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T E S I S
PARA OBTENER EL GRADO DE:
MAESTRO EN CIENCIAS EN ALIMENTOS
PRESENTA:
DIRECTORES DE TESIS:
M. EN C. MARA DEL CARMEN BELTRN OROZCO
DRA. MARA GABRIELA VARGAS MARTNEZ
Currently the study of food with antioxidants has increased considerably due to the
interest that has beneficial efects on health from such compounds, such as cancer
prevention, cardiovascular and other inflammatory cancer diseases.
In addition to the frequent consumption of antioxidants is related to the reduction of
other diseases such as diabetes and heart disease. In this work we have studied 4
types of chia seeds from the states of Puebla and Colima and the oil extracted from it,
determining the antioxidant capacity of each sample by the ABTS method and the
amount of total phenolics with the FolinCiocalteu reagent, and identification of
phenolic compounds by capillary electrophoresis which is a very useful tool in food
analysis because it reduces the generation of pollutants, the analysis time and cost of
them.
The results showed that the fraction defatted chia seeds contains a high antioxidant
capacity (98.73 mmol Trolox / g sample) compared with fruits such as raspberries (84
mmol Trolox / g sample) and red apple (40 mmol Trolox / g shown) that are
distinguished by their high antioxidant content. While chia oil shows comparable
values of total phenols (12 mg acid gallic/100 g sample) compared to olive oil (13.36
mg acid gallic/100 g sample), with respect to analysis by capillary electrophoresis was
achieved identify up to 9 phenolic compounds in the case of seed defatted; ferulic
acid, vanillin, trans-cinnamic acid, gallic acid, caffeic acid, chlorogenic acid, myricetin,
quercetin and kaempferol. In the case of oils were identified up to 4 phenolic
compounds (depending on the type of oil), trans-cinnamic acid, chlorogenic acid, p-
coumaric acid and quercetin.
In general we can consider chia seed as a food with powerful antioxidant that
including it in the daily diet would help meet the daily requirement of antioxidants and
prevent certain inflammatory disease pathology, in addition to the benefits to be
gained by the other nutrients it contains such as protein, fiber, omega 3 and 6.
INDICE GENERAL
Pgina
NDICE GENERAL i
NDICE DE CUADROS iii
NDICE DE FIGURAS v
1. INTRODUCCIN 1
1.1 Caractersticas de la semilla de cha. 1
1.1.2 Cultivo. 2
1.1.3 Usos y aplicaciones. 3
1.1.4 Composicin de las semillas de cha. 5
1.1.5 La cha como fuente de cidos grasos indispensables 7
en la nutricin humana.
1.2 Antioxidantes. 8
IIi
2.3 Desarrollo experimental. 33
2.4 Equipo. 34
3. MTODOS. 34
4. RESULTADOS Y DISCUSIN. 40
4.1 Anlisis proximal 40
4.2 Contenido de fenoles totales en aceite y semilla de cha. 41
4.3 Determinacin de la capacidad antioxidante por el mtodo 45
del ABTS.
4.4 Identificacin de compuestos fenlicos mediante 47
electroforesis capilar.
5. CONCLUSIONES 92
6. BIBLIOGRAFA 94
ii
NDICE DE CUADROS
Cuadro No. Pgina
iii
16 Condiciones ptimas de anlisis halladas 62
experimentalmente.
iv
NDICE DE FIGURAS
Figura No. Pgina
5. Electroferograma. 18
16 Desarrollo experimental 33
v
19. Contenido de fenoles totales de la semilla de cha 44
desgrasada con otros frutos.
vi
38. Electroferograma del aceite 301. 69
vii
1 INTRODUCCIN
La cha (Salvia hispnica L.) es una planta herbcea de la familia de las Lamiceas;
junto con el lino (Linum usitatissimum), es una de las especies vegetales con la
mayor concentracin de cido graso alfa-linolnico omega 3 conocidas hasta 2006.
Se cultiva por ello para aprovechar sus semillas, que se utilizan molidas como
ingrediente alimenticio (Cahill, 2003).
Reino: Plantae
Subreino: Tracheobionta
Divisin: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Subclase: Asteridae
Orden: Lmiales
Familia: Lamiceas
Subfamilia: Nepetoideae
Tribu: Mentheae
Gnero: Salvia
Especie: S. hispanica L.
Nombre binomial S. hispanica L.
Figura 1. Cultivo de cha y clasificacin botnica
1
1.1.2 CULTIVO
Desplazada por los cereales aportados por los espaoles, el cultivo de cha
desapareci durante la colonia; sobrevivi slo en reas montaosas aisladas de
Mxico (donde se cultiva comercialmente desde hace siglos y hasta la fecha) y
Guatemala. El mayor centro productor de Mxico est en Acatic, Jalisco, de donde
se exportan cantidades crecientes a Japn, Estados Unidos y Europa.
Un proyecto comercial desarrollado conjuntamente por varios pases de Amrica
Latina comenz en la dcada de 1990 a replantar experimentalmente la cha en el
norte de Argentina, para proporcionar a los agricultores cultivos alternativos, con
resultados excelentes (Ayerza, 1996).
Los rendimientos del proyecto alcanzaron los 1.6 t/ha, con contenidos de aceite de
hasta el 38,6%. Se han suscrito contratos para la produccin comercial de cha en
las provincias de Catamarca, Salta y Tucumn (Argentina), exportando el producto
sobre todo a los Estados Unidos. La viabilidad en los estudios piloto se estimaba
entre el 78% y el 87% (Coates, 1996).
2
1.1.3 USOS Y APLICACIONES
Hay evidencia cientfica que muestra que la semilla de cha comenz a usarse en la
alimentacin humana hace 3,500 aos A.C. y se convirti en uno de los cultivos
bsicos en el centro de Mxico entre 1,500 y 900 A.C junto con el amaranto, frjol y
maz. Por siglos, la semilla de cha fue utilizada como alimento por los indgenas del
oeste y del sur de Mxico. Los aztecas, entre otros usos, ofrecan la cha a los dioses
como parte de las ofrendas en las ceremonias religiosas. Conocida como el alimento
de caminatas, su uso como un alimento de resistencia y alta energa ha sido
registrado desde los tiempos remotos de los antiguos Aztecas, cuyos guerreros
subsistan con la semilla durante sus conquistas. Los indgenas del suroeste ingeran
muy poco, no ms de una cucharada llena cuando salan de marchas forzadas
durante 24 horas (Ayerza, 1996).
Hacia el ao 1600 D.C. se registraron 101 usos importantes de los cuales el 41%
correspondan a los medicinales y el resto eran culinarios, artsticos y religiosos,
entre otros. Las partes de la planta que se utilizaban como ingrediente en la
formulacin de medicamentos eran en su mayora las semillas y en menor medida
los tallos, hojas y races, las cuales se utilizaban principalmente para combatir las
infecciones respiratorias. Entre los usos medicinales de la semilla destacaban el
tratamiento contra fiebres, diarreas, estreimiento, regulacin de la secrecin biliar,
infecciones y obstrucciones en el ojo e infecciones respiratorias, tambin serva
como estimulante y para proteger la piel. Como alimento, las semillas de cha se
tostaban y molan hasta obtener una harina conocida con el nombre de Chianpinolli.
La harina se incorporaba en las tortillas, tamales y en varias bebidas de los aztecas
llamadas Chianatoles. Los usos artsticos se restringieron al aceite de la semilla para
pinturas, barnices, cosmticos (como emoliente) y para dar acabados brillosos a las
vasijas y platos. Adicionalmente, el aceite sirvi como componente bsico en la
pintura para el cuerpo y rostro (Cahill, 2003).
3
En rituales religiosos, las semillas le servan a los aztecas como ofrenda al dios
Chiomecoatl relacionado con la fertilidad (Cahill, 2003).
Si se mezcla una cuchara llena de cha dentro de un vaso de agua y se deja durante
aproximadamente 30 minutos se forma una gelatina casi slida. La reaccin que
genera el gel se debe a la fibra soluble presente. El gel que se forma en el estmago
crea una barrera fsica entre los carbohidratos y las enzimas digestivas que los
disuelven, de manera tal que disminuye la conversin de carbohidratos en azcar
(Ayerza, 2002).
En adicin a los obvios beneficios para los diabticos, esta demora en la conversin
de los carbohidratos en azcar genera la habilidad de crear resistencias. Los
carbohidratos son la gasolina en nuestros cuerpos. La prolongacin de su conversin
a azcar estabiliza los cambios metablicos, creando as una mayor duracin en sus
efectos de generacin de energa. Adems, una de las cualidades excepcionales de
estas semillas son sus propiedades hidroflicas, teniendo la habilidad de absorber
ms de 12 veces su peso en agua, dicha habilidad de mantener el agua ofrece la
posibilidad de prolongar la hidratacin los fluidos y electrolitos que proveen el entorno
que da vida a las clulas del cuerpo humano. Con semillas de cha, se puede retener
la humedad, regulando la absorcin corporal de nutrientes y fluidos corporales.
