EXTRACCIN ADN BACTERIANO

Ref. ADNBACT (25 extracciones)

1. OBJETIVO DEL EXPERIMENTO

El objetivo de este experimento es introducir los principios de la extraccin de

ADN cromosmico a partir de clulas bacterianas de E.coli.
Los estudiantes aprendern la estructura y funcin de los cidos nucleicos que contiene
una bacteria.
2. INTRODUCCION
Toda la informacin gentica esencial para la vida de la bacteria est contenida en una
nica molcula de cido desoxirribonucleico (ADN) de doble cadena y circular, cerrado
por enlace covalente. Dicha molcula se denomina cromosoma bacteriano. Muchas
bacterias poseen adems ADN extracromosmico, tambin circular y cerrado,
denominado ADN plasmdico por estar contenido en los plsmidos. stos, portan
informacin gnica para muchas funciones que no son esenciales para la clula en
condiciones normales de crecimiento.

En trminos bioqumicos la composicin y estructura de los cidos nucleicos

bacterianos es la misma que para cualquier clula. Conviene recordar brevemente que
los cidos nucleicos son macromolculas compuestas de nucletidos unidos de forma
covalente,
de dos residuos de azcares adyacentes. Esta estructura forma un esqueleto de azcares
y fosfatos constante en toda la macromolcula.

La variacin entre los nucletidos que constituyen la cadena de cido nucleico, est
dada por sus bases nitrogenadas; para el ADN son: adenina (A), timina (T), citocina (C)
y guanina (G) y para el cido ribonucleico (ARN) son en lugar de timina, el uracilo (U).
La A y G se denominan bases pricas o purinas, mientras que T, U, y C se denominan
bases pirimidnicas o pirimidinas. As, una cadena o hebra de cido nucleico, tendr una
estructura primaria determinada por la secuencia de las bases que la componen. El
ADN, como macromolcula, est compuesto por dos cadenas nucleotdicas o hebras
antiparalelas que se enlazan entre s formando una doble hlice. Los enlaces entre
ambas hebras de ADN estn determinados por puentes de hidrgeno entre las purinas de
una cadena, con las pirimidinas de la otra. Entonces, la A forma dos puentes de
hidrgeno con la T, mientras que la C forma tres puentes de hidrgeno con la G. Dicho
fenmeno se conoce como complementariedad de bases, es decir que la A es
complementaria a la T y la C lo es para la G. Estos enlaces mantienen estable la
estructura de doble hlice de ADN.

En esta estructura de doble hlice de ADN se pueden distinguir pares de nucletidos o

pares de bases (pb). Estas pb pueden usarse como unidad de tamao o longitud para las
molculas de ADN, de esta manera podemos decir por ejemplo que el ADN
cromosmico de Escherichia coli tiene un tamao de 4,2 millones de pb o lo que es lo
mismo de 4.200 kilobases (Kb)

Todas las clulas deben enfrentarse al problema de cmo lograr contener en su

estructura molculas tan grandes como el ADN. Volviendo al ejemplo de E.coli, los
4.200 Kb de su genoma implican una longitud de 1,3 mm es decir unas mil veces la
longitud de la clula. Las bacterias no poseen histonas asociadas a su genoma y en
consecuencia no tienen la posibilidad de compactar su ADN en estructuras tipo
nucleosomas como las clulas eucariotas. Por lo tanto, deben compactar su ADN de otra
manera. Esto se logra porque el ADN circular cerrado es capaz de adoptar una
estructura terciaria denominada superenrollamiento, que implica el enrollamiento del
eje de la doble hlice sobre s mismo. Este superenrollamiento se dice que tiene sentido
negativo porque tiene el sentido contrario al enrollamiento de una hebra de ADN sobre
la otra.

