

7. Lavar la columna con 2 ml de tampn de lavado medio.

8. Eluir el ARN en un tubo nuevo con 2 ml de 2 mM EDTA / 0,1% SDS.

9. reequilibrar la oligo (dT) columna, como en el paso 3. Tomar el ARN eluido y repetir el poli (A) + de seleccin, como se
describe en los pasos 4 a 8.

Esta segunda columna de oligo (dT) elimina pequeos niveles de contaminacin de poli (A) + ARN. Se puede omitir si tales
contaminantes no crean un problema, por ejemplo, cuando el ARN se va a utilizar para el anlisis de S1.

10. Aadir acetato de sodio 3 M a 0,3 M final. Precipitar el ARN mediante la adicin de 2,5 vol de etanol. Transferir la
solucin a dos silanizados SW-55 tubos.

11. Incubar durante la noche a ARN - 20 C o 30 min en hielo seco / etanol. Recoger el precipitado
centrifugando 30 min a 304.000 g ( 50.000 rpm en SW-55 rotor), 4 DO.

Se requiere esta centrifugacin a alta velocidad para sedimentar el ARN muy diluido.

12. Retirar etanol y permitir grnulos se sequen al aire. Resuspender ARN en 150 l de RNasa libre de
TE tampn y agrupe las muestras. Comprobar la calidad del ARN mediante el calentamiento de 5 l a 70 C durante 5 min y el
anlisis en un gel de agarosa al 1% ( UNIDAD 10.4).

Reactivos y soluciones

5,7 M CsCl, tratada con DEPC

Disolver CsCl en 0,1 M EDTA, pH 8,0. Aadir 0,002 DEPC vol, agitar 20 a 30 min, y autoclave. Pesar el frasco de la
solucin antes y despus de la esterilizacin en autoclave y compensar la prdida de peso a la evaporacin durante el
tratamiento en autoclave con tratada con DEPC H 2 O. Esto asegura que la solucin es realmente 5,7 M cuando se usa.

solucin de desnaturalizacin

4 M de tiocianato de guanidinio de citrato

de sodio 25 mM, pH 7
0.1 M 2-ME (aadido como se indica a continuacin)

0,5% NORTE- lauroilsarcosina (Sarkosyl)

Preparar una solucin madre disolviendo 250 g de tiocianato de guanidinio en una solucin de 293 ml de H 2 O,
17,6 ml de citrato 0,75 M de sodio, pH 7, y 26,4 ml de 10% a 60 Sarkosyl a 65 C con agitacin. La solucin madre
se puede almacenar hasta 3 meses a temperatura ambiente.

Preparar la solucin de trabajo mediante la adicin de 0,35 ml de 2-ME por 50 ml de la solucin madre. La solucin de
Biologa Molecular
desnaturalizacin de trabajo se puede almacenar durante 1 mes a temperatura ambiente.

10.11.9
Current Protocols in Immunology suplemento 3
 Dietilpirocarbonato tratamiento (DEPC) de soluciones
Aadir 0,2 ml DEPC a 100 ml de la solucin a tratar. Agitar enrgicamente para conseguir
la DEPC en la solucin. En autoclave la solucin para inactivar el DEPC restante. Muchos investigadores mantienen

las soluciones que utilizan para el trabajo de ARN se separan para asegurar que las pipetas sucio no entrar en ellos.

PRECAUCIN: Use guantes y una campana de humos cuando se utiliza DEPC, ya que es un posible carcingeno.

DNasa mezcla de interrupcin

EDTA 50 mM
acetato de sodio 1,5 M 1% de dodecilsulfato
sdico (SDS)

El SDS puede salir de la solucin a temperatura ambiente. Calentar brevemente para volver a disolver.

solucin de guanidinio
4 M de isotiocianato de guanidinio acetato
de sodio 20 mM, pH 5,2
ditiotreitol 0,1 mM (DTT)
0,5% NORTE- lauroilsarcosina (Sarkosyl) Disolver el isotiocianato de guanidinio en H 2 O y la cantidad
apropiada de acetato de sodio. El calentamiento de la solucin ligeramente (65 C) puede ser necesario para
obtener el guanidinio en la solucin. Aadir la TDT y Sarkosyl. Comprobar el pH debe ser

