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DE ALCOHOL ETLICO
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar el ttulo de
MICROBILOGA INDUSTRIAL
3
NOTA DE ADVERTENCIA
La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus
trabajos de tesis. Solo velar por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral
catlica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes
bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia.
Artculo 23 de la Resolucin N 13 de Julio de 1946
4
EVALUACION DEL USO DE ANTIBIOTICOS COMO MECANISMO PARA EL
DE ALCOHOL ETLICO
APROBADO
_____________________________ _____________________________
ANA LUCA GMEZ SCHOUBEN JOAQUN QUINTERO GARCA
Biloga gentica Ing. Produccin Biotecnolgica
Directora Codirector
_____________________________ _____________________________
BALKYS QUEVEDO HIDALGO IVONNE GUTIERREZ ROJAS
Ing. Qumica Bacteriloga
Jurado Jurado
5
EVALUACION DEL USO DE ANTIBIOTICOS COMO MECANISMO PARA EL
DE ALCOHOL ETLICO
APROBADO
_____________________________ _____________________________
DRA. ANGELA UMAA MUOZ DR. LUIS DAVID GMEZ
Decana Acadmica Director de Carrera
6
El presente trabajo lo dedico a Dios por permitir que me levantara todos los das con el
mejor nimo y energa para realizar mis actividades, a mis padres y hermano que con su
cario y apoyo me han formado e inculcado los valores de disciplina y respeto, a mi ta
Rosa Mara que siempre insiste en la fortaleza frente al trabajo, a mis amigos que an en
la distancia estuvieron conmigo durante este tiempo, a todos quienes en esta ciudad (Cali-
Valle) me acogieron amablemente y me brindaron su soporte para que esta investigacin
se llevara a cabo con xito.
7
Mi sincero y especial agradecimiento para SUCROMILES S.A. por permitirme utilizar sus
recursos no slo materiales sino adems los ms importantes y valiosos, sus recursos humanos, al
ingeniero Rubiel Galarza, superintendente de la planta alcoqumica quien permiti y acondicion
las instalaciones donde trabaj y llev a cabo mi investigacin, a mi Directora de proyecto Ana
Luca Gmez, Jefe de Desarrollos Microbiolgicos, quien me apoy incondicionalmente desde el
momento en que present mi propuesta y an dentro de sus mltiples ocupaciones dedic tiempo a
la direccin de mi trabajo, a mi Codirector de proyecto Joaqun Quintero Garca quien fue mi
principal soporte en las aplicaciones a nivel de planta, a Jairo Orozco, Julin Ortz, Ana Mara
Gmez y William Ortz, analistas del laboratorio de calidad alcoqumica por brindarme su amistad
y apoyo en la parte de anlisis qumico y en general a todo el capital humano de esta slida
empresa del sector biotecnolgico para la cul, la microbiologa es una de las bases fundamentales
de su desarrollo.
8
TABLA DE CONTENIDO
PAG
1. Introduccin 22
2. Marco Terico 24
2.1. Saccharomyces Cerevisiae 24
2.2. Bioqumica de la produccin de alcohol por Saccharomyces Cerevisiae 25
2.3. Parmetros y condiciones en la Fermentacin 30
2.3.1. pH 30
2.3.2. Temperatura 31
2.3.3. Concentracin de azcar 32
2.3.4. Tolerancia a altas concentraciones de alcohol 34
2.3.5. Requerimientos de oxigeno 35
2.4. Rendimiento de alcohol etlico 36
2.4.1. Factores que afectan el rendimiento de alcohol 37
2.4.1.1. Crecimiento celular 37
2.4.1.2. Generacin de alcoholes superiores 38
2.4.1.3. Generacin de cidos orgnicos 39
2.5. Melazas como sustrato de fermentacin 41
2.5.1. Produccin de melaza de caa 41
2.5.2. Pretratamiento a las melazas de caa 42
2.5.3. Manejo de nutrientes en la fermentacin con melaza 43
2.5.4. Ventajas del uso de melazas de caa como sustrato 44
2.6. Contaminacin bacteriana en melaza 44
2.6.1. Fuentes de contaminacin 45
2.6.2. Prdidas de sacarosa 45
2.6.3. Bacterias lcticas como contaminantes 46
2.6.3.1. Metabolismo homofermentativo y heterofermentativo 47
2.6.3.2. Requerimientos nutricionales de bacterias lcticas y subproductos 49
2.7. Tratamientos de contaminacin bacteriana 52
9
2.7.1. Antibiticos 53
2.7.1.1. Penicilina y virginamicina 54
2.7.1.2. Estreptograminas 55
2.7.3. Otras alternativas 57
3. Formulacin del problema, justificacin y antecedentes 60
3.1. Formulacin del problema 60
3.2. Justificacin 60
3.3. Antecedentes 61
4. Objetivos 63
4.1. Objetivo General 63
4.2. Objetivos Especficos 63
5. Materiales y Mtodos 64
5.1. Ubicacin y diseo de la investigacin 64
5.1.1. Parmetros y variables en la etapa de reproduccin 66
5.1.2. Parmetros y variables en la etapa de fermentacin 66
5.2. Mtodos 67
5.2.1. Pretratamiento del sustrato 67
5.2.2. Tratamiento con antibitico 67
5.2.2.1. Hidratacin de levadura activa seca 67
5.2.2.2. Preparacin del sustrato para la reproduccin 68
5.2.2.3. Determinacin de los niveles de contaminacin 69
5.2.2.4. Determinacin del inculo para la fermentacin 70
5.2.2.5. Preparacin del sustrato para la fermentacin 70
5.2.2.6. Determinacin de rendimiento (%), eficiencia (%) y
productividad (g/L*h) del proceso 71
5.2.3. Tratamiento con descenso de pH 72
5.2.3.1. Diseo Experimental 73
5.3. Recoleccin de la informacin 74
5.4. Anlisis de la informacin 75
10
6. Resultados 76
6.1. Caracterizacin del sustrato 76
6.2. Dilucin de sustrato en etapa de reproduccin 78
6.3. Dilucin de sustrato en etapa de fermentacin 79
6.4. Preparacin y alistamiento de la levadura 80
6.5. Tratamiento con antibiticos en la etapa de reproduccin 81
6.5.1. Reproduccin con melaza 81
6.5.2. Reproduccin con jugo de caa concentrado 83
6.5.3. Fermentacin con melaza 84
6.5.4. Fermentacin con jugo de caa concentrado 87
6.6. Tratamiento con descenso de pH 90
6.6.1. Etapa de reproduccin 90
6.6.2. Etapa de fermentacin 91
7. Anlisis de varianza 94
7.1. ANOVA doble va 94
7.1.1. ANOVA doble va para melaza como sustrato de fermentacin 95
7.1.2. ANOVA doble va para jugo de caa concentrado como sustrato
de fermentacin 97
7.2. ANOVA una va 99
7.2.1. ANOVA una va para tratamiento con pH en melaza como sustrato
de fermentacin 100
7.2.2. ANOVA una va para tratamiento con pH en jugo de caa concentrado
como sustrato de fermentacin 102
7.3. Medidas de Tendencia Central para datos de Productividad 102
8. Discusin de Resultados 103
9. Conclusiones 120
10. Recomendaciones 121
11. Referencias Bibliogrficas 123
12. Anexos 128
11
LISTA DE TABLAS
PAG
Tabla 1. Rendimiento de alcohol a partir de concentraciones de azcar
para una cepa de Saccharomyces aislada de un sustrato especfico 33
Tabla 2. Composicin tpica de una Miel tipo A 42
Tabla 3. Composicin tpica de una Miel tipo B 42
Tabla 4. Composicin tpica de una miel tipo C 42
Tabla 5. Tipos bacterianos segn su metabolismo fermentativo. 49
Tabla 6. Tratamientos con antibitico para la etapa de propagacin con melaza
y jugo de caa concentrado 69
Tabla 7. Tratamiento con descenso de pH para la etapa de propagacin con melaza
y jugo de caa concentrado 73
Tabla 8. Caractersticas fsico-qumicas y microbiolgicas de melaza y
jugo de caa concentrado 76
Tabla 13. Variables de respuesta etapa de reproduccin con Melaza tratada con
Penicilina (24 horas) 82
Tabla 14. Variables de respuesta etapa de reproduccin con Melaza
tratada con Virginamicina (24 horas) 82
12
tratado con Penicilina (30 horas) 85
Tabla 18. Variables de respuesta etapa de fermentacin de Melaza inoculo
tratado con Virginamicina (30 horas) 85
Tabla 19. Variables de respuesta etapa de fermentacin de Jugo de caa
concentrado inculo tratado con Penicilina (30 horas) 87
Tabla 20. Variables de respuesta etapa de fermentacin de Jugo de caa
concentrado inculo tratado con Virginamicina (30 horas) 87
Tabla 21. Variables de respuesta etapa de reproduccin con Melaza bajo
ajuste de pH (24 horas) 90
Tabla 22. Variables de respuesta etapa de reproduccin con Jugo de caa
concentrado bajo tratamiento de ajuste de pH (24 horas) 90
Tabla 23. Variables de respuesta etapa de fermentacin de Melaza inoculo
tratado con ajuste de pH (30 horas) 91
Tabla 24. Variables de respuesta etapa de fermentacin de Jugo de caa
concentrado inoculo tratado con ajuste de pH (30 horas) 91
Tabla 25. Frmulas generales para el anlisis de varianza de dos vas. 94
Tabla 26. Datos de rendimiento (%) obtenidos con Melaza como sustrato de
fermentacin 95
Tabla 27. ANOVA doble va (Melaza como sustrato de fermentacin) 96
Tabla 28. Datos de rendimiento (%) obtenidos con Jugo de caa como
sustrato de fermentacin 97
Tabla 29. ANOVA doble va (Jugo de caa como sustrato de fermentacin) 98
Tabla 30. Frmulas generales para anlisis de varianza una va. 99
Tabla 31. Datos de rendimiento (%) obtenidos con Melaza como sustrato de
fermentacin 100
Tabla 32. ANOVA una va Melaza como sustrato de fermentacin 100
Tabla 33. Datos de rendimiento (%) obtenidos con Jugo de caa como
sustrato de fermentacin 101
Tabla 34. ANOVA una va (Jugo de caa como sustrato de fermentacin) 102
13
Tabla 35. Medidas de tendencia central datos de productividad 102
Tabla 36. Caractersticas iniciales de Miel de Tercera dilucin 141
Tabla 37. Caractersticas iniciales de Miel de Segunda dilucin 142
Tabla 38. Variables de respuesta etapa de reproduccin de Melaza tratado
con Penicilina (24 horas) 142
Tabla 39. Variables de respuesta etapa de reproduccin de Melaza
tratado con Virginamicina (24 horas) 143
Tabla 40. Variables de respuesta etapa de reproduccin de Jugo de caa
concentrado tratado con Penicilina (24 horas) 144
Tabla 41. Variables de respuesta etapa de reproduccin de Jugo de caa
concentrado tratado con Virginamicina (24 horas) 144
Tabla 42. Variables de respuesta etapa de reproduccin de Melaza con
ajuste de pH (24 horas) 145
Tabla 43. Variables de respuesta etapa de reproduccin de Jugo de caa
concentrado con ajuste de pH (24 horas) 146
Tabla 44. Variables de respuesta etapa de fermentacin de Melaza inoculo
tratado con Penicilina (30 horas) 147
Tabla 45. Variables de respuesta etapa de fermentacin de Melaza inoculo
tratado con Virginamicina (30 horas) 147
Tabla 46. Variables de respuesta etapa de fermentacin de Jugo de caa
concentrado inoculo tratado con Penicilina (30 horas) 148
Tabla 47. Variables de respuesta etapa de fermentacin de Jugo de caa
concentrado inoculo tratado con Virginamicina (30 horas) 149
Tabla 48. Variables de respuesta etapa de fermentacin de Melaza inoculo
tratado con ajuste de pH (30 horas) 149
Tabla 49. Variables de respuesta etapa de fermentacin de Jugo de caa
concentrado inoculo tratado ajuste de pH (30 horas) 150
14
LISTA DE FIGURAS
PAG
Figura 1. Ruta Embden Meyerhof Parnas para la utilizacin de la glucosa. 26
Figura 2. Ciclo del cido ctrico Ciclo de Krebs 28
Figura 3. Conversin de leucina en alcohol isoamlico como ejemplo de la
produccin de alcoholes superiores 38
Figura 4. Fermentacin de glucosa por bacterias cido lcticas. 48
Figura 5. Contaminantes bacterianos tpicos en las destileras. 50
Figura 6. Productos desarrollados por contaminantes bacterianos en la
fermentacin. 51
Figura 7. Esquema de estructuras bacterianas atacadas por diversos antimicrobianos 54
Figura 8. Esquema del proceso de fermentacin por lotes 65
Figura 9a. Colonias en medio MRS a partir de jugo de caa concentrado sin calentamiento
tpicas del gnero Leuconostoc 78
Figura 9b. Colonias puntiformes en medio MRS aisladas en melaza y jugo de caa
tpicas de Lactobacillus 78
Figura 10. Crecimiento positivo en medio slido YM de la cepa de
Saccharomyces cerevisiae 81
Figura 11. Poblacin de BAL (ufc/ml) Vs Concentracin de antibitico (ppm)
en etapa de reproduccin con melaza (24 horas) 82
Figura 12. Poblacin de BAL (ufc/ml) Vs Concentracin de antibitico (ppm)
etapa de reproduccin con jugo de caa concentrado (24 horas) 84
Figura 13. Rendimiento (%) Vs concentracin de antibitico (ppm)
en etapa de fermentacin con melaza (30 horas) 85
Figura 14. Eficiencia (%) Vs Concentracin de antibitico (ppm) en etapa
de fermentacin con melaza (30 horas) 85
Figura 15. Productividad (g/L*h) Vs Concentracin de antibitico (ppm)
en etapa de fermentacin con melaza (30 horas) 86
15
Figura 16. Rendimiento (%) Vs Concentracin de antibitico (ppm)
en etapa de fermentacin con Jugo de caa concentrado (30 horas) 88
Figura 17. Eficiencia (%) Vs Concentracin de antibitico (ppm) en etapa
de fermentacin con jugo de caa concentrado (30 horas) 88
Figura 18. Productividad (g/L*h) Vs Concentracin de antibitico (ppm)
en etapa de fermentacin con jugo de caa (30 horas) 89
Figura 19. Poblacin de BAL (ufc/ml) Vs Tratamiento con pH en etapa
de reproduccin (24 horas) 91
Figura 20. Rendimiento (%) Vs Tratamiento con pH en etapa de fermentacin
con melaza y jugo de caa concentrado 92
Figura 21. Eficiencia (%) Vs Tratamiento con pH en etapa de fermentacin
con melaza y jugo de caa concentrado 92
Figura 22. Productividad (g/L*h) Vs pH del medio en etapa de fermentacin
con melaza y jugo de caa (30 horas) 93
16
ANEXOS
PAG
Anexo 1. Determinacin de la morfologa de la levadura 128
Anexo 2. Recuento en cmara de Neubauer y porcentaje de viabilidad 129
Anexo 3. Determinacin de la concentracin en medio solid de bacterias
acido lcticas 130
Anexo 4. Aislamiento en medio slido YM de levadura hidratada y recuento de levaduras
salvajes 132
Anexo 5. Pruebas adicionales para determinacin de contaminantes bacterianos 134
Anexo 6. Determinacin de acidez voltil en mieles y en vinos 136
Anexo 7. Mtodo de Fehling para determinacin de azucares totales reductores 138
Anexo 8. Determinacin de porcentaje de alcohol en vinos 140
Anexo 9. Registros de parmetros de ensayo etapa de reproduccin 141
Anexo 10. Registro de parmetros de ensayo etapa de fermentacin 147
Anexo 11. Muestra de Calculo para rendimiento, eficiencia y productividad 151
17
RESMEN
Adems del tratamiento con antibiticos, se evalu la variacin en el pH de los sustratos del
proceso con el fin de determinar si dicha variacin, tiene efecto sobre el rendimiento y
productividad de la fermentacin y conocer si puede constituirse como una alternativa
vlida para ser utilizada en sustratos como melaza y jugo de caa evaluando su incidencia
en la disminucin de los contaminantes tpicos (Bacterias cido lcticas-BAL).