Esta estructura de superenrollamiento tambin supone para la bacteria una fuente de

almacenamiento de energa para ser usada en muchos procesos fisiolgicos que la
requieren, por ejemplo la separacin de las dos hebras de ADN necesaria para la
replicacin y la transcripcin. El cromosoma bacteriano es suficientemente largo como
para formar muchos lazos circulares, que como tales pueden superenrollarse formando
una serie de dominios topolgicos independientes. Esta organizacin en dominios
colabora a la compactacin general del genoma bacteriano e impide que, con la ruptura
de una hebra (en cualquier sitio del cromosoma) se pierda el superenrollamiento total,
manteniendo la energa almacenada.
3. COMPONENTES

Pellets bacterianos E.coli 25 unidades

Solucin de Lisis 20 ml
Solucin Precipitacin de Protenas 10 ml
Solucin de Hidratacin 20 ml

Componentes necesarios y NO suministrados

Microcentrifuga.
Microtubos y micropipetas.
Bao de Incubacin.
Etanol 70% y Isopropanol.
Sistema de electroforesis bsico (aparatos y reactivos).
Sistema de deteccin de cidos nucleicos.
4. PRCTICA

Esta prctica permite aislar el ADN cromsomico de clulas bacterianas de E.coli, estas
bacterias son Gram (-) as que no se necesita el tratamiento con lisozima que si
necesitan las bacterias Gram (+) que son ms difciles de lisar y necesitan para ellos
enzimas lticos.

4.1 Protocolo rpido

Este protocolo permite una rpida extraccin del ADN cromosmico de forma que se
puede realizar de una forma rpida en una clase prctica con alumnos. Las clulas
h ug 1. u u v v gh
clulas de E.coli y se suministran en forma de pellet bacteriano.

El primer paso es la incubacin del pellet bacteriano con una solucin de lisis que
romper las membranas celulares y liberar los cidos nucleicos. Luego se eliminarn
las protenas y restos celulares con la adicin de una solucin de precipitacin de
protenas. Despus de una centrifugacin nos quedaremos con el sobrenadante y
haremos precipitar los cidos nucleicos con isopropanol, seguido de un lavado con
etanol 70% y finalmente la hidratacin del ADN.

Lisis celular
1. Aadir 1.5 ml de un cultivo overnight a un tubo de 1.5 ml.
2. Centrifugar a 14.000 x g durante 30 segundos. Eliminar el sobrenadante.
3. Aadir 600 l de Solucin de Lisis al pellet celular y pipetear para resuspender y
lisar las clulas.
4. Incubar las muestras a 80C durante 5-10 minutos. Enfriar a temperatura ambiente.

Precipitacin de protenas
1. Enfriar la muestra a temperatura ambiente.
2. Aadir 300 l de Solucin de precipitacin de protenas.
3. Vrtex vigorosamente durante 20-30 segundos.
4. Centrifugar a 14.000 x g durante 5 minutos. Se observar que el precipitado proteico
forma un pellet.
Precipitacin del ADN
1. Pasar el sobrenadante que contiene el ADN a un tubo de 1.5 ml que contenga 600l
de isopropanol Mezclar por inversin varias veces.
2. Centrifugar a 14.000 x g durante 3 minutos.
3. Eliminar el sobrenadante. Aadir 600 l de etanol 70% e invertir varias veces para
lavar el pellet de ADN.
4. Centrifugar a 14.000 x g durante 2 minutos. Cuidadosamente eliminar todo el
etanol. Vigilar no perder el pellet de ADN
5. Invertir el tubo y dejar secar en papel absorbente durante 15 minutos.

Hidratacin del ADN

1. Aadir 500-750 l de Solucin de Hidratacin del ADN. Resuspender mediante
micropipeta el pellet blanco. La incubacin a 55C con peridicas agitaciones con
vortex ayudar a la disolucin del ADN.

5. RESULTADOS

M 1 2

M: Marcador peso molecular.

1. Pellet bacteriano E.coli.
2. Pellet bacteriano E.coli.
Tincin realizada con nuestro sistema NO TXICO DANABLUE-FLASHBLUE.

Se puede observar 2 bandas por encima de la ltima del marcador de peso molecular
que corresponden al ADN cromosmico. En este mtodo rpido no se utiliza el uso del
enzima RNasa que eliminara el ARN degradado que podemos observar como una o
dos bandas en la parte inferior del gel de agarosa.