Arq Neuropsiquiatr 2004;62(2-A):276-281

ANLISE COMPARATIVA DE CORTES DE

ENCFALOS HUMANOS COM COLORAO
POR TRS TCNICAS DIFERENTES
Murilo Sousa de Meneses1, Juan Carlos Montano Pedroso2,
Rbia Ftima Fuzza2, Jernimo Buzetti Milano3

RESUMO - O estudo anatmico do encfalo em cortes facilitado empregando-se mtodos de colorao para substncia cinzenta.
Os mtodos mais freqentemente empregados so os de Barnard, Robert e Brown, Mulligan e Green. O objetivo deste estudo foi
determinar qual dessas tcnicas apresenta melhores resultados com relao diferenciao entre substncias branca e cinzenta.
Trinta cortes coronais de hemisfrio cerebral humano foram submetidos s trs tcnicas, comparados entre si e analisados de acordo
com trs parmetros estabelecidos: grau de diferenciao entre as substncias branca e cinzenta; presena de linha nica e
contnua separando a substncia branca do crtex cerebral; grau de impregnao da colorao em outros locais de substncia
branca. Atriburam-se pontuaes de 0 a 3 conforme a presena destes parmetros, cada corte recebendo pontuao total que
variava de 0 a 9. Aps anlise estatstica, a tcnica de Barnard, Robert e Brown apresentou mdia 8,33; a de Green 7,93 e a de
Mulligan, 7,5, com diferena estatisticamente significativa.
PALAVRAS-CHAVE: tcnicas de colorao, substncia cinzenta, neuroanatomia.

Comparative analysis of human brain slices with three different staining techniques
ABSTRACT - Studing neuroanatomy at brain slices with gray matter staining techniques has several advantages. More often, the
models described by Barnard, Robert and Brown, Mulligan, and Green are used.The aim of this study was to identify which of them
achieves the best results on differentiation between the gray and the white matter.Thirty coronal slices of human brains underwent
staining by the three techniques, and thus compared and analysed according this three parameters: degree of differentiation between
white and gray matter, presence of a single and uninterrupted line dividing the white matter from the brain cortex; and degree of
impregnation of the color staining in the white matter; scores from 0 to 3 have been given for the three parameters, with total
score from 0 to 9. After statistic analysis, the Barnard, Robert and Brown model showed the best results, followed by Greens and
Mulligans.
KEY WORDS: staining methods, gray matter, neuroanatomy.

O estudo de cortes de encfalo sem tcnicas de colorao
encontra dificuldades na diferenciao das estruturas de
substncia cinzenta e de substncia branca. Estruturas como o
cortx cerebral e os ncleos da base so formadas por substncia
cinzenta com predomnio de corpos celulares de neurnios.A coroa
radiada, a comissura anterior, as cpsulas interna, externa e
extrema, entre outras formaes, representam a substncia
branca, formada basicamente pelos axnios de neurnios e cor-
respondendo s vias de projeo e de associao1.Em certos casos,
vias aferentes e eferentes passam atravs de ncleos de substncia
cinzenta. Por exemplo, o globo plido contm as vias de sada
do corpo estriado e dividido em duas pores, uma lateral ou
externa e outra medial ou interna2. Desta poro saem vias
eferentes ao tlamo e ao ncleo subtalmico. Tais fibras fazem
com que o globo plido apresente aspecto particular em rela-
o aos demais ncleos da base3.A diferenciao detalhada desses
ncleos e dessas vias melhor evidenciada com o emprego de
tcnicas de colorao do encfalo.
Apesar da maioria dos laboratrios no empregar mtodos
de colorao em estudos anatmicos, diferentes meios tm
sido descritos para diferenciar as estruturas de substncia
branca e de substncia cinzenta4. O mtodo de Mainland con-
siste em submergir cortes de encfalo sucessivamente em
solues de cloreto frrico, ferrocianeto de potssio e cido
nitrico5. O mtodo de Kondratjew realizado imergindo-se
seces de encfalo em uma soluo de anidrido de vandio,

