Digestion Anaerobia Unal

Digestin
Anaerobia
una aproximacin
a la tecnologa
Digestin
Ana_erobia
una ,aproximacin,
a la tecnologa
M A RA (O N S U E 100 A z -B EZ
SANDRA El lANA ESPillA VARGAS
FRANCISCO MaliNA IpREZ
UNIVERSIDAD
NACIONAL
DECOLOMBIA:
Instituto de Biotecn01ogia
Bogot, junio de 2002

Este "bro fue pOSi~e graC.s al al"1O d~ Siguiente gNI" de lraba'"
Engie Carolina Plazas BacIIlriloga

Asistente de Investlgacion
Insllulo de Biotecnolog~
Unhlersidad Nacional de Colombia
Mana. Sena. Gonzalez Bacteridoga

Facultad de Ingenieria
Universidad de AnuaqUla
Carolina Garda Microbiloga

Posgrado Irledawllades de MlCro~dOlla
Universidad NaCiOnal de Colombia'
cados JlJio CoIazos Ingemero sanitario M.se.

Facula:l de Ingenlena
~GESTIN ANAEROBIA
Universidad Nacional de Colombia
UNA APROXIMACION A LA TECNOLOGIA
UNIVERSIDAONACJONAL
DECOLOMBIA
INSTITUTODEBI01ECNOLOGIA
MARIA CONSUELO DIAIBAEZ

~ilIogo. M.5c.
Ingenieria Ambiental
Universidad Nacion~ de CoIomtHa
SANORA BIANA ESPilA VARGAS

Bacteridoga. M.SQ..
Instiulo de Biotecnologla
Universidad Nadonal de Colombia
FRANCISCOMOIINA PEREI
Ingeniero sanitario. M.se~
FacuJta:l de Ingeniena
Un'erS~ad de AntioqUIa
Pnmera edlCion 2002

ISBN 958 70 11%-1
Esta Publlcacion ha sido posible gracias al patrocinio del

Instituto Colombiano para el Fomento de la Ciencia y la Tecnologia
"Francisco lose de caJdas" COlCIENCIAS
Diseo y diagr amacion

ALEJANDROMlINA
Correccion de estilo
CAMILOB/l~EROC.
Preparacin editOrial e Impresin

UNNfRS<OADf,I{IONALDECOlOMBIA
UNlBIBIOS
urifJItikl@.dnlc.unal.oou
C9
AGRADECIMIENTOS
Los autores queremos dar un reconocimiento especial al profesor Didier

A1azard,Microbilogo Ph,Ode la ORSTOM,quienha sido uno de los pioneros
en la enseanza y el estudio de la microbiologa anaerobia en Colombia.
Adems, los autores quieren expresar sus agradecimientos a:

Instituto de Biotecnologia de la UJ.1iversidadNacional de Colombia
Facultad de Ingeniera de la Universidad !Nacionalde Colombia
Facultad de Ingeniera de la Universidad de Antioquia
Finalmente, nuestros agradecimientos a Colciencias, Programa

de Biotecnologa, por el apoyo financiero' brindado a los dos grupos de
trabajo, el cual nos permiti explorar este campo, as como contar con la
infraestructura necesaria para continuar en el estudio e investigacin de
la digestin anaerobia.
CONTENlmo ~
PRLOGO
CAPITULO
RECURSOSHDRIOOSy TRATAMIENTODE AGUAS RESIDUALES

Recursos hdricos
Opciones tecnolgicas de tratamiento
Experiencias con digestin anaerobia en Colombia y Amrica Latina
Problemas asociados con la digestin anaerobia
CAPiTULO
HISTORIADE LA DIGESTiNANAEROBIA
Microbiologa
Desarrollo y apli:acin de la digestin anaerobia al tratamiento de residuos
CAPiTULO
MICROBIOLOGADE LA DIGESTiNANAEROBIA
Interacciones microbianas
Degradacin anaerobia de la materia orgnica
Bacterias involucradas en el proceso de digestin anaerobia
Metanognesis
Bacterias sulfato-reductoras (BSR)
CAPiTULO
PUESTA EN MARCHAY OPERACiN DE REACTORESANAEROBIOS

Reactores anaerobios: Caja negra o ecosistema microbiano?
Etapa de puesta en marcha o arranque del reacJor
Etapa de operacin
CAPITULO
CARACTERIZACiNDE LODOS ANAEROBIOS Y AGUAS RESIDUALES

Lodos anaerol)ios
Aguas residuales
ANEXOS
[9]
PRLOGO
AUNQUE COLOMBIA CUENTA CON GRAN CANTIDAD DE RECURSOS HDRICOS E HIDROBIOLGICQS
CONTINENTALES (MS DE 2.6 MILLONES DE HECTREAS DE LAGOS, LAGUNAS, EMBALSES,
cinagas y pantanos, y 720.000 caues), fenmenos como la erosin, la destruccin

de formaGibnes vegetales y la contaminacin de diversos org,enes, han llevado al
grave deterioro de tales recursos que vemos en la actualidad.
En trminos generales, la contaminacin de los recursos hdricos se debe a
la descarga de aguas residuales domsticas e industriales sin ningn tratamiento,
los derrames de hidrocarburos, la actividad agropecuaria y la minera. Es por eUo,
que gran parte de los esfuel2ios de las entidades gubernamentales encargadas de
la proteccin de estos recursos, est orientada tanto a la aplicacin de la normatividad
existente en lo relativo al control de la calidad de los efluentes vertidos, as como a la
rehabilitacin y recuperacin de la base natural de los ecosistemas afectados. Como
resultado de estas medidas, en la actualidad muchas industrias cuentan con varia-
dos sistemas de tratamiento y a nivel municipal, algunos centros urbanos han abor-
dado el problema de tratamiento de sus aguas residuales.
Aunque el tratamiento de aguas residuales domsticas es un proceso co-
nocido y bien estudiado, la aplicacin de los mismos sistemas al tratamiento de
residuos industriales y a la recuperacin y rehabilitacin de suelos, no siempre ha
tenido resultados exitosos. En muchos casos ha sido necesario, no solo conocer
en forma detallada los fenmenos que se llevan a cabo, sino que adems para la
definicin y anlisis del problema, ha sido indispensable el trabajo coordinado e
interdiscipllnario de diferentes reas del conocimiento como la biologa, la qumica
y la ingeniera. Un ejemplo de la necesidad de este trabajo coordinado, es el trata-
miento anaerobio de aguas residuales utilizado exitosamente en diferentes pases
(Europa, Japn, China, Brasil, Mxico, etc.), mientras en otros, problemas como la
carencia de inoulos, la puesta en marcha de los reactores, y la estabilidad del
proceso, han generado gran desconfianza de esta tecnologa cuando, en muchos
de estos casos podran haberse solucionado si se hubieran abordado con la cola-
boracin de varias disciplinas.
Por esta razn, los autores concientes de las bondades de esta tecnolo-
ga, as como de su potencial para el tratamiento de aguas residuales, han que-
rido dar a los profesionales que trabajan en el rea de tratamiento de aguas
residuales, un libro donde desde un punto de vista interdisciplinario, se consig-
nan los fundamentos tericos y algunas de las experiencias prcticas logradas
en el manejo y aplicacin- de la digestin anaerobia.
El presente documento se inicia con los conceptos bsicos de microbiolo-
ga del proceso, contina con aspectos relacionados con la puesta en marcha y
operacin de reactores anaeroJoios, y finaliza con los protocolos recomendados
para la medicin de parmetros de control y operacin. Dado que no existe en el
mercado un texto donde se consignen todos estos elementos, esperamos que
este texto pueda ser una gua importante para los profesionales que abordan esta
tecnologa, adems de contribuir a una mejor aplicacin de la misma en el pas.
Crtp'tulo.
LJ n
RECURSOS I H~DRlaOS~ y
TRATAMIENTO DE
AGUAS RESIDUALES
RECUI{SOS HORICOS
EL AGUA ES UNA MOLCULA, ESENCiAl E INDISPENSABLE PARA LA VIDA; CUANTITATIVAMENTE, RE-
PRESENTA EL CONSTITUYENTE INORGNICO MS ABUNDANTE EN LA MATERIA VIVA. CERCA DE TRES
cuartas partes de la superficie terrestre estn oubiertas por la hidrosfera; de

sta, los ocanos representan I el 97% de la masa total de agua presente y slo un
3% corresponde a agua dulce. El 79% de esta ~ima fraccin se localiza en los
casquetes polares y en los glaciares, el 20% conforma las aguas subterrneas y
nicamente el 1% representa agua dulce superficial fcilmente accesible.
Por su localizadn geogrfica, su historia geolgica y la presencia de los An-
des, en Colombiase propici laformacin de seis grandes unidades o regiones natura-
les:Andina, Caribe,Orinoqua,Amazona, losvalles Ilnterandinosy del Pacfico,lascuales
dan lugar a un pas privilegiado en recursos hdricos, cuyo rendimiento por km2 es
aprol<imadamenteseis veces el planetario y tres veces el suramericano (Tabla 1.1). A la
retencin que ocurre en la biosfera, producto de la diferencia entre la precipitacin y la
evaporacin, se le conoce como 'rendimiento hdrico'.
Tabla 1.1. Precipitacin I y rendimientos, hidricios,
Regin Precipitacin anual media (mm) Rendimiento(Vslkm')
Planeta Tierra 900 10
Sur Amrica 1.600 21
Colombia 3.000 58
Fuente: Ministerio...del Medio Anlbiente. 1996
A pesar que 'el recurso hdrico en Colombia ,es abundante, su distriblilcin

no es uniforme; por ejemplo, en la cuenca Magdalena-Cauca -donde se concentra
el 70 % de la poblacin-, slo se ouenta con el 10 % de la oferta hdrica. El 30%
de la poblacin restante, se localiza en las cuencas del Orinooo, Amazonas, Pac-
fico, Sin, Catatumbo y Sierra Nevada donde se encuentra el 90 % restante de la
oferta Ihdrica superficial..
[14] DIGESTiN ANAEROBIA
En la actualidad, del total de la oferta hdrica superfi~al, solamente se utiliza

entre el S y 6% en actividades relacionadas con: agricultura (63%), generacin de
energa (31 %), consumo humano (S%)" y actividades industriales (1%). Algunas esti-
maciones indican que para un funcionamiento adecuado de los ecosistemas naturales
y el sostenimiento de la capacidad de autor regulacin natural de estos cuerpos de
agua, ser necesario reservar 80% de la oferta superfi~al, por lo que slo un 20% de
la oferta hdricatotal podr utilizarse (Ministerio del Medio Ambiente, 1996).
Sumado al problema de la distribucin desigual, en las ltimas dcadas se
ha observado un creciente deterioro de la calidad de este recurso. La contamina-
cin de las aguas continentales y ocenicas es un problema vigente, y aunl cuando
los mecanismos y efectos de esta contaminacin figuran entre Ilos ms conocidos
de todos los problemas ambientales, la bsqueda de soluciones eficaces muchas
veces ha sido 'complicada y no siempre ha conducido a soluciones tcnicas y
econmicas exitosas.
En informes gubernamentales se establece que las principales causas de
este deterioro estriban en la modificacin de la cobertura vegetal y en las explota-
I
ciones mineras, impactos ambientales que generan gran cantidad de sedimentos,

y el vertimiento de aguas residuales y residuos slidms sin ningn tratamiento a
las corrientes y cuerpos de agua. En 1996, el Ministerio del Medio Ambiente re-
port una descarga diaria de materia orgnica de origen domstico a los ros
colombianos de 1.800 toneladas, y una carga orgnica de SOOtoneladas de ori-
genl industrial (Mondragn, 1996). Por la misma poca, slo el 2% de la pobla-
cin urbana realizaba algn tratamiento de sus aguas residuales (Ministerio del
Medio Ambiente, 1996 y Mondragn, 1996).
Dos aos ms tarde, en el Inventario Nacional del Sector de Agua Potable
y Saneamiento Bsico, realizado por el Ministerio de Desarrollo Econmico (1998),
se report que de los 1.068 municipios colombianos, solamente 154 (14%) rea-
lizaban algn tipo de tratamiento de sus aguas residuales domsticas. De stos,
133 correspondan a reas urbanas con menos de 100.000 habitantes, y los
restantes 21 municipios tenan poblaciones mayores a 100.000 habitantes.
De forma similar, para la disposicin de residuos slidos slo el 40% de la
poblacin contaba con sistemas adecuados de disposicin final, generalmente
RECURSOS HIDRlCOS y TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES [15]
rellenos sanitarios (Mondragn, 1996). De los 1.068 municipios existentes en

1996, solamente 940 contaban con servicio de aseo, 42 de ellos llevaban a cabo
la disposicin final de las basuras directamente en los cuerpos de agua y 538 las
disponan en botaderos o mediante quema a cielo abierto (Ministerio de Desarro-
llo Econmico, 1998).
A pesar de este grave panorama, las regulaciones y las actividades de
control de las agencias gubernamentales encargadas, as como los principios de
responsabilidad integral asumidos por la industria, han llevado a que en algunos
sectores agroindustriales e industriales se realicen esfuerzos en el tratamiento de
aguas residuales. No obstante estas iniciativas, la continua descarga de impor-
tantes volmenes de aguas residuales hace que ros como el Bogot, el Medelln,
el Cauca, el Chicamocha y el Magdalena, presenten altos ndices de contamina-
cin, y por lo tanto, debern someterse prioritariamente a planes de saneamiento
y recuperacin.
OPCIONES TECNOLGICAS
DE TRATAMIENTO
En trminos generales, las opciones tecnolgicas de tratamiento de aguas

residuales se pueden clasificar en dos clases: el tratamiento fisicoqumico y el
tratamiento biolgico. Dadas las caractersticas de la gran mayora de las aguas
residuales, los sistemas de tratamiento involucran una combinacin de procesos
fsicos, qumicos y biolgicos, los cuales se llevan a cabo en una secuencia de
etapas conocidas como tratamiento preliminar, tratamiento primario, tratamiento
secundario o Ibiolgico y tratamiento terciario o avanzado (Figura 1.1).
Los tratamientos preliminares sirven para aumentar la efectividad de los
tratamientos subsiguientes; su papel se relaciona principalmente con la remocin de
slidos de gran tamao. Los tratamientos preliminares ms usuales son: las rejillas,
los tamices, los desarenadores, los tanques de homogenizacin o neutralizacin.
!Lostratamientos primarios tienen como objetivo principal la remocin de
materiales que pueden sedimentar (llamados 'slidos sedimentables') o flotar
[16] !DIGESTIN ANAEROBIA
(llamados 'slidos suspendidos'). 1L0stratamientos ms lutilizados son: la sedi-

mentacin primaria, la precipitacin qumica y la flotacin.
Tralmiento preliminar Tratamiento ~ primario-
Agua
!rllliil:luaLJ Desarealo~
Igual8cin
Tratamiento.~ terciario Tratamiento secundal"io',
Oxidacin aerobia: Lodos activados

Agua Filtros
; tratada percoladores
Lagunas de
oxidacin
Biodiscos
Digestin aerobia: UASB

RAP
Figura 1.1 Niveles de tratamiento de las aguas residuales.
El objetivo Iprincipal de Ilostratamientos secundarios es la remocin de la

materia orgnica soluble. Se llevan a cabo mediante procesos biolgicos en los
cuales, los mioroorganismos utilizan aerbica o anaerbicamente el material
orgnico presente en el agua residual. Los tratamientos ms comunes son: los
lodos activados, los filtros percoladores, las lagunas de estabilizacin, las zan-
jas de oxidacin, los biodiscos y la digestin anaerobia. Esta !ltimapuede con-
siderarse, en algunos casos, como un tratamiento, intermedio ,entre los primarios
y los secundarios.
Los tratamientos terciarios estn orientados a la remocin de elementos
como el nitrgeno, el fsforo, los metales pesados y/o algunos materiales txi-
cos. Los tratamientos avanzados que ms se utilizan, son: la nitrificacin-
desnitrificacilf>n, la adsorcin en ,carbn activado, la oxidacin qumica, el
intercambio inico y Iladoracin.
R E euRSoS H iD R I eos y T R A T A M I E N T o D E A G U A S R E S I D U A L E s [1 7]
EXPERIENCIS ' CON IOIGESTiN

ANAEROBIA EIN COL_OMBIA __ y
AMRICA ILATINA
La remocin de materia orgnica soluble puede ~Ievarse a cabo a travs de proce-

sos Ibiolgicos aerobios o anaerobios. En ambos casos, los microorganismos utili-
zan la materia orgnica como fuente de energa y carbono, y generalil nueva
Ibiomasa, adems de productos de oxidacin: CO'l!f HzO,para los aerobios CH4y
COz'para los anaerobios.
EnColombia, el 97% de las aguas residuales se vierten en los Irossin ningn
tipo de tratamiento, razn Ipor la cual la contaminacin por esta va constituye uno de
los problemas ambientales de mayor impacto para la sooiedad colombiana. E11
sector
agroindustrial origina (sin incluir la caa de azcar y el benefiCiode caf) una carga
de 4.000 toneladas OSO/da; le siguen los sectores pecuario, domstico (1.200
toneladas OSO/da) e industrial (520' toneladas OSO/da).
Aunque en la mayora de los pases latinoamericanos solamente el 10% de
las aguas residuales domsticas son tratadas (Oficina de Anlisis Econmico, Mi-
nisterio del Medio Ambiente, 1997)1 esta tendencia ha venido cambiado en I10s
I
ltimos aos. La utilizacin de reactores anaerobios para el tratamiento de aguas

residuales ha crecidb desde 1982 orientndose principalmente al tratamiento de
aguas residuales agroindustriales. La importancia econmica de este sector, la
susceptibilidad de estos ,efluentes al tratamiento anaerobio y las condiciones de
temperatura de los paises del trpico han favorecido la operacin de este tipo de
reactores (Sorzaccolili et al., 1996). En la Figura 1.2 se presenta el nmero, de
I
reactores instalados entre 1982 y 1'993 en Amrica Latina; de ellos, 82% corres-
ponde a reactores tipo UASS, 14% a filtros anaerobios y los sealados como 'otros'
representan generalmente sistemas hbridos.
I
En 1994 existan en Amrica Latina aproximadamente . 396 reactores

anaerobios los cuales trataban un volumen aproximado de 394.421 m3. El 43%
(182.286m3) eran utilizados en el tratamiento de aguas residuales industriales y
[18] [10 I G E S T I 6 N A N A E R O B I A
agroindustriales, y el 57% restante, para domsticas, o se utilizaban en 11a,diges-

tin final de lodos provenientes de plantas de tratami.ento aerobias. La mayora de
los reactores que trataban I efluentes agroindustriales (11 5), se localizan en Bra-
sil, yen menor propor~m en Mxico (22) y Cdlombia (10) Yel resto en otros
pases. Bsicamente, los efluentes tratados provenan de la industria cervecera
(40%), malteras (21 %), destileras de caa de azcar (5%), yel 34% de la indus-
tria de levaduras (Borzacconi ,et al., 1996).
80
o
13
!~!:~60
.:1.,
~ .. 40
:z
20
Tiempo (aos)
QOlros llFA UASB
Figura 1.2. Reactores anaerobios. utilizados en el tralBmienlo de' efluenlBs'

agroindustriales en Amrica Latina. ,(1982-1993).,
Se calcula que en Colombia existen ms de 80 reactores anaerobios los

cuales tratan un caudal aproximado de 855 J/seg. Estas instalaciones se utilizan
para el tratamiento de efluentes de procesos industriales, agroindustriales yaguas
residuales domsticas. En la Figura 1.3 se presenta la distribucin porcentuall por
volumen y caudal tratado. Los biorreactores tratan efluentes de las industrias
cervecera, de levaduras, de gaseosas y refrescos, papeleras y de lavado de lana,
con eficiencias que oscilan entre 40 y 70% (Duque, 1996).
[18] IoIGESTiN ANAEROBIA
agroindustriales, y el 57% restante, para domsticas, o se utilizaban en la diges-

tin final de lodos provenientes de plantas de tratamiento aerobias. La mayora de
los reactores que tratabalil efluentes agroindustriales (11 5), se localizan en Bra-
sil, yen menor proporcin en Mxico (22) y Colombia (10) Yel resto en otros
pases. Bsicamente, los efluentes tratados provenan ,de la industria cervecera
(40%), malteras (21 %), destileras de caa de azcar (5%) yel 34% de la indus-
tria de Ilevaduras (Borzacconi el al., 1996).
120
100
8'0
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211.1-
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20
1982 1983 1'984 1985 1l)86 19S7 19S8 1981) 19l)O 1991 1992 1993
Tiempo (aos)
o Otros miFA UASB
Figura 1.2. !Reactores anaerobios utilizados en el tratamiento de efluentes

agroindilstriales en Amrica !Latina (1982-1993).
Se calcula que en Colombia existen ms de 80 reactores anaerobios los

cuales tratan un ,caudal aproximado de 855 I/seg. Estas instalaciones se utilizan
para el tratamiento de efluentes de procesos industriales, agroindustriales yaguas
residuales domsticas. En la Figura 1.3 se presenta la distribucin porcentual por
volumen y caudal tratado. Los biorreactores tratan efluentes de las industrias
cervecera, de levaduras, de gaseosas y refrescos, papeleras y de lavado de lana,
con eficiencias que oscilan ,entre 40 y 70% (Duque, 1996).
RECURSOS HiDRICOS y TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES [19]
Agua residual industrial

268 Vsegl
Agua residual 31%
dOlOslica
567 VsegL
66%
Agua residual
agrolndustrial
27 Vsegl
3%
Figura 1.3,. Distribucin porcentual del volumen y el caudal que tratan los reactores'
anaerobios instaladds en Colombia (Duque, 1996).
Para las aguas residuales domsticas, de los 154 municipios Cdlombianos

donde se reporta tratamiento de aguas servidas, las lagunas de estabilizacin
constituyen 'el mayor nmero, seguidas por sistemas de aireacin extendida y reac-
tores anaerobios tipo UASB (Tabla 1.2).
Tabla 1.2. Sistemas de tratamiento, de aguas residuales en los municipios

colombianos, en 1996
Tipo J:1B,gJ,a"Wa, .da tratamiento No. de Municipios
Plantas compactas aerobias 6
Lodos activados 17
Filtros lpercoladores
Lagunas de estabilizacin 96
Filtros biolgicos 18
Aireacin extendida 26
Reaelores anaerobios UAS8 17
Otros 16
Nmero de Municipios que tratan sus aguas servidas: 1541 TOtal de Municipios: 1068
Fuente: Ministerio de Desarrollo. 1998.

[20] o I G E S T IN A N A E R O B I A
PROBLEMAS ASOCI~DOS CON LA

DIGESTiN ANAERO_BIA
Puesta enl marcha de los rlctares
Una caracterstica particular de los microorganismos anaerobios es su baja tasa

de crecimiento; por lo tanto, al iniciar el proceso se requiere un perodo de
tiempo que puede oscilar entre 30 y 180 das dependiendo de la calidad y
cantidad del inculo utilizado (Weiland y Rozzi, 1991). Sin embargo, en los ca-
sos en los que no se cuenta con inculos adecuados esta etapa se puede pro-
longar, incluso hasta condicii:mes crticas en las que nunca se alcanza la
estabilidad. Por 'ello la optimizacin de la puesta ,en marcha requiere contar con
las herramientas apropiadas para la evaluacin de los inculos; adems, en
muchos casos es necesario desarrollar costosos procesos para la obtencin de
semillas o inculos ms eficientes.
Postratamiento
Por lo general, con la digestin anaerobia no se logra la misma remocin de

materia orgnica que con los procesos aerobios. La presencia de concentracio-
nes importantes de slidos suspendidos, nutrientes y organismos patgenos en
el efluente de los sistemas, hace necesario complementan el proceso con
postratamiento. Los recursos tecnolgicos ms utilizados incluyen procesos bio-
lgicos como los filtros percoladores, las lagunas de oxidacin, los humedales y
estanques con plantas acuticas; tambin se usan procesos fsicos, qumicos o
fisicoqumicos como lafiltracin en arena, la desinfeccin con cloro o lafloculacin
y coagulacin (Van Haandel y ILettinga, 1994).
R E e u R S o S H io R I e o s y T R A T A M I E N T o o E A G U A S R E S I o U A L E s [21 ]
Produccin de olores,
Uno de los mayores problemas aso~ados con la tecnologa anaerol:lia es la libera-

cin de' malos olores atribuida a la produccWn de compuestos azufrados como el
cido sulfhdrico (H2S) en el biogs. Estos compuestos tienen un olor muy ofensivo
que se ha convertido en la principal causa de conflictos con las comunidades
aledaas a las plantas de tratamiento de agl!Jasresiduales. Un caso muy conocido
es el de la planta El Vivero Municipal de {ali, Ilacual tuvo que cerrarse entre 1991
y 1994 por este problema (Mora, 1996; Sterling y Mora, 1998). lEn este campo,
existen mltiples necesidades de investigacin, por lo que diferentes grupos estnI
desarrolldndo varios proyectos orientados a la remocin de estos gases (Gmez y
Figueroa, 1998; Martnez et al., 1998; Sterling y IMora, 1998) en ellpas.
R E eu R S o S H D R I eos y T R A T A M I E N T o D E A G U A S R E S I D U A L E s [21 ]
Produccin de olores
Uno de los mayores problemas asociados con Ilatecnologia anaerobia es la libera-

cin de malos 'Olores atribuida a la produccin de compwestos azufrados como el
ddo sulfhdrico- (HzS) en el biogs. Estos compuestos tienen un ol'or muy ofensiyo
que se ha convertido en la principal causa de conflictos con las comunidades
aledaas a las plantas de tratamiento' de aguas residuales. Un caso muy CQnoGi~o
'
es el 'de la planta El Vivero Munic;:jpalde Cali, la cual tuvo que cerrarse entre 1991
y 1994 por este problema (Mora, 1996;, Sterlimg y Mora, 1998). lEn este campo,
existen mltipl~s necesidades de investigacin,I por lo ,que diferentes grupos estn
desarrollandol varios proyectos orientados a la remocin de estos gases (Gmez y
lFigueroa, 1998; Martnez et al., 1998; Sterling y Mora, 1998) en el pas.
R E eu R S o S H D R I eos y T R A T A M I E N T o D E A G U A S R E S I D U A L E s [21 ]
Produccin I de olor~s
Uno de los mayores problemas asociados con la tecnologa anaerobia es la libera-

cin de' malos olores atribuida a la produccin de compuestos azufrados como el
cido sulfhdtico' (HzS) en el biogs. Estos 'compuestos tienen un olor muy ofensivo,
que se ha convertido en la principal 'causa de conflictos con las comunidades
aledaas a las plantas de tratamiento de aguas residuales. Un caso muy conocido
es el de la planta 61Vivero Municipall de Cali, la cualltuvo que cerrarse, entre 1991
y 1994 por este promlema {Mora, 1996; Sterling y Mora, 1998).1 En este campo,
existen mltiples necesidades de investigacin, por lo que diferentes grlilpos estn
desarrollandol varios proyectos orientados a la remocin de estos gases (Gmez y
Figueroa, 1998; Martnez el aI., 1998; Sterling y Mora, 1998) en el pas.
[22] o I G E S T ION A N A E R O B I A
BORZACCONI,L, Lpez, ~.yVias, M. (1995). "Application 01Anaerobic Digestion to the Treatment
01 Agricultural Effluents in Latin America". Water Science Techno/r/gI, 32: 105-111.
DUQUE,A. (1996). "Desarrollo de reactores anaerbicos en Colombia". En: Cuarto seminario
taller latinoamericano sobre tratamiento anaerobio de aguas residuales. Red Colombiana
de Biotecnologa Ambiental y Universdad Industrial de Santander. Bucaramanga

(Colomba).
GMEZ, G. y Figueroa, C. (1998). "Eliminacn de contaminantes del aire y gases por procesos
biotecnolgipos". En: Segundo simposio colombiano sobre biotecnologa ambiental.. Red
Colombianade BiotechologaAmbientaly FundacinUniversitariade Boyac.Tunja (Colombia).
LEITINGA G. (1995). "Anaerobie Digestion and Wastewater Treatment System". Antonie Van
Leewenhoek, 66: 271-294.
MARTNEZ,A., Tmara, W., Vela, G. y Vargas, C. (1998). "Diseo y construccin de un bioliltro la
escala piloto para el tratamiento de olores y VOC's". En: Segundo simposio colombiano
sobre biotecnGloga ambiental.. Red Colombiana de BiotecnGloga Ambiental y Fundacin

Universitaria de Boyac. Tunja (Colombia).
Ministerio' del Medio Ambiente (1996). "Lineamientos de poltica para el manejo integral del
agua". Revista ACOOAL 169, 20. trimestre: 10-30.
Ministerio de Desarrollo Econmico (1998). Inventario nacional del sector de agua potable y
saneamiento. Bogot (Colombia).
MONDRAGN,L (1996). "Polticas nacionales relacionadas con el mejoramiento de la calidad
del agua". En: Conlerencia internacional de mejoramiento de la caldad del agua.

Universidad del Valle. Cali (Colombia).
MORA,L (1996). "Control de olores en la planta de tratamiento de aguas residuales UASBVivero,
MuniGipalde EMCALJI".En: Primer simposio colombiano sobre biotecnologa ambiental..
RedColombianade Biotecnologa Ambiental y Universidad de Antioquia. Medelln (Colombia).

RECURSOS HfDRICOS y TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES [23]
Ministerio del Medio Ambiente, Oficina de Anlisis Econmico (1997). "Aguas limpias para Colombia
al menor costo. Implementacin de Ilas tasas retributivas por contaminacin hdrica".
Revista Palmas, 18 (3)! 69-79..
STERLlNG,C. y Mora, L. (1998). "Resultados de una planta depuradora tipo UASB, IEIVivero
Municipal de EMCAU". En: Segundo simposio colombiano sobre biotecnologa
ambiental., Red Colombiana de IBiotecnologa Ambiental y IFundacin Universitaria de
Boyac. Tunja (Colombia).
VAN HMNOEU, A. y Lettinga, G. (1994). Tratamento anaerobio de esgotos em regioes de clima
quente. Editorial IEpgraf, Campina Grande (Brasil).
W61LANOyRozzi. (1991). "The start up operation an monit0fing of high rate anaerobic treatment
systems". Water Seienee Teeho/lgy, 24 (8): 257-277. ,

captulo
d o s
HlrSTORIA lOE
ILA DIG~ESTiN
ANAEROBIA
COMO SE MENCIONA EN DIFERENTES IREVISIONES (BARKER, 1956; IEI:lNDER, 1978) LA PRIMERA
DESCRIPCiN SOBRE LA PRODUCCiN DE METANO EN LA NATURALEZA. FUE HECHA POR VOliTA EN
1776, quien lo defini como el 'gas de los pantanos'. IUnsiglo despus, se demostr la
produccin de este gas en el intestino grueso de los reos recin ejecutados, ascomo en
el estmago de Ilos rumiantes. En 1868, Bchamp realiza experimentos en los que
observa la produccin de metano al inocular un medio de etanol con heces de conejo;
este resultado perm~e confirmar las observaciones realizadas por Reseten 1858 en las
pilas de estircol almacenadas (McCarty, 1982).
MICROBIOLOGA I
A finales del siglo XIX, Popoff, Van Senus y Omelianski realizan estudios detallados
sobre Ila produccin microbiolgica de metano (McCarty, 1982). Estos investiga-
dores establecen que la metanognesis es un proceso, derivado del rompimiento
de materiales polimricos como la celulosa, dependiente de Ila temperatura. Sin
embargo, hasta ese momento no era claro si las bacterias productoras de metano
eran capaces de utilizar los polmeros directamente, o si la generaciR de este
gas era el producto de la utilizacim de molculas ms simples produGidas por el
rompimiento de los polmeros por otros microorganismos, En sus estudios,.
Omelianski demostr que durante la fermentaci>n metnica de la celulosa se pro-
duce hidrgeno, cido actico, y cido butrico, [para finalmente formar metano de
acuerdo con la siguiente reaccin:
Las observaciones de IBchamp, y los Iresultados obtenidos por OmeJianski,

permiten a Sohngen llevar a cabo una serie de experimentos en los cuales
estudi la produccin de metano a partin de sustratos puros como el formato, ,el

acetato, el butirato, el etanol y una mezcla de H/COzl similar a la obtenida durante
la descomposicin anaerobia de la celulosa (McCarty, 1982). Los resultados per-
mitieron concluir que estos sustratos son compuestos intermediarios generados
durante la fermentacin metnica de la celulosa. Aunque se hicieron ,observacio-
nes microscpicas de algunas especies de microorganismos que actualmente se
Ireconocen como metanognicas, los investigadores nunca lograron aislarlas y
oultivarlas ,enforma pura en elllaboratorio.
lEn 1936, Barker anuncia el primer aislamiento en cultivo puro de un
metangeno al que denomina Melhanobac1llus omelianskll" y muestra los resulta-
dos de los primeros estudios bioqumicos con este microorganismo. Seala Ila
capacidad de esta bacteria para oxidar el ,etanol a aoetato, y basado en la teora
de Ilareduccin del dixido de carbono desarrollada por Van Niel en 1934 (Barker,
1956), plantea que los electrones generados durante la oxidacin son utililados
para reducir los iones bicarbonato los cuales actan como aceptores finales de
electrones de la siguiente forma:
Oxidacin: ClfjCOOH + 2Hp =>- 2COz + 8H+