Debido a que hay una gran eficiencia en la utilizacin de los fluidos corporales, el
balance electroltico se mantiene (Ayerza, 2002).
4
La cha es un nuevo cultivo que tiene gran potencial para ser explotado y puede
servir para reemplazar cultivos tradicionales no rentables en el pas, que los hay y
son muchos. Es ideal para enriquecer gran cantidad de productos como frmulas
para bebs, alimento para animales, barras nutritivas, entre otros. (Beltrn y Romero,
2003).
Cuando se utiliza como alimento animal se pueden obtener productos enriquecidos
con -3 como huevos, pollos, carne vacuna, jamn, leche, quesos, etc. Utilizada
como una fuente de cidos grasos -3, no requiere el uso de antioxidantes
artificiales como las vitaminas sintticas. El aceite esencial encontrado en las hojas
tiene un gran valor potencial como insecticida puesto que impide el ataque de
algunos insectos a la planta (Craig, 1997).
5
Una vez que el aceite se ha extrado de la semilla de cha, el material remanente
contiene un 40% de fibra, de la cual un 5% es fibra soluble o diettica. Los extractos
de agua y metanol de la semilla de cha una vez que se ha prensado y extrado el
aceite, han demostrado una fuerte actividad antioxidante (Beltrn y Romero, 2003).
La semilla de cha contiene una cantidad de compuestos con potente actividad
antioxidante, entre los ms importantes se encuentran el y - tocoferol y
antioxidantes fenlicos tales como cidos clorognico y cafeico y flavonoles
(miricetina, quecetina y kaempferol). La importancia de los mismos radica en su
proteccin frente a la oxidacin lipdica que afecta tanto la calidad de los alimentos
como la salud de los consumidores, con el posible deterioro de las caractersticas
organolpticas, funcionales y nutricionales (Taga et al. 1984).
En el Cuadro 1 se muestra la concentracin de compuestos antioxidantes presentes
en la semilla de cha de los estados de Jalisco y Sinaloa en un estudio realizado por
Taga et al en 1984.
6
1.1.5 LA CHA COMO FUENTE DE CIDOS GRASOS INDISPENSABLES EN LA
NUTRICIN HUMANA.
Las cantidades necesarias de cidos grasos Omega-3 van a depender del ciclo de
vida de cada persona y de su estado fisiolgico o patolgico que pueden llevar a un
aumento en las necesidades de cidos grasos. Se estima en promedio que es
necesaria una ingesta del 1 % de la energa total de cidos grasos Omega-3 y un 4%
de la energa total para los Omega-6. El problema radica en que el contenido de
cidos grasos Omega-3 en nuestra alimentacin es muy bajo, por lo que el consumo
diario no alcanza a superar el 0,5 % de la energa total (Harper et al. 2006).
De todas las fuentes de cido grasos Omega-3, slo el lino (Linum usitatissimum L.)
y la cha tienen su origen en cultivos agrcolas. Ambas son especies vegetales con la
mayor concentracin de cido graso a-linolnico conocida hasta la fecha. Estas
semillas, fuentes de Omega-3 a menudo se utilizan molidas como ingrediente
alimenticio, o en forma natural como suplemento diettico. Las otras dos fuentes
disponibles son de origen marino: las algas y el aceite de pescado (Ayerza, 1995).
7
cardiovasculares, cataratas, declinacin del sistema inmunolgico y disfuncin
cerebral, de las cuales se quiere estar protegido precisamente al ingerir cidos
grasos -3 y antioxidantes (Okuyama et al. 1997).
1.2 ANTIOXIDANTES
8
Los principales compuestos que tienen actividad antioxidante son: carotenoides,
fosfolpidos, tocoferoles (vitamina E), vitamina C, compuestos fenlicos, pigmentos, y
sistemas enzimticos como la superxido dismutasa, catalasa y glutatin peroxidasa.
Las vitaminas E, C, carotenos y los cofactores (Cu, Zn, Mn, Fe y Se) son importantes
antioxidantes que funcionan de manera sinrgica inhibiendo la formacin de
radicales libres. Los compuestos fenlicos interfieren con el proceso de oxidacin al
reaccionar con radicales libres, quelan metales catalticos y capturan el oxgeno.
Estos compuestos se dividen en dos grupos: flavonoides y no flavonoides (Cedillo,
2006).
9
1.3 COMPUESTOS POLIFENLICOS
Los compuestos fenlicos o polifenoles, son las sustancias que poseen un anillo
aromtico, unidos a uno o ms grupos hidroxilo, incluyendo derivados funcionales
(esteres, glucsidos, etc.) (Macheix et al. 1990)
10
Cuadro 3. Las principales clases de compuestos fenlicos en frutos.
tomos de Estructura Clase Ejemplo Fruto
carbono Bsica (Ejemplo)
11
Figura 2. Biosntesis de los compuestos fenlicos a partir de la va del
shikimato y fenilalanina
Fuente; Harborne, 1989.
12
Figura 3. Formacin de fenilpropanoides, estilbenos, lignanos, ligninas,
suberinas, cutinas, flavonoides y taninos a partir de la fenilalanina. FAL:
Fenilalanina amonio liasa.
Fuente; Shahidi y Naczk 2004.
13
1.3.2 ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS COMPUESTOS FENLICOS
A lo largo de los aos, algunos beneficios han sido atribuidos a los compuestos
fenlicos, y un gran nmero de estudios han sugerido que el consumo de frutas y
verduras pueden reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares y de cncer,
potencialmente a travs de la actividad biolgica de los compuestos fenlicos as
como de las vitaminas como antioxidantes (Proteggente et al. 2003). Por lo que los
polifenoles pueden prevenir a la oxidacin lipdica, la mutacin del DNA y el dao del
tejido (Figura 4).
14
El comportamiento antioxidante de los compuestos fenlicos parece estar
relacionado con su capacidad para quelar metales, inhibir la lipoxigenasa y captar
radicales libres, aunque en ocasiones tambin pueden promover reacciones de
oxidacin in vitro. (Decker, 1997).
Para que un compuesto fenlico sea clasificado como antioxidante debe cumplir dos
condiciones bsicas:
1) Cuando se encuentre en una concentracin baja con relacin al sustrato que va a
ser oxidado pueda retrasar o prevenir la autooxidacin o la oxidacin mediada por un
radical libre.
2) El radical formado tras el secuestro sea estable y no pueda actuar en oxidaciones
posteriores.
15
1.4 ELECTROFORESIS CAPILAR
Fe= -Ff
Si Fe = EQ y Ff = 6 rivi
Q Q
Por lo tanto: vi E e
6 ri 6 ri
16
Las separaciones por tanto se basan en las diferencias en la relacin carga-tamao
entre los diferentes analitos presentes en la muestra; cuanto mayor sea esta relacin
ms rpido migrar el in en el seno del campo elctrico. Para iones del mismo
tamao, el de mayor carga elctrica migrar ms rpidamente. Para iones con la
misma carga migrar ms aquel de menor tamao, ya que tendr una fuerza de
retardo por rozamiento de menor valor. La resistencia del medio al paso del in
tambin influir en su movilidad electrofortica, siendo sta mayor cuanto mayor sea
la viscosidad del medio. Para hacer una separacin efectiva es necesario mantener
constantes las cargas de cada especie de iones, de manera que la relacin carga-
tamao (y por tanto la velocidad de migracin) permanezcan en el intervalo ms
estrecho posible. Asegurar que la carga se mantiene igual sobre cualquier cido o
base quiere decir que las separaciones electroforticas requieren disoluciones
tampn (Castanon, 2006).
17
Otra ventaja adicional de la electroforesis capilar es que las especies separadas
pueden detectarse directamente al aplicar el mtodo, es decir la tcnica se puede
automatizar. Se obtiene una grfica de la respuesta en funcin del tiempo, llamada
electroferograma (Figura 5), en la que cada pico representa una especie qumica
separada (Albarrn, 2000).
Figura 5. Electroferograma.
18
con la fase estacionaria. De manera que la eficacia (o nmero de platos N) en
electroforesis capilar vendra dada por:
N = eV / 2D
Dnde: D es el coeficiente de difusin del soluto. Por tanto, para aumentar la eficacia
N, y por tanto la resolucin, es necesario aumentar lo mximo posible el potencial
elctrico V (Curtis et al. 1994).
Al aplicar una diferencia de potencial entre los extremos de un capilar que contiene
un lquido (electrolito), el lquido se mueve, este movimiento se denomina flujo
electroosmtico (Figura 6).
19
Figura 7. Formacin de la doble capa elctrica.