Los antibiticos se evaluaron en las siguientes concentraciones: 0.5, 1.0 y 2.0 ppm. El
sustrato sin adicin del antibitico durante la etapa de propagacin de la levadura fue
utilizado como control.
La variacin del pH en los sustratos fue de 3.0, 3.5 y 4.0 utilizando como control el pH
normal manejado en planta: 4,6.
18
varianza de una va (ANOVA) para el caso del tratamiento con pH para cada uno de los
sustratos (melaza y jugo de caa). Los anlisis se realizaron con un nivel de significancia de
0.05.
19
ABSTRACT
In view of the booming production of ethyl alcohol in the country, different alternatives
have been sought to minimize the losses of fermentable sugar, and the contamination by
microorganisms during the alcohol fermentation process, using the different cane syrups
obtained by the sugar mills, so that the antimicrobial compounds have become important.
The object of this investigation was to evaluate the effect of teo antimicrobial compounds
(penicillin and virginamicine) on the alcohol fermentation carried out by a commercial dry
active yeast satrain of Saccharomyces cerevisiae in a batch system.
In addition to the treatment with antibiotics, the variation in the pH of the process substrates
was evaluated, in order to determine if said variation affects the yield and productivity of
the fermentation, and to determine if it can be considered as a valid alternative to be used in
substrates such as molasses and cane juice, by evaluation its influence on the decrease of
the typical contaminants (Lactic Acid Bacteria-BAL).
The antibiotics were evaluated in the following concentrations: 0.5, 1.0 and 2.0 ppm. The
substrate without the addition of the antibiotic during the yeast propagation stage was used
as the control.
The variations of the pH in the substrates were 3.0, 3.5 and 4.0, with the Ph normally used
in the plant as the control (4.6).
For each treatment, the determination of yield, the efficiency and the productivity of the
process was carried out, based on the alcohol generated.
The results of the average yield were compared by means of an analysis of the double way
variance (ANOVA), in the case of the treatments with antibiotics; and by means of the
20
analysis of single way variance (ANOVA), in the case of the treatments with pH, for each
one of the substrates (molasses and cane juice). The analyses were carried out with a
significance level of 0.05.
According to the statistical analysis of data resulting from this investigation, it can be
concluded that in fermentations with molasses, there is a significant difference among the
effects generated by the addition of the different doses of the antibiotic. However, there is
no significant difference between the effects generated by the use of the two antibiotics
(penicillin and virginamicine) on the fermentation yield, which indicates that either one
could be used, and that its selection would be based on economic criteria.
In the case of using concentrated cane juice as the fermentation substrate, the variance
analysis demonstrates that there is no significant difference among the effects generated by
the use of the different doses, but that there is a significant difference between the effects
generated by the use of the two antibiotic compounds (penicillin and virginamicine) on the
fermentation yield. The results indicate that the use of virginamicine at a concentration
between 1.0ppm and 2.0ppm can benefit the fermentation process.
The alternative of using a decrease in the pH to control the lactic bacteria populations,
especially of the genus Lactobacillus, does not bring an important benefit to the process,
because it affects the population and the viability of the yeast, that influence the yield and
productivity of the process, especially when molasses is used as the fermentation substrate.
21
1. INTRODUCCION
Durante el proceso de fermentacin es necesario controlar todos los factores que pueden
afectar el rendimiento final. Cada etapa, reproduccin y fermentacin, debe ser controlada.
Las condiciones requeridas por el microorganismo fermentador (pH, temperatura, niveles
de oxgeno, concentracin de azcar, etc) deben ser suplidas para que puedan obtenerse
buenos resultados.
A pesar que este microorganismo no es tan exigente metablicamente, existen factores que
lo pueden afectar, tal es el caso de los contaminantes bacterianos, los cuales tienen un
efecto negativo no slo a nivel de competencia por sustrato sino por produccin de
metabolitos indeseables que pueden llegar a afectar la viabilidad de la levadura y por ende
la fermentacin.
22
La alta concentracin de azcares en el sustrato puro genera elevada presin osmtica, y el
bajo contenido de agua son factores que no permiten la multiplicacin de microorganismos
de tipo bacteriano, sin embargo, la carga all presente se activa cuando el sustrato se diluye
y el contenido de agua permite su multiplicacin, de manera que se deben tomar medidas
preventivas y/o de control para que durante la etapa de reproduccin de la levadura no se
aumente de manera dramtica la poblacin bacteriana, la cual podra tener incidencia
negativa en la posterior fermentacin.
Finalmente, se pretende valorar si una variacin en el pH inicial del sustrato puede ser
utilizada como alternativa para el control de estos contaminantes bacterianos (bacterias
acido lcticas-BAL)
23
2. MARCO TERICO
A raz del continuo agotamiento global de los recursos y/o reservas de petrleo y el
consecuente aumento en su precio, la industria biotecnolgica ha encontrado prcticas
alternativas para que a partir de recursos renovables e incluso de subproductos de otras
industrias, pueda producirse alcohol etlico no slo para ser utilizado como combustible
sino para ser utilizado en la industria sucroqumica para la elaboracin de otros compuestos
de inters comercial (Converti et al, 2003).
A partir de este hecho y para lograr la produccin industrial de alcohol etlico a partir de
sustratos azucarados, ha de tenerse un sistema de fermentacin correctamente diseado y
preparado para manejar volmenes importantes de mosto y vino, los sistemas de
fermentacin usados en las destileras pueden dividirse en fermentacin por lotes y
fermentacin continua, en ambos casos, el control de las condiciones del proceso es
importante pues la finalidad es obtener el mximo rendimiento producto/sustrato
(Bellissimi & Ingledew, 2004).
Su reproduccin puede ser de tipo sexual, asexual o incluso pueden presentar los dos tipos,
sin embargo, la reproduccin asexual por fisin binaria o gemacin es el tipo ms comn y
consiste en la divisin de la clula dando origen a una invaginacin que evoluciona hasta
24
obtenerse dos clulas idnticas con el mismo material gentico, proceso denominado
mitosis (Jacques et al, 1999).
La gluclisis, ruta por la cual se metabolizan las hexosas (ver figura 1), puede realizarse en
condiciones anaerobias, sin la oxidacin neta de los azcares sustrato as como tambin en
condiciones aerobias. La ruta se selecciona dependiendo de las condiciones y necesidades
del microorganismo (Mathews et al, 2002).
25
catabolizado, la gluclisis produce menos energa total que la respiracin completa
(Mathews et al, 2002).
26
1) El piruvato, por accin del complejo piruvato deshidrogenada, es oxidado a Acetil-coA.
2) en el ciclo del cido ctrico, la oxidacin del carbono produce CO2, transportadores
electrnicos reducidos una pequea cantidad de ATP y
3) los transportadores electrnicos reducidos se reoxidan, aportando energa para la sntesis
de mas ATP (Mathews et al, 2002).
El ciclo del cido ctrico (ver figura 2), inicia en el momento en el que el piruvato
producido durante la gluclisis, sufre una decarboxilacin y deshidrogenacin mediante el
complejo piruvato deshidrogenada y es convertido en acetil-coA. Una vez este acetil-coA
entra al ciclo, es condensado con oxaloacetato por la accin de la citrato sintasa y se
produce citrato, el cual posteriormente sufre una deshidratacin a isocitrato gracias a la
accin reversible de la enzima aconitasa. Este isocitrato a su vez es oxidado por la isocitrato
deshidrogenada y es producido -cetoglutarato junto con CO2, el primero es
deshidrogenado y decarboxilado a CO2 y succinil co-A, el cual reacciona con ADP y forma
ATP y succinato, que luego es oxidado a fumarato por la succinato deshidrogenasa, con la
intervencin de FAD como cofactor. El fumarato es reversiblemente hidratado a L-malato
tras la accin de la fumarasa. Este nuevo intermediario es oxidado por la malato
deshidrogenasa y con produccin de NADH, regenerando oxaloacetato, el cual inicia un
nuevo ciclo (Nelson & Cox 2001).
El resultado final es producir alrededor de 38 ATPs por cada molcula de glucosa pues tras
la gluclisis slo se producen dos (2) ATPs a partir de una molcula de glucosa. Estas dos
vas metablicas (gluclisis y ciclo de Krebs ciclo de los cidos tricarboxlicos) ocurren al
interior de la clula ms especficamente en las mitocondrias y constituyen lo que se
denomina la respiracin celular de las levaduras durante los procesos fermentativos siempre
y cuando las condiciones de aireacin sean adecuadas y puedan darse las reacciones de
oxidacin (Nelson & Cox 2001).