Departamento de Anatomia da Universidade Federal do Paran (UFPR), Instituto de Neurologia de Curitiba (INC), Curitiba PR, Brasil: 1Neurocirurgio, Doutor em
Anatomia, Professor e Chefe do Departamento de Anatomia da UFPR; 2Mdico; 3Residente de Neurocirurgia do INC.
Recebido 13 Junho 2003, recebido na forma final 30 Setembro 2003. Aceito 12 Novembro 2003.
Dr. Murilo Sousa de Meneses - Instituto de Neurologia de Curitiba - Rua Jeremias Maciel Perreto 300 - 81210-310 Curitiba PR - Brasil.
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glicerina e cido fosfrico, acrescentando-se aps ferro pulve-
rizado e vermelho neutro6. A tcnica de Fujari baseia-se na
fixao da pea em formol com sulfato de zinco, seguida da
imerso desta em soluo de prussiato amarelo de potssio7.
O mtodo de Mari consiste em submergir cortes de encfalo
em soluo de fenol, sulfato de cobre e cido clordrico, seguido
de imerso em soluo de cido tnico e hipoclorito de sdio4.
A tcnica de Bachi realizada atravs da imerso dos cortes
de encfalo em soluo de cido tnico e hipoclorito de sdio4.
Contudo, os mtodos que vm sendo utilizados com maior
freqncia nos laboratrios de neuroanatomia, provavelmente
devido praticidade de realizao que apresentam, so os
mtodos de Green4, Mulligan7 e Barnard, Robert e Brown8.
O objetivo do presente estudo foi determinar o melhor
mtodo para evidenciar os ncleos da base e as vias de projeo
e de associao intra e inter-hemisfricas pelas trs tcnicas mais
utilizadas nos laboratrios de neuroanatomia, ou seja, os
mtodos de Green, Mulligan e Barnard, Robert e Brown. No
foram encontrados trabalhos cientficos na reviso de literatura
que comparassem a eficcia de tais tcnicas.
MTODO
Vinte encfalos humanos de individuos adultos brancos foram
obtidos no Departamento de Anatomia da Universidade Federal do
Paran e do Servio de Anatomia Patolgica do Hospital de Clnicas
da cidade de Curitiba. O material foi colocado em soluo fixadora
de formol a 10 % e em seguida foram retiradas cuidadosamente todas
as meninges e os vasos da superfcie do encfalo. Os encfalos foram
ento seccionados atravs de cortes coronais seriados de espessura
de 10 mm, apoiando-se o material sobre superfcie plana, com au-
xlio de encfaltomo devidamente afiado, atravs de um nico
movimento, conforme preconizado pela literatura 9-12. Foram
selecionados 60 cortes coronais de encfalo; 20 destes passavam pela
comissura anterior, 20 pelo fascculo mamilo-talmico e 20 pelo
ncleo rubro e substncia negra. Tais cortes so clssicos no estudo
da neuroanatomia, pois evidenciam as mais importantes formaes
de substncia cinzenta e da substncia branca. Cada corte coronal,
por sua vez, foi seccionado no plano mediano sagital por um corte
nico passando pelo corpo caloso e fissura longitudinal do crebro,
totalizando-se quarenta cortes de hemisfrio cerebral para cada um
dos trs nveis. Separaram-se 30 cortes de hemisfrio cerebral para
cada mtodo, 10 deles passando atravs de cada nvel especfico j
citado. O trabalho foi aprovado pela Comisso de tica do
Departamento de Anatomia da Universidade Federal do Paran.
Segue-se a descrio das tcnicas de colorao aplicadas.
Tcnica de Mulligan - Aps a lavagem dos cortes em gua
corrente, deixou-se o material em imerso por dois minutos a uma
temperatura de 60-65, na seguinte soluo: a soluo de Mulligan:
Fenol 4,0g; cido cloridrico 0,125 ml; sulfato de cobre 0,5g; gua 100ml.
Em seguida fez-se lavagem em gua corrente (15 segundos) e
subseqente imerso em soluo de cido tnico a 2% por um
minuto. Aps nova lavagem em gua corrente, as peas foram
colocadas em soluo de almem de ferro a 0,5% por