~ 5.5. Si no, ajustar con cido actico. Llevar a volumen y se filtra la solucin a travs de un filtro Nalgene.
Almacenar a temperatura ambiente.

tampn de lisis

Tris 50 mM Cl, pH 8,0 100

mM NaCl mM MgCl 5 2

0,5% (v / v) de Nonidet P-40 Prepare con tratada con DEPC H 2 O

(vase ms arriba) Filtro de esterilizar

Si el ARN es para ser utilizado para el anlisis de transferencia de Northern ( UNIDAD 10.12) o las clulas son particularmente ricos en
ribonucleasa, aadir inhibidores de ribonucleasa al tampn de lisis: 1000 U / ml de inhibidor de ribonucleasa placentaria (por ejemplo,
ARNsin) ms DTT 1 mM o 10 mM complejo de vanadilo-ribonuclesido.

tampn de lavado Medio

LiCl 10 mM Tris 0,15 M Cl,

pH 7.5 mM EDTA 1

0,1% de dodecil sulfato de sodio

Poli (A) tampn de carga

LiCl 10 mM Tris 0,5 M Cl,
pH 7.5 mM EDTA 1

0,1% de dodecil sulfato de sodio

RNasa libre de DNasa I

enzimas preparadas comercialmente tales como Worthington DPRF grado (# LS0633)
son satisfactorios. Si se proporciona como un polvo, redisolver en tampn TE que contiene 50% (v / v) de
glicerol y almacenar a - 20 DO.

Preparacin de ARN
a partir de tejidos
y clulas

10.11.10

suplemento 3 Current Protocols in Immunology

acetato de sodio 2 M

Aadir 16.42 g de acetato de sodio (anhidro) a 40 ml de H 2 O y 35 ml de cido actico glacial. Ajuste

solucin a pH 4 con cido actico glacial y el volumen final a 100 ml con H 2 O. La solucin es 2 M con
respecto a los iones de sodio.

saturada de acetato de sodio fenol

Derretir 100 gramos de fenol ultrapura (redestilado grado cido nucleico) y mezclar con 100 ml de tampn de acetato
de sodio (ver abajo). Agitar vigorosamente, y dejar que las fases se separan; fenol es la fase inferior. Precalentar a 60
C antes de usar.

tampn de acetato de sodio

acetato de sodio 100 mM, pH 5.2 mM

EDTA 1

solucin de TES

Tris 10 mM Cl, pH 7.4 mM

EDTA 5
1% de dodecilsulfato de sodio

fenol en agua saturada

Disolver 100 g de cristales de fenol en H 2 O en 60 a 65 C. Aspirar la fase acuosa superior y almacenar hasta 1
mes a 4 DO.

No utilice fenol tampn en lugar de fenol saturado con agua.

