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TRANSFERENCIA DE ADN A CLULAS ANIMALES

Las clulas animales pueden incorporar ADN por distintos mtodos como microinyeccin directa,
electroporacin, encapsulacin de ADN en membranas artificiales (liposomas) seguido de su fusin con
membranas celulares, vectores basados en virus, YAC o mediada por clulas germinales. En general, el
ADN introducido por cualquiera de estos mtodos se integra en el genoma del hospedador.

La transferencia de genes depende de la introduccin de secuencias de ADN en el ncleo de una clula


somtica, germinal, clula huevo fecundada o una clula madre embrionaria, seguido de la integracin
del ADN en un sitio del cromosoma.

Cultivo de clulas animales: Lneas celulares

1. Separar el cultivo de cekululas y se inicia a partir de una pequea muestra de tejido


2. Las clulas han de ser liberadas de la estructura intercelular (matriz extracelular)
Ya que esta rodea mantenindolas juntas e impidiendo su divisin invitro
3. Luego las clulas son colocadas en un medio complejo que contiene aminocidos,
antibioticios, vitaminas, glucosa, sales y factores de crecimiento. Y donde empieza la
divisin hasta que toda la suferficie se cubre con una monocapa de clulas

Transfeccin
En sentido amplio, la transfeccin consiste en la introduccin de material gentico externo en clulas
eucariotas mediante plsmidos, vectores vricos u otras herramientas para la transferencia. En un
sentido ms reducido, frecuentemente se usa solo para referirse a la introduccin de material gentico
en clulas animales, prefirindose otros trminos para otras clulas (ver Origen del trmino y relacin
con otros trminos).
4.
5. Transfeccin por Aggrobacterium
6.
La transfeccin de clulas animales generalmente se lleva a cabo abriendo poros o "agujeros"
transitorios en la membrana plasmtica de las clulas mediante electroporacin, para permitir el paso
del material gentico (como construcciones de DNA superenrollado o siRNA) aunque pueden ser
transfectadas incluso protenas (como anticuerpos, por ejemplo). Adems de la electroporacin, se
pueden utilizar otras tcnicas para efectuar la transfeccin, como por ejemplo liposomas producidos
mediante la mezcla de lpidos catinicos con el material gentico, que se fusionarn con la membrana
plasmtica celular y depositarn su carga adentro.

Vectores de transferencia gnica


Un vector de transferencia gnica es el vehculo empleado para introducir ADN en una clula u organismo.

Existen dos grandes grupos de vectores, virales y no virales. Los primeros incluyen todos aquellos que se
han obtenido a partir de un virus tratando de eliminar sus caractersticas patolgicas y de adaptarlos a su
nueva funcin como transportadores de material gentico heterlogo. Pretenden aprovechar la ventaja
que aportan los virus como vectores naturales que han sufrido procesos de evolucin complejos a lo largo
de millones de aos para optimizar la funcin de introductores de material gentico en las clulas que
invaden. Los vectores no virales siguen una estrategia de sntesis en lugar de modificacin. Parten de
estructuras sencillas conocidas e intentan reconstruir desde la base un sistema completamente artificial
que posibilite el transporte efectivo de genes en el interior de la clula. Existen tambin vectores
biolgicos no virales (bacterianos) como portadores de genes teraputicos, pero son los menos
estudiados.

Fig1. Tipo de vectores y proceso esquematizado de obtencin.


Las caractersticas de un vector ideal para poder adaptarlo luego a situaciones concretas seran las
siguientes:

- Que sea reproducible


- Que sea estable
- Que permita la insercin de material gentico sin restriccin de tamao
- Que alcance concentraciones elevadas (> 108 partculas/ml)
- Que permita la transduccin tanto de clulas en divisin como quiescentes
- Que posibilite la integracin especfica de gen
- Que reconozca y acte sobre clulas especficas
- Que la expresin del gen pueda ser regulada
- Que carezca de elementos que induzcan una respuesta inmune
- Que pueda ser caracterizado completamente
- Que sea inocuo y minimice sus posibles efectos secundarios
- Que sea fcil de producir y almacenar a coste razonable

El vector es una parte importante en el sistema de transferencia gnica, pero el sistema consta de dos
componentes: el vector (vehculo de transporte) y el cargo (material a ser transportado). El cargo a su vez
se subdivide en: el efector (gen a introducir) y el soporte (los elementos que condicionan su expresin).