27
Fuente: Bioqumica Harper 2004
Figura 2. Ciclo del cido ctrico Ciclo de Krebs
28
Esta fermentacin alcohlica comienza con la descarboxilacin no oxidativa del piruvato a
acetaldehdo, catalizada por la piruvato descarboxilasa, esta reaccin va seguida de la
reduccin del acetaldehdo a etanol que depende de NADH, catalizada por la enzima
alcohol deshidrogenada, reaccin expresada de la siguiente manera:
Alcohol deshidrogenasa
Piruvato descarboxilasa NADH + H+
Es as como el metabolismo del piruvato producido por gluclisis a partir de las hexosas,
dependiendo de la disponibilidad de oxgeno y de los microorganismos presentes en el
medio, puede tomar dos vas principales:
PIRUVATO
AEROBIOSIS ANAEROBIOSIS
29
La produccin de alcohol es un proceso multidisciplinario basado en la qumica,
bioqumica y microbiologa de diversos materiales, el metabolismo del microorganismo
ms estudiado y usado en este campo: Saccharomyces cerevisiae, la tcnica de destilacin
adecuada para separar el etanol de otros compuestos, y en general un sinnmero de
reacciones que originan el proceso y que permiten la obtencin de este valioso producto
(Jacques et al, 1999).
Los principales parmetros a controlar en una fermentacin alcohlica son en esencia pH,
Temperatura, Concentracin de azcar, Tolerancia a concentraciones de alcohol producido
y constituyentes del medio de cultivo, as como durante la propagacin es esencial la
inyeccin de aire que permita el crecimiento del microorganismo fermentador (Pramanik,
2003).
2.3.1. pH
El efecto de pH en una fermentacin es realmente importante no slo en relacin con el
desarrollo de la levadura sino con la tasa de fermentacin y con la formacin de
subproductos.
En estudios realizados con cepas aisladas de ponches azucarados, se encontr que la
mxima produccin de alcohol se obtiene a pH 4.25 y la menor a pH 3.7, probablemente
porque este ltimo es demasiado bajo para lograr una activacin eficiente de las enzimas
necesarias para la fermentacin y el intercambio inico al interior de la clula sufre un
30
descontrol tal, que sta, concentra su energa, en regular su sistema y no en fermentar el
azcar presente en el sustrato (Pramanik 2003).
2.3.2. Temperatura
La temperatura constituye un factor primordial tanto en la produccin de biomasa como de
etanol. Usualmente, la fermentacin alcohlica incrementa cuando la temperatura se
encuentra en un rango de 30-35C con una ptima de 32C, dependiendo de la cepa de
levadura utilizada.
Estudios realizados con distintas cepas de Saccharomyces cerevisiae han demostrado que
cuando ocurre un sobrecalentamiento durante la fermentacin para la produccin de
alcohol, la eficiencia es menor debido a la baja de la actividad enzimtica y al estrs que
sufre el microorganismo por afeccin de sus estructuras celulares.
31
En fermentaciones con melazas, la temperatura ptima, a la cual se obtiene el mayor
rendimiento de alcohol a partir del sustrato ha sido 32C.
Los resultados obtenidos por Pramanik en el ao 2003 en una fermentacin por lotes
usando una cepa de Saccharomyces aislada de un sustrato azucarado muestran que la
concentracin de etanol incrementa cuando se eleva la concentracin de sustrato pero dicho
aumento repercute en el tiempo que toma la fermentacin afectando la productividad.
Tabla 1. Rendimiento de alcohol (%) a partir de concentraciones de azcar para una cepa
de Saccharomyces aislada de un sustrato especfico.
Concentracin de azcar Rendimiento de alcohol Tiempo de fermentacin
32
(g/L) (%) (horas)
250 43 121
200 47 105
Tomado de Pramanik, 2003.
En ambos casos, el porcentaje de conversin del sustrato fue del 100%, demostrando as
que la concentracin de sustrato, la produccin de alcohol y el tiempo de fermentacin son
directamente proporcionales y dependen de los requerimientos y capacidad de la industria.
A nivel industrial, esto tambin depende de la conservacin de la viabilidad de la levadura,
de la respuesta de la cepa a dichos cambios y de los niveles de contaminacin presentes en
los tanques, pues al aumentar el tiempo, puede posiblemente aumentar igualmente el
nmero de bacterias indeseables y sus subproductos, disminuyndose as el rendimiento de
alcohol y la actividad del microorganismo fermentador (Oliveira et al, 1999).
33
Fosfolpidos: otorgan flexibilidad a la membrana, los principales son fosfatidilcolina,
fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina y fosfatidilinositol y se componen de cidos grasos
saturados e insaturados de 16 y 18 carbonos.
Esteroles: Aumentan la rigidez de la membrana y disminuyen su permeabilidad; el
principal esterol de membrana es el ergosterol y las levaduras al ser mas ricas en esteroles,
mantienen por ms tiempo su actividad fermentativa (Tomasso 2004).
Las tecnologas actuales permiten manipular el DNA de las levaduras a travs de tcnicas
especializadas como la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), la electroforesis en
campo pulsado (ECP), el estudio del DNA mitocondrial y el anlisis del polimorfismo del
fragmento de restriccin (RLPF) y mediante las cuales se logra un mejoramiento de las
cepas en diversas caractersticas que incluyen la resistencia al etanol en el medio y que le
permiten tolerar a la levadura incluso un 11% de alcohol (Bartra 2002).
34
adecuadamente y fermentar de forma eficiente. Estudios han revelado que la presencia de
este metabolito en el medio en concentraciones alrededor al 1% v/v induce al
microorganismo a convertir rpidamente el cido pirvico a etanol y lograr un balance de
oxidacin y reduccin al interior de la clula (Jacques et al, 1999).
En cuanto al efecto inhibitorio del etanol, la mayora de cepas utilizadas para dicho proceso
soportan en promedio 9,5% v/v de alcohol en el vino, sin embargo, esta concentracin a
nivel de planta slo se obtiene cuando el sustrato es puro, se suministran concentraciones
de azcar controladas, no existe contaminacin bacteriana y el proceso est estandarizado,
de manera que con sustratos de baja pureza difcilmente se alcanzan estas concentraciones
de alcohol, adicional a esto las cepas comercialmente utilizadas son tolerantes, no tienden a
sufrir estrs o inhibicin por metabolito, en este caso por etanol (Bellisimi & Ingledew,
2005).
35
Diferentes variables son utilizadas para medir el resultado de una fermentacin:
Sin embargo, segn Pasteur, slo puede lograrse un mximo de 95% del rendimiento terico,
es decir que a partir del azcar reductor que ingresa al proceso slo el 95% mximo, ha de
ser convertido a alcohol por parte de la levadura. El 5% restante es empleado para
crecimiento celular, produccin de otros metabolitos como cidos orgnicos, consumo por
parte de la contaminacin bacteriana, conversin en productos infermentables, entre otros
(Jacques et al, 1999).
C) Productividad, indica la relacin entre la masa de producto generado en cierto volumen
de fermentacin en un tiempo determinado:
Productividad g de producto
Volumen(L) * Tiempo de fermentacin (h)
36
Un gran nmero de factores pueden reducir el rendimiento de alcohol y disminuir la
productividad de la planta. Estos factores deben ser controlados para minimizar las perdidas
de sustrato y maximizar las ganancias en trminos de producto.
37
Estos alcoholes superiores se producen en altas tasas en sistemas de fermentacin por lotes
dependendiendo de la cepa de levadura, de altas temperaturas en la fermentacin, aireacin
y agitacin y lo ms importante, una baja disponibilidad de fuentes de Nitrgeno (Titica et
al, 2000).
38
Estos cidos, pueden inhibir el crecimiento de la levadura y existen estudios que sugieren
que a concentraciones superiores a 0.8% y 0.05% de lctico y actico respectivamente
pueden afectar de forma letal el desarrollo celular. Dichos niveles de cido lctico suelen
ser producidos por bacterias fermentadoras de carbohidratos que han sido aisladas en
diversas plantas productoras, que tienen su origen en los molinos de caa y otras fuentes de
sustratos azucarados y constituyen el principal grupo contaminante en la fermentacin de
alcohol. Son importantes no slo por la produccin de estos metabolitos sino por su
significante capacidad para tolerar concentraciones de etanol. (Acevedo et al, 2003).
Uno de los sustratos que por su origen y tratamiento presenta mayores problemas de
contaminacin por bacterias acido lcticas son las melazas de caa que se constituye como
el sustrato ms utilizado a nivel mundial para la produccin de alcohol (Koizumi 2005).
De esta manera, el concepto de acidez voltil constituye uno de los factores a controlar
durante la fermentacin alcohlica pues tiene incidencia en la calidad organolptica del
alcohol y su excesiva concentracin en una fermentacin alcohlica inhibe el desarrollo del
microorganismo fermentador.
39
esta acidez, adems de tener un impacto sobre las condiciones fisiolgicas, es generada al
inicio del crecimiento celular y es dependiente de la expresin de ciertos genes de la cepa
de levadura (Bellisimi & Ingledew, 2005).
Sin embargo, poco se conoce acerca del control de esta produccin bajo condiciones de
azcar alto en una fermentacin, probablemente la adicin de fuente de nitrgeno sea una
forma de controlar dicha produccin y en el caso de mostos de uvas, sta acidez debe ser
controlada eficazmente porque adems de deteriorar la materia prima y el producto, inhibe
considerablemente el desarrollo de la levadura.
La acidez voltil puede cuantificarse mediante mtodo rpido por cromatografa lquida de
alta resolucin (HPLC) mediante destilacin, el primer mtodo utiliza una fase mvil de
cido sulfrico y cuantifica de manera exacta los miligramos de cada cido voltil presente
en la muestra analizada, por su parte, el segundo mtodo involucra un proceso ms lento y
permite una cuantificacin de la acidez voltil total (sin separar los diferentes tipos de
cidos orgnicos) (Bellisimi & Ingledew, 2005).
40
adicin de cal para remover las fibras y el lodo, luego este jugo se evapora para concentrar
el azcar y ocasionar su cristalizacin.
El jugo que contiene los cristales de azcar es posteriormente centrifugado para separar los
cristales formados y el residuo de jugo es lo que se denomina Melaza tipo A, sta melaza es
evaporada y centrifugada nuevamente para cristalizar otra cantidad importante de azcar y
el jugo que resulta de este proceso se refiere a la melaza tipo B y dicho proceso se repite
nuevamente para lograr ms rendimiento en trminos de cristales de azcar logrando la
produccin de melaza tipo C como residuo (Jacques et al, 1999). Este jugo de caa es
normalmente evaporado y centrifugado mximo tres veces pero el nmero de tratamientos
depende de la eficiencia de los mismos y de la importancia econmica que stos implican.
(Jacques et al, 1999).
41
Tabla 3. Composicin tpica de una Miel tipo B
CARACTERSTICA ESPECIFICACIONES
Grados Brx promedio 70-75
Azucares totales mn (%m/m) 57
Azucares no fermentables (%m/m) <1.0
Slidos directos (%m/m en base hmeda) 2.0 - 3.0
Valores mximos y mnimos segn NTC 1846 (Miel A) y 587 (Miel C), Segn anlisis
departamento de calidad Sucromiles S.A. (Miel B).
42
El uso de sustratos impuros como melazas de caa, constituye un medio complejo dado que
contiene microelementos y vitaminas que no deben ser adicionados durante la fermentacin
excepto las fuentes elementales de nitrgeno y fsforo para obtener ptimos resultados,
contrario a otros sustratos que por su pureza deben ser suplementadas con micronutrientes
especiales.
La fuente de nitrgeno ms utilizada es la urea, pues las sales de amonio puede causar
incrustaciones por la formacin de compuestos secundarios y el amonio lquido puede
elevar el pH favoreciendo la contaminacin (Acevedo et al, 2003).
En el caso de mieles de caa puras la situacin cambia porque este tipo de componentes se
encuentran en concentraciones bajas por lo tanto deben adicionarse en mayores cantidades
elementos como nitrgeno, fsforo y algunas trazas de elementos como el zinc. (Acevedo
et al, 2003)
43
podran ser adicionadas lo cual a nivel industrial no es muy rentable, por lo cual se buscan
sustratos con dichas caractersticas nutricionales (Acevedo et al, 2003).
44
Igualmente, los residuos de materia prima que se adhieren a las lneas y la recirculacin y/o
la propagacin continua de levadura, favorecen la contaminacin pues se proporcionan
constantemente las condiciones adecuadas para el crecimiento microbiano, la inoculacin
de bacterias paralelo a la levadura en los fermentadores constituye quizs uno de los ms
graves problemas en las destileras, pues despus que un tipo bacterial logra colonizar un
sistema, es difcilmente removible y controlable, de ah que los mecanismos de prevencin
y control deban tenerse en cuenta de manera constante, principalmente en los sistemas de
fermentacin continuos (Bellissimi & Ingledew, 2004).