Informacin de Antecedentes

COMENTARIO anlisis. Se escal para pequeos cultivos-1 a 2 platos de

La mayora de los procedimientos para el aislamiento de ARN a
partir de clulas eucariotas implican lisis y las clulas para liberar los
cidos nucleicos totales de desnaturalizacin. entonces se requieren
pasos adicionales para eliminar el ADN. El primer protocolo bsico
elimina o minimiza la contaminacin de ADN por el cizallamiento del
ADN. El segundo protocolo bsico permite una rpida preparacin
de ARN total citoplasmtica mediante el uso de un detergente no
inico para lisar la membrana plasmtica, dejando intactos los
ncleos. Los ncleos y por lo tanto la mayor parte del ADN celular A
continuacin se retiran con una simple centrifugacin breve.
El primer protocolo bsico es el mtodo ms fcil, menos
limitado por un equipo caro, y casi equivalente al mtodo de
guanidinio en la calidad de ARN preparado a partir de RNasa
tejidos ricos (Zeff et al., 1991). Las variaciones del segundo
protocolo bsico estn en amplio uso. El origen exacto de este
protocolo es oscura, pero versiones de la misma se utiliza en
algunos de los primeros trabajos de mapeo de la nucleasa S1
(Berk y Sharp, 1977; Favoloro et al., 1980). El protocolo descrito
aqu es una simplificacin considerable de los mtodos
anteriores, omitiendo, por ejemplo, la eliminacin de los ncleos
por centrifugacin a travs de sacarosa. Es rpido y
simplificado, diseado para la preparacin de ARN citoplsmico
total a partir de muchas culturas simultneamente para la
proteccin de nucleasa
clulas adherentes o 10 a 20 ml de un cultivo en suspensin.
El segundo protocolo bsico funciona bien para muchos tipos
de clulas. El protocolo no toma precauciones especiales de
ribonucleasas y puede no producir ARN de transferencia Northern
calidad de algunas clulas. Si se requiere ARN de longitud
completa, los inhibidores de ribonucleasa deben aadirse al tampn
de lisis (como se describe en los reactivos y soluciones) o el
isotiocianato de guanidinio o mtodos de fenol en caliente deben ser
utilizados. Por ltimo, si se asla el ARN a partir de clulas
transfectadas transitoriamente, el ARN debe ser tratada
adicionalmente con DNasa para eliminar el ADN transfectado (vase
el protocolo de apoyo). Esta modificacin es especialmente crtico si
el ARN es a ensayar por la proteccin de la nucleasa usando
sondas uniformemente marcados.
Tiocianato de guanidinio es uno de los desnaturalizantes de
protenas ms eficaces conocidos. El uso de guanidinio para lisar
las clulas se desarroll originalmente para permitir la purificacin
de ARN de las clulas con alto contenido de ribonucleasas
endgenos (Cox, 1968; Ullrich et al, 1977;. Chirgwin et al,.
1979). En el protocolo de guanidinio, las clulas se lisaron
con una solucin que contiene guanidinio 4 M, as como un
detergente suave. Esta lisis es virtualmente instantnea y las
clulas se as tomadas rpidamente de un estado intacto a
una Biologa Molecular