aproximadamente um minuto. Fez-se nova lavagem em gua corrente
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e colocaram-se os cortes em soluo fixadora de lcool a 70 G.L.
Tcnica de Green - para a realizao desta tcnica procedeu-se
preparao de trs cubas da seguinte maneira: Cuba 1 - cido
carblico cristalizado 4%; sulfato de cobre cristalizado 1/2%; cido
clordrico concentrado 1/8%. Cuba 2 - cido tnico 2%. Cuba 3 -
almen de ferro 2%. Os cortes foram lavados em gua corrente e
ento imersos, durante um minuto, primeiramente na cuba 1 e em
seguida na cuba 2, sendo que, aps a retirada de cada cuba, foram
lavados em gua corrente por 15 segundos. Como a utilizao de
qualquer material metlico dentro das cubas pode alterar todo o
processo, foi empregada esptula de plstico. Por ltimo, fez-se a
imerso na cuba 3, por quinze segundos seguida de nova lavagem
em gua corrente.
Tcnica de Barnard, Robert e Brown - Os cortes foram imersos na
soluo de Mulligan previamente aquecida a 60-65 C, por
aproximadamente dois minutos, seguindo-se lavagem em gua corrente
morna por um minuto. Colocaram-se ento os cortes em soluo de
cloreto frrico a 1% durante um a trs minutos e lavaram-se em gua
corrente por um minuto. Seguiu-se a imerso dos cortes em soluo
de ferrocianeto de potssio a 1% durante um minuto. Lavou-se ento
o material em gua corrente morna por um minuto. Os cortes foram
submersos em soluo fixadora de formol a 10% acidificada com
cido clordrico suficiente para que se obtivesse soluo final a 2%.
A anlise dos cortes de encfalo coloridos foi realizada por
acadmicos do curso de Medicina da Universidade Federal do Paran,
durante a Disciplina de Anatomia Mdica II, atravs da visibilizao
das estruturas presentes em cada hemisfrio de acordo com trs
parmetros. O parmetro 1 analisa o grau de diferenciao entre as
substncias branca e cinzenta.As tcnicas de colocao empregadas
realam essa caracterstica presente no crebro humano, permitindo
maior distino entre as regies de substncias branca e cinzenta.
Procurou-se determinar qual das trs tcnicas melhor servia a este
propsito. Para isso analisou-se, em cada hemisfrio corado, a rea
percentual da superfcie de corte que mostrava diferenciao mais
ntida. Estipulou-se uma pontuao de 0 a 3 para cada corte de
hemisfrio. A nota 0 foi atribuda aos cortes de hemisfrio que
apresentaram melhor distino entre substncia branca e cinzenta
numa rea menor que 25% da superfcie total do corte; nota 1 in-
dica que essa melhor diferenciao foi possvel numa rea de 25 a
50% da superfcie de corte; nota 2 mostra a maior nitidez da distino
numa rea de 50 a 75%; a nota 3, em superfcie maior que 75%.
O parmetro 2 refere-se presena de linha nica e contnua
separando a substncia branca do crtex cerebral que a envolve.
Ao se realizar tcnicas de colorao de substncia cinzenta, corre-
se o risco de manchar a linha que delimita naturalmente a substncia
branca do crtex adjacente a ela. Nesse sentido, procurou-se
determinar qual das trs tcnicas mantinha essa linha com maior fide-
lidade. Para anlise desse parmetro atribui-se pontuao de 0 a 3
para cada hemisfrio. A nota 0 indica presena dessa linha nica e
contnua em rea menor que 25% da superfcie total do corte; a nota
1 mostra presena da linha em rea de 25 a 50% da superfcie total
do corte; a nota 2, linha em uma rea de 50 a 75% da superfcie to-
tal de corte; a nota 3, em rea maior que 75%.
O parmetro 3 indica o grau de impregnao da colorao em
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Fig 1. Foto de corte enceflico coronal passando pela comissura anterior, submetido a colorao de Barnard, Robert
e Brown.