El cargo suele ser una estructura de tipo plasmdico (ADN bicatenario y circular), aunque puede ser de
diversa naturaleza y complejidad, desde un simple oligonucletido hasta un cromosoma artificial, que
permite incorporar una cantidad elevada de material gentico con capacidad de perpetuacin en el
tiempo.

El efector que se utilice depender del efecto que se persiga. Si se pretende compensar, sustituir o reparar
un gen daado, el efector debe ser una copia del gen intacto o un elemento que permita su reparacin.
Si se pretende inducir un efecto biolgico concreto (eliminar especficamente un tipo de clulas, bloquear
la expresin de un virus, inducir una respuesta inmune), se pueden introducir genes naturales que
potencien dicho efecto o genes que originen nuevas actividades que den lugar al efecto perseguido.

El soporte es la base para el control de la expresin del transgen e incluye distintos tipos de elementos
reguladores. El primero y fundamental es el promotor, la zona de ADN anterior al gen donde se recluta la
maquinaria de transcripcin. La naturaleza del promotor condiciona el tipo de regulacin de la expresin
gnica. Se pueden utilizar promotores constitutivamente activos o promotores especficos, que slo son
activos en un tipo celular concreto. De la misma manera se pueden emplear promotores inducibles, que
requieren la presencia de un elemento concreto para ejercer su funcin. ste puede ser un agente de
adiccin exgena (control externo) o un agente determinado por caractersticas fisiolgicas especiales
(como por ejemplo promotores activos ante situaciones de hipoxia). Otros elementos del soporte que
pueden ser importantes dependiendo de la funcionalidad perseguida son los potenciadotes y represores
de los promotores, secuencias de aislamiento (insulators) que impiden las influencias de secuencias
reguladoras prximas, secuencias de
integracin (para permitir la inclusin del material exgeno dentro del genoma de la clula hospedadora),
secuencias de recombinacin homloga (para permitir el intercambio de material gentico con el genoma
hospedador con una regin especfica), secuencias de empaquetamiento (para introducir el material
gentico en el interior de un vector viral), secuencias inmunoestimulantes (secuencias bacterianas del
tipo islas CpG no metiladas que sirven como coadyuvantes en las vacunas de ADN)

Los vectores son los encargados de asegurar la estabilidad del material gentico transportado y de vencer
todas las barreras biolgicas hasta alcanzar su destino final, el ncleo de la clula diana, donde tiene lugar
la regulacin gnica. Tambin de ellos va a depender la va de administracin a utilizar.

En los casos de transferencia gnica en individuos postnatales, el vector ha de solventar barreras en su


camino hacia su destino funcional. Entre estas barreras se incluyen: la estabilidad en el medio extracelular
(para evitar su degradacin y eliminacin), el reconocimiento de la clula diana (generalmente mediante
un receptor especfico), su unin a la membrana, su internalizacin en la clula (normalmente utilizando
un sistema de transporte vesicular como la endocitosis), el escape de los sistemas de degradacin
intracelular (lisosomas) y su entrada final al ncleo, donde debe desmantelarse para permitir que el
material gentico que transporta gane acceso a su ubicacin final y a la maquinaria de transcripcin.

Fig2. Puntos clave para regular la eficacia de un vector de transferencia gnica que se introduce en el
individuo

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Transfeccin de clulas somticas animales

La transfeccin de clulas somticas es til para el cuidado medico y veterinario de enfermedades


genticas, y para otros propsitos teraputicos o de mejoramiento de animales.
La transferencia de genes a clulas somticas puede hacerse en el laboratorio (ex vivo) o directamente a
las clulas en el cuerpo (in vivo). En la forma ex vivo, se extraen clulas del individuo para ser
transformadas (proceso por el cual se transfiere exitosamente un gen a una clula) con el vector que
contiene la versin normal del gen. Este mtodo tiene la ventaja de que la transferencia de genes es ms
eficiente y permite la propagacin de las clulas transformadas para generar grandes cantidades. La
desventaja es que slo es utilizable para el individuo especfico del cual se extrajeron esas clulas, adems
de ser costoso por la gran manipulacin y control de calidad requeridos. En el mtodo in vivo se administra
el vector (que contiene el gen normal) a los individuos. Este mtodo puede utilizarse con muchos
individuos, lo que disminuye su costo y la infraestructura necesaria, pero resulta complicado de controlar
y la eficiencia es mucho menor.