Mltiples estudios han demostrado que la accin microbiana es una de las causas
principales de prdidas de sacarosa en caa de azcar y que el principal microorganismo
causante es Leuconostoc mesenteroides, el cual induce la inversin y descompone la
glucosa en diversos productos como cido actico y/o lctico, los cuales disminuyen el pH
del jugo o miel, adems de producir la enzima dextransacarasa, la cual ocasiona la
polimerizacin de unidades de glucosa producindose la llamada dextrana cuya reaccin se
muestra a continuacin:
Dextran
C12H22O11 + H2O Invertasa (C6H12O6) + (C6H12O6) sacarasa (C6H12O5)X
Sacarosa Agua Fructosa Glucosa Dextrana
45
La dextrana es una sustancia mucilaginosa cuyo efecto perjudicial consiste en la prdida de
azcar fermentable y la generacin de una especie de pelcula superficial al mismo tiempo
aumenta la viscosidad del mosto de fermentacin y su produccin excesiva puede ocasionar
serios taponamientos de lneas y equipos de produccin (Mibielli & Filho 1999).
En cuanto a la accin trmica como tratamiento a los jugos de caa, sta puede eliminar la
mayora de los microorganismos pero ocasiona la descomposicin de la sacarosa para
formar compuestos polimricos y/o coloreados mediante reaccin de maillard que
constituyen los denominados infermentables aminoazcares en jugos y mieles de caa,
perjudiciales en cuanto a rendimiento se trata tanto en produccin de azcar como en
fermentacin para la produccin de alcohol (Mibielli & Filho 1999).
46
Los microorganismos heterofermentadores, carentes de aldolasa, no pueden descomponer
el difosfato hexosa a fosfato triosa, en lugar de ello, oxidan la glucosa 6-fosfato a 6-
fosfogluconato y entonces lo dcarboxilan a pentosa fosfato, la cual se transforma en triosa
fosfato y acetilfosfato por medio de la enzima fosfocetolasa (Jacques et al, 1999).
Esta triosa fosfato se convierte finalmente en cido lctico con la produccin neta de 1
ATP, mientras el acetilfosfato acepta electrones del NADH generado durante la produccin
de pentosa fosfato y as se convierte en etanol sin produccin de ATP (Jacques et al, 1999).
Debido a esto, los homofermentadores producen slo un mol de ATP a partir de glucosa a
diferencia de los heterofermentadores que producen dos moles de ATP igualmente a partir
de glucosa (Jacques et al, 1999).
47
Estas rutas para el metabolismo de carbohidratos llevadas a cabo por las bacterias acido
lcticas pueden igualmente dividir este grupo en tres clases: homofermentativos obligados,
heterfermentativos facultativos y heterofermentativos obligados, las especies de
homofermentativos obligados el nico producto final a partir de hexosas es el cido lctico
y la va glicoltica es la nica utilizada, las especies de este grupo producen la enzima
aldolasa pero no producen la fosfocetolasa, lo cual las inhabilita para fermentar pentosas y
gluconato (Jacques et al, 1999).
48
sustratos de fermentacin, as como que son capaces de metabolizar las mismas fuentes de
carbono para realizar su tipo de fermentacin (Jacques et al, 1999).
Oxgeno: las bacterias lcticas se han descrito como anaerobias, sin embargo se ha
demostrado que prefieren ambientes microaeroflicos y pueden sobrevivir en ambientes
donde el oxgeno est completamente ausente, manejando una tasa de crecimiento baja.
Este tipo bacteriano carece de las enzimas catalasa y superoxido dismutasa, las cuales son
usadas por bacterias aerbicas para convertir compuestos txicos: el perxido de hidrgeno
y el superxido respectivamente, ambos formados durante sus procesos respiratorios, sin
embargo L.plantarum y algunas especies de pediococcus pueden sintetizar la catalasa bajo
ciertas condiciones; los iones hierro y manganeso son importantes para la actividad de la
catalasa as como para neutralizar el radical superxido (O-) (Jacques et al, 1999).
Saccharomyces cerevisiae es catalasa positiva y crece adecuadamente bajo condiciones
aerobicas, con el oxigeno como requerimiento principal en los primeros estados de la
fermentacin por lo que constituye en otro ventaja competitiva de las bacterias lcticas bajo
condiciones anaerobias en la fermentacin de la levadura. (Jacques et al, 1999).
49
Fi
gura 5. Contaminantes bacterianos tpicos en las destileras.
Los cidos lctico y actico son productos que afectan notablemente las caractersticas
organolpticas del producto (etanol), pues se producen a partir de l, as como la acrolena
y el diacetil, una cetona que puede producirse durante la fermentacin cuando el piruvato es
convertido a cido lctico y algunas especies de Pediococcus y Lactobacillus son los
responsables de dicha produccin, no obstante, las levaduras producen diacetil durante los
primeros estados de la fermentacin pero este es removido por la accin de varias enzimas
y por la presencia de algunos aminocidos en el medio (Jacques et al, 1999).
50
Fuente: Alltechs Fifteenth Anual International Alcohol course. Lexington, Kentucky.EEUU, Octubre 16 al 20 de 1995.
Figura 6. Productos desarrollados por contaminantes bacterianos en la fermentacin.
2.7. TRATAMIENTO DE CONTAMINACION BACTERIANA
51
adicin de agentes antimicrobianos que actan selectivamente sobre las bacterias y no
tienen efecto sobre la levadura (Koizumi 2005).
Las sustancias mas utilizadas en los procesos fermentativos son los antibiticos, que
adicionados en concentraciones adecuadas ayudan al control de los principales
contaminantes en el proceso, sin embargo, la resistencia que generan estos
microorganismos tras la constante exposicin a estos compuestos constituye uno de los
principales motivos de estudio y ha permitido incursionar en la obtencin de otros
compuestos que puedan complementar el tratamiento. En general, se recomienda hacer una
rotacin de los mismos (antibiticos) para evitar la generacin de dicha resistencia
(Koizumi 2005).
2.7.1. Antibiticos
Adems de los factores de control conocidos como la calidad de las materias primas,
pasteurizacin del mosto, higiene en la manipulacin, sanitizacin y buen mantenimiento,
los antibiticos son utilizados como medida complementaria durante la fermentacin de
alcohol (Ruckle, 2005).
52
Los agentes antimicrobianos actan por una serie de mecanismos, muy diferentes entre
ellos y cuyos blancos se encuentran en diferentes regiones de la clula atacada. Las diversas
regiones de ataque antibacteriano se consideran en general:
Pared celular
Membrana celular
Sntesis de protenas
Sntesis de cidos nucleicos (Errecalde, 2004).
En la figura 7 se presentan los tipos ms comunes y sus blancos de accin dentro de la
estructura microbiana.
Fuente: Uso de Antimicrobianos en animales de consumo. Organizacin de las naciones unidas para la agricultura y la alimentacin. Errecalde J. 2004
53
Las dosis de adicin de este antibitico dependen de la concentracin inicial de
contaminantes en el proceso y generalmente oscila entre 0.5 y 2.0 ppm (recomendacin del
fabricante), sin embargo, a nivel de planta generalmente se requieren dosis ms altas, esto
debido a que la penicilina no es muy estable y se ve parcialmente inactivado bajo pHs
inferiores a 5.0 (Kelsall, 1995).
2.7.1.2. Estreptograminas
Constituyen un amplio conjunto de pptidos cclicos con caractersticas muy peculiares
producidas por diversas especies de Streptomyces y cada miembro se conforma por una
combinacin de dos molculas o grupos: A y B, sin relacin estructural alguna, las cuales
corresponden a macrolactonas poliinsaturadas y hexadepsipptidos cclicos
respectivamente; de cualquier manera, ambas inhiben la sntesis proteica bacteriana,
actuando sobre el dominio de la peptidil-transferasa de la subunidad ribosomal 50S (Garza
et al, 2000).
Sin lugar a dudas, una de las propiedades ms atractivas de estos compuestos radica en el
hecho de que las molculas de ambos grupos actan de forma sinrgica en contra de los
agentes microbianos; ello origina su accin bactericida y reduce la posibilidad de que
sobrevivan bacterias resistentes que pudieran surgir hacia uno u otro componentes, cuyos
pesos moleculares fluctan alrededor de 500 y 800 Daltons dependiendo del grupo al que
54
pertenezcan. Diversos laboratorios de investigacin han logrado aislar numerosas
estreptograminas, encontrando que en realidad stas corresponden a un grupo poco
homogeneo, de hecho, slo se han obtenido algunas preparaciones comerciales utilizadas
principalmente en agricultura entre las que destacan la pristinamicina y la virginamicina, la
primera producida por Streptomyces pristinaespiralis y la segunda producida por
Streptomyces virginiae (Garza et al, 2000).
Uno de los rasgos de estos compuestos consiste en su baja hidrosolubilidad, sin embargo,
recientemente estudios realizados por Leclerq & Courvalin han permitido sintetizar
derivados hidrosolubles que son comunes comercialmente, su espectro es amplio dado que
su estructura est compuesta por dos grupos de molculas cuyo mecanismo de accin
consiste en la inhibicin de los eventos iniciales de la sntesis proteica en las bacterias
blanco, de manera que esto se traduce en la liberacin de cadenas peptdicas incompletas
que conducen a un bloqueo total de su desarrollo posterior (Crecy et al 1997).
55
cantidades como en el caso del uso de vinaza como fertilizante de cultivos, de ah la
bsqueda de compuestos naturales para reemplazar los antibiticos se haya intensificado
(Ruckle, 2005).
Ejemplo de ello es la Unin Europea (UE) donde los productos que se usen para alimento
animal no pueden contener ningn tipo de antibitico; de hecho, a raz de estos cambios en
la legislacin de la UE, en EEUU tambin se est replanteando la utilizacin de antibiticos
en alimentacin animal. Concretamente, a partir del reglamento CE- 2821/98 del Consejo
del 17/12/1998 y del reglamento 2205/01 de la Comisin de l 14/11/2001 se ha prohibido el
uso de Bacitracina de zinc, Espiramicina, Virginamicina y Tilosina (Santom 2003).
Una de estas nuevas alternativas consiste en la utilizacin del lpulo, el cul posee una
propiedad conservante que los cerveceros han reconocido por ms de mil aos, a pesar que
slo en la ltima dcada dichas propiedades han sido propiamente entendidas; la empresa
Betatec HG produce una variedad de compuestos basados en lpulo que han mostrado una
capacidad para controlar el crecimiento de bacterias Gram positivas en varias aplicaciones.
56
Este tipo de productos antibacterianos naturales se obtienen del extracto de lpulo con CO2
mediante un proceso totalmente acuoso y contienen en esencia, cidos de lpulo y son muy
activos contra una serie de bacterias que se encuentran tpicamente durante la fermentacin
alcohlica como Lactobacillus, una concentracin inhibitoria suficiente del antimicrobiano
lograr impedir la generacin de cido lctico y cido actico y por lo tanto contribuir a
prevenir las prdidas en el rendimiento de etanol (Ruckle, 2005).
Los componentes del lpulo que actan como agentes antimicrobianos estn contenidos en
la flor, en glndulas conocidas como lupulinas donde los alfa-cidos son isomerizados
mediante calentamiento a Iso-alfa-cidos, siendo estos ltimos los que realmente poseen
propiedades preservantes que consisten en el bloqueo de las membranas biolgicas de las
bacterias (Ruckle, 2005).
En 1993, W J Simpson, investig sobre la sensibilidad de las bacterias lcticas frente a los
cidos de lpulo, y demostr que stos actan como transportadores mviles de ionforos e
inhiben el crecimiento microbiano por disipacin del gradiente transmembranal de
protones, como consecuencia de esto, la asimilacin de azcar por las clulas bacterianas es
inhibida y por consiguiente a liberacin de sus metabolitos como cido lctico y/o cido
actico no pueden ser producidos ni liberados al medio (Ruckle 2005).
57
No slo la utilizacin de compuestos qumicos sintticos o naturales, constituye la
alternativa para el control de las poblaciones bacterianas en una fermentacin alcohlica, en
un estudio realizado por Alcarde et al, 2002, pudo evaluarse la influencia de la radiacin en
la reduccin de algunas bacterias de los gneros Bacillus y Lactobacillus que usualmente
contaminan los jugos de caa y, efectivamente el tratamiento con este tipo de radiacin
reduce la concentracin bacteriana y como consecuencia, la acidez voltil producida es
menor y la viabilidad de la levadura no se ve afectada (Alcarde et al, 2002).
De esta forma se puede entonces afirmar que existen varias formas de controlar los
contaminantes en una fermentacin alcohlica y lo importante es escoger el tipo de
tratamiento adecuado no slo segn la flora microbiana presente y su incidencia en el
rendimiento del proceso sino de acuerdo a los costos de inversin teniendo en cuenta
volmenes de fermentacin.