Reduccin: 8H+ + COz CH4 + 2Hp
Reacain neta:
Posteriormente en 1948, Buswell y Sollo, utilizando C14como trazador,

demostraron que la formacill de metano a partir de acetato no ocurre por reduc-
Cin del dixido de carbono, sino por la descarboxilacin de este compuesto: Este
hecho posteriormente es verificado, por Stadman y Barker (1949), YPiney Barker
(1956), confirmandb la hiptesis formulada por Sohngen.
Con el desarrollo de nuevos procedimientos para el cultivo de microorga-
nismos anaerobios estrictos (Hungate, 1969) se iniDiauna nueva era en las investi-
gaciones sobre metanognesis. La introduccin de la tcnica del tubo rodado (roll
lube), as como el uso de las nuevas'cmarasde anaerobiosis, permite el aislamiento
de numerosas especies metanognicas en cultivo puro. Mediante el uso de estos
nuevos Iprocedimientos,Bryant el al. (1967) iniOianel estudio sobre la metabolizaclin
H 1ST O R I A O E L A O I G E S T ION A N A E R O B I A [29]
del etanol por un cultivo de M. omelianskll. los investigadores ,encontraron que para
poder llevar a cabo la fermentacinl metnica, ,este microorganismo (denominado
posteriormente oomo Methanobaden:um bryantli), requera de la asociacin con otro
microorganismo que los autores denominaron "Organismo No Metanognico 'Sil. De
esta forma, para lograr el proceso metanognico completo, era necesario contar con
un Organismo No Metanognico S el cual oxida el etanol a acetato e hidrgeno,
mientras que el M. bryantii cepa MoH reduce el bicarbonato presente en el medio oon
el hidrgeno ,generado por el organismo S. Termodinmicamente, las reacciones
fueron descritas de la siguiente forma:
Microorganismos L1Ca' (kJ)
Microorganismo S:
2C2HpH + 2Hp 2CHPOO- + 4H2 + H+ + 19.2
M. bryantii:
4H2 + HC03 + H+ CH4 + 3Hp -135.6
Reaccin neta:
-116.4
La remooin de'l hidrgeno por el M. bryantli' permita mantener la presin

parcial de este gas por debajo de 10 3 atmsferas, lo cual favoreca termodinmica-
mente la primera reaccin y perm~ael crecimiento del Organismo INolMetanognico
S. Este descubrimiento mostr la importancia del hidrgeno como intermediaro en
los habitats anaerobios (Hungate, 1967) y permiti la formulacin de una nueva
relacin biolgica interespecficaconocida como 'asociacin sintrfica' o "transferencia
interespecficade hidrgeno', que aclara una de las relaciones ms importantes en la
ecologa microbiana de los ambientes metanognicos.
La subsecuente caracterizacin de las vas metablcas tpicas de las
bacterias metanognicas, as como la de los cofactores involucrados en el
[30] o I G lE S T IN A N A E R O 8 I A
proceso de generacin de metano, llev al cuestionamiento de las relaciones

filgenticas con otras bacterias al ligual que su papel en la evolucin de la
Vida sobre 'el planeta. Mediante el examen de los patrones de secuencia de
Ilos oligonucletidos ' de la fraccin ribosomal 165, fue posibl'e demostrar que
este grupo es filogenticamente diferente de otros procaritidos y de las c-
luas eucaritidas (Figura 2.1). Como tambin se observ, una alta diversi,-
dad dentro del grupo sugiri la existencia de una divergencia evolutiva que
IpUdo haber dado lugar a la aparicim de las tres l.neas ancestrales que origi--
naron los reinos actualmente conocidos_ como Eucariota, Eubacteria y
Archaebacteria (Balch el al.., 1977).
ARQUEOBACTERIAS :
METGENOS
\ H~S 1ERMFILOS EXTREMOS
=
""~ EUCARI0TES
,~ .__ ----.J
1I I
Bacteria
Cianobaclerias verdes no
Flavobaclecias azufradas
Thermologa
Figura 2.1. rbol filoge:ntico universal."
DESA~ROt!.LO y APUCACiN PE
LA DIGESTiNI AN~EROBIA AL
TRATAMIENTO IDE IRESIDUO_S
!La primera aplicacin documentada del tratamiento anaerolilio de aguas

residuales domsticas fue descrita por Mouras al final del siglb, XIXen Fran __
cia. El tratamiento se llevaba a cabo en una cmara cerrada hermtica-
mente, en la cual los slidos sedimentados se degradaban
anarbicamente, (McCarty, 1982).
HISTORIA DE LA DIGESTiN ANAEROBIA [3
En la ltima dcada del siglo XIX y comienzos del siglo XX, en Inglate-
rra, Alemania, India y Estados Unidos se desarr011aron varios sistemas muy
conocidos: el tanque sptico inventado en Inglaterra por (ameran y el tanque
Imhoff en Alemania. En ambos casos los slidos presentes decantan para ser
degradados anerbicamente en el fondo del reactor. Este tratamiento prima-
rio de los slidos fue ampliamente aplicado entre las dos guerras mundiales;
en Alemania se utiliz el tanq~e Imhoff para una poblacin de doce millones
de habitantes (Van Haandel y Lettinga, 1994).
Debido a la baja remocin de materia orgnica, as como a los largos
perodos de tiempo que requieren los sistemas anaerobios, a partir de 1945,
empieza la utilizacin masiva de sistemas aerobios especialmente, Ilodos activa-
dos y filtros percalladores. La alta ,eficiencia de estos sistemas ,en cuanto la
remocin de la materia orgnica expresada en trminos de OSO (90-95%),
comparada con la obtenida con los procesos anaerobios (30-50%) hacan a
'estos !ltimos poco competitivos. En la actualidad, se reconoce que la baja efi-
Ciencia de estos sistemas se relaciona con un pobre contacto entre la masa
bacteriana presente y el material suspendidb y disuelto del agua residual (Van
Haandel y Lettinga, 1994). Por 'esa razn, gran parte del material disuelto o
hidrolizado no IPoda ser utilizado y era descargadb en el efluente del sistema.
A Ipartir de la dcada de los aos 70 fue plenamente reconocida la impor-
tancia del contacto entre el lodo y el sustrato, lo cual permiti el desarrollo de
nuevas configuraciones de reactores y demostr que estos procesos pueden al-
canzar eficiencias de remocin de materia orgnica comparables con las de los
procesos de depuracin aerobios.
En trminos generales, se Iregistran tres generaciones de reactores
anaerobios, las cuales se caracterizan IPorque en cada generacin se reduce el
tiempo de retencin hidrulico y mejora el contacto entre el lodo y el sustrato, lo
cual significa menores volmenes de reactor, costos ms bajos, sistemas ms
estab'les y de ms fdil operacin.
Aunque podra pensarse que en la actualidad los reactores de la primera
generacin han dejado de utilizarse, en muchos pases se continan usando,
'especiialmente en dos campos:
HISTORIA DE LA DIGESTiN ANAEROBIA [31]
En la ltima dcada del siglo XIX y comienzos del siglo XX, en Inglate-
rra, Alemania, India y Estados Unidos se desarrollaron varios sistemas muy
conocidos: el tanque sptico inventado en Inglaterra- por (am~ran Y el tanque
Imhoff en Alemania. En ambos casos los slidos presentes decantan para ser
degradados anerbicamente en el fondb del reactor. Este tratamiento prima-
rio de los slid'os fue ampliamente~aplicado entre las dos guerras mundiales;
en Alemania se utiliz el tanque Imhoff para una poblacin de doce mi,Uones
de habitantes (Van Haandel y Lettinga, 1994).
Debido a Ila Ibaja remocin de materia orgnica, as como a los largos
perodos de tiempo que requieren los sistemas anaerobios, a partir de 1945
empieza Ilautilizacin masiva de sistemas aerobios especialmente, lodos activa-
dos y filtros Ipercoladores. La alta eficiencia de estos sistemas en cua,nto la
remocin de la materia orgnica expresada en trminos de OSO (90~95%),
comparada con la obtenida con los procesos anaerobios (30~50%) hacan a
estos ltimos poco 'competitivos. En la actualidad, se reconoce que Ila baja efi-
cienGia de estos sistemas se relaciona con un pobre contacto entre la masa
bacteriana presente y el material suspendido y disuelto del agua residual (Van
Haandel y Lettinga, 1994). Por esa razn, gran parte del material disuelto o
hidroliZado no podaser utilizado y era descargado en el efluente del sistema.
A partir de la dcada de los aos 70 fue plenamente reconocida la impor-
tancia del contacto entre el lodo y el sustrato" lo cual permiti el desarrollo de
nuevas configuraciones de reactores y demostr que estos procesos pueden al-
canzar eficiencias de remocin de materia orgnica comparables con las de Ilos
procesos de depuracin aerobios.
En trminos generales, se registran tres generaciones de reactores
anaerobios, las ouales se caracterizan porque en cada generacin se reduce ,el
tiempo de retencin hidrulico y mejora el contacto entre el lodo y el sustrato, lo
cual significa menores volmenes de reactor, costos ms bajos, sistemas ms
estables y de ms fcil operacin.
Aunque podra pensarse que en la actualidad los reactores de il primera
generacin han dejado de utilizarse, 'en muchos pases se continan usando,
especialmernte,en dos campos:
En la digestin de los slidos sedimentados en reactores tipos tanque sptico

o tanque Imhoff yen lagunas anaerobias. En estos casos, los lodos sedimenta-
dos en el fondo del reactor son degradados por procesos anaerobios.
En la digestin anaerobia de los lodos resultantes del tratamiento aerobio (Iodos
activados, filtros percoladores), para lo cual se utilizan reactores donde el tiem-
po de retencin celular es igual al tiempo de retencin hidrulico, por lo que se
trabaja con tiempos de retencin hidrulicos muy altos (mayores de 30 das).
Como se mencion anteriormente, los largos tiempos de retencin requeri-
dos, as como un contacto inadecuado entre la biomasa y el material orgnico, ha-
can que estos reactores fueran poco competitivos, en especial para el tratamiento
de grandes volmenes de aguas residuales. Con el fin de resolver estos problemas,
algunos grupos de investigadores de diferentes pases abordaron el diseo de una
nueva generacin de reactores (segunda generacin), en los cuales se independiza
el tiempo de retencin celular del tiempo de retencin hidrulico y se incorporan
elementos para mejorar el contacto entre la materia orgnica y la biomasa anaerobia
presente en el reactor. A fin de evitar la prdida de biomasa en los reactores se han
probado varias estrategias (Lettinga el al. 1999; Van Den Berg, L., 1984):
Aumentar la concentracin de biomasa en el reactor mediante la recirculacin
de los lodos separados en el sedimentador secundario. Este proceso que dio
origen a un sistema denominado 'reactor de contacto anaerobio' que es similar
a los lodos activados (Figura 2.2A) pero bajo condiciones anaerobias. Ha sido
utilizado en Suiza, Francia, Canad y Estados Unidos principalmente para tra-
tar aguas residuales con materia orgnica fcilmente degradable, como el al-
midn. Sin embargo, la adherencia de las burbujas de gas a los lodos genera
problemas en la sedimentacin del lodo y la clarificacin del agua residual
tratada. Para mejorar la separacin del lodo se han utilizado diversos mtodos
como la adicin de polmeros orgnicos y floculantes inorgnicos, la gasificacin
y la centrifugacin, pero sus resultados no han sido satisfactorios.
Con base en la estrategia de fijar la biomasa a un soporte de material inerte, se
desarrollaron los filtros anaerobios de flujo ascendente, similares
conceptualmente a los filtros percoladores (Figura 2.2B) Estos reactores
fueron propuestos por Young y McCarthy (1969), Y en ellos se utiliza un
medio de soporte (carbn, grava, plstico, etc.) con una gran rea superficial
para el desarrollo de una biopelcula anaerobia. Se han utilizado en el trata-
miento de aguas residuales con bajas cargas orgnicas y material suspendido
fcilmente biodegradable. Sin embargo, el principal inconveniente de este siste-
ma ha sido el frecuente taponamiento de los reactores, ya sea por los slidos
presentes en el agua residual o por materiales como el carbonato de calcio o la
biomasa no adherida al soporte.
Desarrollar un grnulo cuyas caractersticas de sedimentacin y actividad
metanognica, permitieran el desarrollo de todos los grupos bacterianos
involucrados en el proceso de degradacin anaerobia de la materia orgnica.
Lodos con estas caractersticas facilitaran la segregacin de las fases gaseosa,
slida y lquida, y evitaran la prdida de la biomasa del reactor. Como producto
de esta estrategia se present el reactor anaerobio de manto de lodos de flujo
ascendente,comnmente conocido como reactor Up Row Anaerobic Sludge Blanket
(UASB) (Figura 2.2C), sistema desarrollado en Holanda por el grupo de Lettinga
et al. (1980). En la actualidad, existen ms de 1.000 reactores que tratan
exitosamente diferentes tipos de aguas residuales agroindustriales, domsticas e
industriales en Holanda, Blgica, Estados Unidos, Brasil y Cuba.
r; Mezclador Gas Gas
- --J 1
Alimentacin
~. e,"," digerido rea de
Colector sedimentacin
de gas
Tanque de
sedimentacin
Digestor Manto
;etorno I de lodo
de lodo
-.J
-+ LIquido digerido
t
Alimentacin Alimentacin
(A) (B) (e)
Figura 2.2 Diversos esquemas de reactores anaerobios:

(A) Contacto anaerobio, (B) Filtro anaerobio y (C) Reactor UASB.
[34] D lE S T ION A N A E R O B I A
Con aparicin de la tercera generacin de reactores anaerobios, se

optimizaron algunas variables del proceso, las cuales que se citan a continuacin:
A fin de mejorar el contacto entre el sustrato y la biomasa, sta se adheri con
partculas inertes de arena (dimetro: O.1-o.3mm), almina o plstico, las
cuales se expanden ante el flujo rpido del agua residual. Estos reactores se
denominaron de 'lecho fluidizado' o 'expandido', y se han utilizado en el trata-
miento de aguas residuales con alta carga orgnica (Figura 2.3A).
Tambin, para mejorar el contacto entre la biomasa y el sustrato, y evitar los
problemas de taponamiento de los filtros anaerobios, se desarrollo el 'reactor.
de pelcula fija y flujo descendente', en el cual la biomasa se adhiere a una
superficie tubular (Figura 2.3B). La cantidad de biomasa depender del rea
superficial del soporte, el grosor de la pelcula ser controlado por el flujo del
agua descendente y la mezcla del residuo se logra por el flujo de gas ascen-
dente. Los slidos suspendidos son eliminados con el efluent~ evitando as los
problemas de taponamiento. Este sistema ha sido utilizado en el tratamiento
de aguas residuales con baja y alta carga orgnica en pases como Canad y
Puerto Rico.
Gas
t
. Alimentacin
Liquido
digerido
Trampa de
soporte Material de
Lecho soporte
fluid izado
Bomba de
recirculacin
Alimentacin

Liquido digerido
(A) (B)
Figura 2.3 Reactores de lecho fluidizado (A) y de lecho fijo con flujo descendente (B).
La separacin de la fase metanognica de las fases de hidrlisis y acidificacin

permite un manejo por aparte de los principales grupos microbianos
involucrados. Este sistema se denomina 'reactor de fases separadas' y logra
disminuir el tiempo de retencin hidrulico, lo cual facilita la operacin del
sistema y confiere una mayor estabilidad al proceso (Figura 2.4). La separa-
cin ha sido exitosa principalmente con aguas residuales parcialmente
acidificadas que se operan a bajas temperaturas.
Mezclador
11 -Gas
Lquido
digerido
Alimentacin
Separador
gas. lquido. slido
Manto
de
lodos
Acidificacin Metanogenizacin
Figura 2.4 Reactores de fases separadas

[36] D I G E S T ION A N A E R O B I A
BIBLIOGRAFA
BALCH,W E., Fox, G.E., Magrum, L.J.,Woese, eR. yWolfe, R.5. (1979). "Methanogens: Revaluation
of Unique Biological Group". Microbi%gica/ Reviews, 43: 260-296.
BARKER, HA (1936). "Studies upon the methane-producing bacteria". Archiv fur Mlkrobi%gy,
7: 420-438.
BARKER, HA (1956). Bacterial Fermentations. New York: John Wiley & Sons, p. 1-27.
BRYANT,M.P.,Wolin, EA y Wolfe, R.5. (1967). "Methanobaal/us ome/ianskll, a symbiotic association
of two species of bacteria". Archiv fur Mikrobi%gie, 59: 20-31'.
BUSWEL, A.N. y Sollo, F.W (1948). "The mechanism of the methane fermentation". American
Chemica/ Society Journa/, 70: 1778.
HUNGATE, R.E. (1967). "Hydrogen as an intermediate in the rumen fermentation". Archiv fr
Microbi%gie, 59: 158-164.
HUNGATE,R.E. (1969) "A roll tube method for cultivation of strict anaerobes". Methods Microbio/,
3B:117-132.
LETIINGA, G., Van Velsen, A.F.M., Hobma, S.w., de Zeeuw, W. y Klapwijk, A. (1980). "Use of the
Upflow Sludge Blanket (USB) reactor concept for biological wastewater treatment,
especially for anaerobic tretament". Biotechn%gy & Bioengineering, 22: 699-734.

LETIINGA, G., Hulshoff, Poi, L.W y Zeeman, G. (1999). Lecture notes: Biological Wastewater
Treatment. Part 1: Anaerobic Wastewater Treatment. Wageningen University The
Notherlands. December 1999.
McCARTY.L. (1982). "One hundred years of anaerobic treatment". Proceedings of the Second
International Symposium on Anaerbic Digestion, Federal Republic of Germany. Sept. 6-
11, 1981. Elsevier Biomedical Press, Amsterdam.
PINE, M.J Y Barker, HA (1956). "Studies on the methane fermentation. XII. The pathway of
hydrogen in the acetate fermentation". Journa/ol Baderi%gy, 71: 644.

H 1ST o R I A DEL A DI G E ST I 6 N A N A E RO B I A [37]
STADMAN, R.e. y Barker, HA (1949). "Studies on the methane lermentation. VII. Traeer Experiments
on the Meehanism 01 Melhane Formalion". Archives of Biochemistry, 21: 256.
VAN DEN BERG, L. (1984). "Development in Methanogenesis lrom Industrial Waste Water". Journal
of Microbiology, 30: 975-990.
VAN HMNDEL, A. Y Lettinga, G. (1994). Tratamenlo anaerobio de esgotos em regioes de clima
quente. Editorial Epgral. Campina Grande, Brasil.
YOUNG, J.e. y MeCarty, L. (1969). "The Anaerobie Filler lor Wasle Treatment". j Water Pollution
Control Federation, 41: R- 160.
captulo
t r e s
MICROBIOLOGA DE
LA DIGESTiN
ANAEROBIA
SE DENOMINA DIGESTiN ANAEROBIA AL PROCESO EN VIRTUD DEL CUAL LA MATERIA ORGNICA
ES CONVERTIDA EN METANO, DiXIDO DE CARBONO E HIDRGENO, EN AUSENCIA DE OXGENO
Y a causa de la accin combinada de diferentes poblaciones bacterianas. La

formacin de metano y dixido de carbono corresponde a la ltima etapa de
una serie de reacciones en las cuales los compuestos orgnicos son
degradados completamente.
La digestin anaerobia es un proceso que se produce en ambientes natu-
rales como los pantanos, en zonas anegadas para el cultivo del arroz, en los
sedimentos de lagos y mares, en las zonas anxicas del suelo, en fuentes de aguas
termales sulfurosas y en el tracto digestivo de los rumiantes. Bajo condiciones
anaerobias, los diferentes grupos bacterianos interactan unos con otros y cons-
tituyen una comunidad microbiana, la cual tiene una estructura definida y a la que
contribuye cada poblacin para su mantenimiento.
INTERACCIONES MICROBIANAS
En una comunidad, las diferentes poblaciones pueden desarrollar interacciones

positivas y negativas, las cuales surgen en una sola poblacin o entre las diferen-
tes poblaciones que la conforman. Estas interacciones permiten que las poblacio-
nes alcancen un tamao ptimo con los recursos disponibles del habitar,' en su
conjunto, las interacciones mantienen el balance ecolgico de la comunidad
De acuerdo al principio de AIIee, las interacciones positivas y negativas
que ocurren en una poblacin, dependen de la densidad. Cuando se presenta
una relacin positiva, la tasa de crecimiento aumenta y cuando es negativa, se
presenta el efecto inverso. En general, las interacciones positivas (cooperacin)
se presentan en poblaciones con baja densidad, mientras que las interacciones
negativas (competencia) se presentan cuando existe una alta densidad
poblacional. Como resultado, el mximo crecimiento se logra cuando se alcanza

la densidad poblacional ptima.
Cuando dos poblaciones diferentes interactan, una o ambas podrn be-
neficiarse o afectarse negativamente de esta relacin. Para categorizar estas re-
laciones se utiliza un sistema de clasificacin conceptual en el cual se describe
cada una de ellas (Tabla 3.1). En general, en comunidades simples slo se pre-
sentan una o ms de estas interacciones; sin embargo, en comunidades comple-
jas probablemente se presentan todas las interacciones posibles.
Tabla 3.1. Tipos de interacciones entre poblaciones microbianas
Efecto de la interaccin
Interaccin Poblacin A Poblacin B
Neutralismo o o
Comensalismo o +
Sinergismo + +
Mutualismo + +
Competencia
Amensalismo O/ +
Predacin +
Parasitismo +
O = Sin efecto.
+ = Efecto positivo.
- = Efecto negativo.
Fuente: Atlas y Bartha, 1993.
Con el desarrollo de interacciones positivas en una comunidad, los

microorganismos utilizan los recursos disponibles en un determinado habitat de manera
eficiente,combinando sus capacidadesfsicasy metablicas,lo cual permite que lastasas
de crecimientoy/o supervivenciaaumenten. Las interacciones negativas actan como un
mecanismode retro-alimentacin que limita la densidad poblacional;no obstante, a largo
plazo son un mecanismo de auto regulacin que beneficia las especies porque evita la
sobrepoblacin, la destruccin del habitat y la extincin.
MICROBIOLOGIA DE LA DIGESTiN ANAEROBIA [43]
DEGRADACiN ANAEROBIA DE LA
MATERIA ORGNICA
Enel proceso de degradacin anaerobia de la materia orgnica intervienen

diversos grupos de bacterias anaerobias facultativas y anaerobias estrictas las
cuales utilizan en forma secuencial los productos metablicos generados por cada
grupo, segn se esquematiza en la Figura 3.1. El flujo de carbones y electrones
generado durante la degradacin anaerobia de los compuestos orgnicos involucra
tres grandes grupos trficos:
Grupo 1: bacterias hidrolticas y fermentativas.
Grupo 11: bacterias acetognicas.
Grupo 111:bacterias metanognicas.
El proceso se inicia con la hidrlisis de poliscaridos, protenas y lpidos
por la accin de enzimas extracelulares producidas por las bacterias del Grupo
1.Los productos de esta reaccin son molculas de bajo peso molecular como
los azcares, los aminocidos, los cidos grasos y los alcoholes, los cuales son
transportados a travs de la membrana celular; posteriormente son fermenta-
dos a cidos grasos con bajo nmero de carbonos como los cidos actico,
frmico, propinico y butrico, as como compuestos reducidos como el etanol,
adems de Hz y COz. Los productos de fermentacin son convertidos a acetato,
hidrgeno y dixido de carbono por la accin de las bacterias del Grupo 11,las
cuales son conocidas como 'bacterias acetognicas productoras de hidrgeno'
(Figura 3.1).
Finalmente, las bacterias del Grupo III o metanognicas convierten el
acetato a metano y dixido carbono, o reducen el dixido de carbono a metano.
Estas transformaciones involucran dos grupos metanognicos que son los en-
cargados de llevar a cabo las transformaciones mencionadas anteriormente.
En menor proporcin, compuestos como el metanol, las metilaminas y el cido
frmico pueden tambin ser usados como sustratos de el grupo metanognico
(Figura 3.1).
pOLMEROS COMPLEJOS
B. celuloHticas O
Polisacridos (celulosa),
hidroliticas
Lpidos, Protenas
HIDRLISIS Grupo I
MONMEROS
B. fermentativas Azcares, Aminocidos,
cidos grasos
FERMENTACiN
[ 1
PROPIONATO
H, + CO, ACETATO
BUTIRATO
Bacterias B. acetognicas
homoacetogenicas ACETOGENSIS productoras
deH
HOMOACETOGNESIS
1 Grupo 11
ACETATO 1
H, + CO, ACETATO

B. metanognicas B. metanogenicas Grupo 111
acetoclasticas hidrogenofilicas
METANO
Fuente: Madigan. Martinko y Parker. 1997.
Figura 3.1. Principales etapas de la digestin anaerobia y grupos
bacterianos involucrados.
En la Tabla 3.2 se consignan las principales reacciones bioqumicas que se

llevan a cabo en el proceso de digestin anaerobia con los correspondientes
cambios de energa libre.
MICROBIOLOGA DE LA DIGESTiN ANAEROBIA [45]
Tabla 3.2. Principales reacciones qumicas que ocurren en la digestin anaerobia

de la materia orgnica
Tipo de Reaccin Ecuacin LlGO 1 LlGo.2
(KJ/reaccin) (KJ/reaccin)
Fermentacinde Glucosa + 4H20 -+ CH3COO-+ 4H+ + 4H2 - 207 -319

glucosa a acetato
Fermentacinde la Giucosa + 2H20 -+ C,H02 + 2HC03- + 3H+ + 2H2 . -135 -284

glucosa a bulirato
Fermentacin del Butirato + 2H20 + 48.2 -17.6

bulirato a acetato e H2
Fermentacindel + 76.2 - 5.5

propionato a acetato
Acetognesis a -105 - 7.1

partir del H2y CO2
Metanognesis a partir -136 -3.2

del CO2y H2
Metanognesis a -31 - 24.7

partir del acetato
1 Condiciones estndar: solutos 1 molar. gases 1 atmsfera.
2Condiciones tpicas en un reactor anaerobio: AGV = 1mM, HC03 = 20mM, Glucosa= 1OmM, CH,
=0.6mM, H2 =10 .. mM.
Fuente: lindero 1984.
BACTERIAS INVOLUCRADAS EN EL
PROCESO DE DIGESTiN ANAEROBIA
Grupo 1: Bacterias fermentativas - hidroliticas
La utilizacin microbiana de polmeros complejos requiere que los microorganismos

involucrados en su degradacin sean capaces de hidrolizar o romper las molculas
de polisacridos, protenas y grasas e hidrolizarlas a compuestos simples como
azcares, aminocidos y cidos grasos. Las bacterias que llevan a cabo estas reac-
ciones son anaerobias facultativas y los gneros ms frecuentes que llevan a cabo
esta reaccin son los miembros de la familia Enterobacteriaceae, adems de
[46] D I G E S T IN A N A E R O B I A
los gneros: Baci//us, Peptostreptoeoeeus, Propionibaeterium, Baetero/des,

Microeoeeus y [fostndium.
DIGESTiN ANAEROBIA DE POLISACRIDOS
En aguas residuales, los polisacridos ms comunes son la celulosa, la hemicelulosa,

el almidn y la pectina; normalmente estn presentes en materiales como el papel, la
madera o la paja, los cereales y tubrculos comestibles, as como en los productos
del procesamiento del caf y la fabricacin de cerveza.
POLlSACRIDOS
AZCARES
1
2H PIRUVATO I 2H
H, 2H OXALACETATO
I
~ CO, +
LACTATO
CO, 1 L- SUCCINATO
ACETILCoA ACRIDILCoA
4H
rACE~ATol 4H 2H
ETANOL BUTIRATO PROPIONATO
Fuente: Bryant 1979.
Figura 3.2. Principales vas metablicas de la degradacin anaerobia de polisacridos.
Los polisacridos son carbohidratos de alto peso molecular constituidos

por un gran nmero de unidades monomricas unidas una a otra por enlaces
covalentes conocidos como enlaces glucosdicos. Estos enlaces pueden tener orien-
tacin a o 3, por lo que algunos polisacridos con las mismas unidades
monomricas (por ejemplo, la glucosa), tienen propiedades funcionales diferentes
debido a las diferentes configuraciones (a y 3) de los enlaces glucosdicos. Es
M I e R o B I o LaG IA o E L A DI G E ST I 6 N A N A E RO B I A [47]
comn encontrar dos tipos importantes de polisacridos: aquellos como la celulo-

sa y la hemicelulosa con enlaces 13-1-4, y los polisacridos como la pectina y el
almidn, con enlaces a-1-4. En la Figura 3.2 se presentan las principales vas
metablicas utilizadas en la degradacin de polisacridos.
El rompimiento de los enlaces 13-1-4 presentes en la celulosa se lleva a
cabo mediante la accin de enzimas extracelulares, las cuales rompen el enlace
introduciendo una molcula de agua. Las enzimas involucradas en la hidrlisis de la
celulosa se conocen como 'celulasas'. El rompimiento de los enlaces a-1-4, comu-
nes en el almidn y la pectina, son hidrolizados por la accin de amilasas y pectinasas
las cuales son enzimas constitutivas de la gran mayora de los organismos.
DIGESTiN ANAEROBIA DE PROTENAS
Las protenas se encuentran comnmente en aguas residuales y estn constitui-

das por aminocidos unidos mediante enlaces peptdicos. Las protenas son solu-
bles en agua y su hidrlisis se lleva a cabo por accin de proteasas; los productos
son generalmente pptidos de cadena corta y aminocidos. Estos productos son
rpidamente fermentados a cidos orgnicos, amonio y COz' Las bacterias con
actividad protelitica son en su mayora especies de los gneros C/ostridium,
Peptococcus, Bifidobacteriumy Staphy/ococcus. Las vas metablicas utilizadas en
la degradacin de protenas se presentan en la Figura 3.3.
PROTEiNAS

POLlPPTIDOS
!
Pptldos de
Aminocidos + + NH, + CO,
cadena corta
Acetato, Isobutirato ]
Crecimiento
microbiano
Metilbutirato f--------
Isovaleriato
NH, + CO, ------+, Aminocidos
Fuente: Mclnerney. 1988.
Figura 3.3. Degradacin de protenas y metabolismo del nitrgeno.

[48] o I G E S T I 6 N A N A E R O B I A
DIGESTiN ANAEROBIA DE LPIDOS
Estasmolculasestn constituidas por cidos grasos unidos por un enlace ster a una
molculade glicerol, y se denominan triglicridos cuando tres cidos grasos se unen al
glicerol. La hidrlisis depender de la solubilidad del cido, la cual a su vez es funcin
del pH. Por tanto, a altos valores de pH la solubilidad aumenta y a bajos valores dismi-
nuir, por lo que la hidrlisis tendr un compo tamiento similar.
En ambientes anaerobios, los steres del glicerol son hidrolizados libe-
rando los cidos grasos. El glicerol, la galactosa, la colina y otros componentes
tambin son liberados durante la hidrlisis y posteriormente fermentados a ci-
dos grasos voltiles por la accin de las bacterias fermentativas. Sin embargo,
los cidos grasos libres no son fermentados por las bacterias fermentativas, y
solamente en algunos casos los cidos grasos insaturados pueden ser
hidrogenados. En los digestores anaerobios y sedimentos acuticos, donde el
tiempo de retencin es suficientemente largo, los cidos grasos (de cadenas
larga y corta) son oxidados por las bacterias sintrficas productoras de Hz a
acetato mediante la va de la B-oxidacin. En ambientes ricos en sulfatos como
los sedimentos marinos, la degradacin se lleva a cabo por las bacterias sulfato
reductoras. Bacterias como Anaerovibrio lipolytica con actividad lipoltica han
sido aisladas del rumen; esta bacteria fermenta el glicerol, la ribosa y la fructosa
a acetato, propionato y succinato; sin embargo, no puede hidrolizar galacto-
Jpidos a menos que los residuos de galactosa sean removidos. Igualmente, la
Butyrov/brio ftbrisolvens hidroliza fosfo-Jpidos cuando crece con azcares
fermentables como fuente de carbono.
Grupo 11:Bacterias acetognicas
Para que tenga lugar una eficiente metanognesis, los productos de fermentacin
como el propionato y el butirato deben ser oxidados a acetato, COz'e Hz.Esta oxida-
cin es llevada a cabo por un grupo denominado organismos acetgenos productores
obligados de hidrgeno (OHPA, Obligate Hydrogen Producing Acetogens), mediante
un proceso conocido como 'acetognesis'.
Aunque la mayora de este tipo de reacciones consumen energa, el aco-

piamiento de la actividad de las bacterias OHPAcon la de las bacterias consu-
midoras de Hz (metangenos hidrogenoflicos), mediante la 'transferencia
interespecfica de hidrgeno', permiten un balance energtico favorable. Esto
significa que en ambientes donde la energa disponible para los
microorganismos es baja, como ocurre en reactores anaerobios, las relacio-
nes de cooperacin entre los dos grupos microbianos permiten el mximo
aprovechamiento de la energa. As, si una clula requiere un mnimo de + 70kJ
para la sntesis de 1 mol de ATP, las relaciones de cooperacin entre los
microorganismos, permitirn mantener sus actividades metablicas con slo
-20kJ (Schink, 1997).
TRAN5FERENCIA INTER-E5PECFICA DE HIDRGENO
Durante la acetognesis el hidrgeno es un factor de regulacin de la degrada-

cin anaerobia de compuestos orgnicos. La produccin de hidrgeno en esta
fase proviene de la oxidacin del NADPH(nicotin-adenin-difosfo-nucletido) cuyo
potencial redox a pH 7 es -0.32 V (Wo/in, !976). Sistemas con bajos potenciales
redox (Eh)' como el que se obtiene durante la acetognesis del piruvato, se ven
poco afectados por la presin parcial de hidrgeno y las reacciones estn favore-
cidas, por lo cual no pueden ser controladas. Reacciones en sistemas con altos
potenciales redox (Eh)' como los que se presentan en la produccin de Hza partir
del NADPH,o en la acetognesis a partir del propionato o butirato, slo estarn
favorecidas a bajas presiones parciales de hidrgeno, condicin facilitada por la
interrelacin entre las bacterias OHPA y las bacterias metanognicas
hidrogenoflicas. Este ltimo grupo, consume el hidrgeno generado por las OHPA
manteniendo una presin parcial de Hza un nivel adecuado para que termodin-
micamente pueda darse la conversin de los AGV a acetato e hidrgeno. Esta
asociacin se conoce como 'relacin sintrfica' o 'transferencia interespecfica
de hidrgeno'.
El sistema sintrfico mejor estudiado en el metabolismo fermentativo,
es la fermentacin del etanol a acetato y metano por un agente oxidante
anaerobio y un metangeno.
fermentacin del etanol:
2CH3CHpH + 2Hp -+ 4Hz + 2CH3COO- + 2H+

Etanol Acetato
LiGo = + 41.9 KJ/reaccin
Metanognesis:
4Hz + COz -+ CH4 + 2Hp

LiGo = -142.5 KJ!reaccin
Reaccin acoplada:
2CH3CHpH + COz --+ CH4 + 2CH3COO- + 2H+

LiGo = -100.6 KJ /reaccin
En este sistema, los fermentadores del etanol producen hidrgeno y acetato

en una reaccin con un balance energtico desfavorable. Sin embargo, el hidrgeno
generado por las bacterias fermentativas es consumido por un metangeno en una
reaccin energticamente favorable. Cuando el cambio en energa libre de estas dos
reacciones se suma la reaccin total ser energticamente favorable.
Solamente un limitado nmero de especies del grupo OHPA han sido aisla-
das; probablemente existen ms, pero an no son conocidas. Dentro de las espe-
cies aisladas capaces de degradar cidos grasos se pueden mencionar:
Syntrophomonas sapovorans (Roy et a/., 1986): oxida cidos grasos de 4 a 8
carbonos y algunos cidos grasos insaturados produciendo acetato, COze Hz,
Syntrophobacter wo/inii (Boone y Bryant, 1980): oxida propionato generan-
do acetato, COze Hz,
(OHPAj
-+ CH3COO- +H+ + 2Hz

LiGo = + .76 KJ/reaccin
Reaccin acopLada con la bacteria metanognica:
4CH3CHzCOO- + 3Hp -+ 4CH3COO- + 3CH4+H++HC03-