Fig. 1. Sistemas para transferir genes a clulas somticas en individuos

Los vectores son los vehculos microscpicos que se utilizan para transferir genes a las clulas, a
continuacin se exponen sus caractersticas y su relevancia. Hay tres principales tipos de vectores: virales,
no virales y fsicos.

Virales: El mtodo ms eficaz para llevar genes sanos a las clulas daadas es por medio de virus que
han sido adaptados como vectores. Los virus son tiles ya que pueden penetrar naturalmente las clulas,
insertando en ellas su material gentico.

Sin embargo, antes de poder usarlos como vectores deben modificarse para eliminar los genes virales que
les permiten replicarse y causar enfermedad. A estos virus se les llama virus modificados o atenuados, y
entre los ms utilizados como vectores se encuentran los retrovirus, adenovirus y virus adeno-asociados.
Tambin se han desarrollado poxvirus (especialmente el virus de la vaccinia) para vacunas y terapias
gnicas. Actualmente, los vectores virales son los ms eficientes para transformar clulas, aunque no
carecen de desventajas: son de manufactura costosa, hay lmites a la cantidad de genes (es decir, la
longitud de los fragmentos de ADN) que pueden ser insertados en los vectores y que pueden llegar a
desencadenar una respuesta inmune (inmunogenicidad).
No virales: Bsicamente se trata de inyectar el fragmento de ADN que contiene el gen de inters
directamente a las clulas o empacado dentro de otras molculas como son los liposomas (pequeas
vesculas de grasa que pueden transportar sustancias al interior de las clulas). Los vectores no virales son
menos eficientes para transformar clulas, pero no tienen limites para el tamao del inserto (el tamao
del ADN que se va a inyectar), son menos inmunognicos y ms fciles de elaborar.

Fsicos: Involucran sobre todo inyectores sin aguja y electroporacin. Los inyectores sin aguja utilizan alta
presin para insertar el ADN en clulas de la piel o en clulas en cultivo, mientras que la electroporacin
utiliza pulsos elctricos que abren temporalmente agujeros en las membranas de las clulas,
permitiendo insertar el ADN. Los mtodos fsicos an son ineficientes en la transformacin y tienen un
rango limitado de aplicacin.

Los riesgos de la terapia gnica continan siendo difciles de cuantificar. Por ello cada ensayo debe
comenzar lentamente, con un control muy cuidadoso de la dosis de vectores que contengan los genes
que se pretende insertar. Estos riesgos tomaron una nueva dimensin en el otoo de 1999, cuando un
joven de 18 aos muri cuatro das despus de haber iniciado un tratamiento con terapia gnica. Los
mismos riesgos podemos asumir para el resto de especies animales manipuladas genticamente.

Transgnesis
La transgnesis se puede definir como la introduccin de ADN extrao en un genoma, de modo que se
mantenga estable de forma hereditaria y afecte a todas las clulas en los organismos multicelulares.
Generalmente, en animales, el ADN extrao, llamado transgen, se introduce en zigotos, y los embriones
que hayan integrado el ADN extrao en su genoma, previamente a la primera divisin, producirn un
organismo transgnico; de modo que el transgn pasar a las siguientes generaciones a travs de la lnea
germinal (gametos).

Entre las aplicaciones de los animales transgnicos se pueden destacar:

La posibilidad de estudiar a nivel molecular el desarrollo embrionario y su regulacin.


Manipular de forma especfica la expresin gnica in vivo.
Estudiar la funcin de genes especficos.
Poder utilizar a mamferos como biorreactores para la produccin de protenas humanas.
La correccin de errores innatos de metabolismo mediante terapia gnica.