58
3. FORMULACION DEL PROBLEMA, JUSTIFICACIN Y
ANTECEDENTES
3.2. JUSTIFICACION
Debido a los altos costos actuales de las materias primas para fermentacin alcohlica y a
la necesidad de aprovechar al mximo los contenidos de azcar fermentable en las mismas
se desarroll el presente trabajo de investigacin con el fin de determinar si el rendimiento
de la fermentacin se ve afectado por los niveles de contaminacin de bacterias acido
lcticas tpicamente encontrados a nivel de planta, tanto en la etapa de reproduccin como
en la de fermentacin, traducindose esto en prdidas de azcar que deberan ser
cuantificadas con el fin de tomar medidas al respecto y conocer si la utilizacin del
antibitico aporta un considerable beneficio al proceso.
59
son las principales contaminantes en el proceso de fermentacin debido a la condicin de
anaerobiosis, porque adems de consumir el sustrato, generan subproductos que pueden
inhibir la levadura y bajar la calidad organolptica del producto.
Adems, y debido a los tiempos de retencin del sustrato en los tanques, se favorece el
desarrollo de estos microorganismos anaerobios facultativos que soportan ambientes
extremos e incluso crean resistencia a diversos antimicrobianos luego de ser expuestos
constantemente a los mismos.
3.3. ANTECEDENTES
60
embargo, con el tiempo de uso, stos pierden su efectividad sobre el grupo microbiano
determinado y dejan de ser un mecanismo de control adecuado (Ruckle, 2005).
Ante esta situacin, las destileras en Colombia han tomado en cuenta otras opciones de
tratamiento al sustrato antes de iniciar la fermentacin como aumento en los tiempos de
calentamiento de las mieles y jugos de caa, descenso importante del pH de los mismos
para garantizar que las bacterias no puedan reproducirse bajo estas condiciones, al mismo
tiempo que la levadura no se afecte en su desarrollo y fermentacin u opciones innovadoras
como son la utilizacin de compuestos orgnicos como extractos de plantas para evitar el
uso de compuestos con efecto residual que permanezcan en las vinazas, cuyo atractivo
comercial es ser un fertilizante de tipo orgnico libre de qumicos como es el caso de los
antibiticos (Ruckle, 2005).
61
4. OBJETIVOS
5. MATERIALES Y MTODOS
62
5.1. UBICACIN Y DISEO DE LA INVESTIGACIN
La presente investigacin se llev a cabo en la planta alcoqumica de SUCROMILES S.A,
empresa biotecnolgica ubicada en la recta Cali-Palmira Km 18 Departamento Valle del
Cauca Colombia.
Las materias primas utilizadas para los diferentes ensayos dentro del diseo experimental
fueron caracterizadas previamente para garantizar la calidad de las mismas y se incluy el
anlisis microbiolgico de los sustratos y la levadura (Ver Anexos 3 y 4). El manejo y
almacenamiento de las muestras se realiz bajo condiciones de refrigeracin (7C) y en
material estril.
63
un % de azcares totales reductores entre 6%-8% m/v y cuya densidad depende del
tipo de miel utilizada.
Melaza miel de segunda dilucin: utilizada durante la etapa de fermentacin y la
cual tras adicin de agua, cido sulfrico y homogenizacin, registra un % de
azcares totales reductores entre 19%-22% m/v.
Vino
Miel de tercera Fermentacin
dilucin Reproduccin de alcohlica
levadura Mx 30h
ATR 6-8% m/v Mx 24h Destilacin
30% inculo
Etanol Vinaza
Miel de segunda
dilucin Sulfato de calcio + Levadura
ATR 19-22% m/v muerta
64
pH 4.6 NA
Aireacin 5 L/mn
Nutrientes (urea y fosfato) 0,6 y 0,4 g/900ml
(respectivamente)
Antiespumante 30 ppm
Concentracin de azcares 6-8 % m/v
reductores (ATR)
Poblacin inicial de levadura 3x108 UFC/ml
Viabilidad inicial de levadura >85% % celulas vivas
Morfologa de la levadura Homogenea/Heterogenea NA
Tiempo de reproduccin 24 horas
65
Variables de respuesta (dependientes) Unidades
Porcentaje de alcohol al final de la % v/v
fermentacin
Azcar reductor residual (AR) % m/v
Poblacin de contaminantes bacterianos UFC/ml
(BAL)
Rendimiento del proceso de fermentacin %
Eficiencia del proceso de fermentacin %
Productividad g/L * h
*NA: No Aplica.
5.2. METODOS
Etapa de Reproduccin
66
densidad fue ^1.030g/ml. Estas densidades corresponden aproximadamente a un 6-8%
p/v de azcares totales reductores en cada uno de los casos. El pH inicial fue de 4.6
regulado por adicin de cido sulfrico.
67
Tabla 6. Tratamientos con antibitico para la etapa de propagacin con melaza y jugo
de caa
Cada ensayo tanto para penicilina como para virginamicina a las concentraciones
mencionadas (0.5, 1.0 y 2.0 ppm y su respectivo control) y para los dos sustratos de
estudio (melaza y jugo de caa concentrado) se llev a cabo en cuatro repeticiones bajo los
mismos parmetros.
Etapa de fermentacin
68
Una vez se determin la poblacin y viabilidad de la levadura para cada ensayo, se midi el
volumen de inculo que se llev a la fermentacin (900ml) garantizando que el nmero de
levaduras inoculadas se encontrara alrededor de 3X108 clulas/ml, determinadas mediante
recuento en cmara de neubauer, para iniciar el proceso.
Igualmente, se determin mediante recuento en placa en medio MRS, el nmero de
bacterias contaminantes que ingresaron a la fermentacin como parte del inculo tras los
diferentes tratamientos con los antibiticos.
69
Durante el proceso de fermentacin se gener la condicin de anaerobiosis al sistema a
travs de un tapn hermtico en la parte superior de la botella Schoot pero permitiendo la
eficiente salida del CO2 generado en el proceso a travs de una extensin de la botella
conectada a una manguera.
Durante el tiempo de llenado se adicionaron 50 ppm del antiespumante para evitar prdidas
de sustrato por generacin de espuma, adems, se proporcion agitacin en forma circular
mediante plancha agitadora, para simular el sistema de recirculado que se lleva a cabo en
planta, de manera que la totalidad de la poblacin de levadura estuviera en contacto con el
sustrato a fermentar y sta, no tendiera a sedimentarse afectando el tiempo y/o desarrollo
del proceso.
70
(Anexo 8), generada en el proceso y la masa de alcohol esperada tericamente en la
frmula:
71
concentracin de bacterias lcticas en los sustratos de tercera y segunda dilucin iniciales
(antes de adicionar el cido) y de esta forma se estableci la efectividad de este tratamiento
en el control de contaminantes y probablemente en el rendimiento de la fermentacin al
igual que para los tratamientos anteriores (antibitico a 0.5, 1.0 y 2.0ppm).
De cada ensayo (pH 3.0, 3.5 y 4.0 con su respectivo control) se realizaron cuatro
repeticiones bajo los mismos parmetros para obtener una matriz de datos representativa.
Los datos se registraron de forma codificada para su posterior anlisis.
Tabla 7. Tratamiento con descenso de pH para la etapa de propagacin con melaza y jugo
de caa concentrado
TRATAMIENTO
DESCENSO DE pH
pH 3.0
pH 3.5
pH 4.0
Control (pH 4.6)
72
Debido a que la investigacin es de tipo experimental, la recoleccin de la informacin se
llev a cabo paralelo a los ensayos, los datos arrojados por cada uno de ellos, se codificaron
y expresaron mediante una sigla con el fin de facilitar su tabulacin como se muestra a
continuacin:
Tratamiento con Penicilina (P)
Tratamiento con Virginamicina (V)
Tratamiento con pH (H)
Melaza como sustrato (A)
Jugo de caa concentrado como sustrato (B)
Utilizando esta codificacin se diligenciaron formatos (Ver Anexos 9 y 10) que incluy los
siguientes valores: la concentracin de azcar, la poblacin de levadura, la poblacin de
contaminantes, la acidez voltil, la densidad y dems datos que se obtuvieron tanto en el
proceso de reproduccin como en el de fermentacin para cada tratamiento as como para
los controles respectivos.
73
El anlisis de los datos obtenidos experimentalmente se realiz mediante anlisis de
varianza de doble va para cada uno de los sustratos evaluados (ANOVA, dos vas).
En el caso del tratamiento de disminucin de pH, las fuentes de variacin fueron los
diferentes valores de pH a los que se sometieron los sustratos de fermentacin as como el
efecto a partir de los mismos. El anlisis de varianza se realiz a partir del rendimiento
(producto/sustrato) calculado con los datos resultantes de cada ensayo con un nivel de
significancia de 0.05.
6. RESULTADOS
74
Los datos utilizados para la construccin tanto de las tablas como de las figuras que
aparecen en este captulo, salvo que se indique lo contrario en el texto, son los datos
promedio de las cuatro repeticiones realizadas para cada ensayo.
75
de cultivo MRS, similares a las obtenidas en todas las diluciones para el caso de la melaza
de caa.
Para cada uno de los casos se realizaron pruebas confirmatorias (Anexo 5) para las colonias
presuntivas que se resumen en las Tabla 11.
El tipo de crecimiento puntiforme en medio MRS de bacilos Gram positivos y cuya fuente
de aislamiento son sustratos azucarados como las mieles de caa, corresponde a presuntivo
del gnero Lactobacillus y normalmente se encuentra a lo largo de los procesos de
fermentacin. Estas bacterias lcticas se encuentran tanto en los medios de propagacin de
la levadura como en los vinos al final del proceso.
En las plantas industriales, el gnero Lactobacillus, gracias a su maquinaria metablica
logra crecer y/o mantenerse en ambientes aerobios, microaeroflicos e incluso en
anaerobiosis (Jacques et al, 1999).
76
Figura 9a. Colonias en medio MRS a partir de Figura 9b. Colonias puntiformes en medio
jugo de caa concentrado sin calentamiento MRS aisladas en melaza y jugo de caa
tpicas del gnero Leuconostoc. tpicas del gnero Lactobacillus.
En la tabla 12, se presentan las caractersticas iniciales de la miel de tercera dilucin con la
que se inici el proceso de propagacin de la cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae a
partir de los dos sustratos. Estos datos iniciales permitieron conocer bajo qu condiciones
inici el proceso, para posteriormente ser comparados con los obtenidos tras los diferentes
tratamientos objeto de la presente investigacin.
77
Los recuentos de bacterias lcticas corresponden a crecimiento de colonias planas
puntiformes tpicas del gnero Lactobacillus, confirmadas mediante coloracin de Gram y
crecimiento en Agar hipersacarosa (Anexo 5).
No se registra crecimiento de colonias mucilaginosas transparentes y grandes en el medio
de cultivo (MRS) despus del calentamiento (70C) de ninguno de los dos sustratos
evaluados.
Los valores de acidez voltil en melaza duplican los valores obtenidos para el jugo de caa
concentrado al inicio de la etapa de reproduccin, igualmente los recuentos de bacterias
lcticas en melaza, exceden en una unidad logartmica los registrados en el jugo de caa.
Las caractersticas iniciales de las mieles de segunda dilucin con las que se realiz la etapa
de fermentacin se registran en la Tabla 11.
78
Los recuentos de bacterias lcticas corresponden a crecimiento de colonias planas
puntiformes tpicas del gnero Lactobacillus, confirmadas mediante coloracin de Gram y
crecimiento en Agar hipersacarosa (Anexo 5).
Nuevamente se observa que los valores de acidez voltil as como los recuentos de
bacterias lcticas son ms altos en melaza que en jugo de caa.
