TTULO: PRODUCCIN SOSTENIBLE DE FRUCTOOLIGOSACRIDOS A

PARTIR DE LA SACAROSA USANDO ENZIMA FRUCTOSILTRANSFERASA

RECOMBINANTE.
Autores: Enrique Rosendo Prez Cruz*
Duniesky Martnez Garca
Alina Sobrino Legn
Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa de Sancti Spritus. CUBA.
*Autor de correspondencia: Enrique Rosendo Prez Cruz:
enrique.perez@cigb.edu.cu
RESUMEN
En este trabajo presentamos el desarrollo de un biocatalizador no fngico que
convierte la sacarosa de forma eficiente en FOS de cadena corta, en particular 1-
kestosa (GF2). La enzima seleccionada es la sacarosa:sacarosa 1-
fructosiltransferasa (1-SSTrec) de origen vegetal expresada constitutivamente a
niveles altos en Pichia pastoris. Despus de una fermentacin en cultivo
incrementado, la enzima recombinante es recobrada del sobrenadante de cultivo con
pureza superior al 75 % a travs de una etapa de ultrafiltracin-concentracin, para
posteriormente ser liofilizada. La reaccin de la enzima libre a altas concentraciones
de sacarosa (600-800 g/L) ocurre en un reactor tanque agitado para producir 1-
kestosa, la cual representa ms del 50% de los azcares totales en la mezcla de
reaccin. Esta mezcla puede ser separada y refinada por diferentes tecnologas
existentes en industrias de los derivados de la caa de azcar para obtener
fructooligosacridos de alta pureza, los que son muy demandados en las industrias
farmacuticas y de alimentos funcionales.
Abstract
Title: Sustainable production of fructooligosaccharides from sucrose using
recombinant fructosyltransferase enzyme.
We will present the development of a non-fungal biocatalyst that efficiently converts
sucrose into short-chain FOS, particularly 1-kestose (GF2). The enzyme of choice
was a plant sucrose:sucrose 1-fructosyltransferase (1-SSTrec) produced
constitutively to high levels in the yeast Pichia pastoris. After fed-batch fermentation,

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the culture supernatant containing the recombinant enzyme with initial protein purity
above 75% is dialyzed and concentrated by a single ultrafiltration step and then
submitted to a lyophilisation process. The free enzyme is operated in a stirred tank
reactor at high sucrose concentrations (600-800 g/L) to produce 1-kestose, which
reaches to represent more than 50% of total sugars in the reaction mixture. This
mixture can be separated and polished by different existing technologies in the
industry derived from sugar cane to obtain high purity fructooligosaccharides, which
have a great demand in the pharmaceutical and functional foods industries.
Palabras clave: Enzima fructosiltransferasa, fructooligosacridos, 1-kestosa y
derivados de la azcar.
Key words: fructosyltransferase enzyme, fructooligosaccharides, 1-kestose and
sugar derivative.
Introduccin
Los FOS estn compuestos por cadenas lineales con 1-9 residuos de fructosa
enlazados a una molcula de sacarosa por enlace 2 1 [1]. La importancia de
estos compuestos radica en que pueden utilizarse como ingredientes no digeribles
de la dieta, tanto de humanos como de animales, brindando un efecto prebitico, al
producir efectos beneficiosos mediante la estimulacin selectiva del crecimiento o la
actividad de uno o ms tipos de microorganismos en el colon. Entre dichos
microorganismos se encuentran Lactobacillus y Bifidobacterias [2]. En la naturaleza,
los FOS son producidos por accin de enzimas tipo fructosiltransferasas (FTasa, EC
2.4.1.9) y -fructofuranosidasas (FFasa EC 3.2.1.26) de plantas, hongos, bacterias y
algunas levaduras [3]. La produccin industrial de FOS, actualmente, se realiza
siguiendo dos estrategias: degradacin parcial de inulinas [1,4] o sntesis enzimtica
a partir de la sacarosa, con empleo de enzimas FFasa con alta actividad
transfructosilasa o FTasa, producidas por hongos (Aspergillus sp y Aureobasidium
pullulans) (5,6). Ambas tecnologas dan lugar a una mezcla de FOS, que vara su
grado de polimerizacin (GP) de 2 a 10, cuyos principales componentes son: 1-
kestosa (GF2), nistosa (GF3), fructosilnistosa (GF4), bifurcosa (GF3), inulobiosa (F2),
inulotriosa (F3) e inulotetraosa (F4). La 1-kestosa es el FOS de mayor inters