LiGo = -102.4 KJ/reaccin
MICROBIOLOGA DE LA DIGESTIN ANAEROBIA [51]
5yntromonas wo/fei (Mclnerney et al., 1981). Oxida cidos monocarboxilicos

saturados de 4 a 8 carbonos a acetato e hidrgeno.
5yntrophospara bryantti' (Stieb y Schink, 1985; Zhao et al., 1990) : oxida
cidos grasos de cuatro a once carbonos.
5yntrophus buswe/It' (Mountfort, 1984): oxida el benzoato.
Todas las bacterias OHPA aisladas crecen lentamente y sus tiempos de
generacin son muy largos. El estudio de 5yntrophobacter wohi7l'(Boone y Bryant,
1980) mostr que en sintrofa con Methanospiri//um hungateitiene un tiempo de
generacin de 161 horas. Este hecho junto con las necesidades de aislarlas en
co-cultivo ha limitado su estudio fisilogico. Sin embargo en 1987, Kaspar y su
grupo de trabajo lograron desacoplar la oxidacin del butirato y la utilizacin del
hidrgeno, sustituyendo la bacteria hidrogenofilica por una oleofina en presencia
de catalizadores. De esta forma, se logr el cultivo puro de la bacteria OHPA
abriendo as, nuevas perspectivas para futuros trabajos.
Los rendimientos energticos (GO) de todas las conversiones realiza-
das por el grupo OHPAa condiciones estndar (solutos 1M; gases 1 atm) son
positivos, por lo que se piensa que la oxidacin de los cidos grasos a hidrge-
no deber estar acoplada a la produccin de ATP.Esto significa que la presencia
o ausencia de Hz afectar el rendimiento energtico de la reaccin. Como la
concentracin tanto del reactante como la del producto afecta el cambio en
energa libre de la reaccin (GO), .el rendimiento energtico en situaciones
reales puede diferir del rendimiento obtenido a condiciones estndar. As, cuan-
do el Hz es un producto, las bacterias consumidoras de hidrgeno pueden man-
tener la concentracin de Hz tan baja que el rendimiento energtico estar
afectado significativamente. Por ello, durante la fermentacin del etanol a acetato
e Hz el Go' (a 1 atm) es de + 9.63 kJ, sin embargo a 10 atm. el cambio en
energa libre es de -36.03 kJ.
Teniendo en cuenta lo anterior, en una digestin anaerobia estable, las
condiciones de las reacciones estarn controladas por la concentracin de
propionato, acetato e hidrgeno libre, donde las concentraciones de acetato y
propionato oscilarn entre 10-4 Y 10-5 molar y las presiones parciales de
hidrgeno sern inferiores a 10-4 atmsferas (Figura 3.4). A presiones parcia-
[52] D I G E S T IN A N A E RO B I A
les de Hz mayores a 10-1 para el etanol, 10-3 para el propionato, y 10-4 para el
butirato, la transferencia de hidrgeno no ocurre. A estos valores se produce una
inhibicin de las bacterias hidrogenofilicas, lo cual genera una sobreproduccin de
Hz cuya acumulacin inhibir el proceso. Tambin es necesario tener en cuenta que
a nivel de la primera etapa las bacterias fermentativas transfieren los electrones va
Hz a las bacterias hidrogenofilicas, haciendo que las primeras produzcan una mayor
cantidad de acetato y por tanto una mayor cantidad de energa. Cuando la transfe-
rencia de hidrgeno no ocurre, el metabolismo de las bacterias fermentativas se
desplazar hacia una mayor produccin de compuestos reducidos como el etanol, el
lactato, el propianato, el butirato, etc.
-10
-8 , V, CH3CH,OH + 1/2H,O - V, CH3COOH + H,
--6 H, + 1/4CO,- V, CH, + '/, H,O

....-
--4 1/2CH3COOH _o. 1/2CH. + V, CO,

.
...-
1/3CH3CH,COOH + 213H,O - Regin para la oxidacin
1/3CH3COOH + 1/3CO, j- H,
2
Regin para la oxidacin del
propionato a metano
L del etanol a metano
-8 -7 -6 -5 --4 -3 -2 -1 O
Figura 3.4. Efecto de la presin parcial de hidrgeno sobre la energia libre durante la
conversin del etanol, el propionato, el acetato y el hidrgeno durante la
digestin anaerobia.
Las relaciones dependientes de la transferencia interespecfica de hidr-

geno se pueden presentar en los siguientes casos:
M I e RO B I o LO G A o E L A DI G E S TI 6 N A N A E R o B I A [53]
1. En bacterias involucradas en el catabolismo de alcoholes o lactato. Estos

microorganismos pueden crecer con otros sustratos sin necesidad de una transfe-
rencia de hidrgeno, pero slo pueden degradar alcoholes o lactato cuando el
hidrgeno es removido por asociacincon bacterias consumidoras de hidrgeno o
cuando hay un aceptor de hidrgeno inorgnico (sulfato) u orgnico (fumarato).
2. En bacterias que degradan carbohidratos simples y complejos. Crecen bien sin
que se produzca la remocin de hidrgeno, sin embargo cuando estn en
presencia de bacterias consumidoras de hidrgeno incrementan la produccin
de hidrgeno y acetato, disminuyendo la concentracin de propionato, butirato,
lactato y etanol.
3. En bacterias que producen hidrgeno de forma obligatoria, por lo que deben
mantener una relacin sintrfica obligada con bacterias consumidoras de hi-
drgeno las cuales reducen las concentraciones de hidrgeno en el medio
(Ramrez, 1997).
Aunque la transferencia interespecfica se asocia fundamentalmente al hi-
drgeno, se ha podido establecer que el formato y el acetato tambin pueden ser
transferidos. La difusin de estos compuestos de un organismo a otro, es un
fenmeno regulado por factores como la relacin rea superficial/volumen de las
bacterias, la constante de difusin del compuesto, el gradiente de concentracin y
la distancia entre los dos organismos (Schir'iky Thauer, 1988).
La distancia entre organismos productores y consumidores es un factor cr-
tico para la difusin del H2 y depender de la forma en que este estructurada la
biomasa. Clulasagrupadas en lodos granulares presentan alta densidad celular lo
cual favorece la transferencia interespecfica de electrones, por lo que con estos
\
lodos se obtiene una alta actividad metanognica con sustratos como propionato y
butirato (Grotenhuis eta!., 1991).
Estudios orientados a determinar la importancia relativa de otros sustratos
en la transferencia de electrones en cultivos sintrficos, no han mostrado resultados
concluyentes a este respecto. En el caso del formato, las bajas concentraciones, la
poca capacidad de las poblaciones acetognicas para formar este sustrato, as
como la baja capacidad de los metangenos y sulfato reductoras para utilizarlo,
son algunos de los factores que han dificultado establecer con claridad el papel
[54] D I G E S T I 6 N A N A E R O B I A
de este compuesto en la transferencia interespecfica de electrones (Grotenhuis

et al., 1991; Stams, 1994).
BACTERIAS HOMO-ACETOGNICAS
Dentro del grupo de acetgenos existe un grupo de bacterias conocidas como 'bac-
terias homo-acetognicas' las cuales son anaerobias obligadas y utilizan el COz'
como aceptor final de electrones, produciendo acetato como producto nico de la
fermentacin anaerbica. Los electrones para la reduccin del COzprovienen del Hz
y de una variedad de compuestos como azcares, cidos orgnicos, alcoholes,
aminocidos y ciertas bases nitrogenadas.
Auque este grupo no es un grupo taxonmico definido, en l se incluyen una
amplia variedad de bacterias Gram (+) y Gram(-) formadoras de esporas tales
como Clostridium aceticum, Clostridium formicoaceticumy Acetobacterium wooddi
(Balch et al.., 1977).
Las especies Clostridiumy Acetobacterium wood//pueden utilizar compues-
tos orgnicos o inorgnicos mediante la fermentacin homoactica de azcares o
la reduccin del COz'de la siguiente forma:
C6HP6 --+ 3CHjCOOH

2COz + 4Hz --+ CHjCOOH + 2Hp
Las bacterias homo-acetognicas fermentan la glucosa mediante la va

glucoltica produciendo dos molculas de piruvato y dos molculas de NADH.Ade-
ms del acetato producido a partir de las dos molculas de piruvato, una tercera
molcula de acetato se genera por la reduccin del COzproducido en la reaccin,
utilizando los 4 electrones generados en la gluclisis ms los 4 electrones produ-
cidos en la oxidacin del piruvato. Por tanto, la produccin total a partir del piruvato
son tres molculas de acetato.
La mayora de los homoacetgenos convierten el COzen acetato por la va
de la acetil-CoA. La reaccin de homoacetognesis es:
4Hz + H+ + 2HCOj- --+ CHjCOO- + 4Hp

.dGo = -113.2 KJ/reaccin
M le RO B I o L o G A o E L A DI G E S TI 6N A N A E R o B I A [55]
En la Figura 3.5. se presentan las reacciones seguidas por las bacterias

homoacetognicas, sulfato reductoras y metanognicos para la sntesis de acetato.
El grupo metilo del acetato se origina en una serie de reacciones enzimticas en las
cuales el COzse reduce para formar el grupo metilo del acetato, y otra molcula de
COzse incorpora para formar el grupo carboxilo. La va Acetil-CoA requiere Hzcomo
donador de electrones, y una enzima clave es la carboxil-monoxido-dehidrogenasa
que contiene como cofactores los metales Ni, Zn, y hiero. La importancia de esta
enzima es que cataliza la reduccin del dixido de carbono a monxido de carbono,
el cual termina en la posicin carbonil del acetato. Inicialmente el COzse reduce a
formato por la accin de la enzima formiato-dehidrogenasa, y posteriormente se
convierte en formil-tetrahidrofolato. El grupo metilo es entonces transferido a una
enzima que tiene vitamina B1Z como cofactor. En la fase final de la sntesis del
acetato, el grupo metilo se combina con el COen la monxido dehidrogenasa. La
adicin de la coenzima A se produce en este punto, y la CO-dehidrogenasa cataliza
la formacin del acetil-CoA como producto final.
ca, 2H,
..--------------------.
"-... "-... B"

"-.... CH,-B,
/" ) CHa-THF CH,-THF
l
~::~:~~~~~~:ro
ATP THF Formil Metil Metil-B"
L ~~:~~_~:~:::~~:~::
ca, ca ca ------------:
H, "-... I I
Fe ------------'-+ Fe
/"
Fe
I
~-Ni
I
tiI-Ni
........
ca dehidrogenasa
~.
1-
.-Ni-
CoA
CH.

N'
F~erza
Proton
Motriz
CH,-caaH .
/~- CH,-Ca-SCoA

Acetato ATP Acetil CoA ATP
Neto: 4H2 + 2C02
Figura 3.5. Va del Acetil-CoA, mecanismo autotrfico de las bacterias homo-gnicas,

sulfato reductoras y metanognicas. (Tomado de Brock, 1997)
Grupo 111:Bacterias metanognicas
Las bacterias metanognicas pertenecen al grupo actualmente conocido como

Archeaea, cuyos miembros presentan caractersticas diferentes a las encontradas
en Bacteria. Estas caractersticas estn relacionadas fundamentalmente con la
composicin qumica de algunas estructuras celulares.
Aunque la estructura de la membrana celular es una bicapa de
fosfolpidos, en lugar de los enlaces ster presentes en la unin entre el
glicerol y los cidos grasos, los lpidos del grupo Archaea son qumicamente
nicos, debido a que la unin del glicerol a las cadenas laterales hidrofbicas
se hacen mediante enlaces ter, adems los Ipidos carecen de cidos grasos
y en su lugar presentan cadenas laterales constituidas por unidades del hi-
drocarburo isopreno. Los di-teres de glicerol y los tetra-teres de glicerol
son las principales clases de lpidos presentes en las especies del grupo
Arquea, e:los forman una monocapa lipdica, en lugar de un arreglo de bicapa.
Estas monocapas son muy resistentes y se encuentran ampliamente distri-
buidas en bacterias hipertermfilas.
En forma similar, las paredes de algunos metangenos estn constituidas
de un polisacrido similar al pptido-glucano, el cual se ha denominado
pseudopptido-glucano y est compuesto de unidades alternadas de N-acetil-
glucosamina y cido N-acetiltalosaminurnico. Los enlaces glucosdicos son 1-3
en lugar de los 1-4 encontrados en el pptidoglucano. Las paredes celulares de
otros Archaea estn constituidas de polisacridos, glicoprotenas, o protenas.
Especies de Methanosarcina presentan paredes gruesas de polisacridos consti-
tuidos de glucosa, cido glucornico, galactosamina, y acetato.
Las bacterias metanognicas son anaerobias estrictas y producen metano
como principal producto del metabolismo energtico. A pesar de los requerimien-
tos estrictos de anaerobiosis obligada y el metabolismo especializado de este
grupo, estas bacterias se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza.
La actividad metanognica es mucho mayor en ecosistemas de agua dulce y te-
rrestres, la menor actividad detectada en ocanos, se debe a la alta concentra-
Grupo 111:Bacterias metanognicas
Las bacterias metanognicas pertenecen al grupo actualmente conocido como

Archeaea, cuyos miembros presentan caractersticas diferentes a las encontradas
en Bacteria. Estas caractersticas estn relacionadas fundamentalmente con la
composicin qumica de algunas estructuras celulares.
Aunque la estructura de la membrana celular es una bicapa de
fosfolpidos, en lugar de los enlaces ster presentes en la unin entre el
glicerol y los cidos grasos, los lpidos del grupo Archaea son qumicamente
nicos, debido a que la unin del glicerol a las cadenas laterales hidrofbicas
se hacen mediante enlaces ter, adems los lpidos carecen de cidos grasos
y en su lugar presentan cadenas laterales constituidas por unidades del hi-
drocarburo isopreno. Los di-teres de glicerol y los tetra-teres de glicerol
son las principales clases de lpidos presentes en las especies del grupo
Arquea, e:los forman una monocapa lipdica, en lugar de un arreglo de bicapa.
Estas monocapas son muy resistentes y se encuentran ampliamente distri-
buidas en bacterias hipertermfilas.
En forma similar, las paredes de algunos metangenos estn constituidas
de un polisacrido similar al pptido-glucano, el cual se ha denominado
pseudopptido-glucano y est compuesto de unidades alternadas de N-acetil-
glucosamina y cido N-acetiltalosaminurnico. Los enlaces glucosdicos son 1-3
en lugar de los 1-4 encontrados en el pptidoglucano. Las paredes celulares de
otros Archaea estn constituidas de polisacridos, glicoprotenas, o protenas.
Especiesde Methanosarcina presentan paredes gruesas de polisacridos consti-
tuidos de glucosa, cido glucornico, galactosamina, y acetato.
Las bacterias metanognicas son anaerobias estrictas y producen metano
como principal producto del metabolismo energtico. A pesar de los requerimien-
tos estrictos de anaerobiosis obligada y el metabolismo especializado de este
grupo, estas bacterias se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza.
La actividad metanognica es mucho mayor en ecosistemas de agua dulce y te-
rrestres, la menor actividad detectada en ocanos, se debe a la alta concentra-
M I e RO B I o LO G f A oE L A DI G E S T IN A N A E R o B I A [57]
cin de sulfatos, condicin que favorece la sulfato reduccin en sedimentos mari-

nos (Whitman et al., 1992; Zinder, 1998).
Lasbacteriasmetanognicaspueden llevar a cabo una seriede reaccionespor la
presenciade ciertas coenzimas,las cualesno se encuentran en otros gneros de bacte-
rias,y se clasificande la siguientemanera: coenzimastransportadoras de CI : coenzima
M, metanofurano y metanopterina, y coenzimas involucradas en reacciones Redox:
coenzimaF4Z0 y H5-HTP (fosfato de 7-mercaptoheptanoiltreonina ).
o Coenzima F4Z0: actua como donador de electrones en la reduccin del COzen la
metanognesis hidrogenoflica. Esta coenzima en estado oxidado absorbe luz
a 420nm y presenta fluorescencia azul verdosa, esta fluorescencia constituye
una herramienta til para la identificacin preliminar de las bacterias
metanognicas (Whitman et al., 1992).
o Coenzima F430: acta en el paso final de la metanognesis como parte del
sistema metil reductasa. Absorbe luz a 430 nm pero a diferencia del factor F4Z0
no fluoresce.
o Metanofurano: est involucrado en el primer paso de la formacin de metano a
partir del COz.
o Metanopterina: fluoresce a 342nm emitiendo un color azul brillante, es similar
al cido flico, y acta como transportador de compuestos monocarbonados
durante la reduccin del COza metano. La forma activa de la coenzima "in
vivo" es la forma reducida, la tetrahidrometanopterina (THMP).
o Coenzima M: transporta los grupos metlicos y se reduce por el complejo
enzimtico metil-reductasa-F 430 al final de la formacin de metano.
CH]-S-CoM+2H+ -+ HS-CoM+ CH4
Un potente inhibidor de la coenzima M es el cido bromo-etano-sulfnico,

este compuesto a una concentracin de 106M causa una inhibicin del 50% de la
actividad de la metil-reductasa, as como el crecimiento de las bacterias
metanognicas.
o La HS-HTP: (fosfato de 7 mercapto-heptanoil-treonina), al igual que la
coenzima M, este cofactor est involucrado en la fase final de la formacin
de metano catalizada por el sistema metil-reductasa. Su estructura es simi-

lar al cido pantotnico, y acta como donador de electrones en el sistema
metil-reductasa.
Este grupo requiere amonio como fuente de nitrgeno, adems de azufre, y
micronutrientes como cobalto, nquel y hierro. El tungsteno, selenio, molibdeno y
ciertas vitaminas como biotina, cido p-aninobenzoico y riboflavina son
estimuladores del crecimiento (Jamel y Kalmokoff, 1987). Utilizan un limitado
numero de sustratos para la generacin de metano, los principales sustratos son: Hz
+ COz'formato y acetato. Adicionalmente otros compuestos de C,' pueden ser
utilizados como son: metanol, trimetilamina, y algunos alcoholes como isopropanol,
isobutanol, ciclopentano y etanol.
Con base en el tipo de sustrato utilizado, los bacterias metanognicas se
subdividen en tres grupos (Whitman el a/., 1992):
Grupo 1: Utiliza como fuente de energa Hz,formato y ciertos alcoholes, el caz es el
aceptor final de electrones el cual es reducido a metano. La reduccin de COzes
importante para mantener una baja concentracin de Hz y formato, condicin indis-
pensable para los procesos de transferencia interespecifica de electrones.
Reacciones
( KJ /moL de metano)
4Hz + COz -+ CH. + 2Hz -135.6
----=------ ---
4 Fonllalo -+ CH. + 3eOz + 2HzO -130.1
-----'=---------------
Grupo l/.' Utilizauna ampliavariedad de compuestos que tienen el grupo metilo durante
el metabolismo energtico. Algunas de molculas son oxidadas a COz'el cual acta
como aceptor final de electrones y se reduce directamente a CH4
}<"/I. ,'irilll's
( KJ/lllo/ de metano)
-------_.
4 ,\ J ,'1 i/alll~/(1 + H zO -+ CH--'4_+_C_O....;z=--...+_4_N_H_4:.-....... -_7_5 _
2 Dillldilalllilla + 2 HzO -+ 3CH4 + COz + 2NH4 -73.2
Aunque el metanol y Hz-COz, pueden ser metabolizados simultneamente,

el metanol es consumido ms rpidamente. El metabolismo de la aminas metiladas
a CH4, conlleva a la produccin de amonio, el cual es utilizado como fuente de
nitrgeno (Jarrrel y Kalmokoff, (987).
Grupo II/. aunque la mayor parte del metano que se genera en la naturaleza
proviene del rompimiento del acetato, la habilidad de catabolizar este sustrato esta
limitada a los gneros: Methanosarcinay Methanosaeta (Methanothrix). Elcarbono
metilado del acetato es reducido directamente a metano y el grupo carboxilo es
oxidado a COz' El acetato es utilizado como fuente de carbono y de energa, sin
embargo, la energa que se obtiene a partir del acetato es pobre.
CH3COO- + Hp -. CH. + HC03-

Ll ca' =- 31 kJ /moL de metano
Gnero Methanosarcina: Se asocian formando pseudosarcinas y tienen

baja afinidad por el acetato. La constante de afinidad por este sustrato (Km) es
del orden de 5mM y el tiempo de generacin pueden llegar a 30 horas cuando se
cultivan con este sustrato. Adems del acetato, este gnero puede utilizar metil-
aminas, metanol y algunas especies pueden actuar hidrogenoflicamente. Las
especies ms representativas son: Methanosarcina barker~ Methanosarcina mazei
y Methanosarcina thermophila.
Gnero Methanosaeta (antes llamado MethanothriX: Este grupo tienen un
Km para el acetato entre 0.7- 1.2 mM y tiempos de generacin entre 65 y 70 horas.
Aunque las especies de este grupo no utilizan ni el hidrgeno, ni el metanol, ni las
metilaminas, no son inhibidas por el hidrgeno o el formato. Dada la gran afinidad
por el acetato, es recomendable mantener en los digestores anaerobios un alto
contenido en este grupo de bacterias. Por lo general , es frecuente encontrar en
lodos granulares un alto contenido de Methanosaeta. (Whitman et a/., 1992).
Es frecuente encontrar en reactores anaerobios, una competencia por el
acetato entre las especies de los gneros Methanosaeta y Methanosarcina, sin
embargo, las bajas concentraciones de acetato que usualmente predominan al
interior de los reactores favorece el crecimiento del gnero Methanosaeta. Por
otra parte, tambin existen diferencias en los requerimientos de pH entre los do~
gneros, Methanosaetatrabaja a pH 7.0, mientras Methanosarct7ageneralmentl
se presenta a valores inferiores a 7.0. Otra caracterstica diferente se relaciona COI
la predominancia del gnero Methanosaeta en lodos con altas concentraciones dI

propionato, lo cual seala su mejor adaptacin a este sustrato. En el caso dI
Methanosarct7a hay una mejor adaptacin al etanol, fenmeno asociado con lo:
cambios del pH, producidos cuando la oxidacion del etanol no est acoplada con l
conversin del acetato. Cuando esto ocurre, el pH disminuye y las concentracione~
de acetato se incrementan, lo cual favorece el desarrollo de la poblacin dI
Methanosarct7a (GrotenhU/; et a/., 1991).
METANOGN ESIS
La produccin de metano es la principal forma por medio de la cual las bacteria~

metanognicas obtienen la energa necesaria para el crecimiento. Desde un punto dE
vista metablico, la formacin de metano es un tipo de respiracin anaerobia en l
cual, el dixido de carbono acta como aceptor de electrones y el hidrgeno es utiliza-
do para reducirlo. Los estudios bioqumicos indican que el sistema de transporte dE
electrones no es igual al encontrado en organismos aerobios, no hay citocromos ni
quinonas,y existe un sistema de transportadores en los cualesalgunas de las coenzimas
mencionadas permiten la reduccin secuencial de los intermediarios monocarbonados.
Metanognesis hidrogenofil ica
La reduccin de COza metano es un proceso Hz dependiente aunque compuestos

como el formato, el monxido de carbono, y an el hierro elemental (FeO)pueden
actuar como donadores de electrones en este proceso (Vogels et a/., 1982).
La reduccin de COza CH4 se efecta mediante la utilizacin de varios
intermediarios y los principales pasos se pueden resumir de la siguiente
manera (Figura 3.6):
MICROBIOLOGfA DE LA DIGESTiN ANAEROBIA [61]
1. activacin del COzmediante su unin al metanofurano, y la posterior reduccin

del grupo formilo
2. transferencia del grupo formilo del metanofurano a la tetrahidrometanopterina,
y la posterior deshidratacin y reduccin en dos etapas separadas a nivel de
los grupos metileno y metilo.
3. transferencia del grupo metilo de la metanopterina a la coenzima M.
4. reduccin del metil-coenzima M a metano mediante la accin del sistema metil-
reductasa en el cual participan el F430 y el HS-HTP.El donador de electrones para
esta reaccin es el HS-HTP y el producto de la reaccin adems del CH4 es un
disulfuro de la CoM y del HTP (CoM-S-S-HTP). Por reduccin con Hzse regene-
ran CoM y HS-HTP en libre.
Falo de microscopa electrnica
Figura 3.6. Methanobacterium formicicum
Metanognesis acetoclstica
Las reacciones de la va acetil-CoA explicadas anteriormente estn relacionadas con la

produccinde metano a partir de compuestos metmcosy del acetato.Compuestosmetlicos
como el metanol son catabolizados mediante la donacin de los grupos metlicos a una
protena corrinoide para formar un complejo CH3-Corrinoide. Los corrinoides son estructu-
ras parentales como la vitamina B1Z' El complejo Corrinoide-CH3 dona el grupo metlico
a la CoM para formar el complejo CoM-eH3 a partir del cual se obtiene el metano por
reduccin con 105 electrones obtenidos en la oxidacin de otras molculas de metanol a
COZ'En el metabolismo energtico, el acetato es activado a Acetif-CoA, el cual interacta
con el monxido de carbono deshidrogenasa, para transferir el grupo metnico a la enzima
corrinoide de la va acetif-CoA. A partir de este punto, el grupo metilo es transferido a la
tetrahidro-metano-pterina y a la coenzima M para formar el complejo CoMf-CH3. Poste-
riormente, es reducido a metano con 105 electr nes generados en la oxidacin del CO a
COzpor la accin de la COdehidrogenasa (Figura 3.8).
CO,
r----- MF - -- 2H Hp
,.. __.. _.. _.... _ MF - CHO

Formilo
MP
MP-CHO
<
F42o-red
H,O -- ---.J Hidrogenasa
F420-oxi ,
H,
MP > CH,
Melileno
2H
MP-CH, MF: Metanofurano,

Metilo MP Tetrahidrometanopterina
r................... CoM-SH - -- Bomba de Na'
CoM-S-CH,
:-2H
- -............ HS-HTP-- Complejo F",,-metil Bomba
reductasa protnica

L.. _ CoM-S-S-HTP
~
CH,

ATP
Fuente: Madigan, Martinko y Parker, t997.
Figura 3.7. Metanognesis hidrogenofilica a partir de la reduccin del CO"

CH,- COOH
ATP
CH, CO S- CoA Biosntesis
CO Dehidrogenasa
CODH- Monxido CH, CO-CODH

de Carbono
Dehidrogenasa
CO-CODH CH, - Corrinoide
Fuente: Madigan. Martinko y Parker. 1997
Figura 3.8. Utilizacin de las reacciones de la via acetil-CoA durante el crecimiento con acetato.
BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS (BSR)
Las bacterias sulfato reductoras son anaerobios estrictos, ampliamente distribui-

das en ambientes acuticos y terrestres donde se lleva a cabo los procesos de
degradacin de la materia orgnica. Utilizan el sulfato como aceptar de electrones
durante la oxidacin anaerobia de compuestos orgnicos, aunque pueden utilizar
tambin, compuestos como el tiosulfato, el tetrationato y el azufre elemental. Los
donadores de electrones ms utilizados por las BSRson Hz, lactato, piruvato aun-
que existen otros tipos fisiolgicos ms restringidos.
2CH 2 O + SO 42- H 2S + 2 HCO-3

[64] D I G E S T ION A N A E R O B I A
El grupo de las B5R es diverso morfolgicamente pero fisiolgicamente

unificado, taxonmicamente se reconocen 18 gneros capaces de llevar a cabo la
sulfato reduccin desasimilativa, los cuales se agrupan en dos subgrupos fisiol-
gicos:
Grupo 1: bacterias no oxidantes del acetato
Los miembros de este grupo utilizan el lactato, el piruvato. el etanol o ciertos
cidos grasos como fuente de carbono y energa. y reducen el sulfato a sulfuro de
hidrgeno. Los gneros representativos son:
Desu/fovibrio Desu/fobacu/a
Desu/fomicrobium Archaeog/obus
Desu/fobotu/us Desu/fobu/bus
Desu/fotomacu/um Thermodesu/fobacterium
Desu/fomoni/e
Grupo 11:bacterias oxidantes del acetato
Las bacterias de este grupo se especializan en la oxidacin de cidos grasos parti-
cularmente el acetato y reducen el sulfato a sulfuro. Los gneros ms representati-
vos son:
Desu/fobacter Desu/foarcu/us
Desu/fobacterium Desu/fadnum
Desu/fococcus Desu/forhabdus
Desu/fonema Thermodesu/forhabdus
Desu/fosardna
Sulfato reduccin
Para la reduccin del sulfato a sulfuro de hidrgeno es necesario una reduccin de

ocho electrones, y se lleva a cabo a travs de una serie de etapas. Comoel in sulfato
es muy estable, para su utilizacin es necesario una activacin previa mediante el ATP
La enzima ATP-sulfurilasacataliza la unin del sulfato a uno de los fosfatos del ATP
formando el adenosin-fosfo-sulfato (AP5). En la sulfato reduccin desasimilativa, el
complejo AP5 se reduce directamente a sulfito 503 2 con la liberacin de AMP.En la
reduccin asimilativa, un nuevo fosfato se une al AP5 para formar el fosfo-fadenosn-
fosfo-sulfato (PAPS) y solo entonces reduce el sulfato (Figura 3.9). En ambas reaccio-
nes, el primer producto de la sulfato reduccin es el sulfito, a partir de este momento
las subsecuentes reducciones ocurren rpidamente. En la sulfato reduccin asimilativa
el H2Sformado es convertido en azufre orgnico en la forma de aminocidos, mientras
en la sulfato reduccin desasimilativa el HzS es excretado.
ATP PP ATP ADP
so,'
U
ATP-Sulfurilasa
APS
U
APS- quinasa
PAPS
2e-
~ AMP
NADPH
2e-
-. PAP
NADP
SO," SO,'
6e
.. 6e-
1
I

1
H,s H,S
Excrecin Compuestos orgnicos azufrados:

cistena, metionina, etc
REDUCCiN DESASIMILATIVA REDUCCiN ASIMILATIVA
Fuente: Madigan, Marlinko y Parker, 1997.
Figura 3.9. Sulfato Reduccin Desasimilativa y Asimilativa de las Bacterias Sulfato Reductoras
Interrelacin de las B5R durante la degradacin de

la materia orgnica
Una caracterstica de los medios donde las BSR desarrollan una alta actividad
metablica, es la presencia de olores desagradables producidos por el H2S, asi
[66 J D I G E S T IN A N A E R O B I A
como un color negro en las aguas y los sedimentos, debido a la formacin de

sulfuros que precipitan al reaccionar con diferentes metales. Las BSRcumplen un
importante papel en las etapas finales de la degradacin de la materia orgnica,
especialmente en la remocin de los sulfatos presentes en el afluente. Las bacte-
rias BSR pueden crecer en presencia o ausencia de sulfatos, utilizando dos vas
metablicas diferentes; una fermentativa y la otra oxidativa. La Figura 3.10. pre-
senta las interrelaciones de las BSRdurante la utilizacin de la va fermentativa en
la cual, crecen sintrficamente con las bacterias metanognicas, sin embargo, en
la presencia de sustratos como lactato y etanol compiten con las poblaciones
fermentativas por sustratos comunes (Gibson, 1990). La siguientes reacciones
ilustran la capacidad fermentativa de las BSR.
3 Lactato --+ Acetato +2 Propionato + HCOj- + H+

Etanol + H CO + H 2 --+ Propionato
j-
3 Etanol + 2 HCO Acetato + 2 Propionato + H+ + 3H20

j-
Acetato + HCO + H+ +3H2

j- Propionato + 3 H20
En presencia de sulfatos, las BSRson capaces de acoplar la oxidacin de

compuestos orgnicos e hidrgeno a la sulfato reduccin, compitiendo con las
bacterias metanognicas por sustratos comunes, generando la inhibicin de las
bacterias acetoclsticas por la produccin de HzS. Los cidos grasos como el
propionato, y el butirato son oxidados completamente hasta COzpor las BSR, o
parcialmente hasta acetato. Compuestos como el etanol, otros alcoholes, lactato,
malato y compuestos aromticos pueden ser degradados completa o parcialmen-
te. La siguientes reacciones ilustran la capacidad de las BSRde acoplar la oxida-
cin de ciertos sustratos a la sulfato reduccin (Oude Elferink et a/. 1994; Gibson,
1990; Widdel and Hansen, 1992).
4H 2 + SO 4-2 + H+--+HS- + 4H 2
4Formato + H+ + S04-2 --+ 4HCO + HS- j
-
Acetato-+ S04-2 2 HCO + HS- j

-
Propionato- + %S04- 2 Acetato- + HCO- + j

%HS- + 1/H+
+ 1/2S04-z
Blltirato- 2 Acetato- + 112 HS- + 1/2H+
Lactato- + 112 S04- -. Acetato- + HC03- + 'l? H - + 'l? H+
Z
Etanol + 112 S04-Z -. Acetato- + 112 H S- + 112 H + + H zO

Glucosa + S04-z H + 2Acetato + 2COz + HS- + 4Hz
Molculas Polimricas
Protenas, carbohidratos, Ipidos, cidos nucleicos
Hidrlisis
Productos de bajo peso molecular
so; Amino cidos, azucares, cidos grasos, etc
j
s' Intermediarios de fermentacin
Alcoholes, lactato, piruvato, succinato
SO; ~ BSR
S' --1 Fermentacin
Acidos grasos voltiles
Acetato, propionato, butirato CO, H,
Acetognesis
so;~ BSR
S'
o.' =iAcetato BM
Metanognesis
BM BSR BSR
~ S'
CH, CO, CH,
Fuente: Gibson. 1990
Figura 3.10. Interrelaciones entre las B5R durante la degradacin de la materia orgnica.
De acuerdo con Dude Elferink et a/. (1994), durante el tratamiento

anaerobio de aguas residuales, la sulfato reduccin puede interferir con la
metanognesis, generando en los reactores problemas como:
1. Competencia por sustratos comunes y la consecuente disminucin en la pro-
duccin de metano, entre BSRy bacterias metanognicas.
2. Inhibicin de varios grupos bacterianos por la presencia de H2S.
3. Toxicidad generada por el H2S, malos olores, corrosin en las calderas y los
motores operados con biogas
La forma txica del H2S es la forma no disociada lo que facilita su paso a
travs de la membrana celular. Pequeas variaciones de pH en los digestores,
pueden causar inhibicin del proceso. Se ha recomendado para disminuir la toxi-
cidad generada por el H2S las siguientes estrategias (Tanaka y Lee, 1997; Hulshoff
Pol,1996):
Diluir el afluente con aguas residuales que no contengan sulfato.
Adicionar metales como el hierro para remover el H2S por precipitacin.
Implementar sistemas de fases separadas de manera que la sulfato reduccin
se limite al reactor acidognico.
Incrementar el pH para obtener una forma menos txica del H2S.
Oxidar biolgicamente el H2S hasta sulfuro elemental.
H+ + H --H2S atar pH < 7.0

H2S HS- + H+ inodoropH > 8. O
A pesar de los problemas que ocasiona la sulfato reduccin al interior de

los reactores, esta reaccin puede presentar algunas ventajas (Dude Elferink et
al., 1994; Dvorak et al., 1992):
1. Contribuye a mantener un bajo potencial de xido-reduccin al interior de los
reactores.
2. Constituye un mtodo biotecnolgico para la remocin de sulfato.
3. Los complejos Metal-S 2 tienen baja solubilidad, propiedad que puede ser uti-
lizada para la precipitacin de metales pesados como Co, Ni, Pb Y Zn.
M I e Ro BID LO G f A oE L A o I G E ST I 6 N A N A E R o B I A [6S
Interrelacin entre las B5R - bacterias acetognicas

(BA) y las bacterias metanognicas (BM)
EN PRESENCIA DE SULFATO
Las bacterias sulfato reductoras compiten con las bacterias metanognicas