79
Tabla 12. Crecimiento en medio slido de la levadura hidratada y recuento en cmara de
Neubauer
Poblacin de la % de viabilidad de
Crecimiento en
levadura en cmara la levadura en
Ensayo medio YM
de neubauer cmara de
(Positivo/Negativo)
(clulas/ml) neubauer
Melaza con penicilina Positivo 2.4E+09 92
Melaza con Virginamicina Positivo 3.0E+09 94
Jugo de caa con Penicilina Positivo 3.1E+09 92
Jugo de caa con Virginamicina Positivo 2.7E+09 93
Tratamiento con pH Melaza Positivo 2.7E+09 91
Tratamiento con pH Jugo de Positivo 3.0E+09 92
caa
80
Concentracin Recuento de Viabilidad Recuento Acidez
Tratamiento de antibiotico Levadura de Levadura BAL Voltil
neubauer
(ppm) (%) (UFC/ml) (ppm)
(clulas/ml)
Control P4A 0.00 3.0 E+08 100 3.1 E+05 1618
P1A 0.50 3.1 E+08 100 3.2 E+05 1649
P2A 1.00 3.1 E+08 100 4.0 E+05 1595
P3A 2.00 2.9 E+08 100 3.6 E+05 1631
Tabla 14. Variables de respuesta etapa de reproduccin con Melaza tratada con
Virginamicina (24 horas)
Concentracin Recuento de Viabilidad Recuento Acidez
Tratamiento de antibiotico Levadura de Levadura BAL Voltil
neubauer
(ppm) (%) (UFC/ml) (ppm)
(clulas/ml)
Control V4A 0.00 3.1 E+08 100 3.1 E+05 1458
V1A 0.50 3.1 E+08 100 3.4 E+05 1492
V2A 1.00 3.0 E+08 100 3.3 E+05 1481
V3A 2.00 3.3 E+08 100 3.2 E+04 1385
1,00E+07
1,00E+06
BAL (ufc/ml)
1,00E+05
1,00E+04
1,00E+03
0,00 0,50 1,00 2,00
Concentracin de antibitico (ppm)
Melaza tratada con Penicilina Melaza tratada con Virginamicina
Figura 11. Poblacin de BAL (ufc/ml) Vs Concentracin de antibitico (ppm) en etapa de reproduccin con melaza (24 horas)
81
6.5.2. Reproduccin con Jugo de Caa Concentrado
En el caso de los tratamientos con los antibiticos penicilina y virginamicina durante 24
horas de reproduccin de la levadura utilizando jugo de caa concentrado como sustrato
azucarado, se obtuvo la informacin que se registra en las tablas 15 y 16 e igualmente
corresponde a las variables de respuesta frente a los parmetros controlados del proceso. La
concentracin de contaminantes (BAL) puede observarse en la figura 12.
Tabla 15. Variables de respuesta etapa de reproduccin con Jugo de caa concentrado
tratado con Penicilina (24 horas)
Concentracin Recuento de Viabilidad Recuento Acidez
Tratamiento de antibiotico Levadura de Levadura BAL Voltil
neubauer
(ppm) (%) (UFC/ml) (ppm)
(clulas/ml)
Control P4B 0.00 3.0 E+08 100 3.8 E+06 2748
P1B 0.50 3.0 E+08 100 3.5 E+06 2844
P2B 1.00 3.1 E+08 100 3.7 E+06 2816
P3B 2.00 3.0 E+08 100 3.3 E+05 2774
Tabla 16. Variables de respuesta etapa de reproduccin con Jugo de caa concentrado
tratado con Virginamicina (24 horas)
Concentracin Recuento de Viabilidad Recuento Acidez
Tratamiento de antibiotico Levadura de Levadura BAL Voltil
neubauer
(ppm) (%) (UFC/ml) (ppm)
(clulas/ml)
Control V4B 0.00 3.0 E+08 100 3.0 E+06 2888
V1B 0.50 3.1 E+08 100 3.0 E+06 2922
V2B 1.00 3.0 E+08 100 3.0 E+05 2972
V3B 2.00 3.0 E+08 100 3.1 E+05 2872
82
Recuento de Bacterias Acido Lacticas (ufc/ml) vs. Concentracin de antibitico
(ppm) etapa de reproduccin con Jugo de Caa Concentrado
1,00E+07
1,00E+06
1,00E+04
1,00E+03
0,00 0,50 1,00 2,00
Concentracin de antibitico (ppm)
Jugo de Caa tratado con Penicilina Jugo de Caa tratado con Virginamicina
Figura 12. Poblacin de BAL (ufc/ml) Vs Concentracin de antibitico (ppm) etapa de reproduccin con jugo de caa
concentrado (24 horas)
83
Tabla 17. Variables de respuesta etapa de fermentacin de Melaza inoculo tratado con
Penicilina (30 horas)
Tratamiento/ Azcar
Alcohol Rendimiento Eficiencia Productividad
ppm Residual
(% v/v) (%) (%) (g/L*h)
antibitico (% m/v)
Control
8.07 1.80 39 81.01 2.13
P4A/0.0
P1A/0.5 8.08 2.07 40 81.16 2.13
P2A/1.0 8.31 1.88 41 83.44 2.19
P3A/2.0 8.38 1.92 41 84.17 2.21
Tabla 18. Variables de respuesta etapa de fermentacin de Melaza inoculo tratado con
Virginamicina (30 horas)
Tratamiento/ Azcar
Alcohol Rendimiento Eficiencia Productividad
ppm Residual
(% v/v) (%) (%) (g/L*h)
antibitico (% m/v)
Control
8.04 1.86 40 82.56 2.12
V4A/0.0
V1A/0.5 8.05 1.83 41 82.64 2.12
V2A/1.0 8.24 1.78 41 84.64 2.17
V3A/2.0 8.35 1.86 42 85.71 2.20
60
40 42
39 40 40 41 41 41 41
Rendimiento
(%)
20
0
0,00 0,50 1,00 2,00
Concentracin de antibitico (ppm)
Melaza inoculo tratado con Penicilina Melaza inoculo tratado con Virginamicina
Figura 13. Rendimiento (%) Vs concentracin de antibitico (ppm) en etapa de fermentacin con melaza (30 horas
84
Eficiencia (%) vs. Concentracin de antibitico (ppm) etapa de Fermentacin
con Melaza
100,0
60,0
Eficiencia (%)
40,0
20,0
0,0
0,00 0,50 1,00 2,00
Concentracin de antibitico (ppm)
Melaza inoculo tratado con Penicilina Melaza inoculo tratado con Virginamicina
Figura 14. Eficiencia (%) Vs Concentracin de antibitico (ppm) en etapa de fermentacin con melaza (30 horas)
0
0.00 0.50 1.00 2.00
Concentracin de antibitico (ppm)
Melaza inoculo tratado con Penicilina Melaza inoculo tratado con Virginamicina
Figura 15. Productividad (g/L*h) Vs Concentracin de antibitico (ppm) en etapa de fermentacin con melaza (30 horas)
85
En el caso de los tratamientos con los antibiticos penicilina y virginamicina utilizando
jugo de caa concentrado como sustrato de fermentacin, se obtuvo la informacin que
puede observarse en las tablas 19 y 20 que igualmente corresponden a las variables de
respuesta frente a los parmetros preestablecidos y adems registran cuantitativamente el
rendimiento final de fermentacin para cada uno de los tratamientos y la eficiencia y
productividad global del proceso a nivel de laboratorio.
86
Rendimiento (%) vs. Concentracin de antibitico (ppm) etapa de
Fermentacin con Jugo de Caa Concentrado
60
40
Rendimiento 38 40 38 40 39 40 39 40
(%)
20
0
0,00 0,50 1,00 2,00
Concentracin de antibitico (ppm)
Jugo de Caa inoculo tratado con Penicilina Jugo de Caa inoculo tratado con Virginamicina
Figura 16. Rendimiento (%) Vs Concentracin de antibitico (ppm) en etapa de fermentacin con Jugo de caa concentrado (30 horas)
100,0
60,0
Eficiencia (%)
40,0
20,0
0,0
0,00 0,50 1,00 2,00
Concentracin de antibitico (ppm)
Jugo de Caa inoculo tratado con Penicilina Jugo de Caa inoculo tratado con Virginamicina
Figura 17. Eficiencia (%) Vs Concentracin de antibitico (ppm) en etapa de fermentacin con jugo de caa concentrado (30 horas)
87
Productividad (g/L*h) vs. Concentracin de antibitico (ppm) etapa de
Fermentacin para Jugo de Caa Concentrado
2.14 2.16
2 2.03
2.12 2.02 2.11 2.06 2.08
Productividad
(g/L*h)
1
0
0.00 0.50 1.00 2.00
Concentracin de antibitico (ppm)
Jugo de Caa inoculo tratado con Penicilina Jugo de Caa inoculo tratado con Virginamicina
Figura 18. Productividad (g/L*h) Vs Concentracin de antibitico (ppm) en etapa de fermentacin con jugo de caa (30 horas)
88
6.6. TRATAMIENTO CON DESCENSO DE pH
Tabla 21. Variables de respuesta etapa de reproduccin con Melaza bajo ajuste de pH
(24 horas)
Recuento de
Levadura Viabilidad de Recuento BAL Acidez Voltil
Tratamiento pH
neubauer Levadura (%) (UFC/ml) (ppm)
(clulas/ml)
H1A 3.0 2.0 E+06 78 3.2 E+04 1488
H2A 3.5 3.4 E+07 78 4.6 E+04 1483
H3A 4.0 3.6 E+08 100 3.3 E+05 1478
Control H4A 4.6 3.8 E+08 100 3.3 E+05 1477
Tabla 22. Variables de respuesta etapa de reproduccin con Jugo de caa concentrado
bajo tratamiento de ajuste de pH (24 horas)
Recuento de
Levadura Viabilidad de Recuento BAL Acidez Voltil
Tratamiento pH
neubauer Levadura (%) (UFC/ml) (ppm)
(clulas/ml)
H1B 3.0 2.8 E+06 79 3.4 E+04 1816
H2B 3.5 2.8 E+07 84 3.4 E+04 1869
H3B 4.0 2.8 E+07 100 3.4 E+06 1867
Control H4B 4.6 3.0 E+08 100 3.4 E+06 2157
En las figura 19 pueden observarse los resultados de recuento de bacterias lcticas en etapa
de reproduccin para cada uno de los tratamientos con descenso de pH.
89
Recuento de Bacterias Acido Lacticas (ufc/ml) vs. pH del medio etapa de
reproduccin con Melaza y Jugo de Caa Concentrado
1,00E+07
1,00E+06
1,00E+04
1,00E+03
3 3,5 4 4,6
pH
Melaza tratada con pH Jugo de Caa tratado con pH
Figura 19. Poblacin de BAL (ufc/ml) Vs Tratamiento con pH en etapa de reproduccin (24 horas)
Tabla 23. Variables de respuesta etapa de fermentacin de Melaza inoculo tratado con
ajuste de pH (30 horas)
Azcar Productivi
Alcohol Rendimiento Eficiencia
Tratamiento pH Residual dad
(% v/v) (%) (%)
(% m/v) (g/L*h)
H1A 3.0 7.28 3.52 36 73.69 1.92
H2A 3.5 7.51 2.52 37 76.00 1.98
H3A 4.0 8.15 2.15 41 82.48 2.15
Control H4A 4.6 8.21 2.05 41 83.13 2.16
90
Rendimiento (%) vs. pH del medio etapa de Fermentacin con Melaza y Jugo
de Caa Concentrado
60
40 41 41 39
Rendimiento 36 38 37 38 39
(%)
20
0
3 3,5 4 4,6
pH
Figura 20. Rendimiento (%) Vs Tratamiento con pH en etapa de fermentacin con melaza y jugo de caa concentrado
Eficiencia (%) vs. pH del medio etapa de Fermentacin para Melaza y Jugo de
Caa Concentrado
100,0
80,0 82,5
77,9
83,1
78,9
73,7 75,0 76,0 76,3
60,0
Eficiencia (%)
40,0
20,0
0,0
3 3,5 4 4,6
pH
Melaza inoculo tratado con pH Jugo de Caa inoculo tratado con pH
Figura 21. Eficiencia (%) Vs Tratamiento con pH en etapa de fermentacin con melaza y jugo de caa concentrado
91
Productividad (g/L*h) vs. pH del medio etapa de Fermentacin para Melaza y
Jugo de Caa Concentrado
0
3 3.5 4 4.6
pH
Figura 22. Productividad (g/L*h) Vs pH del medio en etapa de fermentacin con melaza y jugo de caa (30 horas)
92
7. ANALISIS DE VARIANZA
Donde:
n: nmero de observaciones
k: nmero de tratamientos
T: total
SST: Suma total de cuadrados
SSTr: Suma total de cuadrados entre tratamientos
SSE: Suma de cuadrados de error
SSB1: Suma de cuadrados del segundo recurso de variacin (antibiticos)
MS: Media de cuadrados
93
7.1.1. ANOVA doble va para Melaza como sustrato de fermentacin
Tabla 26. Datos de rendimiento (%) obtenidos con Melaza como sustrato de fermentacin
Tratamiento (Dosis en ppm)
TAntibitico Total
0,00 0,50 1,00 2,00
Penicilina 39 40 41 41 161
Virginamicina 40 41 41 42 164
Total 79 81 82 83 325
Hiptesis Alterna para tratamientos (H1): Existe diferencia significativa entre los efectos de
las diferentes dosis de antibitico sobre el valor de rendimiento de fermentacin.