Fig 2. Foto de corte enceflico coronal passando pelos corpos mamilares, submetido a colorao de Green.
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Fig 3. Foto de corte enceflico coronal passando pelos corpos mamilares, submetido a colorao de Mulligan.

Fig 4. escore mdio de cada tcnica de colorao nos 3 cortes de encfalo; a colorao de Barnard, Robert e Brown alcanou os
escores mais elevados; os valores de p indicados referem-se diferena entre esta colorao e a colorao de Mulligan.
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outros locais de substncia branca como a coroa radiada, a cpsula
interna e a substncia branca do lobo temporal.Avaliou-se a extenso
e a tonalidade com que essa impregnao foi observada. Sabe-se que
as tcnicas de colorao de substncia cinzenta podem apresentar
a desvantagem de impregnar tambm a substancia branca em graus
variados4. Procurou-se determinar qual das trs tcnicas realizadas
mantinham menor rea de substncia branca impregnada pelo
corante. Do mesmo modo, atribui-se pontuao de 0 a 3 para avalisar
este critrio. Nota 0 indica substncia branca impregnada pelo
corante em rea superior a 75% da superfcie total do corte; nota 1
refere-se presena de substncia branca impregnada pelo corante
em rea de 50 a 75% de superfcie total do corte; nota 2 impregnao
pelo corante em rea de 25 a 50% da superfcie total; nota 3, em
rea menor que 25% da superfcie total de corte.
Desta forma, estabeleceu-se classificao prtica para a anlise
das tcnicas utilizadas nesse estudo atravs da atribuio de
pontuaes para cada parmetro citado.
Para cada corte foi realizado o somatrio das pontuaes obtidas
nos trs diferentes parmetros, podendo a nota variar de 0 a 9.
Todos os dados coletados, digitados em planilha eletrnica (Microsoft
Excel), foram conferidos e exportados para o programa Statistica.
As variveis selecionadas para anlise estatstica foram inicialmente
submetidas avaliao de sua distribuio por meio de testes de
normalidade, coeficiente de variao e anlise de histogramas. Os
dados de distribuio normal so apresentados por meio de mdias
e desvio padro. Os testes estatsticos aplicados foram selecionados
de acordo com a distribuio das variveis e seu carter independente,
constitudo de escores de 3 cortes anatmicos com 3 tipos de
colorao de crtex cerebral. Para todos foram utilizados os testes
bicaudais, considerando que as diferenas poderiam estar distribudas
para ambos os lados da curva, com nvel de significncia mnimo de
5%. Para avaliar as possveis diferenas entre as avaliaes feitas sobre
as coloraes testadas foi aplicada a anlise da varincia (ANOVA).
As diferenas foram posteriormente apontadas pela aplicao do teste
de Duncan. A amostra foi estimada considerando um erro de tipo I
mximo de 5% (alfa) e erro do tipo II mximo de 10%, com um
poder de teste estimado mnimo de 80%.
RESULTADOS
Nos cortes realizados na regio da comissura anterior, a
colorao de Barnard, Robert e Brown (Fig 1) apresentou
mdia de escore de 8,50,64, contra 8,00,81 e 7,50,52 para
as coloraes de Green (fig 2) e Mulligan (Fig 3),
respectivamente. Esta diferena revelou-se significativa
(p=0,004). Quando analisadas isoladamente, houve diferena
significante (p<0,05) quando comparadas as coloraes de
Barnard, Robert e Brown com a de Mulligan; a colorao de
Green mostrou-se intermediria, sem diferena estatstica em
relao s demais.
Nos cortes realizados na regio do fascculo mamilo-
talmico, a colorao de Barnard, Robert e Brown mostrou-se
novamente superior, com escore mdio de 8,10,73, seguida
da colorao de Green (7,70,82), e finalmente da de Mulligan
(7,4 0,82), porm desta vez sem diferena significativa
(p=0,16). A diferena s se mostrou estatisticamente
significante quando comparadas isoladamente as coloraes
de Barnard, Robert e Brown com a Mulligan.
J na regio da substncia negra/ncleo rubro, a mdia
dos escores da colorao de Barnard, Robert e Brown foi de