10.11.11
Current Protocols in Immunology suplemento 3
 desnaturalizacin completa del medio ambiente. El tercer
protocolo bsico, basado en el hecho de que el ARN es ms
denso que el ADN o protena, describe la separacin de ARN
a partir de otras macromolculas celulares en el lisado de
guanidinio en un gradiente escalonado de CsCl (Glisin et al.,
1974). Un mtodo que utiliza fenol caliente y tiocianato de
guanidinio tambin se ha descrito (Ferimisco et al., 1982).
Este protocolo / CsCl guanidinio ha recibido amplio uso, ya
que requiere muy pocas manipulaciones. Esto aumenta la
probabilidad de producir ARN intacto y reduce manos a tiempo
para el experimentador. La desventaja es que requiere una
ultracentrfuga y rotor, en general, limitar el nmero de
muestras que se puede hacer fcilmente de forma simultnea.
Este protocolo se debe utilizar cuando se requiere RNA de
muy alta calidad a partir de un nmero limitado de muestras.
El mtodo de un solo paso de aislamiento del ARN se basa
en la propiedad de ARN a permanecer soluble en agua en una
solucin que contiene 4 M de tiocianato de guanidinio, pH 4, en
presencia de una fase orgnica con fenol / cloroformo. En estas
condiciones cidas, la mayora de las protenas y los fragmentos
pequeos de ADN (50 bases a 10 kb) se encuentran en la fase
orgnica mientras que los fragmentos ms grandes de ADN y
algunas protenas permanecen en la interfase. La fragmentacin
de ADN durante la homogeneizacin ayuda a eliminar el ADN de
la fase acuosa.
Desde su introduccin (Chomczynski y Sacchi, 1987), el
mtodo de un solo paso se ha convertido en un mtodo
ampliamente utilizado para el aislamiento de ARN a partir de un
gran nmero de muestras. Adems, el procedimiento permite la
recuperacin del ARN total de pequeas cantidades de tejido o
clulas, por lo que es adecuada para estudios de expresin gnica
cada vez una cantidad limitada de tejido o clulas estn disponibles.
El protocolo que aqu se presenta es una versin actualizada del
mtodo original, ya que adems reduce el tiempo de aislamiento de
ARN. Cualquier aplicacin comercial del mtodo est limitada por
una patente estadounidense (Chomczynski, 1989).
La mayora de los ARN mensajeros contienen una cola de poli
(A), mientras que los ARNs estructurales no lo hacen. por lo tanto,
Poli seleccin (A) enriquece para el ARN mensajero. La tcnica ha
demostrado ser esencial para la construccin de bibliotecas de
ADNc. Tambin es til en el anlisis de la estructura de los ARNm
de baja abundancia. Extraccin de la ribosomal y tRNAs partir de
una preparacin aumenta la cantidad de ARN que pueden ser
claramente analiz por anlisis de S1, por ejemplo, permitiendo as
la deteccin de un mensaje de nivel bajo.
Aviv y Leder (1972) utilizaron primero oligo (dT) celulosa
Preparacin de ARN
a partir de tejidos para unir poli (A) + mensaje y por lo tanto consiguen
y clulas fraccionamiento de mRNA. Lo bsico
10.11.12
suplemento 3
tcnica ha sido objeto de una ligera modificacin desde entonces.
Algunos poli protocolos sustituto (U) Sephadex para oligo (dT)
(por ejemplo, Moore y Sharp,
1984). Poli (U) Sephadex tiene tramos algo ms largos de
nucletidos y una mejor tasa de flujo que hace oligo (dT)
celulosa.
Parmetros Crticos y solucin de
problemas
La degradacin de los ARN por ARNasa es mejor evitar al
trabajar rpidamente y mantener fra todo hasta desnaturalizantes
(es decir, SDS, fenol, o de guanidinio) se aaden al extracto
citoplsmico o celular. Para las clulas con las que la RNasa es un
problema, los inhibidores se pueden aadir al tampn de lisis (ver
reactivos y soluciones), pero en la mayora de los casos esto no es
necesario. Tenga en cuenta que para algunas lneas celulares,
puede ser posible omitir la etapa de proteinasa K a partir del
segundo protocolo bsico y proceder directamente a extraccin
orgnica despus de la eliminacin de los ncleos y la adicin de
SDS.
la contaminacin de ADN es un problema cuando se prepara
ARN a partir de clulas transfectadas con ADN clonado en un
ensayo de expresin transitoria y puede ser motivo de preocupacin
si se usa un ensayo basado en PCR para los mensajes raros. En
este caso, aadir las fases de digestin DNasa descritos en el
protocolo de apoyo.
En el mtodo de guanidinio (como con cualquier procedimiento
de preparacin de ARN), se debe tener cuidado para asegurar que
las soluciones estn libres de ribonucleasa. Soluciones que entran
en contacto con el ARN despus de aadir la solucin de guanidinio
son todos tratados con DEPC, con la excepcin de la solucin de
TES (Tris inactiva DEPC). La mayora de los investigadores usan
guantes en todo momento cuando se trabaja con soluciones de
ARN, como las manos son una fuente probable de contaminacin
ribonucleasa.
El protocolo de guanidinio se basa en una separacin completa
de ADN y protena a partir de ARN en el gradiente de paso. El uso
de tubos silanizados, as como la tcnica cuidado al retirar el
sobrenadante, son importantes. Por ltimo, los bajos rendimientos
pueden ser resultado de no permitir tiempo suficiente para que la
resuspensin del sedimento de ARN despus de la centrifugacin.
Este sedimento no es fcilmente soluble, y suficiente tiempo y