Hiptesis Alterna para los dos productos evaluados (H1): Existe diferencia significativa en
el efecto de los dos antibiticos evaluados sobre el rendimiento de fermentacin.
94
Tabla 27. ANOVA doble va (Melaza como sustrato de fermentacin)
Grados
Recursos de Suma de Media de Valor de F
de
Variacin Cuadrados Cuadrados F Tabulado
Libertad
Tratamientos
(Dosis
antibitico) 3 4,38 1,46 12,17 9,28
Antibiticos
1 1,13 1,13 9,42 10,10
Error 3 0,36 0,12
Total 7 5,87
( = 0.05)
Tabla 28. Datos de rendimiento (%) obtenidos con Jugo de caa como sustrato de
fermentacin
95
Tratamiento (Dosis en ppm)
Antibitico Total
0,00 0,50 1,00 2,00
Penicilina 38 38 39 39 154
Virginamicina 40 40 40 40 160
Total 78 78 79 79 314
Hiptesis Alterna para tratamientos (H1): Existe diferencia significativa entre los efectos de
las diferentes dosis de antibitico sobre el valor de rendimiento de fermentacin.
Hiptesis Alterna para los dos productos evaluados (H1): Existe diferencia significativa en
el efecto entre los dos antibiticos evaluados.
96
antibitico)
Antibiticos
1 4,50 4,50 26,47 10,10
Error 3 0,50 0,17
Total 7 5,50
( = 0.05)
97
Los datos que registran en las tablas de anlisis de varianza una va con nivel de
significancia de 0.05, corresponden a los obtenidos para porcentaje de rendimiento en cada
uno de los tratamientos con las variaciones de pH en los dos sustratos de fermentacin.
Donde
n: nmero de observaciones
k: nmero de tratamientos
T: total
SST: Suma total de cuadrados
SSTr: Suma total de cuadrados entre tratamientos
SSE: Suma de cuadrados de error
MS: Media de cuadrados
98
Tabla 31. Datos de rendimiento (%) obtenidos con Melaza como sustrato de fermentacin
pH
Sustrato Total
3,0 3,5 4,0 4,6
36 38 41 40 155
36 36 40 41 153
Melaza
35 36 40 40 151
37 38 41 41 157
Total 144 148 162 162 616
Hiptesis Nula (H0): No existe diferencia significativa entre los efectos de los diferentes
valores de pH evaluados de sobre el rendimiento de fermentacin.
Hiptesis Alterna (H1): Existe diferencia significativa entre los efectos de los diferentes
valores de pH evaluados sobre el rendimiento de fermentacin.
99
7.2.2. ANOVA una va para tratamiento con pH en Jugo de caa como sustrato de
fermentacin
Tabla 33. Datos de rendimiento (%) obtenidos con Jugo de caa concentrado como sustrato
de fermentacin
pH
Sustrato Total
3,0 3,5 4,0 4,6
39 39 40 39 157
Jugo de 39 38 39 39 155
Caa 35 37 37 38 147
37 38 39 40 154
Total 150 152 155 156 613
Hiptesis Nula (H0): No existe diferencia significativa entre los efectos de los diferentes
valores de pH evaluados de sobre el rendimiento de fermentacin.
Hiptesis Alterna (H1): Existe diferencia significativa entre los efectos de los diferentes
valores de pH evaluados sobre el rendimiento de fermentacin.
100
pH del
3 5,69 1,90 1,15 3,49
Sustrato
Error 12 19,75 1,65
Total 15 25,44
Se ACEPTA H0, se rechaza H1, es decir, no existe diferencia significativa entre los
efectos de los diferentes valores de pH evaluados sobre el rendimiento con Jugo de caa
como sustrato de fermentacin.
8. DISCUSIN DE RESULTADOS
101
de agua disponible para los microorganismos (Aw) aument y por ende se favoreci su
desarrollo.
102
las fermentaciones del ensayo se asumieron como glucosa para efectos de balances
estequiomtricos teniendo en cuenta que ambos monmeros tienen la misma ruta final
dentro de la va metablica (Jacques et al, 1999).
103
el vino permanezca algunas horas en reposo antes de la destilacin (4-5 horas) para lograr
la disminucin de la temperatura del mismo con la consecuente decantacin del sulfato de
calcio (Ethanol technology guide 2001); esta disponibilidad de tiempo depende de la
capacidad de la destilera y de la existencia de un tanque de decantacin y una centrfuga
que separe estos compuestos slidos del vino de fermentacin.
La cepa de levadura utilizada para llevar a cabo las fermentaciones fue una cepa de
Saccharomyces cerevisiae activa seca que se suspendi en agua a 41C para lograr su
activacin metablica y que despus de la hidratacin registr una viabilidad superior al
90% ya que dentro de los componentes en los que se halla suspendida se encuentran
vitaminas como biotina y otros nutrientes que al hidratarse, generan una crema
reconstituyente lista para iniciar procesos de propagacin(Ethanol technology guide 2001),
esta cepa de levadura es homognea y en medio slido especfico creci formando colonias
cremosas, redondas, de borde regular.
Dicha activacin metablica de las levaduras lleva consigo la preparacin de las paredes
celulares para el intercambio y asimilacin de nutrientes exteriores y activacin de las
enzimas necesarias para la degradacin de los compuestos orgnicos y consecuente
respiracin y divisin celular; estas clulas requieren este proceso de aclimatacin
metablica para recuperar su actividad y lograr una produccin de alcohol eficiente, el tipo
de levadura activa seca, favorece el hecho de disponer de levadura en momentos precisos y
disminuye costos de mantenimiento de banco de cepas, este proceso de propagacin es el
que permite obtener el nmero de clulas deseadas a expensas de un sustrato determinado,
sin embargo, este tipo de levadura es recomendada bsicamente para ser utilizada en
sistemas de fermentacin por lotes, pues en sistemas continuos, el riesgo de contaminacin
bacteriana es ms alto y normalmente se utilizan cepas propagadas por escalamiento
(Bellisimi & Ingledew, 2005).
104
El tiempo mximo de 24 horas como tiempo de propagacin en los ensayos se determin
partiendo de que la cepa comercial en este tipo de sustrato azucarado requiere de un tiempo
de adaptacin entre 2-4 horas pues no ha sido propagada de forma continua y su fase
exponencial bajo condiciones de alimentacin continua en la planta de produccin oscila
entre 12 y 18 horas dependiendo de la velocidad de alimentacin, suministro de aire y
temperatura adecuada (entre 28 y 30C), no obstante, en algunos casos la cepa no logra la
poblacin necesaria y/o los inculos tardan en ser solicitados y debe prolongarse el tiempo
(hasta 24 horas) y mejorarse las condiciones de mantenimiento.
Pasadas 24 horas a partir del momento en que la levadura tuvo contacto con las mieles de
tercera dilucin bajo parmetros controlados, la poblacin obtenida en el medio es del
orden de 108 clulas de levadura/ml, sta poblacin cuya viabilidad generalmente es
superior al 90%, fue suficiente para iniciar la fermentacin pues poblaciones superiores a
106 logran colonizar fcilmente el sustrato teniendo en cuenta que el volumen del inculo
corresponde al 30% del volumen efectivo de trabajo (VET) (Manual de Operaciones Planta
alcoqumica SUCROMILES S.A).
105
El gnero Leuconostoc especie mesenteroides, es el microorganismo que normalmente se
asla en los derivados de caa de azcar, esta especie, tericamente puede eliminarse
cuando la temperatura del medio supera los 70C y cuando el pH es inferior a 4.5, sin
embargo, otros gneros de bacterias lcticas logran tolerar altas temperaturas gracias a la
resistencia de su material enzimtico y se activan una vez la temperatura desciende,
ejemplo de ello es el gnero Lactobacillus que se encuentra normalmente en lneas de
produccin que han sido sometidas a inyeccin de vapor y que alcanzan temperaturas de
incluso 100C (Jacques et al, 1999), de manera que as puede explicarse que durante las
fermentaciones slo se registr crecimiento tpico de Lactobacillus pues la temperatura
aplicada sobre los sustratos de tercera y segunda dilucin fue de aprox 70C garantizando
as la eliminacin del gnero Leuconostoc pero la permanencia de estos bacilos
termoresistentes.
106
industrial debido a sus altos costos, por esta razn, los mtodos de identificacin de estas
especies bacterianas en las plantas productoras de vinos se realiza mediante mtodos
tradicionales como recuentos en placa en medios especficos y por determinacin qumica
de los polmeros producidos por los microorganismos. (Mibielli & Filho, 1999).
De otro lado, el gnero Lactobacillus, encontrado en todos los ensayos tanto en etapa de
reproduccin como en fermentacin e identificado claramente como bacilos Gram
positivos, son los causantes de las colonizaciones ms importantes sobre las mieles de caa
debido a la simplicidad de su metabolismo pues el piruvato generado por gluclisis lo
reducen a lactato cuando las condiciones de oxgeno son insuficientes para oxidar todo el
NADH formado y se origina la denominada fermentacin lctica (Mathews et al, 2002). Su
crecimiento es rpido en cuanto a nmero de clulas/ml se refiere contrario a gneros como
Leuconostoc, cuyo efecto nocivo principal es la polimerizacin de la sacarosa en el medio
(Mibielli & Filho, 1999).
Teniendo en cuenta que tanto la melaza como el jugo de caa de tercera dilucin sometidas
a calentamiento previo a 70C registraron crecimiento de Lactobacillus, una vez
adicionados los productos antibiticos ya exista una poblacin inicial capaz de resistir esta
temperatura de calentamiento y de reproducirse de manera que el antibitico no caus
efecto sobre la misma, probablemente si se utilizaran concentraciones ms altas de estos
antibiticos se lograra controlar la propagacin de esta poblacin contaminante inicial.
107
molecular de este antibitico logra una mayor efectividad sobre las bacterias lcticas
presentes en este sustrato azucarado, pues ste acta sobre la sntesis proteica bacteriana,
especficamente sobre el dominio de la peptidil-transferasa de la subunidad ribosomal 50S
(Garza et al, 2000), y adems, el bajo contenido de slidos del jugo de caa, pudo haber
favorecido la solubilidad de este producto antibitico y por ende su dispersin en todo el
medio lquido, razn por la cual tuvo mayor contacto con los microorganismos presentes.
108
diferencia significativa entre los efectos de las diferentes dosis de cada antibitico para
melaza de caa con un nivel de significancia de 0.05 (P=0.05), es decir que el rendimiento
de la fermentacin vari con respecto a las dosis aplicadas durante la etapa de reproduccin
de la levadura.
Adicional a esto, se evidenci que no hay diferencia significativa entre los efectos de los
dos antibiticos analizados, es decir, que el rendimiento de la fermentacin bajo los mismos
parmetros no mostr que la penicilina tiene un mejor efecto que la virginamicina en el
control de las bacterias lcticas en el proceso y viceversa, de manera que la eleccin entre
uno y otro producto podra depender bsicamente de su costo comercial y de la
disponibilidad de los mismos.
109
actividad, adems, la clula al no tener oxgeno disponible y realizar exclusivamente
metabolismo fermentativo entra en una fase de latencia, momento en el cul, cesa la
conversin de azcar en alcohol y se genera este porcentaje de azcar no fermentado
(Jacques et al, 1999).
110
se encuentran los cidos tartrico, mlico y ctrico; cidos orgnicos derivados, aquellos
producidos durante los procesos fermentativos a los que es sometido el mosto y son
fundamentalmente los cidos actico, lctico y succnico y finalmente, los cidos
inorgnicos cuyo origen es mineral, entre los que se destaca el cido sulfrico, presente
normalmente en forma de sulfatos (Blasco 2001).
En el caso de acidez voltil para los sustratos concentrados, se tiene que para la melaza de
caa utilizada el valor inicial fue de 6530 ppm, significativamente superior al registrado por
el jugo de caa concentrado (1602 ppm), sta acidez, entendida como el contenido de
cidos orgnicos presentes en la muestra puede asociarse a la presencia de contaminantes
bacterianos pero adicionalmente al mismo origen de las mieles pues durante los cultivos de
caa pues el desarrollo de compuestos qumicos es diverso y as como sucede con los
viedos donde las plantas durante su proceso de maduracin natural, generan cidos
detectados posteriormente en el vino (Blasco 2001), en la caa podra presentarse una
situacin similar, de manera que en un jugo o miel de primera extraccin, donde el
contenido de agua no es suficiente para el desarrollo de bacterias y la presin osmtica es
tan alta, la accin bacteriana sobre la produccin de acidez voltil es incierta por lo que se
podra inferir que una parte de la acidez voltil contenida en la melaza es de origen vegetal
y la otra parte corresponde a la accin microbiana y al tratamiento de la misma durante el
proceso de extraccin del azcar.