La transgnesis se puede efectuar siguiendo dos estrategias comunes, microinyeccin de zigotos y la


manipulacin de clulas embrionarias, las cuales se describen brevemente a continuacin:

1. Transgnesis por microinyeccin de zigotos

Desde que en 1982 se obtuviera un ratn transgnico, la produccin de animales transgnicas


es cada vez ms cotidiana, existiendo ya
animales transgnicos de las siguientes especies: ratn, rata, conejo, cerdo, vaca, cabra y oveja.
La tcnica se realiza, fundamentalmente por microinyeccin y se realiza de la siguiente forma:

o En la primera fase, se aslan un nmero grande de vulos fertilizados. Se consigue


sometiendo a las hembras a un tratamiento hormonal para provocar una
superovulacin. La fertilizacin puede hacerse in vitro o in vivo.
o En la segunda fase, los zigotos obtenidos se manipulan uno a uno y con una micropipeta
a modo de aguja, se introduce una
solucin que contiene ADN.
o En la tercera fase, estos vulos son reimplantados en hembras que actuarn como
nodrizas permitiendo la gestacin hasta trmino.

Por ltimo, tras el destete de los recin nacidos, stos se chequean, para ver si ha ocurrido la
incorporacin del transgn.

2. Transgnesis por manipulacin de clulas embrionarias.

Una estrategia ms poderosa para la transgnesis implica la


introduccin de ADN extrao en clulas embrionarias totipotentes (clulas ES) o clulas
embrionarias madres (clulas EM). Estas clulas se toman del interior de la blstula en desarrollo
y se pasan a un medio donde se tratan con distintos productos con lo que se conseguir que las
clulas no se diferencien, y se mantiene su estado embrionario.

El ADN extrao se introduce en las clulas ES mediante diversas tcnicas, posteriormente las
clulas transfectadas son reintroducidas en una blstula y sta reimplantada en una hembra.

Con esta tcnica los neonatos son quimeras; pero mediante el cruce de stas se consiguen
animales transgnicos con aquellas quimeras que hayan incorporado el transgn en su lnea
germinal

El ganado transgnico que se emplea para producir protenas teraputicas, debe contener en el ADN
extrao de sus clulas, adems del gen codificante de la protena, una secuencia o promotor que haga
que se exprese dicho gen en unas determinadas clulas solamente. Por ejemplo, si se quiere que la
protena se produzca junto con la leche, el transgn se fusiona con una secuencia reguladora de una
protena de la leche, con lo que la protena slo se formar en las clulas de glndulas mamarias.
Esto es lo que se hizo con la oveja Tracy en 1992, la primera oveja que produjo una protena humana, la
alfa-antitripsina bajo la direccin del promotor ovino de la beta-lactoglobulina. Dicha protena se produce
en una cantidad de 35 g/l, la cual se emplea para curar el edema pulmonar.

Lo mismo se ha hecho para la famosa cerda Genie, que fabrica en su leche la protena C humana que
controla la coagulacin sangunea y es necesaria para los hemoflicos.
Adems de estas tcnicas existen otras alternativas que se describirn ms adelante, y algunas de las
cuales son una combinacin.
Transferencia gnica por microinyeccin
Microinyeccin pronuclear: pequeas cantidades del ADN de inters (transgen) eran inyectadas en el
proncleo de un embrin al estado de dos clulas. Aunque ampliamente aceptada y utilizada en forma
rutinaria en muchos laboratorios, ha habido muy poco progreso para mejorar su eficiencia, la que se
mantiene en el orden 0.1-5%, dependiendo de la especie considerada.

En la dcada del 80 ocurri un importante avance en la tecnologa de animales transgnicos que marc el
curso de la investigacin en este campo por al menos dos dcadas. Gordon y colaboradores describieron
una tcnica donde el ADN desnudo fue inyectado en el proncleo de un ovocito de ratn recientemente
fertilizado, el que posteriormente se transfiri a hembras receptoras sincronizadas. Este experimento
demostr que era posible usar un plsmido recombinante como vector para transferir genes forneos
directamente hacia el embrin. El ADN inyectado de esta forma se integr en el genoma y pudo ser
heredado por la descendencia de los animales transgnicos fundadores. La inyeccin de embriones al
estado de una clula fue clave para obtener una integracin temprana del transgen, permitiendo al ADN
forneo contribuir en el genoma de todas las clulas somticas y la lnea germinal.