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comercial, por su doble efecto de edulcorante hipocalrico y prebitico, as como por
su posible uso como azcar para diabticos [7].
El mercado de fructooligosacridos mantiene una tendencia creciente y segn los
Analistas de Industrias Globales Inc. (GIA), alcanzar en los Estados Unidos $225,1
milln para 2015, mientras se espera que las ventas europeas lleguen a los $1,17 mil
millones [8]. En China los FOS (polvo con un 95% pureza) se comercializaron en
diciembre del 2012 a un precio de 8 347 USD/t [9]. En el futuro mantener una
tendencia creciente en el mercado de FOS precisa de reducir sus costos de
produccin y expandir sus aplicaciones en la formulacin de alimentos funcionales y
nutracuticos.
Los complejos procesos tecnolgicos de bajos rendimientos en extraccin y
purificacin de las enzimas FFasa y FTasa [10, 11], ha conducido a que se empleen
sistemas inmovilizados de clulas o enzimas en la transfructosilacin industrial de la
sacarosa en FOS [1,12]. Adems esta situacin tecnolgica es la causa de que no
existan enzimas fructosiltransferasas comerciales para uso industrial [13] y que por
tanto tenga que coexistir en una misma fbrica la produccin de biocatalizador y
produccin de FOS.
Una alternativa para simplificar los procesos de extraccin de enzimas para producir
FOS, es la obtencin de fructosiltransferasas recombinantes a partir de su expresin
en la levadura Pichia pastoris. Siguiendo esta estrategia, en nuestro laboratorio se
obtuvo altos niveles de expresin constitutiva en P. pastoris de la enzima
sacarosa:sacarosa 1-fructosiltransferasa (1-SSTrec) de origen vegetal [14]. El
empleo de esta cepa recombinante en la obtencin de una enzima
fructosiltransferasa y su potencial uso en la produccin industrial de FOS son
descritos en este trabajo.
Materiales y mtodos
Produccin de 1-SSTrec.
La cepa recombinante de Pichia pastoris CIGB 308 fue cultivada en un fermentador
de 5 L siguiendo una estrategia de cultivo incrementado. Durante la fase de cultivo
discontinuo la cepa creci en un medio salino suplementado con sacarosa 50 g/L y
extracto de levadura 5 g/L y en la fase de incremento se suministr una solucin de

