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UNIVERSIDAD DE VALLADOLID
Diseo de Experimentos y
Tratamiento de Datos
RESUMEN
1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS
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1.2. Fosfatasa alcalina
O
HO P OH Fosfatasa O
O alcalina
O
+
+ H2 O + HO P OH + H
+
OH
+
N N
- - -
O O O O
p-nitrofenil-fosfato p-nitrofenol
Figura 1. Reaccin enzimtica
1.4. Objetivos
2.1. Equipamiento
Bao termostatizado a 30C.
Colormetro ajustado a 405 nm (fototubo normal).
2.2. Material
Pipetas de vidrio (5,0 ml).
Pipeta automtica P-1000 (puntas).
Propipeta.
Rotulador para vidrio.
Tubos de ensayo de vidrio (1,5x 16 cm) 16 en una gradilla.
Cronmetro.
Tubos especiales para medir en el colormetro.
2.3. Reactivos
Tampn de ensayo.
Solucin sustrato.
Enzima: fosfatasa alcalina de mucosa intestinal bovina.
Solucin para detener la reaccin.
3. PROTOCOLOS A REALIZAR
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3.2.1. A una serie de 5 tubos de ensayo se les aade los distintos reactivos
segn se indica en la Tabla 2, obtenindose as concentraciones
crecientes de enzima en los mismos. Tras agitar suavemente se
incuban en bao termostatizado el tiempo indicado:
3.3.1. A una serie de tubos de ensayo se les aade los reactivos que se
detallan en la Tabla 3 y se agitan suavemente, obtenindose de esta
manera concentraciones crecientes de sustrato en los mismos. Se
introducen los tubos en el bao termostatizado a 30 C el tiempo
indicado para que se desarrolle la reaccin.
3.3.2. Al finalizar los 10 minutos de reaccin, retirar los tubos del bao y
aadir inmediatamente 0,5 ml de la solucin de fosfato mezclando
para detener la reaccin.
3.3.3. Medir la absorbancia a los distintos tubos a 405 nm; usando como
blanco el n 1.
4. RESULTADOS ESPERADOS
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de producto (p-nitrofenol) se basa en la ley de Lambert-Beer: A = .C.l; en
este caso l = 1 cm y (coeficiente de extincin milimolar) es 18,5 mM cm . -1 -1
0,0 24
0,0 18
0,0 12 d [P] a
= vi =
dt b
(m
M
O
O
-N
R
N
E
[p
IT
L
]
)
0,0 06
b
a
0
0 5 10 15 20
TIEMPO (min)
Figura 2. Representacin del efecto del tiempo de reaccin en la
aparicin de producto.
A = . C. I
A
C=
.I
Aplicando esta ecuacin a las absorbancias obtenidas para cada uno de
los tubos, teniendo en cuenta que I = 1 cm y = 18,5 mM-1 cm-1, se obtiene la
concentracin producto formado en cada uno de ellos.
Para representar la curva de progreso de la reaccin (Figura 3), se
trasladan los datos obtenidos de los clculos correspondientes de la Tabla 4
5
4 15 1,203 0,065
5 20 1,300 0,07
b
Vi = t g =
a
Aplicando la ecuacin:
b 0,0 5 -0 ,0 3 5
Vi = = = 0 ,0 0 3 mM min- 1
a 10 -5
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4.1.3. Determinacin de la concentracin de enzima en mU/ml.
Para determinar las mU/ml de fosfatasa alcalina utilizadas en la
reaccin se realizan los clculos apropiados (apartado 4.1).
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Figura 5. Efecto de la concentracin de enzima sobre la velocidad de la
reaccin.
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En la representacin de Eadie-Hofsteese se presentan los valores de las
velocidades enzimticas obtenidas frente a los cocientes de las velocidades
entre las respectivas concentraciones de sustrato y se obtiene una recta cuyo
corte con el eje de abscisas corresponde a la Vm/Km y con el eje de
ordenadas equivale a la Vm, siendo la pendiente -Km.
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Figura 8. Representacin de Eadie-Hofstee: Velocidad frente
al cociente V/[S]
10
3.3.2.Clculo de Vm y Km mediante las representaciones de Eadie-
Hofstee y de Lineweaber-Burk.
La Km y Vm se determinan en ambas presentaciones por los
puntos de corte de la recta:
Eadie- Hofstee (Figura 10)
o en abcisas corresponde a la relacin Vm/Km,
o en ordenadas directamente indica la Vm de la reaccin.
5. DISCUSIN Y COMENTARIOS
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Existe, en las condiciones de trabajo empleadas, una relacin (Figuras 3 y
4) entre el tiempo en que transcurre la reaccin con la aparicin de producto,
o lo que es lo mismo con la desaparicin de sustrato, que indica la vi de la
misma, a partir de la cual se puede determinar la concentracin de la enzima
(mU/mL) necesaria para que transcurra la reaccin en esas condiciones.
Cuando se estudia el progreso de la reaccin utilizando concentraciones
variables de enzima, se puede comprobar (Figura 5) como sta es factor
limitante de la velocidad, siendo dicha velocidad proporcional a la
concentracin de enzima siempre que el sustrato se encuentre en condiciones
de saturacin tal y como ocurre en las condiciones de trabajo utilizadas.
Ante la disyuntiva de seleccionar un mtodo fiable para la determinacin a
partir de una grfica de la Km y Vm de la reaccin se han utilizado dos, la de
EadieHofstee como transformacin lineal de la ecuacin de Michaelis y
Menten, y la de Lineweaber y Burk o de los dobles inversos tambin como
transformacin lineal de la ecuacin de Michaelis y Menten. Como se puede
observar (Figuras 10 y 11), en ambos casos los valores obtenidos para la Km
y Vm son muy similares y por lo tanto los dos mtodos son vlidos para
determinar estos parmetros.
Al finalizar la prctica, se le suministra a los alumnos el material necesario
para que presenten los resultados obtenidos.
6. BIBLIOGRAFA COMENTADA
Tabla 9. Sustrato.
p-nitrofenilfosfato 0,026 g
Tampn de ensayo Hasta 200 ml
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