(BM) por sustratos comunes como; formato e hidrgeno, con las bacterias
acetognicas -(BA) por componentes como propionato y butirato (Lovley, et
a/. 1982). Esto no significa que la metanognesis y la sulfato reduccin sean
excluyentes, pues pueden ocurrir simultneamente cuando el metano se ge-
nera a partir del metanol y/o aminas metiladas, sustratos por los cuales las
BSR tienen poca afinidad.
La relacin DQO/sulfato en las aguas residuales es un indicador de la
cantidad de materia orgnica que puede ser degradada va sulfato reduc-
cin. En teora todo el material orgnico puede ser degradado va sulfato
reduccin, si la relacin DQO/sulfato es menor de 0.66. Si por lo contrario, la
relacin DQO/sulfato es mayor de este valor, las BSR compiten con las bacte-
rias metanognicas y acetognicas por los sustratos disponibles, adems de
otras sulfato reductoras por el sulfato disponible. Se ha estimado que la con-
centracin de H2S al interior del reactor, no debe exceder de 150mg/L, para
que el proceso metanognico sea eficiente (Harada et al., 1994; Oude Elferink
etal.,1994).
En general, los reactores anaerobios operan a valores umbrales para el
consumo de hidrgeno por la poblacin metanognica. Sin embargo, el valor umbral
de las BSRes ms bajo, por lo que en presencia de sulfato el hidrgeno es consumi-
do principalmente por las BSR. Esta poblacin tiene ventajas cinticas frente a las
BM que favorecen su proliferacin al interior de los reactores (Lovley et al., 1982).
Tabla 3.3. Parmetros cinticos de crecimiento entre las bacterias metanognicas y sulfato
reductoras consumidoras de hidrgeno en presencia de sulfato.
Microorganismo Ks V Rendimiento Km V
"'"
(das' ) (!M)
(!M) (g/mol H,) (!mollmin.g)
Desulfovibrio desulfuricans 2.4 -4.2 1.2-1.6 1.4 -2.0 1.1

cepa Gll
Melhanospirillum hungatei 5.8 - 7.3 1.2 -1.8 0.3 - 0.5 5.0
Tomado de Harada el al, 1994
La poblacin de bacterias metanognicas acetoclsticas (BMA), predomi-

nan en reactores anaerobios cuando la concentracin de sulfato es baja al interior
del reactor debido a que las BSRacetoclsticas compiten con las otras BSRpor el
sulfato disponible y con las BM acetoclsticas por el acetato, Por otra parte, el
acetato es el sustrato menos utilizado por las BSRcomparado con el propionato,
butirato y el hidrgeno. Sin embargo, factores como tiempos de retencin celular
cortos favorecen el crecimiento de la poblacin BSRacetoclstica ya que la velo-
cidad de crecimiento es mucho ms alta. Para Desu/fotomacu/um acetoxidans se
ha reportado f...lmax entre 0.65 y 1.39 das-l , mientras para Methanosaeta
soehngenii las tasas de crecimiento oscilan entre 0.08 y 0.29 das-l. Otros
parmetros como afinidad por el sustrato, la capacidad de utilizar otros sustratos
y la temperatura tambin influyen en la competencia entre BSRAy BMAen presen-
cia de sulfato (Jetten et a/., 1992; Visser et a/., 1993).
En reactores anaerobios con alta concentracin de sulfato, las bacterias
sulfato reductoras tambin compiten con las bacterias acetognicas (BA) por
sustratos como propionato y butirato, por lo que la relacin sintrfica entre las BM
y BA para la oxidacin de estos compuestos, son superadas por las BSR.
EN AUSENCIA DE SULFATO
En ausencia de sulfato, las BSR puede constituir el 15% del total de la biomasa
presente en el reactor, Bajo estas condiciones fermentan sustratos como: piruvato,
lactato, etanol, fructosa, propanol y acetato entre otros, y crecen como organis-
mos acetogenicos. Se ha reportado la degradacin del formato mediante la rela-
cin sintrfica de Desu/fovibrio vulgaris y Methanobacterium bryantti: Las BSR
M I e RO B I oLo G lA DEL A DI G E S T IN A NA ER o BIA [71]
mantienen una presin parcial de hidrgeno (1-2 Pa) por debajo de la requerida
para que se de la transferencia interespecfica de electrones con la poblacin
metanognica (3-10 Palo Esta diferencia, podra estar mostrando que la veloci-
dad de crecimiento de las BA depender del organismo consumidor de hidrgeno.
Es por ello, que en algunos estudios se reportan tasas de crecimiento mximo
para las BA consumidoras del propionato y butirato en co-cultivo con BM de 0.10
Y 0.19 das-I, mientras en co-cultivo con BSR es de 0.19 y 0.31 dias-1 Esto
estara sugiriendo que la utilizacin del propionato y butirato por las BSR, est
ms relacionada con la presin parcial de hidrgeno, que con la capacidad de
esta poblacin para utilizar estos sustratos. El crecimiento de BSRcon butirato en
ausencia de sulfato, no ha sido demostrado. Sin embargo Desu/fovibrio sp ha sido
aislado en reactores con altas concentraciones de butirato y en ausencia de sulfato
(Mclnerney eta!., 1981; Bryant eta!., 1977; Stams, 1994).
BIBLIOGRAFA
ATLAS, R. Y Bartha, R. (1993). Microbial ecology: Fundamental and application. The Benjamin/
Cummings Publicing Company Inc. Menlo Park, California.
BALCH, WE., Schoberth, S., Tanner, R.E. y Wolfe, R.5. (1977). "Acetobacterium a new genus 01
hydrogen- oxidizing, carbon dioxide- reducing anaerobic bacteria". Insto Jouma/Systerr.

Bacteri%gy, 27: 355-386.
BRYANT, M.P, Campbell, L.L., Reddy, CA y Crabill, M.R. (1977). "Growth of Desu/fovibrio in
lactate or ethanol media low in sulfate in association with Hz- utilizing methanogenic
bacteria". App/ied Enviromenta/ Microbi%gy, 33: 1162-1169.
BRYANT,M.P (1979). "Microbial methane production- theoretical aspects". Jouma/Anima/Science,
48: 193-201.
BOONE, O.R.y Bryant, M.P (1980). "Propionate- degrading bacterium Syntrophobacter wo/imi'sp. nov.
gen. nov., from methanogenic ecosystem". App/ied Enviromenta/ Microbi%gy, 40: 626-632.
OVORAK,O.H, Hedin, R.5, Edenborn, H.M. y Mcintire, PE. (1992). "Treatment of metal contaminated
water using bacterial sulfate reduction: results from pilot-scale reactors". Biotechn%g}
&: Bioengineering, 40: 609-616.
GIBSON, G.R. (1990). "Physiological and ecology of the sulfate-reducing bacteria". A review.
Jouma/ App/ied Bacteri%gy, 69: 769-797.
GROTENHUIS, ne., Smit, M., Plugge, M., Yuansheng, X., Van Lammeren, A.A.M., Stams, A.J.M.y Zehnder,
A.J.B. (1991). "Bacteriological Composition and Structure of Granular Sludge Adapted te
Oifferent Substrates". App/ied Environmenta/ Microbi%gy July 1991: 1942-1949.
HARADA, H., Uemura, S. y Monomoi, K. (1994). "Interaction between sulfate reducing bacteri
and methane- producing bacteria in UASB reactor s fed with low strengh wastes containin~
different levels of sulfate". Water Research, 28: 355-367.
HULSHOFF-POL L. (1996). Perspective for anaerobic treatment of sulfate rich wastewater
Memorias IV Seminario Taller Latinoamericano sobre tratamiento anaerobio de agua~
residuales. Bucaramanga, Colombia: 383-396.

M I C R O B I O L O G fA DEL A D I G EST I 6 N A NA ERO B IA [73]
JARREL, K.F. Y Kalmokoff, M. (1987). "Nutritional requimerents 01 the Methanogenic

Archeobacteria". Canada oumal Microbiology, 34: 557-576.
JETTEN M.s., Stams AJ y Zehnder AJ (1992) "Methanogenesis lrom acetate: a comparison 01 the
acatate metabolism in Methanothn'x soehngenii and Methanosarcina sPP'. fEMs Microbiology,
88: 181- 198. En Stams, A.J. (1994). Metabolic interactions between anaerobic bacteria in
methanogenic enviroments. Antonie van Leeuwenhoek, 66: 271-294.
KASPAR H.F., Holland A.J. y Mountlort D.O (1987). "Simultaneous butyrate oxydation by
syntrophomonas wollei and catalitic oleolin reduction in absence 01 interspecies
hydrogen transler". Arch. Microbiology, Volumen? 1029-1039.
LOVLEY, D.R., Dwyer, DJ y Klug, M.J. (1982). "Kinetic analysis 01 competition between sullate
reducers and methanogens lor hydrogen in sediments". Applied Enviromental

Microbiology, 43: 1373-1379.
MADIGAN, M.T., Mertinko, J.M. y Parker, J. (1997). 8i%gy of microorganisms. Eighth Edition.
Prentice Hall. New Jersey (USA).
McCARTY,L. (1982). "One hundred years 01 anaerobic treatment". En: Anaerobic Digestion
(1982). Proceedings 01 the Second International Symposium on Anaerbic Digestion,
Federal Republic 01 Germany on Sep!. 6-11. Elsevier Biomedical Press, Amsterdam.
MclNERNEY, MJ, Bryant, M.P, Hespell, R.B. y Costerton, J.w. (1981). "syntrophomonas wolfei
gen. nov. sp. nov., an anaerobic, syntrophic, latty acid- oxidizing bacterium". Applied
Enviromental Microbiology, 41: 1029-1039.
MclNERNEY,MJ (1988). "Anaerobic hydrolysis and lermentation 01 lat and protein". En: Zendher
AJB (Ed.) Biology 01 anaerobic microorganisms. John Wiley & Sons, Ine., publication.
New York, p. 373-415.
MOUNTFORT, D.O., Brulla, WJ, Krumholz, L.R. y Bryant, M.P (1984). "syntrophus buswel/i gen.
nov. sp. nov., a benzoate catabolizer Irom methanogenic ecosystems". Int. J. sys.
8acteri%gy, 34: 216-217.
OUDE ELFERINK, SJ, Visser, A., Hulshoff-Pol, L. y Stams, AJ (1994). "Sullate reduction in
methanogenic bioreactors". fEMs Microbiology Review, 15: 119-136.

RAMREZ, L. (1996) "Evaluacin de potenciales semillas para la inoculacin de reactores
anaerobios". En: IV Seminario Taller latinoamericano sobre Tratamiento Anaerobio de
Aguas Residuales. Bucaramanga (Colombia).

ROY,F., Samain, E., Dubourguier, H.e y Albagnac, G. (1986). "5yntrophomonas sapovorans sp.
nov., a new obligately proton reducing anaerobic oxidizing saturated and unsaturated
long chain latty acids". Archi Microbiology, 145: 142-147.

SCHINK, B. (1997). "Energetics 01 syntrophic cooperation in methanogenic degradation".
Microbiology Molecular Biology Review, 61: 262-280.

SCHINK, B. y Thauer, R.K. (1988). "Energetics 01 syntrophic methane lormation and the inlluence
01 aggregation". En Stams, A.J. 1994. Metabolic interactions between anaerobic bacteria
in methanogenic enviroment. Antonie van Leeuwenhoek, 66: 271-294.

STAMS, A.J. (1994). "Metabolic interaction in methanogenic bioreactors". Antonie van
Leeuwenhoek, 66: 271-294.
STIEB M. Y Schink B. (1985). "Anaerobic oxidation 01 latty acid by Oostridium bryantiisp. nov. a
spore lorming obligately syntrophic bacterium". Archives Microbiology, 140: 387-390.

TANAKA, K. (1992). "Anaerobic oxidation 01 1,5- pentanediol, 2- butanol and 2- propanol by a
newly isolated sullate- reducer". Journalol Fermentation & Bioengineering, 72: 362-365.
VISSER, A., Beekman, l., Van der lee, A., Stams, A.J y Lettinga, G. (1993). "Anaerobic degradation
01 volatile latty acids at different sullate concentrations". Applied Microbilogy &
Biotechnology, 40: 549-556.

VOGELS,G.D., Keltjens,1J. Hullen, J.T.y Van der Drift, e (1982). "Coenzyme Methanogenic Bacteria".
Zbl. Backt. Hyg. 1.Abt. Orig. e 3: 258-264.

WHITMAN, WB, Bowen, U., Boone, D.R. (1992). "The Methanogenic Bacteria". In: Prokaryotes
2nd edn. (Balows A, Truper, Dworkin M, Harder W, Schleiler K-H, Eds.) 719-767. Springer
Ver lag. New York.
WOLlN, M. J (1976). Interactions between Hz- producing and methane- producing species. En:
Microbial Formation and utllization 01gases (H? CH" CO). Schlegel, H.G., Gottschalk, G.
y Plenning, N. (Ed.) E. Goltze, K.G. Germany.
llNDER, S.H. Y Koch, M. (1984). "Non-acetoclastic methanogenesis lrom acetate: acetate oxidation
by a thermophilic syntrophic ca culture". Arch. Microbiology, 138: 263-272.

lINDER, S.H. (1998). Chapter 5. Methanogens. En: Burlage, R.S. et al., Techniques in Microbial
Ecology. Oxford University Press. New York. 113-135.
lHAO, H., Yang, D., Woese, eR. y Bryant, M.P (1990). "Assignment 01 Oostridium bryantii to
syntrophospora bryantli' gen. nov., combo Nov. on the basis 01 165 rRNA sequence
analysis". Int Joumal5ystem baderiology, 43: 278-286.

captulo
cuatro
PUESTA EN MARCHA Y
OPERACiN DE
REACTORES
ANAEROBIOS
REACTORES ANAEROBIOS: CAJA
NEGRA O ECOSISTEMA MICROBIANO?
Los INGENIEROS GENERALMENTE UTILIZAN EL PROCESO DE DIGESTIQN ANAEROBIA PARTIENDO DE
PRINCIPIOS BSICOS, CONTROLANDO Y OPERANDO EL PROCESO EN LA PRCTICA COMO UNA CAJA
negra, en la cual se conocen las entradas: el caudal de agua residual y su carga

'orgnica, as como la existencia o no de sustancias txicas en concentraciones apre-
ciables. El seguimiento de las salidas del sistema de tratamiento se desarrolla a
travs del monitoreo de la calidad del efluente lquido y de la cantidad y calidad del
efluente gaseoso. No obstante, al no disponer de un conocimiento detallado de
los procesos biolgicos que ocurren dentro de los reactores, los ingenieros se
guan fundamentalmente por el principio experimental de ensayo y error. En este
campo existen numerosos trabajos que presentan metodologas para el arranque
y operacin de los sistemas anaerobios, las cuales se basan fundamentalmente en
el seguimiento de los parmetros de operacin y en el aumento paulatino de la
carga, dependiendo de la "salud" del sistema.
De otro lado, microbilogos y bilogos se centran en el estudio de las
poblaciones microbiolgicas existentes y en el tipo de relaciones que se estable-
cen entre ellas, aislndolas y clasificndolas con procedimientos que suelen de-
morar das y an meses. Se estudian as mismo, los fenmenos de competencia
por el sustrato, los procesos bioqumicos y en general se realiza la evaluacin
cuidadosa de las principales relaciones y sucesos que ocurren dentro del proceso
de la digestin anaerobia.
Ambos enfoques, el de la ingeniera de orden eminentemente pragmtico
y prctico, y el microbiolgico poseedor de una mirada ms cientfica y analtica,
deben complementarse procurando un entendimiento integral del proceso. El
trabajo mancomunado debera centrarse en la bsqueda de soluciones para los
principales problemas de la tecnologa anaerobia, como son: el control de olores,
la optimizacin de la etapa de arranque, la identificacin y manejo de sobrecar-
gas, el arrastre de slidos y la valorizacin de subproductos. Se pone entonces, al
[78] o I G E S T IN A N A E R O 8 I A
orden del da, la conformacin de grupos interdisciplinarios que estudien y expe-

rimenten con la tecnologa anaerobia, avanzando de una manera ms integral en
el conocimiento terico y prctico de la misma, y en su aplicacin a nuestra reali-
dad, mediante un enfoque interdisciplinario (Figura 4.1).
Afluente Efluente
enfoque ingenierif I enfoque microbiolgico
? /
mmm
Figura 4.1. Integracin de los enfoques ingenieril y microbiolgico en los

reactores anaerobios.
Reconociendo los vacos que existen actualmente en Colombia respecto a las

metodologaspara el estudiode ladigestinanaerobia,en este captulose considerarnlos
aspectoscrticosen la implementacinde estatecnologa,buscandouna mayor integracin
entre los saberes microbiolgicoe ingenieril.
El uso de la tecnologa implica dos etapas fundamentales: el arranque o
puesta en marcha del sistema y la operacin del mismo (Tabla 4.1). En ambas
etapas la microbiologa juega un papel fundamental, aportando elementos que
permiten explicar las respuestas del sistema, evaluar la salud del reactor, planifi-
car el esquema de trabajo y, en general, obtener informacin de los fenmenos
microbiolgicos que ocurren en el sistema.
PU EST A EN M A R e H A Y o PERA eI6 N oE REA eTo RES A NA ER o B I os [79]
Tabla 4.1. Caracterizacin del residuo y de los lodos anaerobios desde el diseo del
reactor hasta la fase de estudios de mejoramiento de lodos
Fase
DISEO ARRANQUE OPERACiN MEJORAMIENTO

Componente
Contenido Remocin de DaD Remocin de DaD

RESIDUO de nutrientes
AGV efluente AGV efluente
DaD
Alcalinidad y pH Alcalinidad y pH
Biodegradabilidad efluente efluente
Toxicidad Produccin de Produccin de

biogas biogas
Drigen del lodo Actividad Actividad Actividad

INCULO O
metanognica metanognica metanognica
LODO Actividad
metanognica Sedimentabilidad Sedimentabilidad Sedimentabilidad
Sedimentabilidad Relacin SSV/SST Relacin SSV/SST Relacin SSV/SST
Relacin SSV/SST Composicin Composicin Composicin

bacterial (NMP)
Composicin bacterial (NMP) bacterial (NMP)
bacterial (NMP) Aislamiento
Indice de
diversidad de
especies.
Lo anterior se logra estudiando y caracterizando el lodo en las dife-

rentes etapas: antes del arranque como inculo potencial, durante el proceso
de arranque para evaluar la evolucin del lodo y durante la etapa de opera-
cin para realizar el seguimiento de la calidad de ste. Es obvio que la infor-
macin sobre las caractersticas microbiolgicas del lodo es de gran ayuda
para el ingeniero en la toma de decisiones frente a las dos variables de ope-
racin como la carga hidrulica y la carga orgnica.
ETAPA DE PUESTA EN MARCHA O

ARRANQUE DEL REACTOR
Es el perodo de tiempo durante el cual la biomasa anaerobia se adapta a la

cantidad y calidad de las aguas residuales que debe tratar; en dicho perodo
generalmente el sistema de tratamiento se alimenta con caudales menores al de
diseo y la eficiencia de remocin de materia orgnica aumenta lentamente hasta
alcanzar los valores proyectados. Por lo tanto, es una etapa inestable y crtica
cuya duracin puede oscilar entre un mes y un ao o ms, dependiendo del inculo,
las caractersticas del agua residual y de la estrategia de arranque utilizada. La
duracin de la etapa de arranque est definida, segn Van Haandel y Lettinga
(1994), por el perodo de tiempo necesario para obtener una calidad constante
del efluente y una masa de lodo que no vara cualitativamente con el tiempo.
La mayora de los autores identifican el final del proceso de arranque en lo
que respecta a la biomasa,con la aparicin del fenmeno de granulacin y/o la forma-
cin de una biopelcula o floc estable (Weiminel al., 1986; Lane, 1986; Francese y
Sieriz, 1990, 1994; Camposy Anderson, 1991; Weilandy Rozzi, 1991).
Se han podido definir tres etapas en el proceso de arranque de las unida-
des anaerobias (Lettinga el al., 1980):
Adaptacin primaria y crecimiento de bacterias degradadoras de los cidos
actico y propinico.
Formacin de una biomasa anaerobia metanognica activa.
Formacin de un lodo granular, si las condiciones del sustrato lo permiten.
Enfoques utilizados en la etapa de arranque
AUMENTO LENTO DE LA CARGA ORGNICA
El enfoque tradicional de arranque de los reactores anaerobios se fundamenta en

una estrategia de aumento lento de la carga orgnica, siempre y cuando la 'salud'
del reactor lo permita; se inicia el arranque con cargas orgnicas bajas, las cuales
P U E S T A E N M A R e H A Y o P E R A eI6N D E R E A eT o R E S A N A E R o B lOS [81]
se incrementan cuando se alcanzan eficiencias de remocin de la materia org-

nica entre 60 y 80% Y el reactor presenta estabilidad en dichas remociones.
Este enfoque produce generalmente perodos de arranque largos, del orden de
varios meses; con el fin de reducirlos, se han desarrollado otros enfoques los
cuales se presentan a continuacin.
ALTA PRESiN SELECTIVA
Se utiliza fundamentalmente para reactores de flujo ascendente y manto de lodos

(UASB). La velocidad ascensional conseguida funciona como factor de seleccin
del lodo: inicialmente se presenta el lavado del lodo floculento y disperso con
bajas actividades metanognicas y, por lo tanto, en virtud de este fenmeno de
seleccin, suele aparecer el lodo granular (Hulshoff-Pol, 1989). La velocidad
ascensional est controlada por dos parmetros de operacin: la carga hidruli-
ca, relacionada directamente con la velocidad ascensional del lquido, y la carga
orgnica que regula la produccin de biogas; al ascender, el gas aumenta la tur-
bulencia y, por lo tanto, la presin selectiva sobre las partculas de lodo.
ADICiN DE ELEMENTOS Y SUSTANCIAS QUE AUMENTAN
LA ADHESiN BACTERIAL
Esta estrategia consiste en agregar al reactor, a travs del sustrato, elementos y sus-
tancias que incrementen la adhesin bacteria!.Se ha probado, entre otros compuestos,
la adicin de Ca++ y de polielectrolitos; se reportan valores de Ca++ de 100 mg/I-l con
un efecto positivo sobre la adherencia (Mahoney, 1987; Hulshoff-Pol, 1989).
Por su parte, el uso de polielectrolitos mejora las condiciones de forma-
cin de grnulos, incrementando su tamao (Cail y Barford, 1985). Los
polielectrolitos pueden ser tiles cuando el arranque se realiza con lodos pobre-
mente aclimatados o para residuos concentrados que dificultan la utilizacin de
cargas hidrulicas altas buscando la granulacin; la adicin de polmeros catinicos
en presencia de carbn activado, como soporte inicial del grnulo, se ha reporta-
do como una combinacin exitosa para conseguir la granulacin (Wirtz y Dague,
1996). Tambin se ha reportado la adicin de sucrosa en proporcin de 0.1 %
(masa/volumen) como estmulo para la formacin de grnulos (Tay y Van, 1996).
[82] o I G E S T IN A N A E RO 8 I A
FENMENO DE GRANULACiN
El fenmeno de formacin de biomasa con buenas caractersticas de sedimenta-

cin, preferiblemente bajo la forma de agregados en granos, se denomina 'granu-
lacin' y es resultado de varios procesos fsicos, qumicos y biolgicos. El tiempo
necesario para que el fenmeno de granulacin tenga lugar depender, entre
otras cosas, del tipo de agua residual, del lodo utilizado como semilla, la disponi-
bilidad de nutrientes esenciales y las condiciones de operacin del sistema.
El conocimiento de la composicin microbiolgica del lodo y el papel de las
especies en la adhesin ha sido de gran utilidad para el cabal entendimiento de la
manera como los consorcios microbiolgicos trabajan, as como de los factores
que contribuyen a la formacin del grnulo (Wu et a/., 1992; Dolfing, 1985;
Grotenhuis et a/., 1991).
El proceso de granulacin se inicia cuando las bacterias se adhieren a los
precipitados inorgnicos o a las matrices formadas por las bacterias filamentosas.
En ambos casos los polmeros extracelulares excretados por los microorganismos
contribuyen a dar firmeza a la adherencia. Los conglomerados que se forman son
de tres tipos (Tay y Yan, 1996; Wentzel y Moosbrugger, 1995):
Flocs: conglomerados con estructura suelta.
Pellets: conglomerados con estructuras bien definidas que sedimentan r-
pidamente. '.
Grnulos: son pellets con apariencia granular y alta sedimentacin.
Los principales factores que influyen en la granulacin del lodo son
(Weigant et a/., 1986; Hulshoff-Pol, 1989): el tipo y concentracin del lodo semilla;
las concentraciones de cationes bivalentes; la produccin de sustancias polimricas
extracelulares; el efecto hidrulico denominado 'presin selectiva'; la concentra-
cin del sustrato.
La formacin de agregados celulares tiene las siguientes ventajas (Hulshoff-
Poi et a/., 1986):
a. Conduce al ordenamiento de poblaciones heterogneas de microorganismos
sintrficos en forma de asociaciones multicelulares, bajo condiciones fisiolgi-
cas favorables.
[84] o I G E S T IN A N A E R O 8 I A
CAPA CENTRAL
BACTERIAS METANOGNICA
Methanosaeta sp.
CAPA EXTERNA
ACIDGENOS y BACTERIAS
CONSUMIDORAS DE HIDRGENO
CAPA MEDIA
BACTERIAS ACIDOGNICAS
BACTERIAS METANOGNICAS
Tomado de Fang, 1995.
Figura 4.2. Estructura y composicin bacterial de los grnulos que tratan

carbohidratos solubles.
ETAPA DE OPERACiN
La operacin rutinaria del sistema se inicia una vez superada la etapa de arran-
que, cuando se alcanzan las condiciones de diseo de carga orgnica e hidrulica
y la eficiencia de remocin de materia orgnica proyectada. En esta etapa se
espera que el reactor funcione en condiciones de estado estacionario o estable,
en el cual las variables de salida del sistema se mantienen relativamente constan-
tes a pesar de las variaciones temporales en cantidad y calidad del afluente.
La carga hidrulica aplicada sobre un sistema de tratamiento de aguas
residuales se define como la relacin entre el caudal del afluente y el volumen til
del sistema; por lo tanto, la carga hidrulica es igual al inverso del tiempo de
retencin hidrulico.
El tiempo de retencin hidrulico es el tiempo promedio de permanencia
del lquido en el reactor, el cual se define mediante la sigiente relacin:
P U E S T A E N M A R e H A Y o P E R A Ci N oE R E A eT o R E S A N A E R o B lOS [85]
Lh = Qa/Vr = l/Trh (1)

Donde,
Lh = Carga hidrulica
Qa = Caudal del afluente
Vr = Volumen til del reactor
Trh = Tiempo de retencin hidrulico.
Por carga orgnica volumtrica se entiende la relacin entre la masa de

material orgnico aplicada por unidad de tiempo y por unidad de volumen del
reactor, y se define as:
Lo = (Qa ..Ca)/Vr = Ca/Trh (2)

Donde,
Lo = Carga orgnica
Ca = Concentracin de DQO del afluente.
De otro lado, se define tambin la carga orgnica msica como la relacin

entre la masa de material orgnico aplicada por unidad de biomasa presente en el
reactor y por unidad de tiempo:
Lm = (Qa ..Ca)/Mvl (3)

Donde,
Lm = Carga orgnica msica
Mvl = Biomasa presente en el reactor.
Factores que influyen el arranque y la operacin

de los reactores anaerobios
El arranque y operacin de un reactor son procesos complejos que involucran

simultneamente los siguientes factores relacionados (Figura 4.3):
Factores relacionados con el diseo y operacin del reactor.

Factores ambientales (temperatura, pH, nutrientes).
Factores relacionados con la calidad y cantidad de la biomasa.
Factores relacionados con las caractersticas del residuo.
[86] D,GEST'N ANAEROBIA
RESIDUO
Compoalcln
eonc .lnlcln
OegrlldM>lllded
REACTOR
Geomeln.
T.m.o
Figura 4.3. Factores que afectan el arranque y la operacin de los

reactores anaerobios.
FACTORES RELACIONADOS CON EL DISEO Y LA OPERACiN
El diseo y operacin de un reactor anaerobio debe asegurar las siguientes con-

diciones (Monroy, 1997):
Retencin de lodos viables dentro del reactor. Mientras mayor sea la concen-
tracin de clulas activas retenidas (sedimentadas o adheridas), mayor ser la
carga orgnica que podr tratar. La capacidad que puede tener un reactor
para retener biomasa bajo diversas condiciones y el sistema de separacin
gas-slido-Iquido son los factores claves en el diseo y operacin de reacto-
res anaerobios.
Contacto entre el lodo y el sustrato. El tiempo de retencin hidrulica (TRH) debe
ser suficiente para permitir un estrecho contacto entre los reactantes. Si se tiene
en cuenta la baja velocidad de crecimiento de las bacterias metanognicas, y
adems que el 90% de la energa que utiliza esta poblacin es para la produc-
cin de metano y slo el1 0% para sntesis celular, el tiempo que se requiere para
PUESTA EN MARCHA Y OPERACiN DE REACTORES ANAEROBIOS [8~
formar una biomasa activa implica que el tiempo de residencia del lodo con el
agua se debe incrementar. El contacto lodo-agua residual es efectivo solamente
si el lodo est localizado en la parte principal del reactor.
Un problema comn es que algunos lodos pueden flotar en la superficie del
reactor; entonces, el lodo que flota no se pone en contacto con el agua resi-
dual y hay una alta posibilidad que el lodo que flota saldr del reactor. Varias
condiciones pueden asociarse con la flotacin de la biomasa: presencia de
biomasa ligeramente filamentosa (que puede entrapar el biogas); presencia
de sustancias grasas en el lodo las cuales absorben el biogas; presencia de
protenas en el agua residual; contacto inadecuado entre la biomasa y el agua
residual debido a deficiencias en el sistema de alimentacin.
o Velocidades de reaccin. Es decir que los productos puedan salir fcilmente del
agregado, que los subproductos puedan transferirse inmediatamente entre las
especies bacterianas y que los sustratos se encuentren a concentraciones ade-
cuadas frente a dichas especies. La difusin del sustrato hacia el microambiente
que rodea las bacterias est limitada por la velocidad de difusin del sustrato en
el manto de lodo y en el lodo granular (Field, 1987) (Figura 4.4).
+ + + + +