A pH por encima de 3, la pared interna del capilar de slice presenta carga negativa
debido a la desprotonacin de los grupos silanol (Si-OH) de la superficie. Los
cationes de la disolucin formarn cerca de la superficie del capilar una primera capa
interna, fija, en la que los cationes, inmviles, estn unidos fuertemente a la
superficie del capilar. Una segunda capa, denominada capa mvil o difusa, formada
tambin por cationes aunque unidos de manera ms dbil a la superficie del capilar,
migrar hacia el ctodo (electrodo negativo) en presencia de un campo elctrico.
20
(a) (b)
Figura 8. Perfiles de flujo para lquidos: (a) por presin electroosmtica EC, y
(b) por presin hidrodinmica HPLC.
FE
21
En general, cualquier alteracin en la disolucin que modifique la carga en la
superficie del capilar, modifique la viscosidad del tampn o requiera un cambio en el
potencial, altera la velocidad del FE. Como se ha comentado, el flujo electroosmtico
da lugar a un perfil de flujo plano, lo que reduce significativamente el
ensanchamiento de banda y por tanto, mejora la resolucin. Adems, la gran ventaja
que presenta el FE es que la separacin electrofortica y la deteccin pueden
realizarse a la vez para cationes y aniones. Sin el FE, o slo aniones, o slo cationes
migraran hacia el detector. El in de carga opuesta migrara retrocediendo al final de
la inyeccin, y los compuestos neutros se quedaran al final y se dispersaran por
difusin. Con FE todas las especies pasan por el detector (Figura 9) (Chicharro,
2006).
Dnde:
V= Velocidad del in v = (e + feo) E
e = Velocidad electrofortica
feo= Velocidad del flujo
electroosmtico
E= Campo elctrico
22
En una electroforesis capilar en la que las especies migran hacia el ctodo, los iones
negativos tendrn una movilidad electrofortica e negativa, y por tanto estos iones
migrarn ms lentamente que los positivos. El resultado final en el electroferograma
ser una serie de picos que indican el siguiente orden de elucin: primero los
cationes ms rpidos, seguidos sucesivamente de los cationes ms lentos, todas las
especies neutras en una nica zona, y finalmente los aniones ms lentos seguidos
de los aniones ms rpidos (Pais y Knize, 2000).
Inyeccin electrocintica: se retira del depsito del regulador uno de los extremos
del capilar junto con el electrodo, y se colocan en un pequeo recipiente que
contiene la muestra. Se aplica un potencial de corriente durante un tiempo, por lo que
la muestra penetra en el capilar debido al flujo electroosmtico y a la migracin
inica. Despus el extremo del capilar y el electrodo son introducidos de nuevo en el
recipiente con la disolucin regulador (Figura 10). Inconvenientes: la muestra no es
del todo representativa, ya que se introduce en el capilar ms cantidad de los iones
ms mviles respecto a los ms lentos (Castaeda et al. 2005).
23
Figura 10. Inyeccin electrocintica.
24
1.5 APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR AL ANLISIS DE
ALIMENTOS.
Los compuestos fenlicos son metabolitos secundarios presentes en las plantas, los
cuales poseen una caracterstica comn de las estructuras; una fraccin de fenol, y
se comportan como antioxidantes excelentes debido a la reactividad de este grupo.
Los compuestos fenlicos son de inters debido a su posible contribucin al gusto
(astringencia, la amargura, y acidez) y la formacin de los sabores desagradables en
los alimentos, incluidos el t, caf y jugos de diferentes frutas, durante el
almacenamiento (Vallejo y Vargas 2007).
25
Varios anlisis han sido publicados, que puede ser utilizado como una gua para el
anlisis de estos compuestos en los alimentos EC (Da Costa et al. 2000) (Herrero et
al. 2005).
En una revisin reciente, se discutieron las estrategias que se han utilizado durante
la optimizacin de los mtodos de E.C. para el anlisis fitoqumico de los compuestos
bioactivos, y se propuso el uso de mltiples variables diseos experimentales para
simplificar esta tarea (Li et al. 2006).
26
Cuadro 4. Mtodos para el anlisis de compuestos fenlicos mediante E.C.
APLICACIN METODO DE MODO BUFFER REFERENCIA
DETECCIN
E.C. UTILIZADO
Fraccin polifenlico de aceite de olivo extra virgen UV CZE 45 mM tetraborato de Blasco et al. 2005.
sodio pH 9.3
Polifenoles en aceite de olivo UV CZE 60 mM acetato de Carrasco et al 2006
amonio pH 9.5
Polifenoles en queso (Bromus inermis L.) UV CZE 20 mM tetraborato de Strerbova et al 2006
sodio pH 9.2
Rutina y quercetina in plantas ELECTROQUMICA MECK 20 mM boratos pH 8.8 Li et al. 2002
Resveratrol en vinos, hierbas, y en alimentos saludables ELECTROQUMICA CZE 100 mM borato pH 9.24 Gao et al. 2002.
cidos fenlicos (derivados de cido benzoico y cinmico) CONDUCTIMETRIA CZE 150 mM 2-amino-2- Kuban et al. 2006.
metilpropanol
Flavonoides y compuestos fenlicos (cido ferlico, apigenina,
luteolina,cido rosmarinico y cido cafeico) en Perilla frutescens L. ELECTROQUMICA CZE 100 mM boratos pH 8.7 Peng et al 2005.
sodio pH10.5
DAD; detector de arreglo de diodos, CZE: electroforesis capilar de zona, MECK; Electroforesis micelar electrocintica.
27
Otras aplicaciones de la EC en el anlisis de alimentos son mencionados por Vallejo y
Vargas en 2007 y entre los principales se encuentran ;
Separacin de los cidos del lpulo que dan amargor mediante CZE y MEKC
(cidos y de extracto de lpulo comercial).
28
La versatilidad de la electroforesis capilar en el anlisis de alimentos se demuestra
claramente por los numerosos y amplios mtodos presentados anteriormente. Por otra
parte, la eficiencia y la rapidez de la E.C. en las separaciones fueron las principales
ventajas que hacen de esta tcnica una alternativa atractiva en los laboratorios de
anlisis de alimentos. La E.C an est lejos de ser tan bien establecida como las
tcnicas cromatogrficas, aunque ciertamente ha ganado popularidad como una
alternativa a la electroforesis convencional en gel para el anlisis de protenas de los
alimentos, muy probablemente debido a la naturaleza cuantitativa de la CE, gran poder
de resolucin y velocidad de anlisis. Tal vez el mayor potencial de la EC fue
encontrado en la industria alimentaria para garantizar la calidad y autenticidad de los
alimentos (Vallejo et al. 2007).
29
JUSTIFICACIN
Esta investigacin tiene por objetivo caracterizar la semilla de cha cultivada en los
estados de Puebla y Colima, con relacin a los compuestos polifenlicos presentes en
la misma y en el aceite extrado de dicha semilla, mediante la tcnica de electroforesis
capilar debido a que es una tcnica actual y muy eficiente en cuanto al anlisis qumico
se refiere, las cantidades de muestra y reactivos que se utilizan son en cantidad mnima
comparndolas con otras tcnicas que son costosas, tardadas y con menor eficiencia.
30
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
OBJETIVOS ESPECFICOS:
31
2. MATERIALES Y MTODOS
Figura 12. Semilla 094 Figura 13. Semilla 125 Figura 14. Semilla 287
Aumento 10x Aumento 10x Aumento 10x
Semilla 301 de cha (Salvia hispnica L.) proveniente del Estado de Colima
32
2.3 DESARROLLO EXPERIMENTAL.
En la Figura 16, se muestra el diseo experimental que se seguir para el desarrollo de
esta investigacin.
33
2.4 Equipo
Balanza analtica, marca Sartorius, modelo H110.
Balanza analtica, marca Mettler-Toledo, modelo PB5001.
Bomba de vaco, marca Welch, Modelo GEM 1.0,
Cartuchos Diol SEP-PACK, marca Waters.
Espectrofotmetro con longitud de onda visible, marca Perkin Elmer.
Evaporador rotatorio, marca Yamato modelo BM100.
Sonicador, marca Sonic modelo 200.
Sistema de electroforesis capilar P/ACE marca MDQ Beckman-Coulter.
3. MTODOS
(V )( N )( 0.014 )( f )
% proteina (100 )
( w)
Dnde:
V = Volumen gastado de HCl en la titulacin.
N = Normalidad del HCl.
14 = Equivalente-gramo del nitrgeno.
w = Peso de muestra en gramos.
f = Factor proteico (6.25).
El contenido de protena puede representarse en gramos por 100g de muestra,
g/100g.
34
3.2 DETERMINACIN DE HUMEDAD: (A.O.A.C. 14.003, 1990). El contenido de
humedad, se cuantifica de la diferencia entre el peso inicial y final, de una muestra
representativa sometida a una temperatura de 130 C.
CC C
%cenizas (100)
w
Dnde;
CC = peso inicial de la muestra.
C = peso final de la muestra.
w = peso de la muestra.