Generacin de los ratones transgnicos:

En una primera fase se aslan un nmero grande de ovocitos fertilizados, los que se consiguen sometiendo
a la hembras a un tratamiento hormonal para provocar una mayor ovulacin.
En una segunda fase los ovocitos recin fertilizados se manipulan uno a uno, y con una micropipeta a
modo de aguja se introduce una solucin que contiene ADN. El ADN purificado es inyectado directamente
en el pronucle masculino de un zigoto, utilizando para ello un micromanipulador acoplado a una pipeta
con presin negativa y otro manipulador a acoplado a una aguja de inyeccin

Fig3. Instrumental para microinyeccin pronuclear

Fig.4 Fig.5
Fig. 4 y 5. La figura de la izquierda (4) representa un dibujo esquemtico de cmo se introduce el ADN por
microinyeccin en el pronucleo del zigoto. A la derecha (5) hay una foto tomada en tiempo real es la que
se observa lo descrito anteriormente.

En la tercera fase estos vulos son reimplantados en hembras que actuarn como nodrizas permitiendo
el trmino de la gestacin. Se implantan de 20-30 zigotos en el oviducto de una hembra semipreada
(recientemente apareada con un macho vasectomizado. Alrededor de 19 das ms tarde se nacen de 5-8
cras. Los animales transgnicos se identifican mediante anlisis de PCR a partir de ADN extrado de las
colas de los ratones de tres semanas de vida. Los transgnicos son verificados posteriormente por
Southernblots.

Fig.6. Implantacin de vulos transfectados e Identificacin de ratones transgnicos nacidos mediante la


tcnica de PCR
Los ratones positivos para la prueba PCR son cruzados con animales controles para identificar a los
fundadores, es decir, aquellos que tienen el transgen insertado en su lnea germinal.
La eficiencia de transgnesis con este mtodo es menor al 5%. La integracin del transgen en el genoma
del ratn es al azar y los niveles de expresin son variables.
En ciertos casos la integracin del transgen tambin ocurri despus de la primera divisin del zigoto, lo
que result en animales fundadores mosaicos. Estos animales mosaicos an transmiten el transgen a la
descendencia pero lo hacen a una frecuencia menor al 50%. Desgraciadamente, la eficiencia para generar
animales transgnicos utilizando esta tecnologa es baja, particularmente en animales de granja. La
eficiencia de la inyeccin pronuclear est controlada por una serie de factores como quedara demostrado
por los trabajos de Brinster y colaboradores en 1985, quienes entregaron valiosa informacin sobre la
integracin de los transgenes y permitieron establecer que la concentracin y la forma (circular o linear)
del ADN eran los factores ms crticos para una eficiente

Desde entonces, la tecnologa ha sido implementada con xito en la mayora de los animales domsticos
como en conejos, por Buhler y colaboradores en 1990, ovejas, por Wright y colaboradores en 1991, cabras
por Ebert y colaboradores en 1991, vacas por Krimpenfort y colaboradores en 1991 y cerdos por Wall y
colaboradores en 1990. Sin embargo, adems de los problemas asociados con la integracin de los
transgenes hay ineficiencias asociadas con la recoleccin, cultivo de los huevos fertilizados y transferencia
de los embriones hacia las hembras receptoras.
. Estos estudios mostraron los problemas de la inyeccin pronuclear con relacin al control de los niveles
de expresin del transgen. Se encontr una gran variacin de expresin en las lneas de animales
transgnicos generados, siendo sta en general muy pobre, especialmente si no todos los elementos
reguladores del transgen eran incluidos en la construccin gentica (plsmido). Esto llev a que muchos
investigadores dedicaran mayores esfuerzos a entender la forma en que los transgenes se insertan en el
genoma del animal y los factores que afectan la expresin de los mismos. Esto explica por qu la mayora
de los experimentos dirigidos a alterar la composicin de la leche han sido realizados principalmente en
el ratn, aunque existen algunas notables excepciones tales como la secrecin de protenas de valor
teraputico como el factor IX de la coagulacin en la leche de ovejas por Wright y colaboradores en 1991,
el activador de plasmingeno de tejido en la leche de cabras por Ebert y colaboradores en 1991 y la
lisozima humana en la leche de bovinos por Krimpenfort y colaboradores en 1991. Sin embargo, dada la
baja eficiencia de esta tecnologa, sumado a los costos involucrados, es que ha habido una bsqueda
constante por nuevas alternativas.
En trminos generales, a continuacin se presenta una grfica con los niveles de eficiencia de la tcnica
para diferentes especies de animales:

Fig.7. Niveles de eficiencia de la microinyeccin pronuclear para diferentes especies de animales.

- Microinyeccin de ADN en clulas embrionarias: manipulacin de las clulas madre embrionarias de


ratn (ES cells) apareci como una potencial solucin para muchos de los problemas encontrados con la
tcnica de microinyeccin pronuclear.
Transformacin gentica mediante recombinacin homloga en clulas madre embrionarias (ES cells). El
aislamiento de clulas madre embrionarias de ratn, en 1989 por Thompson y colaboradores, abri
nuevas posibilidades para estudiar la funcin gnica en animales transgnicos. Las clulas madre
embrionarias se obtienen desde el macizo celular interno de blastocistos y se pueden mantener en
cultivos sin perder su estado indiferenciado gracias a la presencia en el medio de cultivo de factores
inhibitorios de la diferenciacin. Estas clulas pueden ser manipuladas in vitro va recombinacin
homloga, permitiendo as alterar la funcin de genes endgenos. Las clulas as modificadas pueden ser
entonces reintroducidas en blastocistos receptores contribuyendo eficientemente a la formacin de
todos los tejidos en un animal quimrico incluyendo la lnea germinal.
Utilizando esta tecnologa ha sido posible anular la funcin de genes endgenos del ratn mediante la
integracin de un marcador de seleccin, lo que ha permitido la generacin de varios cientos de ratones
llamados knock out que han servido como modelos de enfermedades genticas en humanos y como
modelos para analizar la funcin de genes endgenos (Melton, 1994; Shastry, 1998; Kolb y col., 1999;
Wallace y col., 2000)

Fig.8. Representacin de las tcnicas de microinyeccin pronuclear y microinyeccin de clulas


embrionarias
Transferencia gnica con transposones
Los transposones se definen como elementos transponibles que contienen genes adicionales a parte
de los necesarios para la transposicin y estn dentro de secuencias repetidas. Dentro de esta
categora se encuentran los trasposones compuestos de procariotas, familia Tn3, elemento P de
Drosophila, secuencias Alu de mamferos, retrotrasposones

CLASE I: MEDIANTE DNA


Elementos IS (Is1, IS2, IS3, IS30, IS200, etc)

Transposones compuestos (Tn5, Tn10, etc)

Transposones de la familia Tn3


I.I PROCARIOTAS
Bacterifagos (Mu, lambda, P22, etc)

Sistemas de inversin
Elementos controladores del Zea mays (Ac, Mu,
Sm, etc)

Elementos P de Drosophila
I.II. EUCARIOTAS

Superfamilia vrica
CLASE II: MEDIANTE RNA
Retrovirus, LINE, Ty, ...

Superfamilia no vrica

II.II EUCARIOTAS SINE Alu y B1 de mamferos, pseudogenes


procesados derivados de la polimerasa II
Los trasposones son secuencias de material genmico que tienen la capacidad del saltar fuera y dentro del
genoma. Son capaces de autorreplicarse e integrarse aleatoriamente en nuevos sitios dentro del genoma
(trasponerse o saltar). Pueden entrar en plsmidos y ser propagados por ellos. Estas propiedades les
confieren la capacidad de ser transferidos exitosamente en clulas y genomas extraos.