Difusin en el grnulo

Difusin en el menlo de lodo
Figura 4.4. Difusin de las partculas de lodo.
o Transferencia de masa. El tamao de las biopartculas o biopelculas debe per-

mitir el fcil acceso de los organismos al sustrato.
o Tiempo de retencin de slidos. Un tiempo de retencin de los slidos alto en
el reactor contribuir a una mayor adaptacin de los lodos al afluente, lo que
favorece la estabilidad de la biomasa.
FACTORES AMBI ENTALES
Entre los factores ambientales que afecta la operacin de un biorreactor anaerol

se encuentran el tipo de sustrato, la temperatura de operacin, los nutrient
disponibles, el pH, la relacin alcalinidad/cidos grasos voltiles (AGV) y
toxicidad anaerobia.
Tipo DE SUSTRATO. El tipo de sustrato determina la comunidad trfi,
que se desarrolla. En ecosistemas complejos como el de un digestor anaerobio,
tamao de cada grupo de organismos deber ser proporcional al flujo de ~
correspondiente sustrato en el sistema y la prevalencia de una u otra rul
metablica est determinada por el acoplamiento entre la velocidad de produ(
cin y la capacidad de asimilacin del mismo. Si las diferencias entre el contenid
de DQO y DBOs son grandes, indica que existe una alta proporcin de componer
tes no biodegradables. Cuando la DQOBD est compuesta por sustratos fcilment
biodegradables, tales como azcar o aminocidos, la etapa limitante en la diges
tin anaerobia es la metanognesis, porque las bacterias fermentativas tienen le
capacidad de acidificar el sustrato a una velocidad ocho veces ms rpida compa
rada con la velocidad con que las bacterias metanognicas consumen los cido~'
grasos voltiles (AGV) productos de la fermentacin; como resultado, la capaci-
dad de utilizacin de DQO BDtotal de la poblacin metanognica en el reactor
determina la mxima carga de DQO BDque puede aplicarse. Si la velocidad de
carga excede la capacidad metanognica se producir una acumulacin de AGV
en el reactor y el pH disminuir (Zegers, 1987).
Cuandoocurren sobrecargas en el reactor puede darse lugar a dos situaciones:
Las bacterias acetognicas crecen rpidamente y producen grandes cantida-
des de cido actico. Esto ocasiona una baja del pH y la liberacin de hidrge-
no; sin embargo el aumento en la concentracin de hidrgeno en el reactor
estimula una disminucin en la produccin de cido actico, lo cual permite
que el reactor se recupere y que el metabolismo se desplace hacia la forma-
cin de cido butrico, lo que reduce la carga sobre el sistema.
Cuando la sobrecarga es muy alta, la concentracin de hidrgeno induce la
formacin de grandes cantidades de cido propinico y, paralelamente, el me-
P U E ST A EN M A R e H A Y o PERA eI6 N DE REA eTo RES A NA ER o B 105 [89]
tabolismo y crecimiento de las bacterias acetognicas cesa por el hidrgeno

acumulado en el sistema. Esta situacin se conoce como 'sobrecarga por cido
propinico' y constituye un grave problema ya que su recuperacin es incierta
y muy lenta (Zegers, 1987).
Por otra parte es importante conocer la composicin promedia del agua
residual con respecto a:
La presencia de compuestos txicos.
La cantidad de nutrientes.
La disponibilidad de trazas de elementos como Fe, Co y Ni.
TEMPERATURA. La mayora de los digestores anaerobios operan entre 30-35C,
por que la formacin de metano a 20C es baja. En reactores operados a 35C se ha
observado un descenso del 50% en la actividad y crecimiento de las bacterias cuando
la temperatura disminuye en 10C. Por el contrario, el aumento en la temperatura
permite incrementar la produccin de metano. Comparativamente, los reactores que
son operados en el intervalo termoflico (55-60C) muestran el doble de la produccin
de metano que a 35C, lo cual disminuye el tiempo de residencia y volumen del reactor,
en contraprestacin de la energa que se requiere para mantener el reactor a esta
temperatura (Varel el al., 1977).
NUTRIENTES. Los nutrientes necesarios para el crecimiento de las bacterias
al interior del reactor dependen de la concentracin de DQOBD del agua residual.
Aunque los requerimientos nutricionales de las bacterias durante el proceso de
degradacin anaerobia son bajos, y la mayora de las aguas residuales no presen-
tan tal deficiencia, los efluentes producidos en la fabricacin de papel, almidn y
alcohol pueden ser deficientes en los micronutrientes esenciales. La adicin de
nitrgeno y fsforo incrementa la eficiencia del proceso. Sin embargo, es necesa-
rio controlar la concentracin de amonio en el afluente del reactor, pues aunque
ste es utilizable por las bacterias para su crecimiento, su exceso puede causar
toxicidad e inhibicin de la poblacin metanognica (Field, 1987; Zegers, 1987).
PH. El reactor debe operar en un intervalo de pH entre 6.8 y 7.5, porque la
actividad de la poblacin metanognica es altamente vulnerable a los cambios de
pH comparada con las dems poblaciones presentes en el lodo. Los AGV son
txicos para la metanoqnesis, solamente en la forma no ionizada. A DH neutro.
los cidos orgnicos estn mayoritariamente (>99%) en la forma ionizada (no

txica). No obstante, cuando el pH disminuye, los AGV estn menos disociados
(txicos), incluso a pH 5.0, los AGVestn disociados en un 50% aproximadamente
(Zegers, 1987).
RELACIN ALCALINIDAD/CIDOS GRASOS VOLTILES. La relacin AGV/aicalinidad es
un parmetro de utilidad para controlar la acumulacin de AGV en los reactores
anaerobios: un valor de 0.2 indica una excelente capacidad buffer del sistema,
con un mximo valor de 0.4; sin embargo, en los reactores UASB,un valor de 0.35
indica acidificacin. As, esta relacin es utilizada como un indicador temprano de
acidificacin, comparado con los datos de pH y alcalinidad que se alteran en esta-
dos avanzados y de difcil recuperacin (Rojas, 1987).
TOXICIDAD ANAEROBIA. El consorcio de microorganismos involucrados en el
proceso de digestin anaerobia de la materia orgnica, como cualquier organis-
mo vivo, no esta exento de ser inhibido por alguno de los compuestos presentes
en el agua residual. Sin embargo, dado el hecho de que las bacterias metangenas
tienen tiempos de generacin muy prolongados, la consecuencia de la introduc-
cin de sustancias txicas es mayor en un sistema anaerobio que en uno aerobio.
Es por esta razn que se debe conceder una especial atencin a la operacin de
este tipo de reactores para evitar que las sustancias txicas entren a los sistemas
anaerobios, por lo menos en concentraciones inhibitorias. Para tal fin es necesa-
rio conocer y entender a fondo el fenmeno de toxicidad.
El trmino toxicidad se refiere normalmente a la perturbacin originada
por una sustancia sobre un proceso metablico o sobre la viabilidad del organis-
mo en cuestin. En la prctica, durante el tratamiento anaerobio del agua resi-
dual, la toxicidad se observa como una reduccin en la produccin de metano a
consecuencia de un compuesto o una mezcla de compuestos. Cabe considerar
que la inhibicin causada por determinadas sustancias puede ocurrir en cualquie-
ra de las poblaciones del consorcio bacteriano, lo que implicara un desbalance
poblacional y, por consiguiente, una sntesis disminuida del producto final: el me-
tano. Esto implica que el efecto de un compuesto txico es muy complejo y no
puede asumirse solamente como la inhibicin de las bacterias metanognicas,
pues ellas dependen del metabolismo de las dems bacterias all presentes; por
P U E S T A E N M A R e H A Y o P E R A eI6 N oE R E A eTo R E S A N A E R o B lOS [9
otra parte, la magnitud de la toxicidad es funcin de varios factores entre los que
se encuentran la concentracin, la formacin de complejos y la aclimatacin,
entre otros.
De acuerdo con Lettinga (1999), se pueden distinguir tres tipos de toxicidad:
a. Toxicidad metablica: Se refiere a la inhibicin competitiva de un proceso
metablico; al retirar la sustancia txica, la toxicidad es completamente reversible.
b. ToxicIdad fisiolgica: Es la inhibicin que resulta del dao sobre componentes
subcelulares; al retirar el compuesto txico ocurre la recuperacin, aunque de
manera tarda. Esta demora se debe al tiempo requerido para reparar los
daos ocurridos.
c. ToxiCIdadbadericida: Se aplica a sustancias txicas que causan la muerte celu-
lar; luego de su remocin, la produccin de metano puede que se reanude
luego de mucho tiempo, pues se requiere que surja una nueva generacin a
partir de las clulas viables, lo cual se ve muy limitado por los largos tiempos
de generacin de las bacterias involucradas.
Existe una gran variedad de compuestos reportados como txicos; Lettinga
(1999) propone la siguiente clasificacin en cinco clases principales:
1. Inhibldores tpicos. Dentro de este grupo se encuentran aquellos compuestos
que son causa frecuente de toxicidad en la mayora de las plantas de tratamiento
de aguas residuales. Tal es el caso de los cidos grasos voltiles, sustratos tpi-
cos de las aguas residuales, o del amonio y el sulfuro de hidrgeno, productos
finales de la digestin anaerobia que resultan de la degradacin de protenas y
de la reduccin del sulfato. Estos compuestos tienen en comn que su toxicidad
es dependiente del pH; esto se debe a que las especies no ionizadas de dichos
compuestos, al tener un carcter apolar, son absorbidas por la membrana celular
y alteran las funciones celulares, siendo entonces las responsables de la toxici-
dad. En la medida en que esta disociacin est en funcin del pH, es posible
controlar hasta cierto punto el efecto de estos compuestos; as, a pH menores de
6, la fraccin de cido actico no ionizado es muy significativa, mientras que a pH 8
es slo una traza. Por lo tanto, durante la operacin del reactor es necesario man-
tener el pH en un intervalo ligeramente alcalino (7,5 - 8) de manera que no se
exceda la capacidad de carga orgnica particular del reactor.
En el caso del sulfuro, su toxicidad se debe a la forma no ionizada del sulfuro

de hidrgeno; como esta especie se incrementa a pH cido, se estima que una
concentracin de 250 mg/L causa la inhibicin del 50% de la actividad
metanognica. Para estimar la concentracin de esta especie en el reactor se
debe tener en cuenta: la cantidad de sulfuro que se llega a producir por reduc-
cin del sulfato, la produccin de biogas, pues junto con el metano tambin se
escapa una fraccin de HzS,y finalmente, la ionizacin del sulfuro. Por su par-
te, el amonio es una fuente importante de toxicidad en aguas residuales ricas
en nitrgeno orgnico; el amoniaco, la base no ionizada del amonio, es consi-
derado como el responsable de la toxicidad, pues su concentracin aumenta a
pH alcalino mientras en condiciones neutras disminuye significativamente.
2. Sales. El agua residual de algunas industrias suele contener altas concentra-
ciones de sal. Los problemas ms comunes de toxicidad se relacionan con Na+,
K+, Ca+zy Mg+z.
3. Compuestos naturales. En este grupo se encuentran aquellas sustancias natu-
rales que tienen efectos inhibitorios sobre las clulas bacterianas. Este tipo de
compuestos es comn encontrarlos en los efluentes de plantas de procesa-
miento de alimentos.
4. Contaminantes industriales. Dentro de esta clase se agrupan los compuesto~
xenobiticos que tienen generalmente un origen industrial, en algunas ocasio-
nes con una contraparte natural, pero cuya concentracin en el ambiente e~
muy baja. Usualmente son muy txicos y ejercen fuertes efectos inhibitorios
muy bajas concentraciones; entre stos se incluyen sustancias como solven

tes, pesticidas, surfactantes, colorantes, organohalogenados y metales pesa
dos, entre otros.
Los metales pesados pueden estar presentes en concentraciones considera
bies en las aguas residuales que provienen de industrias, fuentes domstica:
y comerciales (Hickey et al., 1989; Bhattacharya et al., 1995). Una concen
tracin alta de estos metales en los lodos puede conducir a la perturbacir
del proceso de estabilizacin del lodo y, por lo tanto, puede llegar a limitar su:
opciones de disposicin. La digestin anaerobia es, por lo general, el prime
proceso que sufre un deterioro en su funcionamiento debido a estos compues
PUESTA EN MARCHA Y OPERACiN DE REACTORES ANAEROBIOS [93]
tos. Swandick (1969), citado por Battacharya, afirma que la inhibicin por meta-
les pesados es la segunda causa, despus del diseo y operacin inadecuada,
relacionada con el bajo rendimiento de la digestin anaerobia y las consecuentes
fallas del proceso. Una de las principales caractersticas que distingue a los meta-
les pesados de otros compuestos txicos es que no son biodegradables y, por lo
tanto, se acumulanen el lodo hasta alcanzar concentraciones txicas (Bhattacharya
el al., 1995). La especiacin y particin de los metales es el factor que ms
influyeen su potencial de toxicidad. Las investigaciones de Gouldy Genetelli (1978),
citados por Hickey el al. (1989), muestran que los organismos vivos son ms
sensibles a los metales inicos libres en solucin que aquellas especies del metal
unido a complejos o precipitados.
La toxicidad relacionada con los metales pesados ocurre debido a la alteracin
de la estructura y las funciones de las enzimas, pues stos se unen con de-
terminados grupos de la protena o reemplazan los metales que ocupan nor-
malmente el grupo prosttico Hickey el al. (1989). En consecuencia, cualquiera
de las poblaciones del consorcio bacteriano son sensibles a estos elementos;
se ha reportado que los metales ms txicos para las bacterias metanognicas
son el cromo, el cadmio, el plomo, el zinc, el cobre y el nquel.
Los compuestos aromticos estn presentes en el ambiente en forma de deri-
vados de la lignina, los taninos, los aminocidos fenlicos y otros componentes
aromticos de las plantas. As mismo, muchas actividades humanas contribu-
yen a la presencia en el medio de estos compuestos; dentro de las principales
fuentes de contaminacin se encuentra la incineracin de desechos, la minera
y la descarga a los cuerpos de agua de los desechos provenientes de las
industrias petroqumica, farmacutica y productora de papel. Algunos de estos
compuestos son xenobiticos y tienden a bioacumularse resultando txicos
para los microorganismos (Reyes el al., 1991). Segn Reyes y Lettinga, los
bencenos monosustituidos que presentan mayor toxicidad para las bacterias
metanognicas acetoclsticas son el clorobenceno, el metoxibenceno y el
benzaldehido; concluyen tambin que la toxicidad de los compuestos aromti-
cos se incrementa al aumentar la longitud de las cadenas alifticas sustituyentes,
al igual que el nmero de grupos alquil y cloro. As mismo, estos autores repor-
tan que existe una correlacin positiva entre la hidrofobicidad del compuesto y
la inhibicin de la actividad metanognica.
5. Otras sustancias: Se han realizado otra serie de investigaciones en donde se
busca analizar el efecto de determinados compuestos que suelen entrar en
contacto con las bacterias encargadas de la degradacin anaerobia, depen-
diendo de los procesos que se lleven a cabo en cada industria en particular. Es
as como se encontr que las resinas cidas, presentes en el agua residual de
las industrias productoras de papel, resultan txicas para las bacterias
anaerobias (McCarthy el a/., 1990). Otro ejemplo corresponde al caso del
formaldehdo, un compuesto ampliamente usado en las industrias qumica, tex-
til y maderera, para el cual los investigadores encontraron que causa una
fuerte inhibicin de la biomasa responsable de la digestin (Lu el a/., 1998).
Los compuestos citados se incluyen dentro de las sustancias xenobiticas cau-
santes de toxicidad en los sistemas anaerobios, junto con el formaldehdo,
algunos antibiticos, hidrocarburos c1orados y algunos aromticos. El efecto
de estos detergentes o surfactantes sobre los sistemas de tratamiento de aguas
se ha venido apreciando en varios casos; Austermann el a/. (1998), repor-
tan que durante la recuperacin de la planta de tratamiento de aguas de una
cervecera alemana se hizo necesario sustituir algunos de los desinfectantes y
de los lubricantes de cadenas utilizados, as como la reduccin en el uso de
agentes desinfectantes como el cido etilendiamino triactico (EDTA),con el fin
de mejorar el nivel de tratamiento. Garca el a/. (2000) estudiaron el efecto
de varios surfactantes catinicos comerciales (sales de amonio cuarternario)
sobre la degradacin anaerobia y encontraron que uno de los tres compues-
tos evaluados (compuestos con dos grupos metilo sustituidos y unidos di-
rectamente al tomo de nitrgeno) resultaba txico para las bacterias en
concentraciones superiores a 64 mg/g de lodo; los dems surfactantes, en
los cuales los grupos hidrofbicos estaban unidos al nitrgeno por enlaces
ster, eran tomados como nutrientes por parte de las bacterias. Wagener el
a/. (1987) reportan porcentajes de inhibicin del 80% de la actividad
metanognica con surfactantes aninicos del tipo alquil-benceno-sulfonatos,
y del 20% para surfactantes no inicos como los alquil-fenol-etoxilatos.
PUESTA EN MARCHA Y OPERACiN DE REACTORES ANAEROBIOS [95]
Factores relativos a la calidad del lodo

TIPO DE INCULO
El tiempo para el arranque del reactor ser corto si el lodo utilizado como inculo
tiene una alta actividad metanognica y est adaptado a los sustratos presentes
en el agua residual. En pases donde la tecnologa anaerobia es ampliamente
utilizada (Europa, USA,China), la consecucin de lodos como inculos para las
plantas de tratamiento normalmente se realiza a partir de otros reactores o stos
son suministrados por compaas privadas; sin embargo, en los pases de Amri-
ca Latina que han venido utilizando esta tecnologa, la consecucin de lodos como
inculos no es una labor fcil, ya que no existen suficientes reactores anaerobios
que suministren inculos de calidad.
Frente a esta dificultad se viene trabajando en el acondicionamiento de
inculos a partir de fuentes diferentes a los reactores anaerobios; por ejemplo, se
han explorado inculos provenientes de lodos activados, lagunas de estabiliza-
cin, tanques de sedimentacin y tanques spticos, requirindose por lo tanto, la
adaptacin de dichos inculos al sustrato que se va a utilizar.
En este proceso de bsqueda de inculos alternativos, la caracteriza-
cin microbiolgica de los lodos se ha constituido en una herramienta funda-
mental de trabajo, toda vez que permite identificar y seleccionar potenciales
inculos para reactores anaerobios. En la Tabla 4.2 se reportan las posibles
fuentes de inculos de los reactores, as como los valores de actividad
metanognica y el contenido de slidos suspendidos voltiles (SSV) (Guyot,
1993; Ramrez, 1996).
En general, se recomienda una concentracin mnima de 1OKgSSV/m3 y
un volumen no mayor del 60% del volumen total del reactor. Por otra parte, es
importante evitar el arrastre de las bacterias durante la fase de arranque y
controlar parmetros como la carga orgnica volumtrica, el tiempo de reten-
cin hidrulica (TRH) Y la concentracin de AGV en el efluente del reactor
(Hulshoff-Pol,1987).
Tabla 4.2. Diferentes fuentes de inculos para reactores anaerobios
Tipo de inculo Actividad metanognica Concentracin tpica de

especfica SSV en el lodo
gCH.-DaO/g SSV.d gIl
Lodo granular 0.5 -1.5 70 -120
Biopelicula 0.41.2 ND
Lodos domsticos digeridos 0.02 - 0.2 1540
Estircol digerido 0.020.08 20 - 80
Lodo de fosa sptica 0.010.07 1050
Laguna anaerobia 0.03 30
Estircol fresco 0.001 - 0.002 30 -140
Sedimento laguna 0.002 - 0.005 2050
Fuenle: Fiekl. 1987
Los procesos anaerobios de segunda y tercera generacin requieren d~

biomasa con alta actividad metanognica y que se mantenga en el reactor, ya se
por adherencia a un soporte como en el caso de los filtros anaerobios o los reacto
res de lecho fluidizado, o por formacin de grnulos como ocurre en los reactore~
UASBde alta tasa. En la Tabla 4.3 se consigna un resumen de las principales carac-
tersticas de los lodos granulares presentes en reactores UASBde alta carga.
Tabla 4.3. Propiedades del lodo granular
Caracterstica Intervalo
Densidad ( kg/m 3) 1028 a 1082

I
Relacin SSV/SST 0.45 a 0.90
Velocidad media sedimentacin (mlh) 53 a 100
Dimetro medio de grnulos (mm) 0.8 a 2.2
Actividad metanognica (gDOO-CH'/gSSV/d) 0.2 a 1.9
Fuente: Hulshoff- Poi. 1989.

P U E S T A E N M A Re H A Y o P E R A Ci N D E R E A e T o R E S A N A E R o B lOS [97]
BIBLIOGRAFA
AUSTERMANN, u.; Lange, R. y Seyfried, C. (1998). "Upgrading an Anaerobic/Aerobic Wastewater
Treatment Plant". Water 5cence Techn%gy, 37: 243-250.
BHAnACHARYA, 5.; Madura, R. y Uberoi, V (1995). "Toxic Effects 01 Cadmium on Methanogenic
Systems". Water Research, 29: 2239-2345.
CAIL, R.G y Barford, J.P. (1985). "The development 01 granulation in an upllow Iloc digester
and an upllow anaerobic blanket digester treating cane juice stillage". Biotechn%gy
Letters, 7: 493-498.
CAMPOS, C.M y Anderson, G.K. (1991). "The effect 01 the liquid upllow velocity and the substrate
concentration on the star-up and the steady state periods 01 lab-scale UASB reactors".
In: 6 International Symposion on Anaerobic Oigestion. Sao Paulo, Brasil.
OOLFING, J. (1985). "Chemical and bacteriological co~position 01 granular methanogenic sludge".

Canada. ouma/ of Microbi%gy. 31: 744-750.
OOLFING J. Y Bloemen, W. (1985). "Activity measurements as a tool to characterize the microbial
composition 01 methanogenic environments". ouma/of Microbia/ Methods, 4: 1 - 12
FANG, H., Chui, H.K. y Li, Y. (1995). "Microbial structure and activity 01 UASB granules treating
different wastewater". Water 5cence Techn%gy 30(12): 86-96.
FIELD,J.(1987) "Medicin de parmetros". En: Curso de arranque y operacin de reactores anaerobios
con flujo ascendente y manto de lodos (UASB). Universidad del Valle, Cali. (Colombia).
FRANCESE, A. y Sieriz, F. (1990). "Puesta en marcha de reactores anaerobicos tipo UASB".
Memorias del XXII Congreso de AIOIS, San Juan de Puerto Rico.
FRANCESE, A. y Sieriz, F. (1994). "Puesta en marcha de reactores UASB". Memorias del 111
Taller y Seminario Latinoamericano 'Tratamiento Anaerobio de Aguas Residuales'.
Montevideo, (Uruguay).
GARcA,M., Campos, E., Sanchez, J. y Ribosa 1. (2000). "Anaerobic Oegradation and toxicity 01 Comercial
Cationic Surfactants in Anaerobic Screening Tests". Chemosphere. 41: 705-710.

GROTENHUISJ.T.,Smith" M. y Plugee, C.M. (1991). "Bacteriological composition and structure of
granular sludge adapted to different substrates". Applied and Enviromental Microbiology,

57(7): 1942-1949.
GUIOT, R.5., Pauus A. y Costerton J,W (1992). "A structural model of the anaerobic granule
consortium". Water 5cence Technology, 25(7): 1-10.
GUYOT,J.P (1993). "Anaerobic microbial counts of different potential anaerobic inocule". Applied
Microbiology, 40: 139-142.
HICKEY,R., Vanderwielen, J. y Switzenbaum, M. (1989). "The effect of Heavy Metals on Methane
Production and Hydrogen and Carbon Monoxide Levels Ouring Batch Anaerobic Sludge
Oigestion". Water Research, 23:207-218.
HULSHOFF-POL, L., Worp, L.W. y Lettinga, G. (1986). "Physical characterization of anaerobic
granular sludge". Proc(. NVA/ EWPCA, Water Treat. Conf. Anaerobic Treatment: A grow-
up technology, Amsterdam, (The Netherlands). Sept. 1986: 89-101.
HULSHOFF-POL, L. (1987). "Arranque y operacin de reactores UASB. Arranque y operacin de
sistemas de flujo ascendente con manto de lodo UASB. Manual del curso. Universidad
del Valle. Corporacin Autnoma Regional del Cauca y Universidad Agrcola de
Wagenngen. Santiago de Cal (Colombia). Noviembre. E-1 - E-11.
HULSHOFF-POL, L. (1989). "The phenomenon of granulation of anaerobic sludge". Tesis doctoral.
Universidad Agrcola de Wageningen, (Holanda).
LANE, A.G. (1986) "Star-up, operating requeriments and granule formaton during upflow sludge bed
treatment of a strong food processing effluent". Environmental Technology Letters, Vol. 7.

LEnlNGA G. (1980) "Use of the upflow sludge blanket (USB) reactor concept for biological
wastewater treatment". Biotechnology & Bioengineering, 22: 699-734.
LETIINGA G., Hulshoff-Pol L. y Zeeman G. (1999). Lecture notes: "Biological wastewater treatment.
Part One: Anaerobic Wastewater Treatment". Wageningen University (The Netherlands),
Oecember, 1999.
LU, Z. y Hegemann, W. (1998). "Anaerobic Toxicity and Biodegradation of Formaldehyde in Batch
Cultures". Water Research, 32: 209-215.
MAHONEY, E.M. (1987). "The effect of calcium on microbial aggregation during UASB reactor
star-up". Water 5cence Technology, 19: 249-260.
McCARTHY,P, Kennedy, K. y Oraste, R. (1990). "Role of Resin Acids n the Anaerobic Toxicity of
Chemythermomechanical Pulp Wastewater". Water Research. 24, 1401-1405.

P U E S T A E N M A R e H A Y o P E R A eI6 N o E R E A eT o R E S A N A E R o B I os [99]
MOLlNA, F.(1997). "Influencia de la carga hidralica y la concentracin del sustrato en el arranque
de reactores UASB". Tesis de Maestra. Universidad del Valle, (Colombia)
MONROY, O. (1997). "Sistema de Rectores Anaerobios". Memorias. VIII Curso Avanzado sobre
Procesos Biotecnolgicos "BiotecnologaAmbiental". Junio 30-Julio 11. Cuernavaca, (Mxico).
RAMIREZ, L., Molina F., Rojas O. y Alazard O. (1996). "Evaluacin de potenciales semillas para la
inoculacin de reactores anaerobios". En: IV Seminario Taller Latinoamericano sobre
Tratamiento Anaerobio de Aguas Residuales. Bucaramanga, (Colombia).
REYES,S. y Lettinga, G. (1991). "The Effect 01 Aromatic Structure on the Inhibition 01 Acetoclastic
Methanogenesis in Granular Sludge". Applied Microbiology & Biothechnology, 34: 544-550.
ROJAS, O. (1987). "Relacin Alcalinidad - Acidos grasos voltiles. Arranque y operacin de
sistemas de Ilujo ascendente con manto de lodo". UASB. Manual de curso. Universidad
del Valle. Corporacin Autnoma Regional del Cauca y Universidad Agrcola de
Wageningen. Santiago de Cali (Colombia). Noviembre. 0-1-0-31.
TAY,J.YVan, y. (1996). "Influence 01 substrate concentration on microbial selection and granulation
during star-up 01 upllow anaerobic sludge blanket reactors". WaterEnvironment Research,

68(7): 1140-1150.
VAN HAANOEL, A. y Lettinga, G. (1994). Tratamento anaerobio de esgotos em regioes de clima
quente. Editora EPGRAF.Campina Grande, Brasil
VAREL IJ.H.,Isasscson, Bryant, M.P. (1977). "Thermophilic methane production Irom cattle waste".
App/ied Environtal Microbiology; 33: 298-307.
WAGENER, S. y Schink, B. (1987). "Anaerobic degradation 01 nonionic and anionic surfactans in

enrichment cultures and lixed-bed reactors". Water Research, 21 :615-622.
WEIGANT, M. y Oe Man, A.w (1986). "Granulation 01 biomass in thermophilic upllow anaerobic
sludge blanket reactors treating acidilied wastewater". Biotechnology & Bioengineering,

28: 718-727.
WEILANO, P. y Rozzi, A. (1991). "The star-up operation and monitoring 01 high-rate anaerobic
treatment systems. Oiscessers reports". Water Sdence Technology, 24 (8): 257-277.
WENTlEL, M.C y Moosbrugger, R.E. (1995). "Tentative guidelines lor waste selection, process
desing, operation and control 01 upllow anaerobic sludge bed reactors". Water Sdence
Technology; 30(12): 31-42.
WEIMIN, w., Jiwi, H. y Xiasheng, G. (1986). "Effect 01 granulation 01 sludges in the upllow reactor
in solid-liquid separation". Uanjing Kexue Xuebae, 6 (1): 86-95.

[100] D,GESTiN ANAEROBIA
WIRTZ, R. Y Dague, R. (1996). "Enchancement 01 granulation and star-up in the anaerobic

sequencing batch reactor". Water Environment Research, 68(5): 883-892.
WU,W.M.,Jain, M.K., Macario, E.C., Thiele, J.Hy Zeikus, G. (1992). "Microbial composition and
characterisation of prevalent methanogens and acetogens isolated Irom syntrophic
methanogenic granules". App/ied Microbi%gy & Biotechn%gy. 38: 282-290.
ZEGERS,F. (1987). Microbiologa, arranque y operacin de sistemas de flujo ascendente con
manto de lodo. UASB. Manual de curso. Universidad del Valle. Corporacin Autnoma
Regional del Cauca y Universidad Agrcola de Wageningen. Santiago de Cal. Colombia.
Noviembre. A-1-A-14.
ZEHNDER,A. (1988). Biology of Anaerobic Microorganisms. John Wiley and SonsoInc.
captulo
c i n c o
CARACTERIZACIN DE
LODOS ANAEROBIOS Y
AGUAS RESIDUALES
EL XITO O FRACASO DE UN SISTEMA ANAEROBIO DE TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES
DEPENDE FUNDAMENTALMENTE DE LA CALIDAD DE LA BIOMASA CONTENIDA EN EL REACTOR; POR
lo tanto, la caracterizacin de la biomasa permite entender el funcionamiento del

sistema, proyectar su desempeo futuro y definir la potencialidad de la biomasa
como fuente de inculo para otros reactores.
LODOS ANAEROBIOS
Caracterizacin Fisicoquimica
MUESTREO
La toma de una muestra de lodo en reactores de lecho suspendido, por ejemplo

reactores UASB,se realiza extrayendo la cantidad de lodo necesaria mediante las
vlvulas de drenaje del sistema. En los reactores de lecho fijo, por ejemplo los
filtros anaerobios, la toma de la muestra se lleva a cabo extrayendo una cantidad
suficiente del medio de soporte y raspando posteriormente la biomasa adherida.
La muestra de lodo se toma en recipientes limpios; dependiendo del objetivo
del estudio, se pueden tomar muestras puntuales de una o varias capas de lodos o
del medio de soporte. La otra alternativa consiste en tomar muestras compuestas a
partir de muestras individuales tomadas a diferentes alturas o alcuotas del manto
de lodo o del medio de soporte. Es importante tener en cuenta, que para obtener
una muestra representativa, debe descartarse el lodo almacenado en la vlvula,
para lo cual se descarta el volumen inicial colectado. Generalmente se toma de uno
a dos litros de muestra y se recomienda llenar el recipiente hasta el borde superior
para minimizar la exposicin al oxgeno (Wills et al., 2000).
Al tomar la muestra, se debe registrar informacin bsica como el tipo de
reactor evaluado, los parmetros de operacin y las caractersticas del afluente y
el efluente del reactor. La muestra se debe transportar refrigerada, y una vez

ingresa al laboratorio, se recomienda gasear la muestra con Nz por 10 a 15 minu-
tos y luego refrigerar a 4C hasta el momento de ser procesada.
SLIDOS
FUNDAMENTO TERICO. El material suspendido o disuelto presente en el agua resi-

dual se denomina 'slidos', y en l se pueden distinguir tres categoras: slidos
totales, slidos suspendidos totales y slidos disueltos totales. En cada una de
estas tres categoras tambin se hace diferencia entre los slidos fijos y los sli-
dos voltiles: los primeros son los slidos que permanecen despus de incinerar
la muestra, mientras que los segundos son los slidos oxidados o volatilizados al
incinerar la muestra.
Cuando los lodos anaerobios presentan caractersticas slidas o semi-s-
lidas, la masa de los slidos disueltos es despreciable comparada con la fraccin
de slidos suspendidos, por lo cual no es necesario filtrar los lodos, evitando as
las dificultades inherentes a filtrar al vaco una cantidad apreciable de lodo.
En caso de que el contenido lquido del lodo sea importante, debe realizar-
se el filtrado de los lodos para separar la fraccin suspendida de la disuelta; para
este caso se utiliz el mtodo consignado en los mtodos normalizados para el
anlisis de aguas potables y residuales (APHA, 1998).
MATERIALES y EQUIPOS.
o Cpsulas de porcelana
o Balanza analtica
o Probeta
o Bao Mara
o Estufa
Mufla
Pipetas
Pinzas para mufla
PROCEDIMIENTO. Se recomienda trabajar por triplicado, as:
Colocar 30 mililitros de lodo en una cpsula de porcelana previamente incine-
rada y pesada, (PJ
CARACTERIZACiN DE LODOS ANAEROBIOS Y AGUAS RESIDUALES [105]
Evaporar al bao Mara la humedad del Iodo.

Secar en estufa a una temperatura entre 103( Y 105( durante 24 horas.
Transferir las cpsulas al desecador hasta que se enfren y pesarlas, (Pzl.
Incinerar la muestra en la mufla a 550 0
( 50 0
( durante una hora.
Transferir las cpsulas a la estufa durante 15 minutos.
Posteriormente, colocar las cpsulas en el desecador y permitir que se enfren.
Pesar las cpsulas, (PJ
CLCULOS.
Slidos Suspendidos Voltiles (SSV):
SST (mg/l) = (PrP)"'1.OOO/(30/1.000)
Slidos Suspendidos Totales (SST):
s V (mg/l) = (PrP)+1.OOO/(30/1.000)
NDICE VOLUMTRICO DE LODOS Y VELOCIDAD DE SEDIMENTACiN
FUNDAMENTO TERIco' Los sistemas de tratamiento de aguas residuales por proce-

sos biolgicos anaerobios se basan en la retencin de grandes cantidades de
lodo en el sistema; con ello se logra que el tiempo de retencin de lodos sea
mucho mayor que el tiempo de retencin hidrulico; por lo tanto la velocidad de
sedimentacin (VS) es una variable importante para mantener la biomasa dentro
del sistema. La velocidad de sedimentacin indica la rapidez con la que sedimenta
el lodo y se expresa en m/h.
El ndice Volumtrico de Lodos (IVL) es una prueba que evala la capaci-
dad de sedimentacin y compactacin de un lodo; se define como el volumen que
ocupa un gramo de lodo, despus de sedimentar durante 30 minutos, sus unida-
des son ml/g.
Probeta de vidrio de 1.000 mi

(ronmetro
Regla
200 mi de lodo sedimentado
[106] D,GESTiN ANAEROBIA
PROCEDIMIENTO.
Colocar los 200 mi de lodo sedimentado en la probeta y aforar a 1.000 mi con

efluente clarificado del propio reactor anaerobio o con agua destilada.
Tapar la probeta con parafilm, homogenizar el lodo y el agua invirtiendo la
probeta tres veces.
Colocar la probeta en una superficie plana y registrar el volumen de lodo sedi-
mentado por unidad de tiempo; generalmente se registra el volumen sedimen-
tado cada 30 segundos para los primeros 5 minutos y, posteriormente, cada 3
minutos hasta completar 30 minutos.
CLCULOS.
Seconvierte el volumensedimentadoa altura equivalenteutilizandola siguienteecua-

cin h= (1.000 - V) * L /1.000, donde hies la altura (cm) del borde superior de la
probeta al volumende lodo sedimentado para un tiempo ~,Vies el volumen sedimen-
tado (mi) en un tiempo Ti y L es la altura (cm) de la probeta entre O y 1.000 mI.
Se construye una grfica de Ti(abcisas) contra h (ordenadas), uniendo los pun-
tos manualmente, luego se traza una tangente a la zona de la curva con mayor
pendiente. La pendiente de esta recta corresponde a la velocidad mxima de
sedimentacin (cm/min); utilizando el factor de conversin se calcula la velocidad
de sedimentacin en m/h.
El IVL se calcula aplicando la siguiente ecuacin:
lVL = VJOmi.",,j(SST*F)
donde V30 mlnu

. t es el volumen en mi, ocupado por el lodo a los 30 minutos de
os
iniciado el ensayo, los SSTson los slidos suspendidos totales del lodo en gIL y F
es el factor de dilucin, que para este caso es 200/1.000=0.20 .
PERFIL DE LODOS
FUNDAMENTO TERICO. La concentracin del lodo dentro del manto de lodo no es

uniforme, pues generalmente la concentracin disminuye desde el fondo a la su-
perficie del reactor. La evaluacin de esta variacin se realiza determinando la
concentracin del lodo a diferentes alturas, procedimiento denominado 'perfil de
lodos', el cual permite estimar la cantidad de lodo existente en el reactor. Cono-

ciendo la biomasa presente y la actividad metanognica del lodo, se puede prede-
cir la mxima carga orgnica que puede soportar el sistema.
El contenido y la actividad del lodo varan con el tiempo; se estima que el
reactor alcanza la estabilidad, la actividad metanognica del lodo permanece cons-
tante y la cantidad del lodo aumenta a una tasa constante.
o Recipientes para toma de muestras.

o Materiales y equipos necesarios para determinar slidos.
PROCEDIMIENTO.
o Tomar aproximadamente 100 mi de lodo en cada punto de muestreo.

o Determinar los SSTy SSVen cada muestra de acuerdo con el mtodo determi-
nacin de slidos.
CALCULOS.
o Convertir la altura de toma de muestra a volumen de reactor utilizando la geo-

metra y dimensiones del reactor
o Construir sendas grficas de las concentraciones de SSTo SSV(abscisas) con-
tra el volumen correspondiente de reactor (ordenadas): el rea bajo las cur-
vas resultantes son las masas de SSTy SSVcontenidas en el reactor. El contenido
total de SSTy SSVse calcula descomponiendo el rea bajo la curva en figuras
geomtricas, calculando el rea para cada una de estas figuras y realizando la
suma de las reas individuales.
GRANULDMETRA
FUNDAMENTO TERICO. El tratamiento anaerobio de residuos lquidos en reactores

de lecho suspendido, tiene como fundamento el lograr la formacin de grnulos
que tengan velocidad de sedimentacin alta y actividad metanognica notable.
Los grnulos evolucionan con el tiempo y dependen de la operacin del reactor y
del estado en que se encuentre el mismo, es decir en la fase de arranque o en la
estable. La determinacin del tamao de los grnulos permite establecer sus cam-
bios durante un proceso de granulacin y adems, permite identificar la homoge-
neidad o heterogeneidad de los grnulos del lodo con respecto a su tamao.
Agar bacteriolgico o gelatina sin sabor.