% lpidos = ( a b) X 100
B.S.
m
Dnde:
a = Peso del cartucho a peso constante conteniendo la muestra deshidratada
envuelta en papel filtro.
b = peso del cartucho del inciso anterior llevado a peso constante.
m = peso de la muestra seca en gramos.
35
3.6 DETERMINACIN DE CARBOHIDRATOS: Los carbohidratos totales se calculan
por diferencia de porcentaje de humedad, protena, lpidos, cenizas y fibra (Blanco-
Metzler et al. 2009). El contenido de carbohidratos totales se calcul de acuerdo a la
siguiente ecuacin:
Se prepararon soluciones de 100, 200, 300, 400 y 500 mg/L de cido glico o tnico.
En los tubos de ensaye se adicionaron 100 L de cada una de las soluciones
anteriores, 100L de agua desionizada, 1 mL del reactivo de Folin Ciocalteu y 0.8 mL
de una de solucin de carbonato de sodio al 7.5 %.
37
Tratamiento de la muestra.
38
Los capilares fueron acondicionados antes de cada separacin lavndolos con
hidrxido de sodio 0.1 M durante 2 min, agua desionizada durante 2 min, y luego con
el regulador de pH elegido durante 10 min para equilibrar el capilar.
Despus del ltimo anlisis de cada da, los capilares se lavaron con hidrxido de
sodio 0.1 M durante 2 min, y finalmente con agua desionizada (10 min).
Los estndares se disolvieron en etanol al 80 % a excepcin de la miricetina,
quercetina y kaempferol que fueron disueltos en dimetilsulfoxido al 10 % en etanol.
Todos los estndares fueron preparados a una concentracin de 1000 ppm.
39
4. RESULTADOS Y DISCUSIN.
a
Valores expresados en base hmeda por triplicado con desviacin estndar.
2 y = 0.0033x + 0.1116
1.8 R = 0.9966
1.6
1.4
1.2
A 765 nm
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 100 200 300 400 500 600
cido glico mg/L.
41
Cuadro 6. Contenido de fenoles totales en aceite y semilla de cha.
Fraccin de semilla mg cido Aceite de cha mg cido
desengrasada glico/100 g extrado de la semilla glico/100 g
a a
muestra muestra
Aceite de cha 5.920.42
prensado en fro
Semilla 094* 1104.716.05 Aceite 094* 11.490.53
42
En promedio la cantidad de fenoles totales contenidos en el aceite de olivo de
diferentes regiones de Italia como se muestra en un estudio realizado por Baiano et
al en 2009 y su comparacin con las diferentes muestras de aceite de cha, es
aproximadamente 3 veces mayor a la del aceite de cha (Figura 18), a excepcin de
una de las muestras de aceite estudiadas en el presente trabajo (aceite 094) la cual
es comparable con el contenido de fenoles del aceite de olivo, esta diferencia es
probablemente debido al tipo de la semilla y no por el mtodo de obtencin del
aceite.
20
18
mg cido glico/100 g muestra
16
14
12
10
8
6
4
2
0
43
Al ser comparada la semilla de cha con frutos que se sabe que tienen un alto
contenido de compuestos antioxidantes y los cuales fueron estudiados por Garca-
Alonso (2003), se observa que de igual forma que con los cereales, la semilla de cha
tiene una cantidad superior de compuestos fenlicos, a excepcin de la muestra 125
que se encuentra en el mismo orden (900 mg cido glico/100 g muestra).
1400
1000 985.33
910 904.01
800
600
400
200 159.02
97.39
34.55
0
44
4.3 DETERMINACIN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE POR EL MTODO
DEL ABTS.
Previamente se realiz una curva tipo de Trolox como compuesto estndar, debido a
su analoga con la vitamina E, las unidades en las que se realiz la curva tipo fueron:
Absorbancia vs M Trolox (Figura 20).
0.8 y = -0.0292x + 0.6899
0.7
R = 0.9904
0.6
ABSORBANCIA 734nm
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
M TROLOX
Una vez realizada la curva tipo de Trolox se sustituyeron las absorbancias y los
resultados obtenidos se muestran en el Cuadro 7.
Cuadro 7. Capacidad antioxidante de los distintos tipos de semilla de cha y
aceite.
Semilla (M Trolox/g (mol Trolox/g Aceite extrado (M Trolox/g (mol
desengrasada muestra)a muestra)a de la semilla muestra)a Trolox/g
muestra)a
Semilla094 283.2835.31 56.657.06 Aceite 094 9.670.79 1.930.16
45
La capacidad antioxidante que poseen los aceites de cha del presente estudio y la
fraccin desengrasada de la misma semilla, muestran una relacin directa con el
contenido total de fenoles, es decir las muestras de aceite incluyendo el comercial de
cha muestran una actividad antioxidante del orden de 50 veces menor que la
fraccin desengrasada, estos resultados corroboran que en el aceite de cha la
cantidad de compuestos fenlicos es mnima en relacin con la fraccin
desengrasada la cual muestra una fuerte actividad antioxidante, sin embargo, al igual
que en la determinacin de fenoles totales existen diferencias importantes de
actividad antioxidante entre los diferentes tipos de semilla de cha, lo cual es de
inters debido a que cada tipo parece tener un perfil diferente de compuestos
fenlicos que actan como antioxidantes.
En el Figura 21 se hace la comparacin de la actividad antioxidante de las semillas
de cha estudiadas en el presente trabajo con la actividad antioxidante de otros frutos
en un estudio realizado por Garca-Alonso et al (2003) bajo el mismo mtodo (ABTS).
Puede observarse que la muestra de cha 125 presenta una mayor capacidad
antioxidante que el resto de las muestras de cha e incluso de frutos que
comnmente se relacionan con un alto contenido en antioxidantes como la cereza,
frambuesa, manzana, granada y kiwi. Esto nos indica que al igual que en el aceite de
cha, la muestra 125 proveniente del estado de Puebla, contiene un mayor poder
antioxidante que el resto de las muestras analizadas en el presente trabajo, lo cual
indica que efectivamente cada muestra de semilla de cha contiene un perfil
polifenlicos diferente al resto.
46
120
98.73
100
84 82
mol Trolox/g muestra
80 72.3
69
56.65
60
45.56
40 38
40
20
47
Todos los estndares utilizados fueron grado HPLC, para garantizar su pureza.
El primer procedimiento fue obtener las condiciones ptimas para que el mtodo
fuera reproducible y confiable para el posterior anlisis de los extractos de las
muestras de aceite y de semilla de cha desgrasada.
48
Tambin se disminuy el tiempo de inyeccin de la muestra a 5 segundos en lugar
de 8 segundos que tena anteriormente, de este modo se redujo el volumen de
muestra y consecuentemente de disolvente dentro del capilar. Bajo estas
condiciones se logr obtener el electroferograma de los estndares que se muestran
en la Figura 22.
0.0775 2 0.0775
1.-Vainillina
0.0750
2.-cido tnico 0.0750
4.-cido ferlico 2
0.0700 0.0700
5.-cido p-cumrico 7
0.0675 6.-cido vainillinico 4 8 0.0675
0.0650
7.-cido cafeico 0.0650
8.-cido glico 5
0.0625
AU
0.0625
AU
0.0600 0.0600
0.0575 1 3 6 0.0575
0.0550 0.0550
0.0525 0.0525
0.0500 0.0500
0.0475 0.0475
2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0
1
Minutes
49
con otros anillos a su vez y de esta forma se forma un polmero lo cual no lo hace
apto para utilizarlo como estndar en el presente trabajo. Por la razn antes
mencionada se decide excluir de la lista de estndares el cido tnico ya que no es
considerado estrictamente un polifenol.
Una vez determinados los estndares que se podan utilizar se procedi a realizar
diferentes anlisis para verificar la reproducibilidad del mtodo. Se cambi el capilar
y se procedi a acondicionarlo (lavarlo) con el procedimiento descrito en el apartado
de mtodos. Una vez efectuado el acondicionamiento del capilar se procedi a
realizar el ensayo de los estndares bajo diferentes condiciones.
Voltaje de anlisis 20 kV
50
Cuadro 10. Condiciones utilizadas en el anlisis electrofortico.
Voltaje de anlisis 24 kV
Voltaje de anlisis 24 kV
Las condiciones resultaron no ser las ptimas para trabajar ocasionando que la
corriente dentro del capilar aumentara y terminara por caerse, por tal motivo se
decidi cambiar el medio conductor (amortiguador) a uno de Na2B4O7.10H2O de
concentracin 50 mM al 7.5 % de metanol y ajustando el pH a 9.4. Al cambiar el
amortiguador, las condiciones de anlisis tambin debieron cambiar a las que se
muestran en el Cuadro 12.
51
Cuadro 12. Condiciones utilizadas en el anlisis electrofortico.
Presin de inyeccin 0.5 psi.
Se analizaron en dos ocasiones a 28.8 kV con inyeccin de 0.5 psi por 5 segundos
(Figura 23), observndose una buena reproducibilidad del mtodo.