8,40,69, a de Green 8,10,31 e a de Mulligan 7,60,61, sendo
esta diferena novamente significativa (p=0,008).Analisadas
isoladamente, a diferena revelou-se estatisticamente sig-
nificante quando comparadas as coloraes de Barnard, Robert
e Brown com a de Mulligan.
Quando analisados os dados em conjunto, constata-se
que a colorao de Barnard, Robert e Brown mostra-se mais
eficaz principalmente quando comparada com a de Mulligan,
a colorao de Green ocupa posio intermediria, com valores
prximos aos nveis de significncia estatstica em relao
colorao de Green, ou seja, assemelha-se mais colorao
de Barnard, Robert e Brown (Fig 4).
DISCUSSO
O grande desenvolvimento tecnolgico de novos mtodos
de neuroimagem por tomografia computadorizada e por
ressonncia magntica de ltima gerao tm evidenciado
detalhes anatmicos muito precisos13-17. H necessidade cada
vez maior de estudo anatmico prvio para perfeito con-
hecimento das estruturas de substncia cinzenta e branca18,19.
Os cortes enceflicos utilizados em estudo de anatomia
apresentam estruturas muitas vezes de difcil identificao
quando observadas a olho nu. As tcnicas de colorao
utilizadas em nosso estudo demonstraram-se eficazes ao
permitirem melhor delimitao entre as diversas formaes
de substncia cinzenta e de substncia branca. Esta caracters-
tica uma das principais vantagens do emprego dos mtodos
de colorao, sendo analisada nos diversos cortes por meio do
parmetro 1. O estudo neuroanatmico dos ncleos base, por
exemplo, muito facilitado uma vez que ntida a separao
existente entre os mesmos por uma fina camada de substncia
branca.
As tcnicas de colorao apresentam tambm algumas
desvantagens reveladas pela anlise dos parmetros 2 e 3. O
parmetro 2 avaliava a presena de limite preciso e ntido entre
substncias cinzenta e branca. Em alguns cortes observou-se
que a colorao ofuscava este limite diminuindo a nitidez da
delimitao que h entre estas formaes.A anlise do parmetro
3, grau de impregnao da colorao em outros locais de
substncia branca, demonstrou uma das principais desvantagens
destes mtodos de colorao, ou seja, a substncia branca pode
ser afetada pelo corante. Atravs da atribuio de pontuaes
para os trs parmetros citados, obteve-se avaliao objetiva
da qualidade da tcnica de colorao empregada, uma vez que
se consideram tanto as suas vantagens como desvantagens.
Em nosso estudo, de acordo com os trs parmetros
estabelecidos, o mtodo de colorao de Barnard, Robert e
Brown revelou-se melhor que o mtodo de Green, e este, por
sua vez, melhor que o mtodo de Mulligan. Contudo, a
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hosa que a de Green, uma vez que necessita de quatro solues Theor Biolv 1994;17:61-73.
diferentes, sendo uma delas aquecida a 65C. A tcnica de
Green exige, para sua realizao, apenas trs solues que no
necessitam de aquecimento.Alm disso, a realizao da tcnica
de Barnard, Robert e Brown mais demorada que a de Green,
com durao mdia de nove minutos para corar um corte
enceflico, enquanto que a de Green tarda apenas trs minutos.
Com relao tcnica de Mulligan, sua realizao
relativamente trabalhosa (necessita de trs solues, sendo
uma aquecida a 65C) e demorada (5 minutos), porm a qua-
lidade da colorao obtida com este mtodo inferior quando
comparada aos outros dois.
A tcnica de Barnard, Robert e Brown revelou-se a mais
eficaz na diferenciao entre as substncias cinzentas e branca
do encfalo quando comparada s demais pelos parmetros
estabelecidos. Recomendamos que os laboratrios de anatomia
empreguem esta tcnica como mtodo de colorao de cortes
enceflicos, apesar de ser uma tcnica mais trabalhosa e de
realizao mais demorada.
Sugerimos a realizao de novos estudos comparativos de
tcnicas de colorao de peas do sistema nervoso central
atravs de anlise de outros mtodos de colorao e da
atribuio de novos parmetros de avaliao.

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