Cajas de Petri.
Microscopio ptico con ocular de Whipple.
PROCEDIMIENTO.
Preparar agar bacteriolgico como lo recomienda la casa comercial; no

requiere su esterilizacin. Como alternativa se puede utilizar gelatina sin sal
En 5 cajas de Petri, colocar 1mi de lodo en el centro.
Enseguida verter el agar an tibio, procurando formar una pelcula lo rr
delgada posible.
Distribuir la muestra en el agar de manera uniforme, con movimientos circ
lares de la caja de Petri hacia la derecha y los mismos hacia la izquierc
formando ochos.
Esperar a que se solidifique el agar.
Observar en el microscopio ptico empleando un ocular de Whipple previamen
calibrado, determinando el tamao de cada cuadrado del micrmetro ocular.
Para su lectura se debe tener en cuenta:
Presencia de grnulos bien definidos y compactos.
El valor del dimetro promedio se debe realizar sobre una muestra al azar (
mnimo 100 grnulos.
Para granos no esfricos se debe medir el dimetro mayor.
CALCULOS. Con los datos obtenidos de las mediciones de los grnulos se determin
la valor promedio de los grnulos.
ACTIVIDAD METANOGNICA ESPECFICA
Para evaluar la actividad metenognica especfica (AME) del lodo, se determina I

capacidad del consorcio microbiano para generar metano, lo cual se mide baj
condiciones controladas de temperatura. Se puede utilizar diferentes sustratos e
forma individual o mezclados, lo cual permitir establecer la presencia y la activi
dad de los diferentes grupos metanognicos.
FUNDAMENTO TERICO. La actividad metanognica es una caracterstica que indica 1;
capacidad de la biomasa para transformar la materia orgnica en metano; SI

define como la masa de sustrato en forma de DQOque es convertida a metano por

unidad de masa de biomasa y por unidad de tiempo, lo cual se expresa con las
siguientes unidades: gDQO-CHigSSV da.
La actividad metanognica se mide bajo condiciones de saturacin de sustrato;
por lo tanto, la concentracin de cidos grasos voltiles (AGV) deber ser suficiente
para que su difusin en el lecho del lodo no constituya una limitante. As por ejemplo,
en ensayos estticos con frecuencia el lodo sedimenta y forma una capa que limita la
difusin del sustrato. Tambinse debe adicionar macro y micronutrientes, una solucin
buffer para mantener el pH cercano a 7, mientras su incubacin puede hacerse con o
sin agitacin, a una temperatura entre 30C y 35C. En estas condiciones ambientales
los microorganismos presentes en el lodo podrn llevar a cabo la transformacin del
sustrato. Comoresultado,podr calcularselatasa mximade produccin de metano para
el lodo bajoestudio (Field, 1987). Enreactores a escalareal, o en la naturaleza, latasa de
conversin de sustrato a metano es menor debido a que existen limitacionesen la canti-
dad de sustrato, en la cantidad de nutrientes y en las condiciones ambientales.
Para determinar la cantidad de lodo y de sustrato que se deben adicionar
en la prueba, se han hecho algunas recomendaciones (Field, 1987) las cuales se
consignan en la Tabla 5.1.
Tabla 5.1. Relaciones SSV/AGV
Sistema lodo SSV (gil) AGV' (gil) DaD
Agitado 2.0 a 5.0 2.0 a 4.0
No agitado . 1.0 a 1.5 3.5 a 4.5
'Los KN del sustrato deben ser neutralizados a pH 7 usando NaOH; de lo contrario. la baja de pH y la alta fraccin de KN no ionizados
causarn inhibkin severa de la metanognesis.
Los sustratos ms utilizados para este ensayo son una mezcla de Hz-eOz
(80%-20%), cidos grasos neutralizados solos o en mezclas, especficamente
los cidos frmico, actico, propinico y butrico; tambin se utilizan alcoholes,
metanol, etanol y carbohidratos (glucosa).
La actividad metanognica del lodo puede verse afectada por el tiempo
que el lodo requiere para adaptarse al sustrato, este perodo se denomina 'fase
de adaptacin' o 'fase lag'. Por esta razn, previamente a su determinacin, se

hace una primera alimentacin con el sustrato, de forma que la actividad se mide
durante la segunda alimentacin.
METODOLOGAS.
Existen diferentes metodologas para realizar el ensayo de activi-
dad metanognica, las cuales se diferencian en la forma como se mide la cantidad
de CH4 producido y en la manera como se realiza la adicin del sustrato.
Las metodologas bsicas de medicin de la produccin de metano son
las siguientes:
Medicin de CH4 por desplazamiento de lquido, para lo cual se utilizan reci-
pientes de 0.5 litros o mayores y un sistema de desplazamiento de lquido
(Figura 5.1). El biogas producido se burbujea en una solucin alcalina (gene-
ralmente de NaOH o KOH) con pH mayor que 12 en la cual el COzes adsorbido
y el volumen de gas metano desplazar un volumen igual de la solucin alcalina;
esta metodologa exige un montaje y seguimiento muy cuidadoso. El volumen
de lquido desplazado fuera de la botella de solucin ser equivalente al volu-
men de biogas generado por el sistema.
Solucin
de NaOH
Siegas
----.
Figura 5.1.
Reactor Vlvula
Medicin de la actividad metanognica por desplazamiento.

Cilindro
graduado
Medicindel volumen de metano mediante la determinacin de la concentracin de

CH4 por cromatografa de gases en un sistema cerrado (Figura 5.2), mediante el
CARACTERIZACiN DE LODOS ANAEROBIOS Y AGUAS RESIDUALES [111 ]
uso de botellas serolgicas de 60 o 120 mi, en las cuales la fase gaseosa corres-
ponde a 2/3 del volumen de la botella donde podr acumularse el metano produ-
cido. Tanto en la preparacin del medio de cultivo, como en la inoculacin se debe
seguir los procedimientos recomendados para el manejo de microorganismos
anaerobios (evitar contaminacin con oxgeno y mantener condiciones reductoras).
Aunque en este mtodo la manipulacin de las botellas es mucho ms simple, los
requerimientos de equipos de cromatografa de gases limitan su uso.
Para la adicin del sustrato se pueden utilizar dos mtodos:
o Realizar dos alimentaciones, iniciando la segunda alimentacin cuando se ha
logrado la conversin a metano de por lo menos el 80% del sustrato adiciona-
do en la primera alimentacin.
o Realizar una activacin inicial del lodo mediante la adicin de 0.1-0.3 mi de
sustrato; al cabo de 12 horas se retira de la botella de ensayo todo el metano
producido durante este lapso de tiempo. En ese momento, se adiciona una
cantidad de sustrato tal, que se cumpla la relacin SSV/AGVseleccionada y se
inicia la medicin de metano a diferentes intervalos de tiempo hasta el momen-
to en que se alcanza la mxima produccin (generalmente, 72 horas).
MEDICiN DE METANO POR DESPLAZAMIENTO DE LQUIDO
Ver Figura 5.1.

o Botellas de suero de 500 mI.

o Sistema de mangueras y agujas para comunicar la botella utilizada como reac-
tor con la botella utilizada para medir la produccin de metano por desplaza-
miento de lquido.
o Cuarto caliente o bao Mara.
o Solucin de NaOH con fenoftaleina como indicador de pH.
o Medio de cultivo (ver Anexo 1).
o Solucin de nutrientes (ver Anexo 1).
PROCEDIMIENTO.
o Adicionar 250 mi de agua destilada hervida as como los volmenes de AGV y

de lodo. El volumen depender de si el sistema es esttico o agitado.
Cuando se sospecha una limitacin de nutrientes y elementos traza se adiciona

la solucin de nutrientes en una relacin de 1mi /L. El extracto de levadura se
adicionan en una concentracin de 0.2g/L.
La temperatura de incubacin es de 30C a 35C de acuerdo con las condicio-
nes que se fijen para el ensayo.
En otra botella de suero se colocan 500ml de la solucin de NaOH, se sella con
tapn de caucho el cual se perfora con dos agujas de jeringa. La botella con
NaOH se coloca boca abajo, y se conecta a la botella con el lodo (Figura 5.1).
La "T" de la manguera de conexin funciona como trampa para NaOH, e impi-
de la entrada de NaOH a la botella de lodo. La segunda aguja en el frasco con
NaOH permite la salida del lquido y medir el volumen de gas producido, el cual
es equivalente al volumen de NaOH desplazado y recogido en el cilindro gra-
duado.
Determinar la produccin diaria de metano a intervalos regulares de tiempo
para determinar el periodo de tiempo en el cual se obtiene la mayor produc-
cin de metano. Es importante agitar la botella que contiene el lodo antes de
realizar la lectura para liberar el gas del lodo y conseguir mayor contacto
entre el sustrato yellodo.
Cada muestra se realiza por duplicado. Para cada serie de ensayos se incluye
un blanco que contiene agua destilada y un control al que no se le agrega
sustrato, a fin de corregir la produccin endgena de gas, as como el volumen
desplazado por cambios de temperatura y presin atmosfrica.
Medicin de metano por cromatografa
Ver Figura 5.2.

Botellas serolgicas de 60 mi, con tapn de caucho y sello de aluminio

Cilindro de CH4 puro para elaborar curva de calibracin
Cromatgrafo de gases configurado para cuantificacinde concentraciones de CH4
Cuarto caliente o bao Mara.
Medio de cultivo, ver Anexo 1.
Figura 5.2. Cromatgrafo de gases para medicin de metano.
PROCEDIMIENTO.
Por cromatografa de gases no slo se puede determinar la produccin de

metano sino las de alcoholes y cidos grasos voltiles.
Previa a la determinacin de la actividad metanognica es necesario contar
con una curva de calibracin para cuantificar el volumen de metano producido
por cada muestra.
CURVA DE CALIBRACIN.
La curva de calibracin se construye rea-
lizando mediciones en 6 botellas
serolgicas de 60 mi, a las cuales se les
agrega 20 mi de agua destilada. Las bo-
tellas se tapan y se sellan con sello de alu-
minio. Utilizando jeringa se inyectan los
----+--_ Aire + CH,
siguientes volmenes de metano puro: 0.5,
1, 5, 10,20 Y 30 mililitros (Figura 5.3).
_-1-_-+ Agua
destilada La curva de calibracin se construye
graficando el volumen de metano inyec-
Figura 5.3. Preparacin de la curva
de calibracin tado versus el rea del cromatogrma ob-
tenido en el cromatgrafo de gases. La ecuacin de la regresin lineal de lo~

datos corresponde a la relacin de calibracin.
PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR LA ACTIVIDAD METANOGNICA
Se colocan 13 mi de medio de cultivo en botellas serolgicas de 60 mi, 0.2 mi

de la solucin de vitaminas diluida y 0.2 mi de la solucin de NazS.En la cmara
anaerobia o bajo flujo continuo de nitrgeno se adiciona el volumen de lodo
requerido para mantener la relacin DQO/SSV seleccionada. Posteriormente,
se adiciona el volumen de sustrato requerido (generalmente se preparan solu-
ciones a una concentracin suficiente para adicionar entre 1 a 2 mi) y se com-
pleta a un volumen total de 20 mi con el medio de cultivo.
Adicionalmente, se debe preparar una botella sin sustrato con la cual, se eva-
luar la produccin de metano residual del Iodo. Se recomienda hacer el ensa-
yo por triplicado para cada sustrato. La adicin de las soluciones estriles
(vitamina y agente reductor) se lleva a cabo con jeringa estril, purgadas con
Nz (filtro estril de algodn en rama para el flujo de Nz), y se debe flamear el
tapn al realizar este procedimiento. La inoculacin del lodo se puede realizar
con pipeta o con jeringa sin aguja, el lodo a utilizar debe en lo posible estar
estabilizado para eliminar la interferencia por produccin de metano por sustrato
residual presente en ellodo.
Para la preparacin de la solucin de sustrato se pueden utilizar los datos
para cidos grasos voltiles que se presentan en la Tabla 5.2. La cantidad de
sustrato y de lodo a agregar se calculan utilizando las relaciones consignadas
en la misma Tabla 5.1.
Para la incubacin se colocan las botellas en posicin invertida, lo cual contribuye
a crear un sello hidrulico. Las lecturas se realizarn a diferentes intervalos de
tiempo hasta cuando la produccin de metano sea constante a travs del tiempo
o hasta que el 80% del sustrato haya sido utilizado. Cuando se realiza una se-
gunda alimentacin, se adiciona la misma concentracin de AGVque la utilizada
en la primera alimentacin, el control de la produccin de metano se lleva a cabo
hasta que el 80% del sustrato haya sido consumido (Field, 1987).
CARACTERIZACiN DE LODOS ANAEROBIOS Y AGUAS RESIDUALES [11
Tabla 5.2. Datos bsicos de 105 cidos grasos voltiles (AGV)
Formula Peso molecular Densidad DaD Produccion

del teorica (g CH,
Acido Acido Sal ACldo Sal hquido(*) DaD/ g teorica(mol
(g/mi) acido) CH, / mol
acido)
Frmico CH02 CHO,Na 460 6801 1.22 0348 0.25
Acetlco C2H,02 C2H30Na3H2 6107 13608 105 1067 100
Proplmco C3H602 C3H502Na 74.08 9606 0.99 1514 175
8utJnco C4Hs02 C,H02Na 88.11 1101 0.96 1.818 250
\ I Dependede lacalidaddelreactivo.
CALCULOS.
Se construye una grfica colocando el volumen acumulado de metano en el ej~

Y,y el tiempo acumulado en horas en el eje X. Se selecciona la regin de mayor
pendiente de la curva, y se calcula el valor numrico de dicha pendiente, la cual
estar expresada en mililitros de CH/hora. El perodo de tiempo utilizado para
determinar la tasa de produccin de metano, debe cubrir por lo menos el re-
querido para la utilizacin del 50% de los AGV.La actividad metanognica es-
pecfica (AME) se calcula mediante la siguiente ecuacin:
.1M 1:' = (P24) /(FCI'SSI')
Donde,
P= Pendiente de la grfica en mi/hora,
FC = Factor de conversin de DQO a CH4, en mi CH4/g DQO (este valor depen-
de de la temperatura y la presin, En la Tabla 5.3 se consigna este factor para
diferentes temperaturas).
V= Volumen de lodo utilizado en el ensayo en litros.
SSV = Concentracin de SSV en el Iodo.
Tabla 5.3. Factores de conversin de llramos de DQOa mililitros de CH, bajo

diferentes temperaturas y a una presin de 1 atmsfera"
Temperatura (OC)
I mi CH, seco! 9 de Daa
I mi CH, hmedo! 9 de Daa
10 363 367
15 369 376
20 376 385
25 382 394
30 388 405
35 395 418
40 401 433
45 408 450
50 I 414 471
Si la determinacin de la actividad melanognica se realiza en mayores akiludes sobre el nivel del mar. se puede corregir el factor de
conversin reporlado para la presin atmosfrica. as:
Factorde conversin x 760 I presin atmosfrica del lugar (mm de mercurio).
Caracterizacin microbiolgica
RELACIONES DE LOS MICROORGANISMOS CON EL 'OXGENO
En la naturaleza no existe una lnea rgida de demarcacin entre los organismos

aerobios y anaerobios, por lo que los microorganismos pueden ser divididos en
varios grupos de acuerdo con su relacin con este parmetro; la Figura 5.4 ilustra
dicha situacin. Tomado como criterio la relacin de las bacterias con el oxgeno,
stas se puden clasificar como aerobios obligados, anaerobios obligados,
anaerobio aerotolerante, anaerobio facultativo y microaerfilo.
I ANAEROBIOS
Aerotolerantes
Obligados
Fillura 5.4. Relacin de los microorllanismos con el oxilleno.

Aerobios obligados. Son bacterias capaces de crecer con las concentraciones

de oxgeno presentes en el aire (21 %) Y muchos pueden tolerar altas concen-
traciones (hiperbricos).
Anaerobios obligados. Son microorganismos que carecen del sistema respira-
torio y no pueden utilizar el oxgeno como aceptar final de electrones. Estos
mueren en presencia de oxgeno, probablemente por su incapacidad para
detoxificar algunos de los productos del oxgeno. Cuando el oxgeno se reduce,
algunos productos txicos como el perxido de hidrgeno (HzOz)'el superxido
(Oz ), y el radical hidroxilo (OH') se producen. Muchos de los anaerobios obli-
gados son ricos en enzimas flavnicas las cuales reaccionan espontneamente
con el 0z generando los productos txicos. Obtienen energa mediante las vas
fermentativas, en las que compuestos orgnicos como cidos, alcoholes y otros
productos sirven como aceptares de electrones.
Anaerobios aerotolerantes. Son bacterias que pueden tolerar el 0z y crecer en
su presencia an cuando no lo utilizan.
Anaerobios facultativos. Son bacterias que crecen bajo condiciones anaerobias
o aerobias determinadas. Usan el oxgeno como aceptor de electrones termi-
nal, con menos eficiencia; en condiciones anaerobias, tienen metabolismo
fermentativo produciendo Hzy COzY pueden crecer aerbicamente por respi-
racin produciendo slo COz.Si el 0z est presente, produce mayor cantidad
de ATP y mayor crecimiento de biomasa celular; pero si no hay 0z' y est
disponible una fuente de energa fermentable como la glucosa, se lleva a cabo
la fermentacin, que produce menos crecimiento de la biomasa y elimna Hzy
COz.(Madigan et a/., 1997).
Microaeroflicos. En contraste a los anteriores existen algunos microorganismos
aerobios que utilizan el oxgeno solo cuando esta presente en niveles muy
bajos, usualmente por su limitada capacidad para respirar o porque contienen
alguna molcula o enzima sensible al oxgeno.
FORMAS TXICAS DEL OXGENO
Como se mencion anteriormente, el oxgeno es un fuerte oxidante y un excelente

aceptor de electrones en la respiracin. La presencia de oxgeno atmosfrico in-
duce reacciones en la clula que conllevan a la produccin del radical superxido

de carga negativa (O-z)' perxido de hidrgeno (HPz) y otros productos de
oxidoreduccin txicos. Los dos primeros pueden reaccionar y producir radicales
hidroxilo (OH-) libres que constituyen los oxidantes biolgicos ms poderosos
conocidos. La enzima superxido-dismutasa cataliza la conversin de radicales
superxido a perxido de hidrgeno y oxgeno molecular, mientras la catalasa
convierte el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno.
TCNICAS PARA EL CULTIVO DE BACTERIAS ANAEROBIAS
Considerando las limitaciones y restricciones de crecimiento de los

microorganismos anaerobios, su aislamiento y cultivo requiri del desarrollo de
metodologas especiales, que slo hasta hace menos de cuatro dcadas fueron
incorporadas para su estudio. Los desarrollos de Hungate (1969), Wolfe (1976),
Bryant (1967) Y Mah (1980), permitieron avances significativos en el uso de
tcnicas especficas para el estudio de bacterias anaerobias estrictas. Adems,
estos avances permitieron conocer y entender la complejidad de las interacciones
microbiolgicas y bioqumicas que ocurren durante la digestin anerobia de la
materia orgnica.
JARRA DE ANAEROB/OS/S. Son recipientes sellados de policarbonato, en las cuales el
aire es reemplazado por una mezcla de Hz y COz'y con la presencia de un catali-
zador qumico se remueven las trazas de Oz presentes en el vaso o en el medio de
cultivo; de esta forma es posible obtener las condiciones anxicas requeridas
(Figura 5.5). En estos sistemas tambin se puede crear las condiciones anaerobias
mediante el uso de klrspara generar hidrgeno y dixido de carbono (Gas PaK,
Gas Pack Plus). Cuando se utilizan generadores de Hz y COz'el sobre del gene-
rador se abre y se coloca en la jarra, se adiciona 10 mi de agua destilada o
desionizada para permitir la generacin de hidrgeno y dixido de carbono e
inmediatamente se cierra la jarra. En el sistema Gas Pack Plus, el hidrgeno se
genera a 'partir de las tabletas de borohidruro; una vez que se adiciona agua, el
hidrgeno que se genera se combina con el oxgeno presente en la jarra en pre-
sencia del catalizador de paladio para formar agua. El COzse genera a partir del
bicarbonato de sodio ms la tableta de cido ctrico. Con este sistema despus de
CARACTERIZACiN DE LODOS ANAEROBIOS Y AGUAS RESIDUALES [1
30 minutos de incubacin se observa la formacin de gotas de condensacin al

interior de la superficie de la cmara. Dentro de las dos horas siguientes a 35C,
la concentracin de COz suele superar el 4%, pero menor al 10%. Despus de la
incubacin, aire la jarra por 15 segundos, antes de retirar las cajas (Catlogo No.
4371040. Becton Dickinson).
Figura 5.5. Jarras de anaerobiosis.
Elcatalizador que se utiliza est compuesto de bolitas de almina recubiertas

de paladio, que acta removiendo las trazas de oxgeno y generando vapor de agua,
el cual puede ser inactivado por exposicin a humedad y al HzSu otros productos
voltiles de la bacteria. Las bolitas de almina pueden ser rejuvenecidas o restitui-
das a su total actividad mediante calentamiento en horno seco a 160-170 oCduran-
te 2 horas. Luego se guardan a temperatura ambiente en un recipiente limpio y
seco, preferiblemente en un desecador, hasta el momento de ser usadas. Es impor-
tante cada vez que se usen las jarras, es preciso utilizar un catalizador activo e
indicador de la anaerobiosis. Las jarras de anaerobiosis no son utilizadas para el
aislamiento de bacterias anaerobias obligadas, por que la exposicin al oxgeno no
puede ser evitada durante en la manipulacin de los cultivos.
En el sistema evacuacin-reemplazo el aire del frasco es extrado y reem-
plazado por una mezcla de 85% de Nz' 10% de Hz y 5% de COz;este sistema es
ms econmico que el generador de gas y permite que las condiciones anaerobias
se establezcan rpidamente (Holdeman et al., 1977).
(AMARA DE ANAEROB/OSIS. Sistema anaerbico autoabastecido que permite la mani-

pulacin de bacterias por medio de dos guantes fijados hermticamente y propor-
ciona una atmsfera de gases controlada con 85% de Nz' 10% de Hz y 5% de COz
(Figura 5.6). El material se introduce o se retira de la cmara mediante un dispo-
sitivo de intercambio de gases que, por lo general, es un compartimiento anexo a
la cmara, de material rgido, con una puerta interior que comunica a la cmara y
una exterior. Las cmaras de anaerobiosis pueden contar con incubadora,
indicadores de potencial redox (azul de metileno, usualmente) y esterilizador de
asas por electricidad (ver Anexo 4).
Figura 5.6. Cmara de anaerobiosis.
GASES LIBRES DE OXIGENO
En los laboratorios de microbiologa anaerobia se utiliza gases de alta pureza como:

Nz' Hz, COz' mezclas Nz-COz (80-20%) y Hz-COz (80 -20%). El sistema de distribu-
cin utilizado, que se ilustra en la Figura 5.7, es el 'manifold' descrito por Ba/ch el al.
(1979). Los gases pueden contener algunas trazas de oxgeno las cuales pueden
ser removidas haciendo fluir el gas por una columna de vidrio empacada con cobre
la cual es calentada a 3500( con electricidad, las trazas de oxgeno se combina con
el cobre y este es oxidado tomando una coloracin negra. El cobre puede ser rege-
nerado haciendo pasar hidrgeno por unos pocos minutos (3% de Hz, y 97% de
COz)a travs de la columna de cobre calentada (Holdeman el al., 1977).
Figura 5.7. Sistema de distribucin de gases.
AGENTES REDUCTORES
Las bacterias anaerobias estrictas, grupo al que pertenecen las bacterias

metanognicas, requieren de un ambiente totalmente exento de oxgeno puesto
que el este gas acta como un txico o como un inhibidor del crecimiento del
grupo de bacterias anaerobias estrictas; de otro lado las bacterias metanognicas
exigen tambin condiciones reductoras en el medio( ~330 mv).
Estos requerimientos obligaron a desarrollar tcnicas especiales (Hungate,
1969; Wolfe, 1976; Balch y otros, 1979). dichas tcnicas se apoyan en la aplica-
cin de dos principios fundamentales:
1. Exclusin total de trazas de oxgeno en la preparacin y almacenamiento de los
medios de cultivo.
2. Mantenimiento de condiciones reductoras estrictas en dichos medios de cultivo.
El mtodo ms simple para evitar la contaminacin con oxgeno del me

de cultivo, consiste en hervir y enfriar el medio bajo un flujo de gas inerte como
o una mezcla Nz/COz;posteriormente se distribuye el medio en los viales, as m
mo en presencia de dichos gases. Una vez distribuido el medio se realiza el ca
bio de la fase gaseosa para asegurar que cualquier traza de oxgeno presente
la misma desaparezca; por ltimo, la manipulacin de los medios se realiza dent
de la cmara anaerobia o utilizando jeringas y agujas hipodrmicas previamen
purgadas con Nz.
La sola remocin de las trazas de oxgeno del medio de cultivo r
asegura las condiciones reductoras necesarias, por lo que se requiere ad
cionar al medio uno o varios compuestos reductores que permitan manten{
un potencial redox adecuado para el crecimiento de las poblaciones anaerobia
(Tabla 5.4).
Generalmentese utilizan dos agentes reductores: la cistena-HCI,que se agre
ga al preparar el medio, y el sulfuro de sodio, que se agrega a cada tubo o botell
antes de inocular para garantizar las condiciones de anaerobiosis adecuadas.
Tabla 5.4. Caractersticas de algunos compuestos reductores
Compuesto Potencial redox estndar (mV)
Thioglicolato de sodio -100 005

----------------''--------------'
Cistena-HCI I
-210 0.05
Dithiothreitol i -330 0.05
Titanio 111citrato -480 0.5 a 2.0
-571 0.05
INDICADORES DE ANAEROBIOSIS
Las condiciones de anaerobiosis se controlan mediante un agente indicador de

oxido-reduccin. Para este propsito, se dispone en el comercio de tiras de
azul de metileno o tambin se puede preparar una mezcla de azul de metileno-
glucosa (Anexo 4); el azul de metileno (AM) es azul cuando est oxidado e
incoloro cuando est reducido. Cuando el azul de metileno es incoloro el poten-
cial redoxen este punto es cercano a -230m\'. A pH alcalino y a una temperatu-

ra mayor de 3]OC, la glucosa reduce el azul de metileno a una forma transpa-
rente. (Holdeman el al., 1977)
Azul de melileno + Glucosa Azul de melileno + cido glucornico

oxidado CALOR reducido
(azul) (reductora) (incoloro)
Los indicadores generalmente se mantienen incoloros en condiciones

reductoras y se colorean en condiciones oxidantes. Otro indicador de uso general
en la preparacin de medios de cultivos prereducidos es la resarzurina, la cual
presenta un color rosado a un Eh cercano de -SOmV y es incolora a -10m\'.
Resarzurina Reduccin Resorufin Reduccin Oihidroresorulin

(azul/morado) (rosado) (transparente)
Oxidacin
Al igual que los agentes reductores, los indicadores redox pueden ser txi-
cos para algunas bacterias; por lo tanto, debe ser utilizado en concentraciones
muy bajas en los medios. La resarzurina se utiliza a una concentracin aproxima-
da de 1mg/L .
MATERIAL DE VIDRIO
La vidriera utilizada en microbiologa anaerobia se ilustra en la Figura 5.S;

incluye botellas de suero de diferente volumen, tubos de alta presin y tubos
Hungate, los cuales tienen tapa rosca y un septo de caucho. El material de
vidrio se tapa con tapn de caucho de butyl y sello metlicos, de 20 mm de
dimetro; se utiliza la agrafadora y la desagrafadora para colocar y retirar los
sellos metlicos respectivamente.
Figura 5.8. Material de vidrio: agrafador, desagrafador, tapones, agrapes y

viales de cultivo.
INOCULACiN y TRANSFERENCIA DE SOLUCIONES
Los tubos y botellas utilizados en la manipulacin de bacterias anaerobias se

sellan con tapones de caucho, lo cual asegura las condiciones de anaerobiosis
y permite agregar soluciones e inocular utilizando jeringas estriles gaseadas
con Nz. Para realizar la inoculacin o transferencias de soluciones se utilizan
generalmente jeringas de 1 mi tipo 'tuberculina'; antes de tomar cualquier lqui-
do, el aire contenido en la jeringa se debe purgar con Nz' para lo cual se intro-
duce la aguja de la jeringa dentro de otra aguja de dimetro mayor, previamente
esterilizada, realizando varias succiones de Nz para desalojar el aire; posterior-
mente, se toma la solucin deseada. Al inocular o transferir soluciones se tienen
los cuidados normales para evitar la contaminacin de estos medios (flamear
los tapones, agujas y trabajar cerca de la llama); la Figura 5.9 ilustra el proce-
dimiento de inoculacin y transferencia de soluciones.
N2
Purgar la jeringa
con N2
cerca de la llama
Flamear el tapn. Agua

Inocular destilada
con jeringa
cerca de la llama.
Tomado de Alazard el al., 1997
Figura 5.9. Inoculacin y transferencia de soluciones.
TRANSfERENCIA DE COLONIAS. El aislamiento de bacterias anaerobias estrictas re-

quiere de un manejo especial para evitar el contacto con el oxgeno; a tal fin se
realizan pases consecutivos de medio slido a medio lquido hasta obtener un
cultivo puro.
Para la inoculacin en medio slido se utiliza la tcnica del ro//-tube
(tubo rodado). Los viales que contienen el medio slido se llevan a un bao
serolgico a SOO( para evitar que se solidifiquen; con ayuda de una jeringa
hipodrmica y su aguja, se inocula O.S mi de la dilucin seleccionada del re-
cuento realizado inicialmente; es necesario evitar la formacin de burbujas.Luego
el tubo es rodado lentamente hasta obtener una capa uniforme del medio slido
sobre las paredes del tubo. Los tubos rodados son incubados en posicin inver-
tida para que el agua de condensacin pueda ser removida posteriormente.
Para la transferencia de las colonias, se seleccionan aquellas bien desa-
rrolladas sobre la superficie del medio en el ro//-tube, y son transferidas al
medio lquido con la mnima cantidad de agar alrededor de la colonia. Para ello,
y bajo condiciones aspticas, se remueve el agrafe y el tapn, se flamea la boca
Purgar la jeringa
con N2
cerca de la llama
Flamear el tapn. Agua

Inocular destilada
con jeringa
cerca de la llama.
~
Tomado de AJazard el al, 1997

B
Figura 5.9. Inoculacin y transferencia de soluciones.
TRANSFERENCIA DE COLON/AS. El aislamiento de bacterias anaerobias estrictas re-

quiere de un manejo especial para evitar el contacto con el oxgeno; a tal fin se
realizan pases consecutivos de medio slido a medio lquido hasta obtener un
cultivo puro.
Para la inoculacin en medio slido se utiliza la tcnica del ro//-tube
(tubo rodado). Los viales que contienen el medio slido se llevan a un bao
serolgico a 50 0
( para evitar que se solidifiquen; con ayuda de una jeringa
hipodrmica y su aguja, se inocula 0.5 mi de la dilucin seleccionada del re-
cuento realizado inicialmente; es necesario evitar la formacin de burbujas.Luego
el tubo es rodado lentamente hasta obtener una capa uniforme del medio slido
sobre las paredes del tubo. Los tubos rodados son incubados en posicin inver-
tida para que el agua de condensacin pueda ser removida posteriormente.
Para la transferencia de las colonias, se seleccionan aquellas bien desa-
rrolladas sobre la superficie del medio en el ro//-tube, y son transferidas al
medio lquido con la mnima cantidad de agar alrededor de la colonia. Para ello,
" h"i" rnnriirinnpc; rlsoticas. se remueve el agrafe y el tapn, se flamea la boca
del vial e inmediatamente se inserta una aguja a travs de la cual fluye el nitr-
geno; la aguja debe estar adaptada a una jeringa empacada con fibra de vidrio
estril (Figura 5.10).
FIBRA DE VIDRIO
Figura 5.10. Jeringa empacada con fibra de vidrio para el saseo de los viales.
Usando una pipeta de Pasteur estril, con su punta doblada y preferible-

mente gaseada con nitrgeno, y valindose de la ayuda de'una chupeta, se toma
la colonia marcada sobre la superficie del vial y se transfiere a un vial con medio
lquido el cual ha sido conectado al sistema de gaseo con nitrgeno; inmediata-
mente despus se tapa y agrafa, procedimiento que ilustra la Figura 5.11.
(Holdeman et al., 1977).
o O O
O
'-- __ O-----J ~
Tomado de Esp~ia. 1999.
Figura 5.11. Transferencias de colonias a medio liquido.