52
0.20 0.20
UV - 200nm UV - 200nm
MEZCLASTD30mM3-31-2009 1-06-10 PM.dat mezclastd30mm3-31-2009 12-24-29 pm.dat
1.-Vainillina
0.18 1 2.-cido clorognico 0.18
3.-cido ferlico
0.16 4.-cido p-cumrico 0.16
5.-cido vainillinico
0.14
6.-cido benzoico 0.14
7.-cido cafeico
5 6 8.-cido glico
0.12 0.12
AU
AU
0.10
1 0.10
0.08 0.08
0.06 0.06
7 8
2
0.04 3 0.04
4
0.02 0.02
0.00 0.00
5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0
Minutes
AU
AU
AU
0.150 0.150 0.150 0.150
53
0.50 0.50
UV - 200nm UV - 200nm UV - 200nm UV - 200nm
CUM-BENZ30mM3-31-2009 4-29-15 PM.dat cum-benz30mm3-31-2009 4-29-15 pm.dat CUM-BENZ30mM3-31-2009 4-29-15 PM.dat 6estandar30mm3-31-2009 4-59-43 pm.dat
0.45
cido cumrico-cido benzoico. 0.45
0.275
mezcla de seis estndares. 0.275
0.250 0.250
0.40 0.40
0.225 0.225
0.35 0.35
0.200 0.200
0.30 0.30
0.175 0.175
AU
AU
AU
AU
0.25 0.25 0.150 0.150
0.125 0.125
0.20 0.20
0.100 0.100
0.15 0.15
0.075 0.075
0.10 0.10
0.050 0.050
0.05 0.05
0.025 0.025
UV - 200nm UV - 200nm
0.250 0.250
8ESTANDAR30mM3-31-2009 5-17-06 PM.dat 6estandar30mm3-31-2009 4-59-43 pm.dat
1.-Vainillina
0.225
2.-cido clorognico 0.225
3.-cido ferlico
0.200
4.-cido p-cumrico 0.200
5.-cido vainillinico
0.175 6 6.-cido benzoico 0.175
7.-cido cafeico
0.150
8.-cido glico 0.150
AU
AU
0.125 0.125
5
0.100 0.100
0.075 0.075
4 7
0.050
1 2 3
8 0.050
0.025 0.025
0.000 0.000
5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5
Minutes
Posteriormente una vez que ya se haba obtenido el mtodo adecuado para hacer el
anlisis de fenoles mediante electroforesis capilar, se procedi a analizar una
muestra comercial de aceite de cha para observar el perfil polifenlico que este
mostraba (Figura 26).
54
Figura 26. Electroferograma de extracto de aceite de comercial de cha.
55
Las condiciones utilizadas para este anlisis se muestran en el Cuadro 13.
Voltaje de anlisis 24 kV
Temperatura de 25C
anlisis
Amortiguador 30 mM de Na2B4O7.10H2O con 7.5% de metanol ajustado
a pH 9.4
Se puede observar que en cada anlisis que se le realiz al extracto, los resultados
no fueron reproducibles, en el primer anlisis se observa un par de saales a los 4
min aproximadamente y una seal ms alrededor de los 18 min, pero en el segundo
anlisis la seal de los 18 min se recorri hasta los 27 min aproximadamente.
56
Se realizaron ensayos por pares de estndares para observar si no exista un
traslape entre alguno de ellos, la reproducibilidad fue la mejor obtenida hasta el
momento, aunque s exista un traslape de dos seales. Se determin que el
estndar que se traslapaba era el cido benzoico y se decide excluirlo de la mezcla
ya que inicialmente se decidi incluirlo en la muestra como estndar interno pero
este se remplaz por vainillina, por tal razn se decidi quitarlo de la mezcla para
evitar que las seales se traslaparan.
Al final se analizaron los 8 estndares solubles en agua; cido cinmico, cido trans-
cinmico, cido cafeico, cido glico, cido vainillinico, cido clorognico, cido
cumrico y vainillina como estndar interno. Las condiciones ptimas que se
encontraron experimentalmente para realizar los ensayos se muestran en el Cuadro
14.
C. V= X 100
57
En el Cuadro 15, se observan los tiempos de migracin que se obtuvieron de cada
uno de los 8 estndares (picos) y su desviacin estndar durante los cuatro ensayos
que se realizaron. El coeficiente de variacin no deba ser mayor al 3% que es lo
deseable en cualquier mtodo analtico.
58
40 40
40 40
5.66 Min
5.87 Min
10STDnuevos 10STDnuevos
35 35
35 35
30 30 30 30
25 25 25 25
20 20 20 20
mAU
mAU
mAU
mAU
15 15 15 15
10 10 10 10
AC TRANS-CINMICO
5 5 5 5
0 0 0 0
VAINILLINA
-5 -5 -5 -5
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
nm nm
6.60 Min
180 8.83 Min
180
AC CLOROGENICO500ppm AC p-CUMARICO500ppm
80 80
160 160
70 70
140
AC P-CUMRICO 140
60 60
120 120
50 50
100 100
mAU
mAU
mAU
mAU
40 40
80 80
30 30
60 60
20 20
40 40
10 10
20
0 AC CLOROGNICO 0
20
0 0
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
nm nm
40 40
180 180
6.84 Min 7.62 Min
10STDnuevos
AC FERULICO500ppm
35 35 160 160
30 30 140 140
25 25 120 120
20 20 100 100
mAU
mAU
mAU
mAU
15 15 80 80
10 10 60 60
5 5 40 40
0
AC VAINILLNICO
0 20
AC FERLICO 20
-5 -5 0 0
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
nm nm
59
100 11.25 Min
100
13.36 Min
AC CAFEICO500ppm
50 AC GALICO500ppm
50
90 90
45 45
80 80
40 40
70 70
35 35
60 60
30 30
mAU
mAU
mAU
mAU
50 50
25 25
40 40
20 20
30 30
15
AC GLICO
15
20 20
10 10
10 AC CAFICO 10
5 5
0 0 0 0
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
nm nm
50 50
120 120
45 45
110 110
40 40
100 100
90 90
35 35
mAU
mAU
mAU
mAU
80 80
30 30
KAEMPFEROL
70 70
25 25 60 60
50 50
20 20
40 40
15 QUERCETINA 15
30 30
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
nm nm
8.68 Min
MIRICETINA500ppm
120 120
100 100
80 80
mAU
60
mAU
60
40 40
20 20
0 MIRICETINA 0
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
nm
60
Las condiciones ptimas de separacin de los estndares fueron determinadas
despus de hacer distintas pruebas en la concentracin del regulador a 50, 52.5, 55,
60 y 70 mM de Na2B4O7.10H2O, con pH fijo de 9.4, e inyeccin de 0.5 psi durante 5
segundos a 28 kV de voltaje y manteniendo la temperatura constante a 22C los
electroferogramas de estas pruebas se muestran en la Figura 28.
PDA - 200nm PDA - 200nm PDA - 200nm PDA - 200nm PDA - 200nm
0.12 10STD50mM 10std52.5mm 10std55mm 10std60mm 10std70mm 0.12
0.10 70 mM 0.10
0.08 0.08
60 mM
AU
0.06
AU
0.06
55 mM
0.04 0.04
50 mM
0.00 0.00
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Minutes
61
Se conoce muy bien que los boratos pueden formar complejos con dioles (Mazurek y
Perlin, 1963), por lo que no nos sorprende que la movilidad de varios de nuestros
polifenoles se vea afectada por el cambio en la concentracin de los boratos
Utilizados al formar complejos con algunos de los analitos, especialmente a los que
se encuentran entre los 9 y 10 min.
Una vez establecidas las condiciones ptimas de anlisis se procedi a realizar una
mezcla de todos los estndares mencionados anteriormente para lo cual se tomaron
0.5 mL de cada estndar y se mezcl en un sonicador para mejorar la disolucin de
la mezcla. La mezcla se realiz con soluciones de 1000 mg/L de cada estndar
disuelto en etanol al 80%, a excepcin de miricetina, quercetina y kaempferol los
cuales se disolvieron en dimetilsulfxido (DMSO) al 10% en etanol. Los anlisis
fueron realizados bajo las condiciones mencionadas en el Cuadro 16.
62
El electroferograma de la mezcla de los 11 estndares se muestra en la Figura 29.
0.055 0.055
1.-Vainillina
2.-cido trans-cinmico
0.050 0.050
3.-cido clorognico
4.-cido ferlico
5 5.-Kaempferol
0.045 0.045
6.-Miricetina
2 7.-cido p-cumrico
0.040 8.-cido vainillinico 0.040
9.-Quercetina
10.-cido cafeico
0.035 6 11.-cido glico 0.035
AU
AU
0.030 8 9 0.030
4 10 11
1 7
0.025 0.025
0.020 3 0.020
0.015 0.015
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Minutes
Figura 29. Electroferograma obtenido del ensayo para separar y determinar el
tiempo de migracin de los 11 estndares.