agitacin en vrtex se debe permitir que se disuelva.
Hay dos puntos importantes a considerar cuando se utiliza el
protocolo de un solo paso. En primer lugar, tejido fresco es
preferible para el aislamiento de ARN. Alternativamente, el tejido
se debe congelar inmediatamente en nitrgeno lquido y se
almacen a
- 70 C. En el ltimo caso, el tejido debe ser pulverizado en
nitrgeno lquido y se homogeneizaron en solucin sin
descongelacin usando un mezclador Polytron o Waring
desnaturalizante. Segundo,
Current Protocols in Immunology
es importante no dejar que el sedimento de ARN final de secar
completamente, ya que se reducir mucho su solubilidad. Esto es
crtico en todos los mtodos de aislamiento de ARN. Parcialmente
ARN solubilizado tiene una
UN 260 / UN 280 relacin <1,6. Solubilidad de ARN se puede mejorar por
calentamiento a 55 a 60 C con agitacin con vrtex intermitente o
haciendo pasar la solucin de ARN a travs de una punta de pipeta.
Es crtico-incluso ms que en la mayora de ARN
tcnicas de tener soluciones libres de RNasa cuando se
hace la seleccin de poli (A). Esto es porque en la mayora
de los casos el 5 ' Se necesita final del mensaje. Por lo
tanto, no hay pausas entre el 5 ' y 3 ' final del mensaje se
puede tolerar, ya que el mensaje roto se separa de su poli
(A) + cola.
Un segundo aspecto crtico cuando se hace la seleccin de
poli (A) es que el tamao de la columna puede adaptar a la
cantidad de ARN que se selecciona. El tamao de la columna
determina el volumen en el que se eluye el poli (A) + ARN. Si
este volumen es muy grande, entonces el poli (A) + RNA sern
extremadamente diluidas. El ms diluir el RNA, ms difcil es
para precipitar cuantitativamente. Adems, una fraccin mayor
de una solucin de ARN diluido se pierde debido a la
adherencia no especfica de la ARN a los lados de la columna y
tubos utilizados durante la preparacin. La capacidad de oligo
(dT) celulosa se suministra generalmente por el fabricante y
tiende a ser bastante alto. Por lo tanto, una muy pequea
columna se debe utilizar cuando se hace la seleccin de poli (A)
en cantidades pequeas de ARN, y los volmenes de elucin
debe ser escalado hacia abajo tambin.
resultados previstos
los rendimientos de ARN utilizando el primero y segundo
protocolo bsico varan ampliamente, dependiendo de la lnea
celular. Esperar 30 a 100 g de un confluente placa de 10 cm de la
mayora de lneas de fibroblastos o 10 7 clulas linfoides. Las
relaciones de UN 260 a UN 280 debe caer en el intervalo de 1,7 a 2,0.
ARN en 1 mg / ml tiene una
UN 260 de 25 aos.
En el mtodo de guanidinio, ~ 200 g RNA debe ser
recuperado de 10 8 clulas utilizando el protocolo bsico. Este
ARN debe estar completamente libre de contaminacin de
ADN.
El mtodo de una sola etapa produce todo el espectro de
molculas de RNA incluyendo pequeos (4S a 5S) ARN. La
cantidad de ARN aislado depende del tejido utilizado para el
aislamiento. Tpicamente, de 100 a 150 g de ARN total se
asla a partir de 100 mg de tejido muscular y hasta 800 g es
aislado a partir de 100 mg de hgado. El rendimiento de ARN
total de 10 7 clulas cultivadas oscila de 50 a 80 g para los
fibroblastos y linfocitos y
Current Protocols in Immunology
100 a 120 g para las clulas epiteliales. los UN 260 / UN 280
relacin de la RNA aislado es> 1,8.
Aproximadamente el 1% del ARN de entrada debe ser
recuperada como poli (A) + ARN. El ARN debe aparecer como
una mancha de 20 kb hacia abajo (con mayor intensidad en el
intervalo de 5 a 10 kb) en un gel de agarosa, sin evidencia de
bandas de rRNA.
Consideraciones de tiempo
En cualquiera de fenol caliente o mtodos de ARN
citoplsmico, es posible proceder a partir de la recoleccin de las
clulas o el tejido de la etapa de precipitacin con etanol en 1 a 2
h. Este es el mejor punto de detencin provisional. El ARN puede
ser recuperado, volvi a disolver, y se cuantific ms tarde el
mismo da o al da siguiente.
En el mtodo de guanidinio, cosecha del ARN y la configuracin
del gradiente lleva muy poco tiempo ( ~ 1 h para seis muestras) y se
hace convenientemente en la noche, permitiendo que la centrfuga
de ejecucin de alta velocidad para ir durante la noche. En caso de
necesidad, el lisado celular de guanidinio puede ser congelado
rpidamente en hielo seco / etanol y se almacenan a - 70 C. Cuando
el ARN se disuelve despus del gradiente, se puede almacenar
como un etanol precipitar indefinidamente en cualquiera de las
etapas de precipitacin. Todo el protocolo requiere de 2 a 3 h de
manos a tiempo de 6 a 12 muestras.
El aislamiento de RNA total por el mtodo SingleStep se
puede completar en <4 hr. El procedimiento puede interrumpirse
en una de las precipitaciones isopropanol o en las etapas de
lavado de etanol. Almacene las muestras a - 20 C si el
procedimiento se interrumpe en estos pasos. Evitar mantener las
muestras en solucin para> 30 min de desnaturalizacin.
Para la seleccin de poli (A), que se llevar ~ 1 hr para
preparar y equilibrar la columna. Ejecucin de la columna
tomar media hora. El ARN es estable una vez que est en
etanol.
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Preparacin de ARN
a partir de tejidos
y clulas

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