CARACTERIZACiN DE LODOS ANAEROBIOS Y AGUAS RESIDUALES [12j
COMPOSICiN MICROBIOLGICA
Existen varios mtodos para realizar la caracterizacin y la cuantificacin de la

composicin microbiolgica de los lodos. Los mtodos convencionales para la ca-
racterizacin del lodo se basan en el crecimiento de las diferentes poblaciones en
medios selectivos. En primer lugar est la tcnica del Nmero Ms Probable (NMP),
en la cual diluciones seriadas del lodo son inoculadas en medios selectivos; con este
mtodo se maneja un intervalo de confianza del 95% y brinda informacin de la
proporcin de cada poblacin bacteriana presente en el lodo (Beliaeff y Mary, 1993).
Elanlisisde microscopadirecta ha sido utilizado durante la caracterizacin de
lodos, para determinar la estructura de los grnulos y las biopelculas.Algunas tcnicas
permiten realizar la visualizacin directa, otras requieren de la fijacin y teido del lodo
previa al examen. Esta tcnica presenta el inconveniente de basarse solamente en la
morfologa, lo cual no siempre permite identificar las bacterias con exactitud. La
epifluorescencia permite identificar las bacterias metanognicas gracias a la fluores-
cencia producida por el factor 420; sin embargo, tiene el inconveniente de que algunos
microorganismos metangenos no exhiben fluorescencia (Doddema y Vogels, 1978).
Otro mtodo es la determinacin de la velocidad de conversin de sustratos
a metano (AME) el cual es frecuentemente utilizado para la caracterizacin de la
biomasa del lodo, ya que proporciona informacin sobre la mxima actividad
metablica posible de los diferentes grupos microbianos presentes en el lodo; sin
embargo no ha sido utilizada para la identificacin y cuantificacin de los
microorganismos.
A pesar de las limitaciones de las tcnicas convencionales descritas ante-
riormente, estas han sido utilizadas con xito para la caracterizacin de las comu-
nidades microbianas de los lodos, han permitido un mayor entendimiento de las
diferentes reacciones metablicas que se llevan a cabo entre las poblaciones den-
tro del reactor y, por lo tanto, contribuyen a mejorar el dominio de esta tecnologa
(Zinder, 1998; Oude Elferink, 1994).
Los avances en las tcnicas de caracterizacin microbiolgica han permi-
tido disponer de diversos mtodos como la inmunodeteccin (ELlSA), los
biomarcadores (RNA ribosomal; amplificacin de secuencias de la fraccin 165 del
rRNA mediante reaccin en cadena de la polimerasa, PCR) y los anlisis de

composicin lipdica de las membranas, para llevar a cabo una identificacin
recta de los microorganismos en los lodos (Oude Elferink, 1994). Cabe mencior
que, si bien estas tcnicas permiten una rpida identificacin de los represent
tes de las poblaciones microbianas presentes en el lodo, no evala la capacid
de estas poblaciones para producir metano a partir de diferentes sustratos. En
Tabla 5.5 se especifican las principales poblaciones microbianas que son cuant
cadas en los estudios de caracterizacin micr.obiolgica de los lodos.
A travs de los recuentos microbiolgicos se realiza la estimacin del to
de las poblaciones presentes y del nmero de representantes para cada pob
cin. Para ello se utilizan las siguientes tcnicas:
Recuento total de bacterias con naranja de acridina.
Estimacindel nmero ms probable (NMP) de representantes de cada poblacic
Recuento total de la poblacin metanognica por epifluorescencia (factor 42(
RECUENTO MICROBIOLGICO TOTAL
La metodologa utilizada es la
descrita en el Standar Methods
(1992). La poblacin total se es-
tima a travs de la extrapolacin
del promedio de varios conteos
directos, realizados por mi-
croscopa de epifluorescencia
sobre unfiltro de nucleopore (0.2
~m), en el cual previamente se
filtran la dilucin del lodo selec-
cionada y se colorea con naranja
de acridina (ver Anexo 2).
Figura 5.12. Microscopio de

epifluorescencia.
Tabla 5.5. Caracterizacin microbiolgica de lodos utilizados en el tratamiento de

diferentes tipos de agua residual por la tcnica del NMP
Grupos Domstica Matadero Vinaza Refineria de Reflneria de Procesadora Palma Cerveceria

microbianos (Ramrezet (Ramirezel (Ramirezet azcar azcar de papa africana (Wuelal.
al. 1996)" al. 1996)" al. 1996)" (Grotenhuis (Ooflingel (Wuelal. (Espitia el 1993)"""
elal. al. 1985)"" 1993)""" al. 1998)"
1991)""
8acterias
fermentativas
(Glucosa) 2 x lO' 3 X lO" 3 x 10' 2.1 x 10" lO" 2.7 x 10' 5x 10' 1.9 X lO"
(Lactosa) 2x lO' 5 x 10' 4 x 10' 5.6 x 10' 11 x 10' 1.2 x lO"
Bacterias
sulfato
reductoras
(Acetato) 1 x 10' 1 x 10' 2 x 10' 2 x 10' 3.4 X lO"
(Lactato) 1xl0' 3 x 10' 4 x 10' x 10' 6.8x lO"
Bacterias
acetognicas
Propionato 2 x 10' 4 x 10' 2.4 x 10' lO' 6.6x lO" 5 x 10'
Butirato 4 x lO' 2 x 10' lO' 4.2 X lO" x 10'
Etanol 1.5 x 10'
Bacterias
metanognicas
Acetato 2 x lO' 1 x 10' 2 x 10' 2.4 x 10' 10' 1.3 x 10" 3 x lO' 6.6 X lO"
Hidrgeno 8 x 10' 2 x 10' 2 x 10' 9.0 x 10' 10' 3.5 x 10" 5 X lO' 1.3 x 10"
Formato 2.0 x 10' 2.0 x 10" 4.7 x 10"
Metanol 4.3 x 10' 3.1 x lO"
No.de baderiasl 9 SSV No.de baderiasl mi No.de baderiasl 9 SS
El microscopio est dotado de un ocular micromtrico de 100 divisiones,

sobre el cual las bacterias coloreadas por el naranja de acridina toman una tona-
lidad verde-amarilla que presenta fluorescencia; se realizan varios conteos, cuyo
promedio se extrapola al rea del filtro, dividiendo dicho resultado por la biomasa
filtrada; as, se obtiene el nmero total de bacterias por gramo de SSVde lodo.
ESTIMACiN DEL NMERO DE REPRESENTANTES DE CADA POBLACiN
Se realiza mediante la tcnica del nmero ms probable (NMP), descrita en el

5tandar Methodsdiferenciando los siguientes grupos segn los medios de cultivo
utilizados para cada poblacin:
Bacterias fermentativas (BF).
Bacterias sulfatoreductoras (BSR).
Bacterias sintrficas (BS).
Bacterias metanognicas (BM).
A su vez, para cada pblacin se cuantifican el nmero de representantes

con diferentes sustratos. La Tabla 5.6 resume los sustratos utilizados para cada
poblacin, el periodo de incubacin y los parmetros para detectar la positividad
de los tubos sembrados.
Se realizan diluciones seriadas del lodo en el medio correspondiente. La
dilucin 10-1 de la muestra de lodo previamente mezclada y homogenizada (me-
diante un homogenizador de tejidos) se realiza en la cmara de anaerobiosis o
bajo una fuente de nitrgeno. Las dems diluciones se realizan fuera de la cmara
con jeringas gaseadas con nitrgeno. Se inoculan tres o cinco tubos por cada
dilucin, adicionalmente se incuban para cada poblacin tubos sin inculo como
control del medio (ver Anexo 3).
Las concentraciones de sustratos recomendadas para las bacterias
metanognicas fueron: formato de sodio 4g/L y metanol 4 ml/L para las bacterias
acetognicas; etanoI20-30mM/L para las sulfato reductoras; propionato 1 mi de una
solucin de cido propinico neutralizado, butirato, 1 mi de una solucin neutralizada
de cido butrico, el metanol y etanol 1 mi de una solucin stock de 6M y 1M respecti-
vamente (Whitman, 1992; Widdel, 1992; Hickey 1991).
Tabla 5.6. Principales caracteristicas de la determinacin del NMP de acuerdo con el

metabolismo bacterial de los grupos relacionados con la digestin anaerobia
Grupo Sustrato Periodo de Incubacin Deteccin tubos positivos

35'C (dias)
Bacterias fermentativas de la glucosa (BFG) y Glucosa 5a8 Acidificacin dei medio. cambio de
Lactosa (BFG) color verde a amarillo
Bacterias fermentativas del lactato (BFL) Lactosa 5a8 Acidificacin del medio. cambio de
color verde a amarillo
8acterias sulfatoreductoras del lactato (BSRL) Lactato 7 a 15 Produccin de feS, coloracin negra
Bacterias sulfatoreductoras del acetato (BSRA) Acetato 7 a 15 Produccin de FeS, coloracin negra
Bacterias sintrficas del propionato (BSP) Propionato 30 a 60 Deteccin de metano por

cromatografa
Bacterias sintrficas del butirato (BSB) Butirato 30 a 60 Deteccin de metano por

cromatografa
Bacterias metanognicas hidrogenoflicas (BMH) H/eD, 15 a 45 Deteccin de metano por

cromatografia
Bacterias metanognicas acetoclsticas (BMA) Acetato 30 a 60 Deteccin de metano por

cromatografa
Para la estimacin de la poblacin metanognica del Hz-e0z' se realiza el

intercambio de gases con esta mezcla (80%-20%). Cada tres das se gasean los
tubos inoculados. Para la poblacin fermentativa, sintrfica y metanognica,
acetoclstica y sulfatorreductora, el intercambio de fase se realiza con mezcla
Nz-COz (80%-20%).
Para el aislamiento de bacterias de las diferentes poblaciones cuantifica-
das por la tcnica del NMp, a partir de la ltima dilucin donde todos los tubos
fueron positivos, se toma 0.2-0.5 mi y se inoculan medios de cultivo slidos (agar-
agar 2% para bacterias mesoflicas o 3% para bacterias termoflicas) para cada
poblacin y se aplica la tcnica del tubo rodado, de tal forma que las colonias
crecen sobre el agar en las paredes del tubo.
AISLAMIENTO DE BACTERIAS METANOGNICAS
Para la inoculacin de los medios slidos se deben mantener a 50C en un bao

serolgico. A esta temperatura
, adicionar las vitaminas, agente reductor e inoculo
en condiciones de esterilidad con jeringas gaseadas con nitrgeno. Se homogeniza
suavemente y se rodan bajo un chorro de agua fra. Se incuban en posicin inver-
tida por el tiempo necesario para obtener colonias, el agua de condensacin es
retirada con una aguja gaseada con nitrgeno. Las colonias posteriormente son
transferidas, dentro de la cmara de anaerobiosis o bajo una fuente de nitrgeno
con pipetas de Pasteur estriles dobladas en la punta, a medios de cultivo lquidos
(el mismo medio que se utiliz para el aislamiento). Fuera de la cmara se realiza
intercambio de fase con jeringas empacadas con fibra de vidrio y estriles para
evitar una posible contaminacin. El aislamiento de las colonias se obtiene me-
diante repiques sucesivos.
La pureza de los cultivos es confirmada inoculando el aislado en medio
slido donde se deben obtener colonias de un solo tipo, tambin se chequea la
ausencia de contaminantes aerobios u otro tipo de anaerobios inoculndolo en un
caldo nutritivo donde se inhiba el crecimiento de las bacterias en estudio y se
favorezca el crecimiento de los posibles contaminantes.
Para el aislamiento de bacterias metanognicas es necesario utilizar me-
dios selectivos que proporcionen las fuentes de carbono y energa que requiere la
Para la estimacin de la poblacin metanognica del H2-C02, se realiza el

intercambio de gases con esta mezcla (80%-20%). Cada tres das se gasean los
tubos inoculados. Para la poblacin fermentativa, sintrfica y metanognica,
acetoclstica y sulfatorreductora, el intercambio de fase se realiza con mezcla
N2-C02 (80%-20%).
Para el aislamiento de bacterias de las diferentes poblaciones cuantifica-
das por la tcnica del NMp, a partir de la ltima dilucin donde todos los tubos
fueron positivos, se toma 0.2-0.5 mi y se inoculan medios de cultivo slidos (agar-
agar 2% para bacterias mesoflicas o 3% para bacterias termoflicas) para cada
poblacin y se aplica la tcnica del tubo rodado, de tal forma que las colonias
crecen sobre el agar en las paredes del tubo.
AISLAMIENTO DE BACTERIAS METANOGNICAS
Para la inoculacin de los medios slidos se deben mantener a 50C en un bao

serolgico. A esta temperatura adicionar las vitaminas, agente reductor e inoculo
,
en condiciones de esterilidad con jeringas gaseadas con nitrgeno. Se homogeniza
suavemente y se rodan bajo un chorro de agua fra. Se incuban en posicin inver-
tida por el tiempo necesario para obtener colonias, el agua de condensacin es
retirada con una aguja gaseada con nitrgeno. Las colonias posteriormente son
transferidas, dentro de la cmara de anaerobiosis o bajo una fuente de nitrgeno
con pipetas de Pasteur estriles dobladas en la punta, a medios de cultivo lquidos
(el mismo medio que se utiliz para el aislamiento). Fuera de la cmara se realiza
intercambio de fase con jeringas empacadas con fibra de vidrio y estriles para
evitar una posible contaminacin. El aislamiento de las colonias se obtiene me-
diante repiques sucesivos.
La pureza de los cultivos es confirmada inoculando el aislado en medio
slido donde se deben obtener colonias de un solo tipo, tambin se chequea la
ausencia de contaminantes aerobios u otro tipo de anaerobios inoculndolo en un
caldo nutritivo donde se inhiba el crecimiento de las bacterias en estudio y se
favorezca el crecimiento de los posibles contaminantes.
Para el aislamiento de bacterias metanognicas es necesario utilizar me-
dios selectivos que proporcionen las fuentes de carbono y energa que requiere la
bacteria que se desea aislar; as, cuando se quiere aislar bacterias metanognic.
hidrogenoflicas, se utiliza Hz/COzcomo fuente de carbono. Durante la incubaci
el espacio de cabeza es analizado para determinar la produccin de metano pi
cromatografa de gases. Cuando se obtiene un resultado positivo se examina
cultivo por epifluorescencia; si se observa una fluorescencia azul-verdosa, el
indica la presencia de bacterias metanognicas (BM), pero es necesario tener e
cuenta que no todas las BM muestran esta fluorescencia. El uso de antibitico
como kanamicina y vancomicina, entre otros, ayuda a reducir la contaminaci
con bacterias no metanognicas durante el aislamiento.
AGUAS RESIDUALES
Muestreo
,
La toma de muestras del residuo debe enmarcarse en la metodologa de carac-
terizacin de aguas residuales; sta consta generalmente de cinco etapas (es-
tablecimiento de objetivos, informacin bsica, seleccin de sitios de aforo y
muestreo, programa de aforo y muestro, registro e interpretacin de resulta-
dos), las cuales se especifican a continuacin.
Objetivo de la caracterizacin. En este caso, el objetivo de la caracteriza-
cin responde a obtener las caractersticas fundamentales del residuo antes y
despus del sistema anaerobio de tratamiento biolgico. De esta manera se pue-
de evaluar la eficiencia del sistema y realizar los balances bsicos de materia
orgnica, slidos y nutrientes. Debe incluirse la medicin y caracterizacin del
biogas generado en el proceso.
Informacin bsica para la caracterizacin. La informacin bsica esta rela-
cionada con las caractersticas del sistema de tratamiento, tales como: tipo de siste-
ma, cargas hidrulica y orgnica, volumen y tiempo de retencin hidrulico, origen
del residuo, procesos preliminares (rejas, desarenado, sedimentacin primaria).
Seleccin de sitios de aforo y muestreo. Con el fin de evaluar la eficiencia
del sistema de tratamiento, los sitios de aforo y muestreo se localizan al ingreso
del sistema y a la salida del mismo. Normalmente se cuenta con algn dispositivo
de aforo que permite determinar el caudal afluente y efluente del sistema. De
otro lado, en sistemas anaerobios de tratamiento de aguas residuales, la medi-
cin y caracterizacin del biogas generado en el proceso es fundamental para
realizar los balances de materia orgnica e identificar la eficiencia en su remo-
cin; por lo tanto, se debe prever dicha medicin en el programa de caracteri-
zacin del residuo.
Elaboracin del programa de aforo y muestreo. En la etapa de planifica-
cin del muestreo se debe definir si se toman muestras puntuales o una mues-
tra compuesta; por lo general, cuando se quiere evaluar la calidad del residuo y
la eficiencia del sistema, se trabaja con muestras compuestas; esta muestra se
compone a partir de muestra puntuales, mezclndolas en forma proporcional al
flujo o al tiempo. La muestra debe tomarse en recipientes limpios y refrigerarse
a 4C hasta su anlisis, los parmetros ms importantes a analizar son la De-
manda Qumica de Oxgeno (DQO), la Demanda Bioqumica de Oxgeno (DBO) y
los Slidos Suspendidos (SST y SSV). La medicin de biogas generalmente se
realiza con medidores continuos tipo gasmetro seco, como los utilizados en
las redes de gas natural.
Registro e interpretacin de resultados. La calidad con que se realice todo
el proceso de caracterizacin del residuo influye directamente en los resultados
del mismo; as, los aspectos ms sobresalientes para tener en cuenta son:
representatividad de la muestra, tcnicas de muestreo apropiadas, adecuado
manejo y preservacin de muestras y anlisis de datos desde los aspectos ms
relevantes. Generalmente, el anlisis se fundamenta en determinar las cargas hi-
drulica, orgnica y de slidos que ingresan al sistema, as como en evaluar la
eficiencia del sistema para remover materia orgnica y slidos. Otro aspecto im-
portante en el anlisis es la estabilidad del pH en el sistema, as como la evolucin
de los cidos grasos voltiles (AGV). Dichos parmetros influyen directamente en
el desempeo del proceso de digestin anaerobia: la tasa de degradacin
anaerobia es mxima en la faja neutra, cerca del pH = 7, pero si el pH toma
valores menores de 6.3 o mayores de 7.8, la tasa de metanognesis disminuye
drsticamente (Van Handel v I pttinn~ 1 qqL1\
Demanda Qumica de Oxgeno
La determinacin de la DQO,tanto en el afluente como en el efluente del sistem

permite evaluar la tasa de remocin de la materia orgnica. Para completar el CU
dro de transformacin de la materia orgnica en un reactor anaerobio, se requier
cuantificar y caracterizar el biogas generado en el proceso. Segn las caracterstiC
del residuo y el proceso de tratamiento, la DQOpuede presentarse de varias man(
ras: soluble, insoluble, biodegradable y resistente. En el proceso de degradacin,
DQO biodegradable est constituida por las fracciones acidificada, celular
metanogenizada. La suma de la DQOresistente y la acidificada en el efluente, repn
senta la DQO no removida; mientras que la sumatoria de la DQO celular y
metanogenizada conforma la DQOremovida. La Figura 5.1 3 representa esqueml
camente el balance de DQOen el proceso de degradacin anaerobia.
DQOCH. -DQO
Figura 5.13. Balance de DQO en el proceso de degradacin anaerobia.
FUNDAMENTO TERICO
La metodologa para la determinacin de la demanda de oxgeno se fundamen

en una oxidacin de la materia orgnica presente en la muestra en medio cid
para lo cual se utiliza una mezcla de dicromato de potasio en exceso y cic
sulfrico, en presencia de un catalizador y alta temperatura. Luego de la dige
tin, se valora el exceso de dicromato de potasio y por lo tanto se determina
cantidad de materia orgnica oxidada en trminos de equivalentes de oxgeno.
METODOLOGAS
Con respecto a la forma en que se realiza la digestin y oxidacin de la materia

orgnica, los mtodos de determinacin se clasifican en aquellos de reflujo abierto y
los de reflujo cerrado. Los primeros, referenciados bajo el mtodo 5220B en los
Mtodos normalizados para el anlisis de aguas potables y residuales (APHA, 1998),
requieren de un cantidad importante de muestra y de los compuestos qumicos
utilizados en la determinacin; adems, para concentraciones bajas de DQO, no
presentan buena exactitud. El otro mtodo es el de reflujo cerrado, ms econmico
en el uso de reactivos y con buena exactitud para concentraciones bajas de DQO,
siempre y cuando dichas concentraciones estn por encima de 50 mg/1.
Con relacin al mtodo de valoracin del dicromato de potasio en exceso
se dispone de dos mtodos: el titulomtrico y el colorimtrico. El primero,
referenciado como el mtodo 5220C en los Mtodos Normalizados para el anlisis
de aguas potables y residuales (APHA, 1998), consiste en una titulacin del
dicromato de potasio en exceso en presencia de indicador de ferrona, utilizando
una solucin valorada de sulfato ferroso amoniacal; por su parte, el mtodo
colorimtrico, referenciado como 5220D en el mismo manual de referencia, re-
quiere cantidades pequeas de muestra y de reactivos, y para su implementacin
debe usarse un espectrofotmetro y una curva de calibracin que se obtiene a
partir de una solucin estndar de ftalato hidrgeno de potasio.
cidos grasos voltiles

MTODO 1. CIDOS GRASOS VOLTILES POR TITULACiN
La medicin de los AGVtambin puede ser realizada por titulacin, mtodo por el
cual se determina el bicarbonato y los cidos grasos voltiles en soluciones acuo-
sas. La muestra centrifugada o filtrada se lleva a pH 3.0 con HCI0.1 N; a este pH,
el bicarbonato ser convertido en COzy los AGVestarn presentes en solucin en
la forma no ionizada. Despus de ebullir la solucin bajo condensador, para remo-
ver el COz' la solucin se titula con NaOH 0.1 N hasta pH 6.5. Los AGV (y quizs
algunos otros cidos orgnicos) sern convertidos ahora a su forma disociada.
Los equivalentes de bicarbonato y AGVse pueden calcular a partir de los volme-

nes de cido y base utilizados en la titulacin. (Rojas, 1988).
Las aguas residuales que contienen compuestos oscuros coloreados necesitan
ser evaluadas para corregir la acidez preexistente debida a cidos orgnicos que no
son voltiles, generalmente cidos hmicos y compuestos acaramelados. Una vez co-
nocida esta acidez, la concentracin verdadera de AGVpuede ser calculada:
ACV verdaderos(meq/I) = ACV (meq/I) - Acidez preexistente (meq/t)
El procedimiento se realiza de la siguiente manera: la muestra se centrifuga

por cinco minutos a 5000 rpm o se filtra a travs de papel filtro, se deja decantar
y el sobrenadante se lleva a un recipiente graduado. Posteriormente, se agrega
agua destilada hasta un volumen de 100 mi, cuando el pH es mayor de 6.5 se
aade cido hasta lograr un pH de 6.5, enseguida se titula con cido clorhdrico
0.1 N hasta pH 3.0 (el consumo se registra como A).
Posteriormente la muestra se coloca en un baln de digestin con co-
nexiones de vidrio esmerilado, se aaden algunas perlas de vidrio de ebullicin y
se conecta el baln al condensado. De esta forma se elimina por calentamiento el
bicarbonato como COz' mientras que se preservan los AGV que han sido
volatilizados por condensacin. Se calienta el baln hasta que el lquido empieza a
ebullir y se deja as tres (3) minutos. Se interrumpe el calentamiento y se espera
dos (2) minutos, entonces se titula inmediatamente hasta lograr un pH 6.5 con
NaOH0.1 N (este consumo se registra como B). No es necesario enfriar el lquido
(Field, 1987). Los meq/I de AGVse calculan de la siguiente, manera:
Voltlmende base gastada (B) x O.lmeq = meq ACV

meq ACV / Volumen de muestra V(mt) x 1000 = meq/I ACV
Volttmellde cido gastado (A) x O.1meq = meq de Acidez total
meq de Acidez total/Volumen de muestt'a V(ml) x 1000 = meq/I Acidez total
meq/I Acidez total - meq/I ACV = meq/I bicarbonato.
CARACTERIZACiN DE LODOS ANAEROBIOS Y AGUAS RESIDUALES [13'
MTODO 2. CIDOS GRASOS VOLTILES POR CROMATOGRAFfA
Para la determinacin de cidos grasos voltiles, la muestra se toma aspticamente

del cultivo, se acidifica y extrae con ter; el extracto de ter es utilizado para la
lectura por cromatografa.
La sal a partir del cido es soluble en agua pero no en ter. A bajo pH (por
ejemplo, pH 2.0) los cidos se encuentran en la forma de cido libre, la cual es
soluble en agua y ter. Por esta razn las muestras para el anlisis cromatogrfico
son acidificadas a pH 2.0 o menor con una solucin acuosa de H2SO4 al 50%
previamente a la extraccin.
Para su anlisis la muestra (1 mi) se mezcla con 0.2 mi de H2S04 al 50%,
O.4g de NaO y 1 mi de etil ter, mezclar, centrifugar y retirar la capa de ter, a esta
adicionar CaCL2para remover agua disuelta en el ter. Inyectar en el cromatografo el
extracto de ter para su anlisis. Se utiliza un cromatgrafo de gases, equipado con
detector de conductividad trmica, columna de aluminio o acero inoxidable de 6 1/
4
de pulgada, empacada con Supelco 1OOO,o 5% de FFAPsobre Chromosorb-G y

como gas de arrastre se utiliza helio.
La solucin estndar de los cidos grasos voltiles se prepara: 1meq de
Ca/1 OOmlde solucin acuosa: cido frmico: 0.037ml, actico 0.057ml, propinico
0.075mL y butrico 0.091 mi (Holdeman et a/., 1977).
Biodegradabilidad del residuo

FUNDAMENTO TERICO
Existen dos tipos de procesos para el tratamiento de aguas residuales: los

fisicoqumicos y los biolgicos. Los primeros son aplicados a aguas con contami-
nantes inorgnicos o con materia orgnica no biodegradable. Los procesos biol-
gicos aerobios y anaerobios son utilizados cuando los principales contaminantes
son biodegradables.
La prueba de biodegradabilidad anaerobia permite evaluar el potencial de
degradacin de la materia contaminante en un agua residual hasta metano (CH4)
y dixido de carbono (C02). Con esta prueba se puede determinar:
La velocidad de reaccin (tasa de biodegradabilidad).

Porcentaje mximo de biodegradabilidad.
El efecto de la carga orgnica.
Detectar efectos inhibitorios.
El mtodo se basa en medir a lo largo del tiempo (30-45 das) la produc-
cin de metano generado dentro de un reactor batch con medio mineral, lodo
metanognico activo y la muestra problema. En esta prueba se puede determinar
si los microorganismos son capaces de llevar a cabo la degradacin de la materia
orgnica, lo cual permite hacer una aproximacin al comportamiento y la veloci-
dad de reaccin de las bacterias en un tratamiento continuo.
MATERIALES y EQUIPOS
Botellas serolgicas de 160ml con tapones de hule y sellos de aluminio.

Lodo metanognico activo.
Cromatografa de gases equipado con columna para la determinacin de metano.
Anlisis de OQO (ver seccin respectiva).
Anlisis de cidos grasos voltiles (ver seccin respectiva).
Anlisis de slidos suspendidos voltiles (ver seccin respectiva).
Incubadora a 35C.
Medio mineral de Batch (Anexo 1).
REACTORES
Las pruebas de biodegradabilidad se realizan en botellas serolgicas de 160 mi con

un volumen de fase gaseosa del 30% del volumen total. El medio mineral se adiciona
para asegurar que no se presente limitacin por nutrientes, las botellas con el medio
se esterilizan previo a la adicin del lodo y del agua residual de prueba.
INCULO y ARRANQUE
El agua residual a estudiar se debe caracterizar mediante la determinacin de

slidos totales, voltiles y fijos; en sus formas totales (ST), suspendidos (SS) y
disueltos (SO), Demanda Qumica de Oxgeno (DQO) total y soluble. Cuando el
agua residual tiene un pH cido se debe neutralizar.
Aliado metanognico activo que se va a utilizar como inculo se le determi-

nan los slidos suspendidos voltiles. Estos datos, junto con la DQO del agua, son
necesarios para calcular las cargas orgnicas de prueba. Durante el ensayo se debe
montar una botella testigo (Iodo y medio mineral nicamente) para corregir la pro-
duccin de gas generada por el lodo solo y obtener la produccin neta de metano.
PROCEDIMIENTO
Aunque depende de la actividad metanognica del lodo y del volumen total de la

fase lquida en el vial de ensayo, la mayora de los autores recomiendan utilizar una
concentracin de lodo suficientemente alta para mantener un exceso (5 gSSV/1),
pero suficientemente baja para que el lodo no contribuya con ms del 20% de la
DQO.Si el lodo tiene una alta actividad metanognica (> 0.2 gDQO-CH/g SSV da)
se puede usar menor cantidad de lodo, pero no menos de 1.5 gSSV/L. La concentra-
cin de DQOdel agua residual debe ser suficientemente alta que permita medir el
metano y los AGV en forma precisa. Generalmente se recomienda, utilizar agua
residual con una concentracin de 5 gDQO/L (Field, 1987).
Luego de la inoculacin los reactores son incubados a 35C, el ensayo se
debe realizar por triplicado, ya que al tiempo cero se sacrifica una botella por cada
carga que se va a evaluar para verificar pH y determinar DQO total y soluble y
cidos grasos voltiles. Durante la prueba se debe medir la produccin de metano
acumulada, la presin de la botella con un transductor de presin, la concentra-
cin de AGV y la DQO filtrada, tanto del lodo control como del tratamiento en
intervalos de tiempo de tres a cuatro das.
El volumen de medio mineral de Balch en las botellas, puede variar, depen-
diendo del agua residual. Aguas residuales con una baja DQO son poco adecua-
das para el tratamiento anaerobio, el volumen de medio mineral adicionado a
cada vial puede introducir una importante dilucin del agua residual a probar,
dando resultados poco confiables
El periodo de tiempo requerido para el ensayo depende del tiempo permi-
tido para que ocurra la digestin y por lo tanto siempre se debe informar el nme-
ro de das en que se llev a cabo el experimento para obtener resultados de
DQOBD(Daz-Baez, 1994; Field, 1987).
La prueba de biodegradabilidad se da por terminada cuando deja de au-

mentar la presin interna de la botella y la produccin de metano se hace nula;
cuando esto sucede, se procede a abrir las botellas para determinar la DQO total
y soluble final, as como el pH y los SSV (Daz-Bez, 1994).
CLCULOS
A manera de ejemplo se realizar el clculo del volumen de agua residual y de lodo a

utilizar en un ensayo de biodegradacin. En el caso que se quiera evaluar una relacin
de 1 gDQO/gSSVcon un agua residual y un lodo con las siguientes caractersticas:
Agua residual Lodo de inculo

Q0Total = 81369 mg/I SST = 46850 mg/I
QOSolllblr = 77260 mg/I SSV = 32740 mg/I
Para los clculos se debe trabajar en mg/ml, por lo que los anteriores valores
seran:
Agua residual Lodo de inculo

DQ0Total = 81,369 mg/ml SSV = 46,850 mg/ml
El volumen de lodo adicionar a la botella de ensayo, teniendo en cuenta una con-

centracin mnima de lodo 1.5 9 SSV/I (1.5mg/ml) y un volumen total de la fase
lquida del ensayo (por ejemplo 13 mi) ser;
1.5 mg ,.. 13 mi
x = 1 mi
x = 19.5 mg
Como la concentracin de slidos del lodo es: 32.740 mg/ml,

1 mi
x 19.5mg ,..-----
32. 740mg
x = 0.6 mi de lodo
Para el clculo del agua residual, por ejemplo para una carga de 1mg DQO/
mgSSV,ser:
1mgDQO/mgSS V 32. 740mgSSV/ml
O.6ml x
x= 19.6 mg DQO
La DQOTotal
del agua residual es de 81.369mg/ml:
1mI _1_9_. 6_m....::og~D....:Q::....O

__
x =
81.369 mgDQO
x = O.24 mI de residuo.
Cuando el agua residual tenga ms del 80% de la DQOtotal como DQOsoluble, se

tomar en cuenta la DQOsoluble para los clculos, de lo contrario la DQO soluble
e insoluble( o DQO filtrada y DQOss) debern ser separadas y estudiar la
biodegradabilidad para cada fraccin (Field, 1987).
Con los datos experimentales obtenidos en la prueba de biodegradacin
se realizan los siguientes clculos:
CLCULO DE fA DQO SOLUBLE DEL AGUA RESIDUAL. La primera etapa del clculo es con-
vertir los datos de la produccin acumulada de CH4 a mg de DQO-CH4/L (DQO
convertida a metano), como sigue (Field, 1987):
1000 X (SCH4/FC)/V
Donde,
S CH4: Produccin acumulada de CH4 (mi) producido despus de un tiempo de
digestin.
FC: Factor de Conversin (mi de CH4/ gDQO). (ver Tabla 5.3.).
V: Volumen efectivo (litros) del recipiente de digestin.
/000 = mg/g
El factor tambin puede ser calculado con base en la masa de metano
producida expresada como DQO, dividida sobre la masa de DQO removida. Si el
clculo se hace sobre la fraccin soluble, la produccin que se considera es la
neta de metano; si es sobre la DQOtotal, se utiliza la produccin bruta de metano.
Para el primer caso, es necesario lavar el lodo antes de inocular las botellas para
eliminar el sustrato soluble que pueda contener el inculo.
MCHrDQO(g)
y
MCHrDQO(g) = nCH4 tletas (mximo) (16) (4) = gCHrDQO

MCH4-DQO removida(g) = (DQOi - DQOj) (VoLumenfase Lquida)
Los valores de concentracin de los cidos grasos voltiles debern ser

convertidos a mg DQO/L, en el caso que estn expresados meq/L. Los factores de
conversin son: para el cido actico 64, para el propinico 112 y para el butrico
160. Sin embargo, es necesario conocer la relacin (2:(3:(4 para poder calcular
el factor de conversin correcto. Estos pueden ser cuantificados por cromatografa
de gases.
(on los datos en mg DQO/L, es necesario corregir los datos de cada trata-
miento, restndoles los valores obtenidos para el control. Los datos corregidos
se dividen por la concentracin corregida de la DQO del agua residual al tiempo
cero (Field, 1987).
Para obtener los porcentajes de metanognesis, el porcentaje de AGVpre-
sentes, el porcentaje de acidificacin, y el porcentaje de DQO filtrada remanente,
se utilizan las siguientes ecuaciones:
% Metanognesis: DQO- CH 4/ DQOt =0 x 100

% Acidificacin: DQO- acid / DQOt=O x 100
% ACV presentes: DQO - A.C. V / DQOt=O x 100
% DQO fiLtrada 'emanente: DQO -fiLtr / DQOt = Ox 100
Despus se calcula la DQOfiltrada removida (% DQOfi,trada

removida) o % R
de la siguiente forma:
% R = 100 - % DQO ji/llotlo
Los porcentajes de biodegradacin del agua residual (% DQOBDo % BD) Y

las clulas producidas como una fraccin de la DQOdel agua residual (% DQOcelo
% clulas) se calcula como sigue:
% BD = % R + % ACV
% LuLas= % BD - % A o % CLtdas = % R - % M
El coeficiente de rendimiento celular (Y): 9 DQOclu,as

/ 9 DQOBD
y = % clulas / % BD
CALCULO DE LA MM/MA TASA DE B/ODEGRADAB/L/DAD. Indica la velocidad de utilizacin

del sustrato por los microorganismos, se calcula a travs de la medicin de
metano obtenida por unidad de SSVy por unidad de tiempo. Para ello se grfica
las moles netas de metano producidas en funcin del tiempo, y se calcula la
pendiente mxima de produccin de metano. El dato de la pendiente mxima de
la curva, se divide entre los SSV inoculados en la botella. Las moles de metano
expresadas en masa de DQO (g CH4-DQO), se obtienen multiplicando por el
peso molecular del metano (16g) por los gramos de Oz requeridos para oxidar
1 9 de CH4 a COzy Hz (4g). Las unidades obtenidas son 9 CH4-DQO/gSSV das
(Daz-Bez, 1994).
La tasa mxima de biodegradabilidad ser:
Pendiente mxima nCH 4 "<las X 16 x 4 x 1000

-----------.:......:....------- = mgCHPQO/mgSSVd
SSV*
*La concentracin mg/mJ x volumen de lodo inoculado
Toxicidad anaerobia
FUNDAMENTO TERICO
En el tratamiento de aguas residuales, la toxicidad es observada cuando se pro-

duce una reduccin en la produccin de metano como consecuencia de la presen-
cia de uno o varios compuestos txicos. El ensayo de toxicidad se basa en comparar
la reduccin en la tasa de produccin de metano de un lodo expuesto a una sus-
tancia txica frente a un control que no tiene dicha sustancia (Figura 5.14).
Generalmente la toxicidad es el resultado de la inhibicin de bacterias
metanognicas y/o acetognicas, sin embargo se puede presentar inhibicin de las
enzimas extracelulares producidas por las bacterias responsables de la hidrlisis de
polisacridos, protenas y grasas.
CONTROL
M
E
T
A MS COMPUESTO TXICO
N
O
TIEMPO
Figura 5.14. Produccin de metano en un ensayo de toxicidad.
MATERIALES y EQUIPOS
Botellas serolgicas de 120ml, con tapn de caucho y sello de aluminio.