63
Figura 30. Espectros de absorcin obtenidos mediante detector de arreglo de
diodos.
64
4.4.2 ANLISIS DE LOS EXTRACTOS DE ACEITE DE CHA
0.056 0.056
0.054 0.054
0.052 0.052
0.050 0.050
0.048 0.048
AU
AU
0.046 0.046
0.044 0.044
0.042 0.042
0.040 0.040
0.038 0.038
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Minutes
65
compuestos fenlicos (un aumento de la intensidad de esa seal indicara la
presencia de dicho compuesto) (Figura 33).
0.06 0.06
0.05 0.05
0.04 0.04
AU
AU
0.03 0.03
0.02 0.02
0.01 0.01
0.00 0.00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Minutes
PDA - 200nm
0.055 0.055
0.050 0.050
0.045 0.045
cido clorognico
0.040
cido glico
0.040
0.035 0.035
Compuesto no
identificado
AU
0.030
AU
0.030
0.025 0.025
0.020 0.020
0.015 0.015
0.010 0.010
0.005 0.005
0.000 0.000
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Minutes
0.05 0.05
0.04 0.04
AU
AU
0.03 0.03
0.02 0.02
0.01 0.01
0.00 0.00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Minutes
PDA - 200nm
0.11 0.11
0.09 0.09
0.08 0.08
0.07 0.07
AU
0.06
AU
0.06
0.05 0.05
Compuesto no
0.04 identificado 0.04
0.03 0.03
0.02 0.02
0.01 0.01
0.00 0.00
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Minutes
67
La muestra de aceite 287 (Figura 36) al igual que la muestra 125, mostraron una
seal alrededor de los 9 min, indicando posiblemente la presencia de kaempferol, por
lo cual se procedi de igual forma a aadir una alcuota de dicho compuesto (Figura
37) para confirmar o eliminar dicha posibilidad.
0.055 0.055
0.050 0.050
0.045 0.045
0.040 0.040
0.035 0.035
AU
0.030
AU
0.030
0.025 0.025
0.020 0.020
0.015 0.015
0.010 0.010
0.005 0.005
0.000 0.000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Minutes
PDA - 200nm
0.11 0.11
0.10 0.10
0.08 0.08
0.07 0.07
AU
0.06
AU
0.06
Compuesto no
0.05
identificado
0.05
0.04 0.04
0.03 0.03
0.02 0.02
0.01 0.01
0.00 0.00
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Minutes
68
De igual forma se analiz la muestra de aceite 301, (Figura 38) sin embargo a pesar
de que efectivamente se observaron seales, todas estas no coincidieron con ningn
tiempo de migracin de alguno de los 11 estndares utilizados en el presente trabajo.
0.055 0.055
0.050 0.050
0.045 0.045
0.040 0.040
0.035 0.035
AU
0.030
AU
0.030
0.025 0.025
0.020 0.020
0.015 0.015
0.010 0.010
0.005 0.005
0.000 0.000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Minutes
69
En el extracto de la semilla 301 (Figura 42) se detectaron las seales de posibles
compuestos fenlicos como el cido trans-cinmico, cido clorognico, cido ferlico,
kaempferol, cido cafeico y cido glico.
0.12 0.12
0.10 0.10
0.08 0.08
AU
AU
0.06 0.06
0.04 0.04
0.02 0.02
0.00 0.00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Minutes
0.20 0.20
0.18 0.18
0.16 0.16
0.14 0.14
0.12 0.12
AU
AU
0.10 0.10
0.08 0.08
0.06 0.06
0.04 0.04
0.02 0.02
0.00 0.00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Minutes
70
0.10 0.10
0.09 0.09
0.08 0.08
0.07 0.07
0.06 0.06
0.05 0.05
AU
AU
0.04 0.04
0.03 0.03
0.02 0.02
0.01 0.01
0.00 0.00
-0.01 -0.01
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Minutes
0.11 0.11
0.10 0.10
0.09 0.09
0.08 0.08
0.07 0.07
0.06 0.06
AU
AU
0.05 0.05
0.04 0.04
0.03 0.03
0.02 0.02
0.01 0.01
0.00 0.00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Minutes
71
Para poder confirmar la presencia de estos compuestos fenlicos en los extractos de
semilla, se decidi aadir una alcuota de 5 L de cada estndar del cual se
sospechaba su presencia en la muestra, esto se decidi realizar debido a que los
tiempos de migracin de las muestras sufrieron un corrimiento en comparacin con la
mezcla de estndares, esto es ocasionado por la viscosidad de la muestra al ser
inyectada en el equipo de electroforesis capilar.
Debido a este fenmeno las seales sufrieron un desplazamiento del orden de
segundos, por lo cual fue necesario poder confirmar con la adicin del estndar del
cual se sospechaba su presencia y en caso de aumentar la seal se confirmaba de
ese modo la presencia de dicho compuesto.
72
0.20 PDA - 200nm PDA - 200nm
0.20
Ac trans-cinmico
0.16 0.16
0.14 0.14
0.12
1 0.12
AU
AU
0.10 0.10
2
0.08 0.08
0.06 0.06
0.04
3 0.04
4
0.02 0.02
0.00 0.00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Minutes
1.-extracto sin estndares aadidos. 2.-extracto con cido cafeico y cido trans-
cinmico aadidos. 3.-extracto con cido clorognico aadido.
Figura 43. Electroferograma de semilla 094 con estndares aadidos.
73
5 6 7 8 9 10 11
Minutes
PDA - 200nm PDA - 200nm
0.18 0.18
Ac trans-cinmico
0.16 0.16
0.16
0.14
cido clorognico
0.14
0.12 0.12
AU
AU
1
0.10 0.10
2
0.14
0.08 0.08
0.06 3 0.06
0.04 0.04
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
0.12 Minutes
AU
0.10
0.08
0.06
0.04
1.-extracto sin estndares aadidos. 2.-extracto con cido clorognico aadido. 3.-
extracto con cido trans-cinmico aadido.
6
Figura 44. Electroferograma 7 125 con estndares
de semilla 8 aadidos. 9 10
74
En la semilla 287 (Figura 45) se detect cido trans-cinmico y cido clorognico.
PDA - 200nm PDA - 200nm
0.10 0.10
0.09 0.09
cido clorognico
0.08 0.08
0.06 0.06
0.05 0.05
AU
AU
0.04
1
0.04
0.03 0.03
0.02 2 0.02
0.01
3 0.01
0.00 0.00
-0.01 -0.01
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Minutes
75
5 6 7 8
En la semilla de cha 301 se identific cido trans-cinmico y cido glico (Figura 46).
PDA - 200nm PDA - 200nm
0.14
Acido glico 0.14
Ac trans-cinmico
0.12 0.12
0.10 0.10
1
0.08 0.08
AU
AU
0.06 2 0.06
0.04 0.04
A - 200n m
0.02 0.02
3
0.00 0.00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Minutes
4 5 6 7 8 9
1.-extracto sin estndares aadidos. 2.-extracto con cido glico aadido. 3.-extracto Min
con cido trans-cinmico aadido.
Figura 46. Electroferograma de semilla 301 con estndares aadidos.
76
El nico compuesto fenlico que fue identificado en comn en las 4 muestras de
semilla de cha fue el cido trans-cinmico, y cada tipo de semilla contiene distintos
compuestos fenlicos, lo cual indica que dependiendo del tipo de semilla es el
contenido de compuestos fenlicos, mostrando as que cada variedad de semilla
tiene un perfil diferente de compuestos fenlicos.
Al realizar la comparacin con los resultados obtenidos por Taga et al en 1984, slo
se encuentra coincidencia en la presencia de cido clorognico compuesto que est
presente en las muestras 094, 125 y 287 provenientes del estado de Puebla, y cido
cafeico que est presente en una sola muestra (094), sin embargo, es de llamar la
atencin que los flavonoles miricetina, quercetina y kaempferol, no fueron detectados
en las muestras analizadas en el presente trabajo mientras que en el estudio
anteriormente mencionado s se reporta la presencia de dichos polifenoles.
77
Cuadro 18. Contenido de fenoles totales, capacidad antioxidante y fenoles
detectados mediante electroforesis capilar.
MUESTRA FENOLES CAPACIDAD COMPUESTO
TOTALES (mg ac ANTIOXIDANTE IDENTIFICADO
glico/100g (M Trolox/g
muestra) muestra)
Semilla 1.-cido clorognico.
094 1104.716.05 283.2835.31 2.-cido trans-cinmico.
3.-cido cafeico.
Semilla 1.-cido clorognico.
125 854.295.82 493.6751.12 2.-cido glico.
3.-cido trans-cinmico.
Semilla 1.-cido trans-cinmico.
287 1052.613.36 227.8120.37 2.-cido clorognico.