La ingeniera gentica puede manipular estos trasposones para llevar a cabo transferencia horizontal de
genes. La transferencia horizontal de genes es la transferencia de material gentico entre clulas y genomas
que pertenecen a especies no relacionadas, por procesos distintos a la reproduccin. Un ejemplo de ello es
el uso de los trasposones de salmnidos para la transferencia gnica en vertebrados. Los trasposones de
vertebrados de la familia Tc1/mariner contienen como mnimo un gen nico que codifica la enzima trasposasa
flanqueada por dos repeticiones terminales invertidas (tir). Cada una de las tir posee uno o varios sitios de
20-30 p.b. de interaccin con la trasposasa. La trasposasa interacciona con estos sitios para cortar el
trasposn, luego interacciona con secuencias presentes en el genoma en otro locus y pega el trasposn en el
nuevo locus. En vertebrados todos los trasposones que se han detectado estn inactivados por mutaciones.
Sin embargo recientemente se ha obtenido un trasposn activo de salmnidos mediante mltiple
mutagnesis dirigida. Dicho transposn denominado Bella durmiente o Sleeping beauty (SB) se puede
usar en todos los vertebrados analizados hasta el momento como vehculo de incorporacin de nuevos genes
y para inactivar genes en el genoma por insercin.
Fig.11. Esquema de un procedimiento para integrar genes en clulas usando trasposones.
Transferencia gnica con vectores virales
Los vectores virales son todos aquellos que han sido obtenidos a partir de un virus, tratando de eliminar
sus caractersticas patolgicas y adaptarlos a una nueva funcin como transportadores de material
gentico heterlogo. Pretenden aprovechar las ventajas que aportan los virus como vectores naturales
que han sufrido procesos de evolucin complejos a lo largo de millones de aos para optimizar su funcin
de introductores de material gentico en las clulas que invaden. Para modificar un virus y transformarlo
en un vector de transferencia gnica en animales, el primer paso es bloquear su capacidad de propagacin
eliminando los genes responsables de su replicacin. El segundo paso es la eliminacin de parte del
genoma viral para crear espacio para introducir el material gentico de inters (gen o genes, ms los
elementos de control). Se han de eliminar genes que no sean esenciales, y especialmente aquellos que
puedan resultar txicos o perjudiciales para el individuo a manipular.
La ventaja de los vectores virales en la gran eficacia de transferencia y la posibilidad, en algunos casos, de
integrar el transgen en el genoma de la clula hospedadora. Por otro lado presentan desventajas como
su falta de especificidad celular en la mayora de los casos, la limitacin del tamao (debido a que han de
empaquetarlo en la cpsida), su elevada inmunogenidad y el riesgo biolgico que conllevan
(reconstitucin de partculas replicativas por recombinacin, y oncogenidad inducida por integracin
inespecfica.

- Vectores retrovirales
Los retrovirus son virus de ARN con envuelta. Poseen una elevada eficacia de transduccin en un gran
nmero de tipos celulares, son capaces de integrarse de forma estable en el genoma de las clulas que
infectan sin expresar ninguna protena viral inmunognica, y son relativamente poco patognicos, con
excepcin de algunos como el VIH. La mayora de ellos derivan del virus de la leucemia murina (MuLV).