Cilindro de CH4 puro para elaborar curva de calibracin.
Cromatgrafo de gases configurado para cuantificacin de CH4
Cuarto caliente o bao Mara.
Medio de cultivo (ver Anexo 1).
PROCEDIMIENTO
El ensayo de toxicidad se realiza igual a una Actividad Metanognica Especfica,

AME (ver seccin correspondiente) con la activacin previa del lodo y la
cuantificacin de la produccin de metano mediante cromatografa de gases.
La prueba se hace por triplicado, debe incluir un control positivo con una
sustancia de referencia de toxicidad conocida, y un control negativo en el cual no se
le ha adicionado lasustanciao el agua residual potencialmentetxica (Iodo + sustrato).
Se deben probar adems diferentes concentraciones del txico o del agua residual
que se va a evaluar.
Luego de la activacin del lodo, se adiciona el sustrato para control nega-
tivo, para cada uno de los tratamientos se adiciona el sustrato junto con el txico
o dilucin a evaluar. Se incuban las botellas a 35C, y se realiza la medicin de la
produccin de metano cada tres horas durante las primeras 24 horas del ensayo.
Posterior a este tiempo, se hacen mediciones dos veces al da durante los si-
guientes 5 das de exposicin. Previo a iniciar el ensayo de toxicidad se establece

la tasa de produccin de metano propia del lodo mediante un ensayo de actividad
metanognica especfica.
CLCULOS
Con los datos obtenidos, se construye una grfica de volumen de metano produ-
cido en funcin del tiempo de prueba. Se calcula la pendiente obtenida para el
control negativo, el control positivo, y para cada uno de los tratamientos utiliza-
dos. Con los valores obtenidos, se calcula la actividad metanognica de cada uno
de los tratamientos.
La inhibicin de la actividad metanognica para cada uno de los tratamien-
tos se calcula comparando el valor obtenido respecto al valor obtenido para el
control negativo. El porcentaje de actividad metanognica (% ACT) comparada
con la del control ser:
El porcentaje de inhibicin (% 1)para cada tratamiento o concentracin ser:
%1 = 100 - %ACT
El valor de la concentracin a la que un compuesto o mezcla de compues-

tos (agua residual) produce una inhibicin de la actividad en un 50%, se determi-
na graficando los % ACT obtenidos para cada tratamiento en funcin de la
concentracin o dilucin del tratamiento. La concentracin a la cual se obtiene
una inhibicin del 50%, corresponder a la CEsode la muestra.
BIBLIOGRAFA
ALAZARD, D. Y Molina, F. (1997). Microbiologa de la digestion anaerobia y caraderizacin de

lodos anaerobios. Universidad de Antioquia, Medelln, (Colombia).
APHA (American Public Health Association) (1998). Standar Methods for the Examination of
th
Water and Wastewater. 20 edition. Washington.
BALCH, W.E.; Fox, G.E.; Magrum, L.J.; Woese, C.R y Wolfe, R.5. (1979). "Methanogens: Revaluation
of unique biological group". Microbio!. Rev. 43: 260-296.

BELlAEFF, B. Y Mary, J.Y. (1993). "The Most Probable Number Estimate and its confidence limits".
Water Res. 5: 799 - 805.

BROCK, l y Madigan, M. (1984). Biology of Microorganisms. Fifth Edition. Prentice Hall. New
Jersey (EUA).
BRYANT, M.P.;Wolin, EA y Wolfe, R.S. (1967). "MethanobaClllus omelianskii, a symbiotic association
of two species of bacteria". Archiv fur Mikrobiologie 59,20- 31

Catlogo No. 43710401993. U.S. Patent No 4,976,931. BBL Gas Generator Envelopes of
Anaerobic Atmosphere. Gas Pak Plus 1M Disposable Hydrogen + Carbono Becton Dickinson
and Company.
DAZ-BEZ, M.e. (1994). "Manual de ensayos de caracterizacin de lodos y reactores anaerobios".
Corporacin para el fomento de la investigacin y el desarrollo tecnolgico de la Facultad
de Ingeniera de la Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogot (Colombia).
DODDEMA, H.J. y Vogels, G.D. (1978). "Improved Identification of Methanogenic Bacteria by
f1uorescence microscopy". App!. Environ. Microbio!. 36: 752-754.

DOLFING, J.; Griffioen A; Van Neervan, A. y Zevenhuizen, L.( 1985). "Chemical and bacteriological
composition of granular methanogenic sludge". Can. j Microbio!. 31: 744-750.

E.P.A. 1986. "Operation of Wastewater Treatment Plants". Volumen 11.En: Romero, J. (1989).
Acuianlisis. Escuela Colombiana de Ingeniera. Bogot (Colombia).

ESPillA, S. (1999). "Caracterizacin microbiolgica de lodos provenientes de plantas de tratamiento
anaerobio". Tesis de maestra. Universidad Nacional de Colombia, Bogot (Colombia).
FIELD, J. (1987). "Parmetros operativos del manto de lodos anaerobios de flujos ascendente.
Arranque y operacin de sistemas de flujo ascendente con manto de lodo UASB". Manual
del curso. Universidad del Valle. Corporacin Autnoma Regional del Cauca y Universdad
Agrcola de Wageningen. Santiago de Cali (Colombia). Noviembre. B-1 - B-35.
GROTENHUIS,J.T; Smith, M. y Plugee, C.M. (1991 ). "Bacteriological composition and structure of
granular sludge adapted to different substrates". App/ied and Enviromenta/ Microbi%gy.
57(7): 1942 - 1949.
HICKEY,R.F.;Wu,W y Zeikus, G. (1991). "Characterisation of metabolic performance of methanogenic
granules treating brewery wastewater: role of Sulfate-reducing bacteria". App/ied
Enviromenta/ Microbi%gy.5 7 ( 12): 3438- 3449.
HOLDEMAN, L.V; Cato, E. y Moore, W.E.C.(1977). "Anaerobe Laboratory Manual. Culture Methods.
Use of Prereduced Media". 4th Edition. Virginia Polytecnhnic Institute and State University.
Blacksburg, Virginia (EUA), p. 117-121.
HUNGATE, R.E (1967). "Hydrogen as an intermediate in the rumen fermentation". Archiv fur
Microbi%gie 59: 158-164.
MAH, R.A. (1980). "Isolation and characterization of Methanococcus mazael'. Current Microbi%gy
3: 321-326.
OUDE, E.; Visser A.; Hulshoff L.W y Stams A.J. (1994) "Sulfate reduction in methanogenic
bioreactors". FEM5 Microbi%gy Rev. 15: 119 - 136.
RAMREZ, F.; Molina, F.; Rojas, O. y Alazard, D. (1996). "Evaluacin de potenciales semillas para
la inoculacin de reactores anaerobios". Memorias IV Seminario Taller Latinoamericano
sobre tratamiento de aguas residuales. Bucaramanga (Colombia) p. 33-44.
ROJAS, O. (1988). "La alcalinidad como parmetro de control de cidos grasos voltiles en
digestin anaerobia". En: Manual del curso Tratamiento Anaerobio de Aguas Residuales
Microbiologa y Bioqumica. Universidad de Antioquia, Medelln (Colombia).
VAN HAANDEL, A. Y Lettinga, G. (1994). Tratamento anaerobio de esgotos em regioes de clima
quente. Editora EPGRAF.Campina Grande (Brasil).
WIDDEL, F. y Hansen, lA. (1992). "The dissimilatory sulfate and sulfur-reducing bacteria". In:
The Prokaryotes, 2nd ed. (Balows A., Dworkin M., Harder W, Schleifer K.H, Eds.), p. 719-
767. Springer Verlag. New York (EUA).

WILDSCHUT, L. (1987). "Medicin de parmetros. Arranque y operacin de sistemas de f1L
ascendente con manto de lodo UASB". Manual del curso. Universidad del Vall
Corporacin Autnoma Regional del Cauca y Universidad Agrcola de Wageninge
Santiago de Cali (Colombia). noviembre. J 1-J17.
WHITMAN, W.B., Bowen, IL. y Boone, D.R. (1992). "The Methanogenic Bacteria". En: Th
Prokariotes 2nd edn. (Balows, A., Truper, Dworkin, M., Harder, W., Schleifer, K.H, Eds;
Springer Verlag. New York (EUA), p. 719-167.
WILLS, B. el a/(2000). "Informe final de la investigacin: Optimizacin de la etapa de arranqu(
de reactores anaerobios, mediante el mejoramiento de la calidad de diferentes semilla~
en condiciones dinmicas de operacin". Colciencias, contrato 178-96. Universidad de
Antioquia, Facultad de Ingeniera, Medelln (Colombia).
WOLFE, R.S. y Higgins, !.J. (1979). "Microbial biochemistry of methane: a study in contrats". /nt.
Rev. Biochem. 21: 267-350.
WU, W.M.; Thiele, J.H.; Jain, M.K.; Pankralz, H.5. y Hickey, R.F. (1993). "Comparison of Rod -
versus Filament type methanogenic granules: Microbial population and reactor

performance". App!. Microbio!. Biotechno!. 39: 795-80l
ZINDER, S.H. (1998). "Methanogens", captulo 5. En: Techniques in Microbial Ecology (Burlage,
R.5 el al, eds. ) Oxford University Press. New York (EUA), p. 113-135.
ANEXOS
ANEXO 1
MEDIOS DE CULTIVO y SOLUCIONES
ANAEROBIAS
A. MEDIOS DE CULTIVO
ACTIVIDAD METANOGNlCA
Para 1000 mi
Solucin mineral de Balch sin sulfatos 50 mi

Solucin oligoelementos sin sulfatos 10 mi
KzHP04 0.3g
Solucin de resarzurina (0.1%) 1.0 mi
Extracto de levadura 0.1g
Bio-tripcase (Peptona trpsica de casena) 0.1g
Se completa volumen a 11,se ajusta pH a 7.0 con NaOH 1N, agregar 10% en
volumen de agua destilada adicional, hervir hasta llegar al volumen de 1 litro y enfriar bajo
atmsfera de Nz.
Cuandoest a temperatura ambiente agregar:
NaHC03 2.0g
Cistena 0.5g
Dosificar bajo corriente de nitrgeno. Se gasea el frasco donde se va a servir con Nz

y se agrega el medio. Servir 13 mL en botellas de 60 mL, hacer intercambio de fase Nz - COz
(80% - 20%) por un minuto, se debe retirar primero la aguja con la cual se est gaseando
para que no haya una sobre presin y luego la aguja de desalojo, llevar a autoclave durante
15 minutos (121C - 15 psi), antes de utilizarlo agregar:
NazS(2.0%) 0.2 mL
Solucindiluida de vitaminas de Balch 0.2 mL
Nota. Elmedio para la realizacin de la prueba de Biodegradabilidad es este mismo suprimien(

el extracto de levadura y Bio-tripticasa, estos compuestos aumentan la concentracin de DQOf
un bajo porcentaje y finalmente la concentracin real no es la misma que se va a evaluar.
RECUENTO DE BACTERIAS ANAEROBIAS ESTRICTAS (BAS)

Volumen 1 litro:
Solucin mineral de Ba/ch sin sulfatos 50ml

KzHP04 0.30g
Fe(SOJ7HzO (0.2%) 1.0ml
Solucin de oligoelementos sin sulfatos 10.0ml
NiClz6HzO (O.5g/L) 0.5ml
Azul de bromotimol (1.0%) 1.0ml
Bio trypcase (Peptona trpsica de casena) 2.0g
Glucosa 10.0g
Se completa con agua destilada a 1OOOmL,se ajusta pH con NaOH 1N, agregar 1O~
en volumen de agua destilada, hervir hasta llegar al volumen de 1 litro y enfriar bajo atmsfl
ra de nitrgeno (NJ
Cuando est a temperatura ambiente agregar

NaHC03 5.0g
Cistena 0.5g
Servir 5mL en tubos Hungate, hacer cambio de fase N/COz (80%, 20%) durante u
minuto, llevar a autoclave durante 15 minutos (121C - 15 psi). Antes de utilizarlo agregal
NazS.9HzO (2.0%) 0.05ml/5ml
Vitaminas diluidas de Balch 0.05ml/5ml
Despus del autoclave el pH debe ser 7.1

ANEXOS [153]
RECUENTO BACTERIAS FERMENTADORAS DEL LACTATO Y DE LA GLUCOSA (BFG Y BFL)

Volumen 1 litro:
Solucin mineral de Balch sin sulfatos 50ml

Oligoelementosde Balch sin sulfato 10ml
KzHP04 0.30g
Fe(SOJ7HzO (0.2%) 1.0m\
NiClz.6 HzO(O.5g/L) 1.0ml
Azul de bromotimol (1.0%) 1.0ml
BIOtrypcase (Peptona trpsica de casena) 2.0g
Selenito de sodio (1.73g/L) 1.0ml
Para las BFGtomar 500mL del medio anterior y agregar 5g de glucosa. Ajustar pH a
7.1. Despusde hervir enfriar bajo atmsfera de N/COz y agregar:
Cistena- HCI 0.25g
NaHCO (10%) 2.5g
Para las BFLtomar los 500 mL de medio restantes y agregar 3.6 mL de lactato de
sodio (60% en peso) 2.8 mL de cido lctico. Ajustar el pH a 7.25. Despus de hervir,
enfriar bajo atmsfera de NzlCOz.

Cistena- HCI 0.25g
NaHCO (10%) 2.5g
Servir 5mL en tubos Hungate, bajo atmsfera de nitrgeno. hao"r cambio de

fase Nz/COz(80% / 20%) durante un minuto. Llevar al autoclave durante 15 minutos
(121C - 15 psi).
Antes de utilizarlo agregar:
NazS.9HzO (2.0%) 0.05ml/5ml
[154] D,GeST'N ANAeROBIA
RECUENTO DE BACTERIAS SULFATOREDUCTORAS DEL ACETATO Y LACTATO (85RLAc y 85!

Volumen 1 litro:
KHlo4 0.2g
NH4CI 0.5g
Na2S04 3.0g
NaCl 1.2g
FeCI2AH20 0.36g
MgCl26H20 OAg
CaCl22H20 0.15g
Oligoelementos P.w.sin sulfato 1.0ml
Solucin de resarzurina (0.1 %) 1.0ml
Para las bacterias sulfato reductoras del acetato se toman 500mL del medio
y agregar 1. 5g de acetato de sodio. 3Hp Ajustar pH a 6.7.
Despus de hervir, enfriar bajo atmsfera de N2/C02 y agregar antes de ser
NaHC03
Para las bacterias reductoras del lactato tomar los 500mL de medio re~
agregar 4.25ml de lactato de sodio (60%). Ajustar el pH a 6.8. Despus de herv
bajo atmsfera de N/C02.
Cuando est a temperatura ambiente agregar antes de servir 2.5g
NaHC03
Servir 5mLen tubos Hungate,bajo atmsfera de nitrgeno, hacercambiode fa
(80% / 20%) durante un minuto, llevar al autoclave durante 15 minutos (121C, 15 P
Cistena HCI (2.5%) 0.1 ml/5ml
Vitaminas P.W.diluidas 0.05ml/5ml
RECUENTO DE BACTERIAS METANOGNlCAS HIDROGENOFllCAS. (BMH)

Volumen 1 litro:

Solucin oligoelementos de Balch sin sulfatos 10ml
ANEXOS [155]
K2HP04 0.30g
NiCI2. 6Hp (O.5g/L) O.5ml
Selenita de sodio (1.73g/L) 1.0ml
FeCI2.4H20 (0.2%) 1.0ml
Resarzurina (0.1 %) 1.0ml
El medio no contiene SO4 con el fin de evitar el crecimiento de bacterias autotrficas,

cuando se requiere el medio para aislar bacterias hidrogenofilicas, con el fin de evitar la
contaminacin del cultivo, no se agregan vitaminas, extracto de levadura, Bio-trypcase , ni
jugo de rumen.
Cuandose requiere el medio para identificar crecimiento de bacterias hidrogenoflicas

se agregan:
Bio- trypcase 0.1g
Ajustar el pH a 7.2 - 7.4 con NaOH 1M, agregar 10% en volumen y hervir hasta
evaporar el exceso, enfriar bajo corriente de nitrgeno, cuando est a temperatura am-
biente agregar:
Cistena - HCI O.5g
NaHCOJ (10%) 5.Og
Servir 5mL en tubos Hungate,bajo atmsfera de nitrgeno,hacer cambiode fase H)C02

(80% /20%) durante un minuto, llevar al autoclave durante 15 minutos (121 C_15 psi).
Renovar el cambio de fase H)C02 cada 2 3 dias despus de inocular.
Na2S. 9H20 (2.0%) 0.05ml/5ml
RECUENTO DE BACTERIAS METANOGNlCAS ACETOCI..STlCAS (BMA)

Volumen 1 litro:

K2HP04 0.30g
[156] DIGE:ST/N ANAE:RDBIA
Solucinoligoelementosde Balchsin sulfatos 10.0ml

FeS04' 7HzO(0.2%) 1.0ml
Selenitode sodio (1.75g/L) 1.0ml
Extracto de levadura O.5g
Bio - tripcase 0.19
Resarzurina (0.1%) 1.0ml
Acetato de sodio 8.0g
Para el aislamiento de bacterias metanognicas del metanol, se utiliza este medio

adicionando 0.63mL de metanol a cambio del acetato.
Ajustar el pH a 7.1-7.2. Agregar 10% del volumen final de agua destilada, enfriar
bajo atmsfera de N/COz (80% - 20%), cuando est a temperatura ambiente agregar:
Cisteina- HCI O.5g
Na HC03 (10%) 5.0g
Servir 5mL en tubos Hungate, bajo atmsfera de nitrgeno, hacer cambio de fase N/
COz(80% - 20%) durante un minuto, llevar al autoclave durante 15 minutos (121C - 15 psi).
NazS.9H20 (2.0%) 0.05ml/5ml
Vitaminasdiluidas de Balch 0.05ml/5ml
RECUENTO DE BACTERIAS slNTRFlCAS DEL PROPIONATO / BUTlRATO (BsP y BsB)

Volumen 1 litro:
Solucinmineral de Balch sin sulfatos 50ml

Solucinoligoelementos de Balch sin sulfatos 10ml
KzHP04 0.3g
Fe S04' 7HzO(0.2%) 1.0ml
Selenito de sodio (1.75g/L) 1.0ml
NiClz(0.05%) O.5ml
Extracto de levadura 0.19
Bio - tripcase 0.19
Resarzurina(0.1%) 1.0ml
ANEXOS [157]
Setoman 500ml para preparar el medio de bacterias sintrficas del propionato, agre-
gando 0.5g de propionato de sodio (C3HsOzNa)
Los 500ml restantes se utilizan para el medio de bacterias sintrficas del butirato, se
agregan O.5g de butirato de sodio (C4H70zNa) o 4.5ml de cido butrico 1M.
Agregar 10% en volumen de agua destiladaen exceso,enfriar bajo atmsfera de N/COz

(80% - 20%) ,cuando est a temperatura ambiente agregar:
Cistena - HCI 0.5g
NaHC03 (10%) 5.0g
Servir 5mL en tubos de Hungate, bajo atmsfera de nitrgeno, hacer cambio de fase Ni
COz(80% - 20%) durante un minuto, llevar al autoclave durante 15 minutos (121C - 15 psi).

NazS.9Hp (2.0%) 0.05ml/5ml
B. PREPARACiN DE SOLUCIONES
SOLUCIN MINERAL DE BALCH
Con sulfatos Sin suIfatos *

KHl04 6.0g 6.0 9
(NH4)zS04 6.0g
NH4C1 5.0 9
MgClz6Hp 2.1 9
MgS047HzO 2.6g
CaClz2HzO 0.16g 0.16 9
NaCl 12.0 9 12.0 9
* Para evitar inhibicin por la presencia de bacterias sulfato-reductoras.
Diluir en 1litro de agua destilada., preparara en aerobiosis, almacenar en refrigera-
dor a 4(,
[158] D,GSTIN ANAROBIA
SOLUaN OLlGOELEMENTOS SIN SULFATOS

Con sulfatos Sin sulfatos*
cido nitrilotriactico** 1.5g 1.5 9
MgS04 7HzO 3.0g
MgClz6Hp 2.5 9
MnS04HzO 0.5g
MnClz.4HzO 0.6 9
NaCl 1.0g 1.0 9
FeS047HzO 0.1g
FeClz.4HzO 0.1g
CoClz6HzO 0.1g
CoS046HzO 0.1g
CaClz2HzO 0.1g 0.1g
ZnClz 0.1g
ZnS04 0.1g
CuS04.5 Hp 0.01g
CuCV HzO 0.01g
ALK(S04)z 0.01g
ALCIJ 0.01g
HJBOJ 0.01g 0.01 9
NaMo04.2 Hp 0.01g 0.01 9
* Para evitar inhibicin por la presencia de bacterias sulfato reductoras.

**Se disuelven 1.5g de cido nitrilotriactico con KOH 10N 1N hasta pH 6.5.
La solucin se prepara en aerobiosis. Despus de adicionar todo, ajustar el pH a

con KOH 1N, almacenar en el refrigerador a 4(,
SOLUaN DILUIDA DE VITAMINAS DE BALCH

Volumen 1 litro:
Biotina (vitamina H) 2mg

cido p-aminobenzico (PABA) 5mg
Cianocobalamina (vitamina B12) 0.1mg
ANEXOS [159]
Tiamina HCI(vitamina B1) 5.0mg

D.L.Pantotenato de Ca 5.0mg
cido nicotnico 5.0mg
Piridoxina - HCI (vitamina B6) 10.0mg
Acido flico 2.0mg
Riboflavina (vitamina B2) 5.0mg
cido lipoico (thioico) 5.0mg
Esterilizar por filtracin en membranas de 0.22mm en anaerobiosis

Almacenar protegido de la luz en refrigerador a 4(,
Se preparan en frascos de 60mL con cambio de fase de N/COz y estriles.
SOLUCIN MINERAL DE PEENNlG ET W/DDEL (SIN SULFATO)

Volumen 1 litro:
KHl04 0.2g
NH4CL O.5g
NaCl 1.2g
MgClz6HzO OAg
CaClz2HzO 0.15g
KCI O.5g
SOLUCIN DE OUGOELEMENTOS DE PFENNlG y W/DDEL

(MODIFICADO)
Volumen 1 litro:
HCLa 25% (6.75N)* 10ml

* Acidificar el hierro antes de disolverlo en el agua, los oligoelementos se disuelven en el
siguiente orden:
FeClzAHzO 1.5g
H3B03 60mg
MnClzAHp 100mg
CoClz6Hp 120mg
ZnClzanhidro 70mg
NiCI26H20 25mg
CuCl22H20 15mg
AICI] anhidro 50mg
Na2Mo042H20 25mg
Na2SeO] 3mg
SOLUCIN DE VITAMINAS DE PFENNlG y WlDDEL

Volumen 1 litro:
Biotina (vitamina H) 1mg

Acido para-Amino benzoico (PABA) 5mg
Cyanocobalamina (vitamina B12) 5mg
Thiamina, HCI 10mg
DL panthotenato de Ca 5mg
Acido nicotnico 5mg
Pyridoxamina (Pyridoxina HCI) 10mg
Nota: Esterilizar por filtracin, en anaerobiosis. Almacenar a 4 oCy protegido de la IL
SOLUCIN DE RESARZURINA (0.1%)

Volumen 50 mi:
Resarzurina 0.05g
Se disuelven en 50 mL de agua destilada
Almacenar a temperatura ambiente, proteger de la luz con papel aluminio
SOLUCIN DE SULFITO DE SODIO (2.0%)

Volumen 20ml:
Na2S. 9 Hp O.4g
Se disuelven en 20mL de agua anxica
Realizar el cambio de fase N/C02 y despus esterilizar
Se almacena a temperatura ambiente
SOLUCIN DE AZUL DE BROMor/MOL (1.0%)

Volumen 100ml:
Azul de bromotimol 1.0g
NaOH 1N 100ml
Se utiliza 1mi/litro de medio
SOLUCIN DE AGUA REDUCIDA

Volumen 1litro:
K2HP04 0.3g
Solucin mineral de Balch sin sulfato 50ml
Resarzurina 1ml
Se completa el volumen a un litro y agregar el 10% adicional de agua destila,

hervir hasta llegar al volumen de 1 litro y enfriar bajo atmsfera de nitrgeno.
NaHCO 5g
Cistena. HCI 0.5g
Servir segn necesidad 4.5ml , 9.0ml 13.5ml en tubos Hungate, hacer cambio de fase I
C02 (80%- 20%) por un minuto, llevar a autoclave durante 15 minutos (121C, 15lb/pulg
Antes de usar agregar:

Na2S.9H20 (2%) 0.05ml/5ml
ANEXOS [163]
ANEXO 2
RECUENTO TOTAL DE BACTERIAS
A. PRINCIPIO DEL MTODO
Se filtra la dilucin del lodo seleccionada en un filtro nucleopore de O.2Ilm, las bacterias son
retenidas por el filtro y son teidas con una solucin de naranja de acridina, con la luz de
epifluorescencia se realiza el conteo directo del nmero de bacterias por retcula en un campo
visual, este procedimiento se repite al menos tres veces, luego se promedia el resultado y
extrapolando el promedio al rea total del filtro.
B. REACTIVOS y EQuIPOS
Solucin de Naranja de Acridina

Se prepara la solucin A y B de la siguiente manera:
Solucin A, disolver 2.76g de NaHl04.HzO en 1OOmlde agua destilada
Solucin B, disolver 3.56g de NazHP04.HzOen 1OOmlde agua destilada
Se disuelven 100mg de Naranja de Acridina en 28.25ml de la solucin A y 21. 75ml de la
solucin B, completando el volumen de esta mezcla a 100ml.
Filtros
Se requiere de filtros Millipore de 0.451lm para filtrar el agua de preparacin de la Na-
ranja de Acridina y el agua de lavado, la filtracin de la muestra se realiza sobre un filtro
Nucleopore de O.2Ilm; para realizar ambos procesos se utilizan soportes de filtracin
que se unen a un erlenmeyer donde se aplica vaco.
Microscopio con luz de epifluorescencia
C. PROCEDIMIENTO
Filtrar el agua de lavado en filtro Millipore de 0.451lm

Coloracin de las bacterias con Naranja de Acridina
- Colocar el filtro sobre la filtra del portafiltro con el lado brillante hacia arriba, arman-
do el equipo de filtracin.
Tomar con jeringa 5ml de la dilucin en estudio (generalmente 10 Jo 10-4'

la jeringa con Nz y agitando muy bien el tubo antes de tomar la muestra
Agregar los 5ml de muestra por las paredes del tubo de carga del sisterr
cin, filtrar en presencia de vaco.
Detener el vaco y agregar 1mi de la solucin de Naranja de Acridina, dej,
colorante durante 15 minutos en la oscuridad.
Eliminar el colorante lavando profusamente en presencia de vaco.
Retirar el filtro y colocarlo en una caja de petri, cubrindola con papel alL
protegerla de la luz.
Conteo
Dividir el filtro en cuatro partes iguales, montar un cuarto de filtrc
portaobjetos, agregando una gota de aceite de inmersin y colocando el CL
La lectura se realiza con el objetivo 100X.
Se enciende la lampara de epifluorescencia.
Secuentan las bacterias presentes en la retcula, las bacterias se identifican pe
un color verde fluorescente, se repite el conteo en varios campos visuales y e
El clculo se realiza con la siguiente ecuacin, teniendo en cuenta que la
microscopio tiene un rea de 0.0064mmZy el rea del filtro es de 227mr
N. Bact./gSSV = 35469 x (Promedio de Losconteos/DiLucin)/(5mL x SS)

ANEXOS [165]
ANEXO 3
RECUENTO DE LOS GRUPOS TRFICOS
POR LA TCNICA DEL NMERO MS
PROBABLE (NMP)
A. PRINCIPIO DEL MTODO
Se realizan diluciones seriadas del lodo en estudio, con las diluciones seleccionadas se inocu-
lan cinco tubos Hungate por dilucin; se identifican los tubos positivos de acuerdo con las
caractersticas de cada grupo bacterial (Tabla 5.6) realizando los clculos del nmero ms
probable con base en la tabla 6.1
B. REACTIVOS y EQUIPOS
Medios de cultivo yagua reducida, segn especificaciones del Anexo 1.

o Tubos Hungate
Cmara de anaerobiosis para realizar la primera dilucin
Incubadora a 35C.
Cromatgrafo de gases para la deteccin de metano
C. PROCEDIMIENTO
La muestra de lodo se introduce en la cmara de anaerobiosis para realizar la primera

dilucin, la muestra se homogeneiza utilizando un homogeneizador de tejidos estril: se
diluye 1mi de lodo homogeneizado en 9ml de agua reducida.
Las diluciones seriadas se realizan fuera de la cmara de anaerobiosis, agregando 1mi
de la dilucin anterior a 9ml de agua reducida utilizando una jeringa purgada con nitrge-
no previamente y trabajando con las normas de asepsia para evitar la contaminacin de
las diluciones.
La inoculacin de los tubos se realiza con jeringas, bajo flujo de nitrgeno, con los cuidados
necesarios, para evitar la contaminacin de los medios flamear tapones y trabajar cerca de
la llama, los medios se inoculan con O.2ml por tubo de la dilucin correspondiente, se inocu-
lan cinco tubos por dilucin, exceptuando los grupos de las bacterias sintrficas para
cuales se inoculan tres tubos y dos controles (sin sustrato) por dilucin.
La incubacin se realiza a 35( durante el periodo recomendado para cada grupo trl
(Tabla 5.6)
El Nmero ms Probable se calcula utilizando la siguiente ecuacin:
MP/gSSV= o. Bacterias (tabla 6.1) x mxima dilucinpositiva x 5000 / gSSV
Clculo del NMP segn Mac Grady para 5 tubos por dilucin
Combinacin de Nmero de Combinacin de Nmero de

Combinacin de Nmero de
bacterias tubos positivos bacterias tubos positivos bacterias
tubos positivos
para tres para tres para tres
diluciones diluciones
diluciones
consecutivas consecutivas
consecutivas
0.0 231 1.4 451 5

000
0.2 240 1.4 500 2.5
001
0.4 300 0.8 501 3
002
0.2 301 1.1 502 4
010
0.4 302 1.4 503 6
011
0.6 310 1.1 504 7.5
012
0.4 311 1.4 510 3.5
020
0.6 312 1.7 511 4.5
021
0.6 313 2 513 8.5
030
0.2 320 1.4 520 5
100
0.4 321 1.7 521 7
101
0.6 322 2 522 9.5
102
0.8 330 1.7 523 12
103
0.4 331 2 524 15
110
0.6 340 2 525 17.5
111
0.8 341 2.5 530 8
112
0.6 400 1.3 531 11
120
0.8 401 1.7 532 14
121
1 402 2 533 17.5
122
0.8 403 2.5 534 20
130
1 410 1.7 535 25
131
1.1 411 2 540 13
140
0.5 412 2.5 541 17
200
0.7 420 2 542 25
201
1.2 421 2.5 543 30
203
0.7 422 23 544 35
210
0.9 430 2.5 545 45
211
1.2 431 3 550 25
212
0.9 432 4 551 35
220
1.2 440 3.5 552 60
221
1.4 441 4 553 90
222
1.2 450 4 554 160
230
ANEXOS [167]
ANEXO 4
PREPARACiN AZUL DE METILENO
COMPOSICiN:
A. Tris (tris-(hydroxymethyl)-amonimethane), 60% en agua hervida (para mantener la

alcalinidad del indicador)
B. Glucosa(agenteque se reduce) 4% en agua
C. Azul de metileno, 0.02% en agua.
Se mezcla partes iguales de A, B Y e a temperatura ambiente, el pH de la solucin

indicadora es de 12. El indicador debe ser protegido de la luz y almacenado en refrigeracin
Holdeman., et al., 1977. La solucin es utilizable por dos semanas (Catlogo Cabina de
Anaerobiosis 1025 Forma Scientic).
Este libro se termin de imprimir
en el mes de agosto de 2002
Universidad Nacional de Colombia

UNIBIBLOS
unibiblo@dnic.unal.edu.co
Bogot, Colombia

Digestion Anaerobia Unal

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Digestin

SANDRA El lANA ESPillA VARGAS

FRANCISCO MaliNA IpREZ

Bogot, junio de 2002

Engie Carolina Plazas BacIIlriloga

Mana. Sena. Gonzalez Bacteridoga

Carolina Garda Microbiloga

cados JlJio CoIazos Ingemero sanitario M.se.

MARIA CONSUELO DIAIBAEZ

SANORA BIANA ESPilA VARGAS

Pnmera edlCion 2002

Esta Publlcacion ha sido posible gracias al patrocinio del

Diseo y diagr amacion

Preparacin editOrial e Impresin

Los autores queremos dar un reconocimiento especial al profesor Didier

Adems, los autores quieren expresar sus agradecimientos a:

Finalmente, nuestros agradecimientos a Colciencias, Programa

RECURSOSHDRIOOSy TRATAMIENTODE AGUAS RESIDUALES

PUESTA EN MARCHAY OPERACiN DE REACTORESANAEROBIOS

CARACTERIZACiNDE LODOS ANAEROBIOS Y AGUAS RESIDUALES

AUNQUE COLOMBIA CUENTA CON GRAN CANTIDAD DE RECURSOS HDRICOS E HIDROBIOLGICQS

CONTINENTALES (MS DE 2.6 MILLONES DE HECTREAS DE LAGOS, LAGUNAS, EMBALSES,

cinagas y pantanos, y 720.000 caues), fenmenos como la erosin, la destruccin

EL AGUA ES UNA MOLCULA, ESENCiAl E INDISPENSABLE PARA LA VIDA; CUANTITATIVAMENTE, RE-

PRESENTA EL CONSTITUYENTE INORGNICO MS ABUNDANTE EN LA MATERIA VIVA. CERCA DE TRES

cuartas partes de la superficie terrestre estn oubiertas por la hidrosfera; de

Tabla 1.1. Precipitacin I y rendimientos, hidricios,

Regin Precipitacin anual media (mm) Rendimiento(Vslkm')

Planeta Tierra 900 10

Sur Amrica 1.600 21

Fuente: Ministerio...del Medio Anlbiente. 1996

A pesar que 'el recurso hdrico en Colombia ,es abundante, su distriblilcin

En la actualidad, del total de la oferta hdrica superfi~al, solamente se utiliza

ciones mineras, impactos ambientales que generan gran cantidad de sedimentos,

rellenos sanitarios (Mondragn, 1996). De los 1.068 municipios existentes en

En trminos generales, las opciones tecnolgicas de tratamiento de aguas

(llamados 'slidos suspendidos'). 1L0stratamientos ms lutilizados son: la sedi-

Tratamiento.~ terciario Tratamiento secundal"io',

Oxidacin aerobia: Lodos activados

Digestin aerobia: UASB

Figura 1.1 Niveles de tratamiento de las aguas residuales.

El objetivo Iprincipal de Ilostratamientos secundarios es la remocin de la

EXPERIENCIS ' CON IOIGESTiN

La remocin de materia orgnica soluble puede ~Ievarse a cabo a travs de proce-

ltimos aos. La utilizacin de reactores anaerobios para el tratamiento de aguas

En 1994 existan en Amrica Latina aproximadamente . 396 reactores

agroindustriales, y el 57% restante, para domsticas, o se utilizaban en 11a,diges-

Figura 1.2. Reactores anaerobios. utilizados en el tralBmienlo de' efluenlBs'

Se calcula que en Colombia existen ms de 80 reactores anaerobios los

agroindustriales, y el 57% restante, para domsticas, o se utilizaban en la diges-

Figura 1.2. !Reactores anaerobios utilizados en el tratamiento de efluentes

Se calcula que en Colombia existen ms de 80 reactores anaerobios los

Agua residual industrial

Para las aguas residuales domsticas, de los 154 municipios Cdlombianos

Tabla 1.2. Sistemas de tratamiento, de aguas residuales en los municipios

Tipo J:1B,gJ,a"Wa, .da tratamiento No. de Municipios

Plantas compactas aerobias 6

Reaelores anaerobios UAS8 17

Fuente: Ministerio de Desarrollo. 1998.

PROBLEMAS ASOCI~DOS CON LA

Puesta enl marcha de los rlctares

Una caracterstica particular de los microorganismos anaerobios es su baja tasa

Por lo general, con la digestin anaerobia no se logra la misma remocin de

Uno de los mayores problemas aso~ados con la tecnologa anaerol:lia es la libera-