Aceite
comercial 5.920.42 10.700.52 N.D.
de cha
Aceite 094 11.490.53 9.670.79 N.D.
N.D.= No detectado.
78
Esto nos dio la pauta para pensar que dichos extractos se haban degradado al
momento de haber sido analizados por electroforesis capilar debido a que en ese
momento, dichos extractos tenan 120 das de almacenamiento bajo atmsfera de
nitrgeno y en frascos mbar a 0C, por lo cual se decidi realizar pruebas con
extractos de aceite fresco (1 da de almacenamiento) y comparar los
electroferogramas con los del aceite almacenado durante 120 das. Los
electroferogramas se obtuvieron bajo las condiciones mencionadas en el Cuadro 19.
En la Figura 47 se muestran las seales del aceite 094 fresco, en el cual se observan
distintas seales, y se sobrepuso la mezcla de los 11 estndares de polifenoles y
logrando identificar el cido trans-cinmico.
PDA - 200nm PDA - 200nm
ACEITE0941 10std50mm
0.05 0.05
Ac trans-cinmico
0.04 0.04
AU
AU
0.03 0.03
0.02 0.02
0.01 0.01
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Minutes
Figura 47. Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 094.
79
En la Figura 48 se muestran las seales del aceite 125 fresco, en el cual se observan
distintas seales, y de igual forma se sobrepuso la mezcla de los 11 estndares de
polifenoles, logrando identificar el cido trans-cinmico y el cido cafeico, y tambin
una seal intensa alrededor de los 8 min que no coincide con ninguno de los
estndares.
0.05 0.05
Ac trans-cinmico
cido cafeico
0.04 0.04
AU
AU
0.03 0.03
0.02 0.02
0.01 0.01
0.00 0.00
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Minutes
Figura 48. Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 125.
En la Figura 49, se muestran las seales del aceite 287 fresco, en el cual se
observan distintas seales, y de igual forma se sobrepuso la mezcla de los 11
estndares de polifenoles, logrando identificar el cido trans-cinmico, cido
clorognico y cido glico, sin embargo, esta muestra de aceite contuvo ms seales
en comparacin con las otras dos muestras de aceite previamente analizados.
80
PDA - 200nm
0.055 0.055
0.050 0.050
Ac trans-cinmico
0.045 0.045
Ac clorognico
0.040 Acido glico 0.040
0.035 0.035
AU
AU
0.030 0.030
0.025 0.025
0.020 0.020
0.015 0.015
0.010 0.010
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Minutes
Figura 49. Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 287.
La ltima muestra analizada fue la del aceite 301 (Figura 50) en el cual logr
identificar cido trans-cinmico, cido clorognico, cido p-cumrico y quercetina, y
de igual forma se obtienen seales de diferentes compuestos que no coinciden con
el tiempo de migracin de los 11 estndares utilizados en este trabajo. Esta muestra
de aceite es la que contiene mayor nmero de compuestos fenlicos y con mayor
concentracin
81
PDA - 200nm
0.055 0.055
Ac trans-
0.050 cinmico
0.050
AAc clorognico
0.045 0.045
Ac p-cumrico
0.040 0.040
0.035 0.035
AU
AU
Quercetina
0.030 0.030
0.025 0.025
0.020 0.020
0.015 0.015
0.010 0.010
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Minutes
Figura 50. Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 301.
82
0.06 0.06
PDA - 200nm PDA - 200nm PDA - 200nm PDA - 200nm
ACEITE0941 aceite125 3 seg1 aceite287 3 seg1 aceite fresco espectros
0.05 0.05
0.04 0.04
Aceite 301
AU
0.03
AU
0.03
Aceite 287
0.02 0.02
Aceite 125
0.01 0.01
Aceite 094
0.00 0.00
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Minutes
Figura 51. Electroferograma de las 4 muestras de aceite de cha.
83
Los resultados fueron confirmativos de que el tiempo de almacenamiento es
determinante en el contenido de compuestos fenlicos, al analizar el extracto fresco
de la semilla 094 se logr identificar; cido clorognico, cido trans-cinmico, cido
cafeico (Figura 52).
0.06 0.06
1. cido clorognico
2. cido trans-cinmico
3. cido cafeico
0.05 0.05
0.04 0.04
AU
0.03 3
AU
0.03
0.02 0.02
1
0.01 2 0.01
0.00 0.00
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Minutes
Figura 52. Electroferograma del extracto de la semilla 094 fresco.
84
En la semilla 125 se logr identificar; cido trans-cinmico, cido clorognico, cido
ferlico, kaempferol, miricetina, quercetina, y cido glico (Figura 53).
2. cido clorognico
3. cido ferlico
4. Kaempferol
0.05 5. Miricetina 0.05
6. Quercetina
7. cido glico
0.04 0.04
1
AU
AU
0.03 0.03
0.02 0.02
6 7
0.01 3 5 0.01
2 4
0.00 0.00
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Minutes
Figura 53. Electroferograma del extracto de la semilla 125 fresco.
En este extracto se hizo evidente los distintos resultados que se obtienen con
extractos frescos y almacenados 120 das, esta misma muestra cuando se analiz
con 120 das de almacenamiento solo lograron identificarse 3 polifenoles (cido
trans-cinmico, cido clorognico y cido glico), mientras que en el extracto fresco
se identificaron 7 compuestos fenlicos de la base de datos que tenemos de
comparacin.
85
En el extracto de la semilla 287 se identificaron; cido trans-cinmico, cido
clorognico, cido ferlico, kaempferol, miricetina, quercetina, cido glico (Figura
54).
1. cido trans-cinmico
2. cido clorognico
0.06 3. cido ferlico 0.06
4. Kaempferol
1 5. Miricetina
6. Quercetina
0.05 0.05
7. cido glico
0.04 0.04
AU
AU
0.03 0.03
0.02 7 0.02
3 5
2 6
0.01 4 0.01
0.00 0.00
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Minutes
86
En el extracto fresco de la semilla 301 se identificaron; cido trans-cinmico, cido
clorognico, cido ferlico, kaempferol, miricetina, cido vainillinico, quercetina,
cido glico y cido cafeico (Figura 55).
1. cido trans-cinmico
0.06 2. cido clorognico 0.06
3. cido ferlico
4. Kaempferol
5. Miricetina
0.05 6. cido vainillinico 0.05
7. Quercetina
8. cido glico
9. cido cafeico
0.04 0.04
AU
AU
0.03 0.03
2
8
0.02 7 0.02
3
5 9
1
0.01 4 0.01
6
0.00 0.00
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Minutes
Figura 55. Electroferograma del extracto de la semilla 301 fresco.
87
esto es debido a que dichos compuestos fenlicos al actuar como antioxidantes se
oxidan despus de cierto tiempo por la presencia de ciertos factores como la luz,
calor, y oxigeno del aire que aceleran las reacciones de oxidacin.
c trans-cinamico
ac clorognico
Ac. p-cumrico
Ac vainillinico
vainillina (E.I)
M
Kaempferol
Quercetina
ac ferlico
Miricetina
ac cafeco
ue
ac glico
st
ra
Ac.
Ac.
Ac.
Ac.
Ac.
Ac.
A
Ac
A
A
A
A
aceite 094 almacenado
(mg ac
c p-cumrico
c vainillinico antioxidante
glico/100g (M Trolox/g
kaempferol
Quercetina
c ferlico
c cafeico
Miricetina
muestra)
c glico
muestra)
89
Sin embargo, debe tomarse en cuenta que dichas seales nos indican la presencia
de distintos compuestos fenlicos que le confieren cierta capacidad antioxidante y
contenido de fenoles totales.
Puede observarse que el aceite 301, es el que contiene una mayor capacidad
antioxidante y un mayor contenido de compuestos fenlicos identificados con 4
compuestos, curiosamente no result ser el de mayor valor de fenoles totales, en lo
que respecta a la semilla de cha sucedi algo similar; la semilla que contiene una
mayor capacidad antioxidante fue la 125, sin embargo, el contenido de fenoles
totales result ser el menor, un comportamiento similar al que se present en los
extractos de aceite. La semilla con mayor contenido de compuestos fenlicos
identificados mediante E.C fue la semilla 301 con 9 compuestos aunque como se
mencion anteriormente existieron compuestos fenlicos que no se identificaron por
falta de estndares de polifenoles.
90
Es importante mencionar que tratndose de semillas la composicin qumica de sus
metabolitos est determinada casi siempre por el suelo donde se cultiva y en algunos
casos tambin por el genotipo de la misma, es por ello la importancia de saber de
dnde proviene dicho alimento, de lo contrario resulta complicado la comparacin de
resultados de diferentes trabajos, aunado a esto en lo que respecta a la identificacin
de compuestos fenlicos presentes en la semilla de cha no existen artculos con los
cuales se pueda comparar los resultados obtenidos en el presente trabajo, cabe
mencionar que esta situacin fue una de las razones por las cuales se plante esta
investigacin, adems de que en diferentes estudios realizados se han reportado las
excelentes cualidades nutricionales entre las cuales destacan el contenido de fibra,
protenas, cidos grasos 3 y 6, y antioxidantes de este alimento y que sin exagerar
puede ser considerado el alimento funcional por excelencia.