En general, su principal limitacin es que slo pueden transducir eficazmente clulas en divisin, ya que
el acceso al ncleo del complejo de preintegracin requiere la ruptura de la membrana nuclear. Hay un
tipo de retrovirus, los lentivirus, que si que pueden infectar e integrarse en clulas quiescentes, como el
VIH y SIV, pero el riesgo inherente al uso de los mismos limita su aplicacin.
Otro inconveniente que tiene el uso de retrovirus como vectores es la poca estabilidad de las partculas y
su baja tasa relativa de produccin. Esto ha sido parcialmente resuelto con la sustitucin de la protena
de la envuelta por la glicoprotena G del virus de la estomatitis vesicular que posibilita la obtencin de
ttulos de hasta 109 p.i. /ml y estabiliza las partculas.
Debido a que estos virus tienen un rango de infectividad muy amplio, cuando se quiere transducir
selectivamente una poblacin celular, se le incorporan ligandos heterlogos o anticuerpos
monocatenarios que generan nuevas especificidades. Son vectores que poseen protenas quimricas en
la envuelta.
Contrario a la percepcin de muchos, los primeros animales transgnicos fueron producidos hace ya casi
30 aos mediante la microinyeccin de ADN viral (SV40) en la cavidad del blastocele de embriones de
ratn (Jaenish y Mintz, 1974). Los prximos intentos involucraron embriones de ratn infectados con el
retrovirus Moloney de la leucemia murina (MoMuLV), lo que result en la transmisin estable hacia la
lnea germinal (Jaenish, 1976). Esto se logr reemplazando genes que no son esenciales para el virus por
genes heterlogos, aprovechando as la capacidad de los virus de infectar un amplio espectro de clulas
y con una gran eficiencia. Una de las grandes desventajas de este mtodo radica en que la integracin del
ADN se produce en diferentes etapas del embrin en desarrollo, lo que implica que el ADN no se integra
en todas las clulas somticas o en la lnea germinal y por lo tanto no hay transmisin del transgen a la
descendencia. Adems, los animales generados por este mtodo tienen a menudo ms de un sitio de
integracin, lo cual ocurre cuando ms de una clula del embrin es infectada por el virus (Palmiter y
Brinster, 1985). Esto implica que las lneas de ratones transgnicos deben ser cruzadas para segregar los
diferentes loci conteniendo el transgen y poder as aislar lneas con un sitio de insercin nico. Finalmente,
los vectores retrovirales poseen una limitada capacidad de ADN forneo que puede ser acomodado,
alrededor de 8 kb, lo cual imposibilita muchos experimentos especialmente con secuencias genmicas
humanas que pueden superar ampliamente este tamao.
- Vectores Adenovirales

Los adenovirus son virus de DNA sin envuelta con un genoma bicatenario hasta 36 kb. Se han seleccionado
los serotipos 2 y 5 para la obtencin de vectores por no estar asociados con ninguna enfermedad severa
ni originar tumores en animales. Pueden transducir un nmero bastante amplio de tipos celulares
distintos, tanto clulas en divisin como post-mitticas, con una eficacia muy elevada. El genoma viral se
mantiene epismico, lo que permite una expresin gentica transitoria.
Originalmente la capacidad del vector para incorporar ADN era de hasta 8 kb. Recientemente se ha
conseguido eliminar casi todo el genoma viral, manteniendo las secuencias de empaquetamiento y las
secuencias terminales, rindiendo vectores que pueden incorporar hasta 35 kb a los que se les ha
denominado vectores sin tripas (gutless).
La eliminacin de material genmico viral adems de aumentar la capacidad del vector de incorporar
ADN, disminuye el riesgo de induccin de respuesta inmune. La mayora de la poblacin ha sido infectada
en algn momento por adenovirus y presenta una respuesta inmune inicial.
Una de las mayores ventajas de estos virus es su alta reproductividad con ttulos de hasta 10 10 p.i./ml, y
Su falta de especificidad celular se compensa con el desarrollo de estrategias de redireccionalidad.
Quimeras que introducen ligandos especficos en protenas de la cpside y molculas biespecficas que
reconocen tanto la cpside viral como el receptor seleccionado.

Vectores de virus adenoasociados

Los virus adenoasociados son parvovirus humanos no patolgicos. Son pequeos virus sin envuelta con
un genoma de ADN monocatenario, capaces de infectar un gran nmero de clulas de origen diverso,
tanto en divisin como en su estado quiescente.
Pueden integrarse en la clula hospedadora en un lugar especfico del genoma, eliminando la posibilidad
de mutagnesis insercional. Otra ventaja en la carencia de respuesta inmune observada in vivo.
Tiene una reducida capacidad de transporte (4,5 kb) y su reproduccin es tediosa porque necesitan un
virus de apoyo (adenovirus o herpesvirus), los cuales son difciles de eliminar completamente.
Originalmente se descubri que al eliminar parte del genoma viral para introducir el transgen se perda la
capacidad de integracin especfica. Recientemente se ha descubierto que la protena Rep78, en
presencia de los ITRs, es capaz de potenciar la integracin especfica en el genoma celular y podra
solucionar este problema.
La falta de especificidad celular ha sido solucionada empleando estrategias de molculas biespecficas.

Fig.12. Vectores virales de transferencia gnica