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sacarosa 500 g/L. La temperatura se mantuvo a 28C y el pH 5,5. La agitacin se
vari de 500 a 900 rpm y el flujo de aire de 1-2 vvm a para mantener el oxgeno
disuelto superior a 20%. La duracin de la fermentacin fue 72 horas.
Posteriormente, el cultivo se centrifug separando biomasa de sobrenadante de
cultivo. El sobrenadante de cultivo es filtrado por 0,2 m, antes de ser concentrado y
diafiltrado en ultrafiltro de 30kDa. Finalmente el extracto crudo de 1-SSTrec es
liofilizado.
Actividad enzimtica.
Una unidad de actividad enzimtica (U) de 1-SSTrec se defini como la cantidad de
enzima que libera 1mol de glucosa por minuto a velocidades iniciales de la reaccin
en una solucin de sacarosa a 1,46 M en tampn acetato de sodio 0,1 M, pH 5,5 a
30C
Produccin de fructooligosacridos.
Un reactor enchaquetado tipo tanque agitado fue alimentado con una solucin de
sacarosa a concentraciones de 600-800 g/L y pH 5,5 a 25C y se le adicion 1-
SSTrec a razn de 900- 6000 U/L una vez alcanzada la temperatura de operacin
45C. La agitacin fue controlada para mantener el sistema homogneo. El tiempo de
reaccin fue determinado por simulacin en Matlab de la reaccin cintica, de la
desactivacin enzimtica y la transferencia de calor.
Cuantificacin de fructooligosacridos.
El anlisis cuantitativo de las muestras se realiz por HPLC de un sistema isocrtico
combinado con deteccin por ndice de refraccin para el anlisis de carbohidratos.
Se aplicaron 20 L de muestra a una
columna Aminex HPX 42-C (BioRad, Richmond), con un flujo de trabajo de 0,5
mL/min, una presin de aproximadamente 52 bar y una temperatura de trabajo de
85C. El solvente utilizado fue agua destilada. Se emple un detector de ndice de
refraccin Knauer Differential-Refractometer. Los resultados se analizaron con ayuda
del paquete informtico BioCrom, versin 3,0, CIGB, 1996-1997.
Resultados y discusin
El cultivo de la cepa de Pichia pastoris CIGB 308 en las condiciones descritas en
materiales y mtodos permiti obtener rendimientos de 375,0 9,2 g/L de peso

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hmedo, la actividad enzimtica extracelular fue de 101,6 9,5 U/mL y la intracelular
38,9 5,4 U/mL (103,7 U/g de biomasa hmeda equivalente a 364,4 U/g de peso
seco). Estos rendimientos de actividad en biomasa por litro de cultivo son superiores
entre 5 a 6 veces a los mximos al reportado para cepas de hongos que usaron las
clulas en conformar biocatalizadores para producir FOS [15, 16, 17, 18]. En cuanto
a los niveles obtenidos de actividad extracelular de 101,6 9,5 U/ml clasifica como
rendimientos altos, que superan la media de los mximos reportados para enzimas
FTasa o FFasa producidas por cepas de hongos cultivadas en fermentadores [19,
20, 21].
Los rendimientos de la extraccin de 1-SSTrec a partir del sobrenadante de cultivo
siguiendo el procedimiento descrito en materiales y mtodos fue 81360 U/L de cultivo
equivalente a 22,1 g de liofilizado con una actividad especfica de 18400 U/g. El
recobrado fue superior al 95% y pureza de la enzima mayor al 75% por SDS-PAGE.
La 1-SSTrec liofilizada fue estable a temperatura ambiente por al menos un ao.
La produccin de FOS catalizado por la 1-SST muestra un similar perfil de producto
para todas las concentraciones de sacarosa ensayadas (Figura I). Los mximos
rendimientos alcanzados fueron de 55-60% de FOS, con la particularidad que la
composicin de 1-kestosa es
superior al 50% de carbohidratos
totales en la mezcla y ms de 90 %
entre los FOS. Esta composicin de
1-kestosa (>50%) es muy superior a
las obtenidas por enzimas fngicas
(<35%), para similar conversin de
sacarosa en FOS [22]. Este resultado
constituye una ventaja tecnolgica
adicional del uso de la 1-SSTrec en
la produccin FOS, pues aplicando
tecnologa existente para separacin
de azcares industrial (Ej.
Cromatografa de Lecho Mvil

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Simulado o adsorcin a carbn activado) que discrimen mono y disacridos de los
fructooligosacridos, se obtendr un licor de 1-kestosa una pureza superior al 90% y
que adems posibilita su cristalizacin [23]. Productos de similar grado de pureza
solo existe en el mercado para propsitos analticos a precios prohibitivos para su
uso en alimentos funcionales o nutracuticos.
Conclusiones
Los altos rendimientos, el simple proceso de produccin, la formulacin en polvo
estable a temperatura ambiente y su fcil introduccin en fbricas existentes,
convierten a la 1-SSTrec en la fructosiltransferasa de uso industrial demandada para
la expansin de la produccin de FOS. Adems su empleo en la produccin industrial
de FOS generar un producto de mayor calidad a los existentes en el mercado.
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