91
5. CONCLUSIONES
92
El aceite que mostr mejor contenido de antioxidantes fue el 301,
proveniente de la semilla del estado de Puebla, a pesar de no ser el que
contiene mayor contenido de fenoles totales, fue el que mostr una
mejor capacidad antioxidante y el que contuvo mayor contenido de
compuestos fenlicos al analizarse mediante electroforesis capilar.
Por su parte la semilla 125 del estado de Puebla, fue la semilla que se
considera la de mejor capacidad antioxidante y un buen contenido de
compuestos fenlicos detectados mediante electroforesis capilar.
93
6. BIBLIOGRAFA
Albarrn Guadalupe. 2000. Electroforesis capilar en el estudio de la oxidacin
radiolitica del benceno en solucin acuosa. Sociedad qumica de Mxico.
ao/vol. 44 nm. 003 p. 194-199.
Ayerza R. 1995. Oil content and fatty acid composition of cha (Salvia hispnica)
from five Northwestern locations in Argentina. Journal of the American Oil
Chemists Society. 72 (9): 971-1090.
Blasco, A. J., Barrigas, I., Gonzlez, M. C., and Escarpa, A., 2005. Fast and
simultaneous detection of prominent natural antioxidants using analytical
94
Microsystems for capillary electrophoresis with a glassy carbn electrode: A new
gateway to food environments. Electrophoresis. 26, 4664.
Bonoli, M., Colabufalo, P., Pelillo, M., Toschi, T. G., and Lercker, G., 2003. Fast
Determination of Catechins Xanthines in Tea Beverages by Micellar
Electrokinetic Chromatography. Journal Agricultural Food Chemistry. 51, 1141.
Brand-Williams, W., Cuvelier M.E. and Berset, C.1995. Use of a free radical
method to evalate antioxidant. Lebensm-Wiss. U-Technology.28 (1): 25-30.
Brandolini, V., Maietti, A., Tedeschi, P., Durini, E., Vertuani, and Manfredini,
S.2002. Capillary Electrophoresis Determination, Synthesis, and Stability of
Resveratrol and Related 3-O--DGlucopyranosides. Journal Agricultural Food
Chemistry. 50, 7407.
Coates W. Ayerza R. and M. Laura. 2000. Cha Seed (Salvia hispnica L.) as an
-3 Fatty Acid Source for Broilers: Influence on Fatty Acid Composition,
Cholesterol and Fat Content of White and Dark Meats, Growth Performance,
and Sensory Characteristics. Poult Science. 1999; 79:53-58.
Craig R. 1997. Application for approval of whole cha (Salvia hispnica L), seed
and ground whole, cha as novel food ingredients. Disponible en:
http://www.food.gov.uk/ multimedia/pdfs/chiaapplication.pdf
96
Decker, E.A.1997. Phenolics: prooxidants or antioxidants?. Nutritional Reviews.
55 (1): 396-398
Finkel., T. and Holbrook, N.J. 2000. Oxidants, oxidative stress and the biology
of ageing, en Nature. 408, pp. 239-247.
Frazier, R. A., Ames, J. M., and Nursten, H. E. 2000. CE applications for food
analysis in Capillary electrophoresis for food analysis: Method development. The
Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK, p. 67.
Harper CR. Edwards MJ. DeFilipis AP. Jacobson TA. 2006. Flaxseeds oil
increases the plasma concentrations of cardioprotective (n-3) fatty acids in
humans. Journal of Nutrition; 136 ; 83-87
Herrero M., Arrez-Romn D., Segura., Kenndler A., Gius B., Raggi M.A., E.
Ibez., Cifuentes A. 2005. Pressurized liquid extraction capillary
electrophoresis mass spectrometry for the analysis of polar antioxidants in
rosemary extracts. Journal of chromatography. 1085; 56-62.
97
Kartsova, L.A. Ganzha, O.V. 2006. Electrophoretic Separation of Tea
Flavanoids in the Modes of Capillary (Zone) Electrophoresis and Micellar
Electrokinetic Chromatography. Russian Journal of Applied Chemistry, Vol. 79,
No. 7, pp. 1110 -1114.
Kim, K.-H., Tsao, R., Yang, R., and Cui, S. W. 2006. Phenolic acid profiles and
antioxidant activities of wheat bran extracts and the effect of hydrolysis
conditions. Food Chemistry, 95, 466473.
Lauritzen L. Hansen HS. Jorgensen MH. Michaelson KF. 2001. The essentiality
of long chain n-3 fatty acids in relation to development and function of the brain
and retina. Progress in Lipid Research. 40; 1-94.
Li, P., Li, S. P., and Wang, Y. T. 2006. Optimization of CZE for analysis of
phytochemical bioactive compounds. Electrophoresis. 27, 4808.
Li, X., Zhang, Y., and Yuan, Z. 2002. Separation and Determination of Rutin and
Quercetin in the Flowers of Sophora japonica L. by Capillary Electrophoresis
with Electrochemical Detection. Chromatography, 55, 243.
Macheix, J., Fleuriet, A. and Billiot, J.1990. Fruit Phenolics.CRC Press, Inc.
Boca Raton, Fl. EUA.
98
Minussi, R.C.; Rossi, M.; Bologna, L.; Cordi L.V.; Rotilio, G.M.; Duran, N. 2003.
Phenolic compounds and total antioxidant potential of commercial wines. Food
Chemistry. 82; pp.409-416.
Montedoro G Servili., Baldioli M., Selvaggini R., Miniati E., Macchioni A. 1993.
Simple and hidrolizable compounds in virgin olive oil espectroscopic
characterization of the secoiridoid derivates. Journal Agricultural Food
Chemists. 41, 2228-2234.
Okuyama, H., T. Kobayashi, and S. Watanabe. 1997. Dietary Fatty Acids - The
N-6/N-3 Balance And Chronic Elderly Diseases Excess Linoleic Acid And
Relative N-3 Deficiency Syndrome Seen In Japan. Progress in Lipid Research.
35(4): 409-457.
Pais, P., and Knize, M.G. 2000. Chromatographic and related techniques for
the determination of aromatic heterocyclic amines in foods. Journal of
Chromatography B, 747, 139.
Peng, Y., Ye, J., and Kong, J. 2005. Determination of Phenolic Compounds in
Perilla frutescens L. by Capillary Electrophoresis with Electrochemical Detection.
Journal Agricultural Food Chemists. 53, 8141.
Qingcui Chu E Miao Lin E Xueqin Yu E Jiannong Ye. 2008. Study on extraction
efficiency of natural antioxidant in coffee by capillary electrophoresis with
99
amperometric detection. European Food Research and Technology. 226:1373
1378
Serrano, M., Guillen, F., Martnez-Romero, D., Castillo, S. And Valero, D. 2005.
Chemical Constituents and Antioxidants Activity of Sweet Cherry at Diferent
Ripening Stages. Journal Agricultural Food Chemist`s.53 (7): 2741-2745.
Shahidi F., and Naczk, M, 2004. Phenolics in Food and Nutraceuticals. CRC
Press, Inc. Boca Raton, Fl. EUA.
trrbov, D., Vlek, J., and Kub, V. 2006. Capillary zone electrophoretic
determination of phenolic compounds in chess (Bromus inermis L.) plant
extracts. Journal of Separation Science. 29, 308.
100
Surveswaran, S.: Cai, Y.; Corke, H.; Sun, M. 2006. Systematic Evaluation Of
Natural Phenolic Antioxidants From 133 Indian Medicinal Plants. Food
Chemistry; 45;1-16
Taga, M.S., Miller, E.E., y Pratt, D.E. 1984. Cha seeds as a source of natural
lipid antioxidants. Journal of the American Oil Chemist's Society; 61:928-931
Wang, H., Cao G., y Prior R. L.1996. Total Antioxidant Capacity of Fruits.
Journal Agricultural Food Chemist`s. 44 (3): 701-705
Wu, X., Beecher G. R., Holden, J.M., Haytowtiz, D. B., Gebhardt, S.E. And Prior,
R.L. 2006. Concentrations of Anthocyanins in Common Foods in the United
State and Stimation of Normal Consumption. Journal Agricultural Food
Chemist`s. 54 (11): 4609-4075.
Youyuan Peng., Fanghua Liu. Yuyu Peng ., Jiannong Ye. 2004. Determination
of polyphenols in apple juice and cider by capillary electrophoresis with
electrochemical detection. Food Chemistry 92. 169175
Zuta P.C., Simpson B.K., Zhao X., Leclerc L. 2005. The effect of a-tocopherol on
the oxidation of mackerel oil. Food Chemistry 100 (2007) 800807.
101