En el caso de mieles y vinos el mtodo utilizado ms comnmente para medir acidez voltil
es el mtodo por arrastre de vapor de agua y posterior titulacin con una solucin bsica
(Blasco 2001), sin embargo, este resultado arroja valores de cidos totales y no permite
conocer cul es el cido especfico que se encuentra en mayor concentracin en una
muestra, probablemente este sea un punto clave a desarrollar para conocer la incidencia de
esta variable en el anlisis de rendimiento del proceso fermentativo en estudio.
111
La concentracin de acidez voltil tras la etapa de reproduccin de la levadura en melaza
excedi en 1177 ppm (promedio de observaciones para todos los ensayos) a los valores
promedio del sustrato inicial: melaza de tercera dilucin, de manera que estos cidos
voltiles fueron generados durante sta etapa del proceso por las bacterias contaminantes.
Estudios realizados por Remize et al en el ao 2000, revelan que algunas cepas de levadura,
denominadas levaduras salvajes silvestres de tipo Saccharomyces y No Saccharomyces,
tambin producen cantidades importantes, usualmente entre 57 y 145ppm, de estos cidos
orgnicos en especial actico, que establece un balance organolptico de la fermentacin y
que para le levadura constituye una especie de regulacin metablica frente a la acidez
exterior, pero aumenta la acidez voltil que sumada a la generada por las bacterias
contaminantes constituye el total de acidez en el proceso y por ende prdidas de azcar
fermentable (Remize et al, 2000).
La produccin de cido actico por la levadura es controlada por ella misma durante el
metabolismo fermentativo, en la fermentacin alcohlica, el acetato es generado por
Saccharomyces cerevisiae y a travs del complejo enzimtico piruvato descarboxilasa,
acetaldehdo deshidrogenada y acetil-CoA sintasa se da el transporte acetil-coA desde la
mitocondria hacia el citosol, de manera que en este compartimiento de la clula de levadura
se origina la formacin de acetato lo que conduce adems a la regeneracin de equivalentes
reducidos: NADH y NADPH para mantener el balance redox al interior celular, de forma
que la importancia fisiolgica de la produccin del acetato dentro de la clula es
inminente.(Remize et al, 2000).
112
la produccin de alcohol con mieles de caa no enfatizan en la produccin innata de cidos
orgnicos por parte de la levadura Saccharomyces cerevisiae, esta produccin normalmente
se atribuye a bacterias contaminantes y levaduras salvajes presentes durante la
fermentacin alcohlica (Remize et al, 2000).
Estudios realizados en algunos mostos y vinos de uvas se confirma que el cido actico es
producido por la levadura fermentadora: rangos de 200-400ppm se producen normalmente
por Saccharomyces cerevisiae durante la fermentacin, los vinos dulces son ms propensos
a niveles elevados de acidez voltil, niveles de 1000ppm fueron obtenidos durante la
fermentacin en mostos de alta concentracin (>15% m/v azcar reductor) a partir de uvas
de primera calidad (Rodriguez & Smith, 2001).
Huang et al, 1994, observaron variaciones en el nivel de cido actico tan altas como
4000ppm debidas al aumento en los cultivos de Lactobacillus durante la primera
fermentacin de los vinos, adems, se indica que la actividad de estos microorganismos es
la causa principal de acidez voltil y su origen en las uvas se atribuye al deterioro por parte
de insectos que posiblemente llevan consigo este tipo de bacterias y a tratamientos de
control ineficientes durante la cosecha de las mismas (Rodriguez & Smith, 2001).
113
Los porcentajes de azcar residual tras las 30 horas de fermentacin con jugo de caa
fueron inferiores al 1.2%(p/v), de manera que se esperaba que todo el azcar que ingres al
proceso se convirtiera en alcohol, es decir que el rendimiento sera de aproximadamente
48.5% (segn Pasteur), sin embargo, esto no ocurri pues el mximo valor alcanzado fue de
40%.
Estos resultados evidencian que las condiciones de proceso permitieron prdidas de azcar
probablemente por: generacin de otros compuestos diferentes al etanol por parte de los
microorganismos contaminantes que son en esencia bacterias lcticas en jugo de caa como
sustrato de fermentacin; consumo de azcar por parte de la levadura para su
multiplicacin (durante la fermentacin la tasa de respiracin y multiplicacin de la
levadura es baja, sin embargo, ocurre para evitar la muerte celular) y factores de operacin,
constituyen prdidas de rendimiento superiores al 7%.
114
Los valores de acidez voltil en el jugo de caa despus de la etapa de reproduccin en los
diferentes tratamientos son altos (entre 2748-2972ppm) comparados con los obtenidos
despus de la etapa de reproduccin con melaza (Entre 1385-1649ppm), evidenciando que
la produccin de estos metabolitos por accin bacteriana es importante y teniendo en cuenta
que los valores de cido lctico y cido actico tolerables por la levadura son de 8000ppm y
500ppm respectivamente se sugiere que esta acidez voltil bsicamente corresponde al
primero (Bely et al 2003), el cul fue producido durante las fermentaciones por la
poblacin de Bacterias cido lcticas (BAL) presente en el sustrato.
En los ensayos a partir de melaza son similares a los obtenidos con jugo de caa de manera
que podra asumirse que por un lado la misma naturaleza de la melaza ocasiona prdidas
por generacin de azcar residual tras la fermentacin, mientras que las prdidas con jugo
de caa como sustrato, corresponden a la capacidad de este medio diluido para facilitar la
proliferacin de poblaciones de bacterias lcticas y por ende la prdida de azcar por la
generacin de biomasa, nuevamente se contemplara la posibilidad de medir biomasa al
final de cada fermentacin mediante recuento pues en esta investigacin el objetivo era
esencialmente evaluar las poblaciones de bacterias lcticas en etapa de reproduccin tras el
tratamiento con antibiticos y su repercusin en el rendimiento de la fermentacin
115
se vieron afectadas al utilizar este pH en el medio, el intercambio de los iones H+ con el
medio probablemente generaron en las clulas un desequilibrio inico que bloque los
canales de intercambio celular pues un medio hipertnico ocasiona una respuesta repulsiva
por parte de la clula, seguramente la maquinaria enzimtica igualmente se vio afectada por
estos valores de pH y la actividad metablica general de la levadura entr en un estado de
inercia (Blumberg & Alder, 1997).
A partir de estos resultados durante la etapa de reproduccin tanto para melaza como para
jugo de caa concentrado a valores de pH 3.0 y 3.5, se obtuvieron como consecuencia
rendimientos inferiores en la fermentacin: 36 y 37% para melaza y 38% para jugo de caa,
comparados con los obtenidos a pHs 4.0 y 4.6: 41% para melaza y 39% para jugo de caa.
116
El anlisis estadstico muestra que utilizando jugo de caa como sustrato de fermentacin
sometido a cambios de pH s existe diferencia significativa entre los efectos de los valores
de pH evaluados sobre el rendimiento de la fermentacin debida a la disminucin de la
capacidad metablica y reproductiva de la levadura, cuyo efecto inmediato es la
incapacidad para fermentar los azcares reductores del sustrato, los valores de
productividad son inferiores a pH 3.0 y 3.5, de manera que el efecto de este descenso de pH
no favorece el proceso y por el contrario incluye un consumo adicional de cido sulfrico.
Ante estos resultados, la opcin de utilizar el descenso de pH sobre los dos sustratos de
fermentacin evaluados no representa beneficios importantes en cuanto a rendimiento de
fermentacin se refiere, por el contrario afecta el proceso de manera considerable ms
ampliamente en melaza, pues los valores de rendimiento a pHs 4.0 y 4.6 con este sustrato
de fermentacin son significativamente ms altos que los obtenidos con jugo de caa
concentrado 41% Vs 39% respectivamente; esto podra indicar que bajo descenso de pH no
hay una relacin directamente proporcional entre las poblaciones de bacterias y el
rendimiento de las fermentaciones con los dos sustratos mencionados, probablemente se
trata de otros factores que afectan dichos resultados.
Una explicacin a este evento podra ser que en sistemas de fermentacin por lotes, el
tiempo de retencin de la levadura en reproduccin as como el tiempo que tardan los vinos
fermentados en ser destilados es menor con respecto a sistemas continuos donde suele ser
ms importante el control de los contaminantes bacterianos, pues bsicamente las
poblaciones bacterianas no permanecen el tiempo suficiente en el sistema para lograr la
colonizacin de los sustratos y reproducirse a tal punto que logren afectar el rendimiento de
la fermentacin (Jacques et al, 1999).
Probablemente la utilizacin de compuestos antibiticos para generar levadura limpia e
iniciar la etapa de propagacin debe hacerse a concentraciones superiores a 2.0ppm para
lograr un mejor efecto en el control de las bacterias cido lcticas contaminantes y evitar
117
prdidas de azcar en etapa de reproduccin, adems, la acidulacin del sustrato de
fermentacin debe ser constante como control de los contaminantes, como mecanismo
facilitador para la inversin de la sacarosa y precipitacin de la levadura y las sales de
calcio (sulfato de calcio generado) sin que se afecte su metabolismo y sin ocasionar
prdidas por consumo innecesario.
De esta manera, el estndar de pH que hasta el momento se ha manejado para melaza (4.6)
en planta es el adecuado en el proceso sin que la cepa de levadura actual vea afectada en su
metabolismo y el consumo de cido sulfrico sea razonable, sin embargo, cuando exista la
posibilidad de usar jugo de caa concentrado como sustrato de fermentacin, la opcin de
disminuir el pH del medio puede ser favorable pues el incremento de la poblacin de
bacterias lcticas es superior cuando se utiliza este sustrato debido a sus caractersticas y al
nivel de agua que debe adicionarse para lograr una concentracin de azcar determinada.
118
9. CONCLUSIONES
119
10. RECOMENDACIONES
El mtodo actual con el que se determina acidez voltil en mieles y vinos es general,
no indica cual es el cido que se produce en mayor cantidad, sera conveniente
hacer esta determinacin mediante HPLC para lograr una aproximacin ms real al
origen de valores de acidez voltil en mieles y su drstico incremento en vinos de
fermentacin.
120
Sera favorable validar y estandarizar el mtodo para la deteccin de bacterias
acticas durante la etapa de reproduccin de la levadura y contemplar el hecho que
estas bacterias puedan constituir un riesgo para la prdida de azcar en el proceso y
en caso de presentarse, si los metabolitos que producen inciden en los valores de
acidez voltil normalmente registrados en proceso.
121
11. REFERENCIAS
Blasco, Iaki. 2001. Los cidos del vino. Reporte tcnico. II Simposio Vinicultura
Abril 17. Chile. 13 pp.
122
Converti, A; Arni, S; Sato, S; Monteiro, J & Aquarone, E. 2003.Simplified
Modeling of fed-Batch alcoholic fermentation of sugarcane blackstrap molasses.
Wiley Periodicals Inc. Vol 7. 2045-2060 pp.
Ethanol technology guide. 2001. International Fuel Ethanol Workshop and trade
show. New York. 445 pp.
123
Jacques, K; Lyons, T & Kelsall, D. 1999. The Alcohol Textbook. 3rd Edition.
Nottingham University press. Chapters 1, 3, 5, 6, 20 y 21. 386pp.
124
Nelson & Cox. 2001. Lenhinger. Principles of biochemistry. Third edition. Worth
edition. New york. 1790pp.
125
Alcoholic Fermentation. Aplied and Environmental Microbiology. Vol 66. N 8. pp
3151-3159.
Rodriguez, D & Smith, R. 2001. Reduccin de acidez voltil en vinos por medio
de adsorcin selectiva de cido actico de un permeato separado del vino por
Osmosis inversa. Vinovation Inc and Oenovation Internacional LLC. Santiago de
Chile. pp 374-378.
126
12. ANEXOS
ANEXO 1
127
ANEXO 2
Levadura Hidratada:
Dilur 11g de levadura hidratada en un frasco de vidrio, adicionando 99g de agua
de pozo.
Mezclar hasta obtener una solucin homognea.
Tomar 1cm3 de a solucin de levadura hidratada II y llevar a un baln aforado de
100 cm3 adicionado con azul de metileno al 1%.
Montar la muestra en la cmara de recuento y realizar el recuento en el cuadrante
del centro y teniendo en cuenta las clulas que estn gemando a partir del tamao de
las mismas.
El recuento de clulas obtenidas se multiplica por el factor de dilucin 107 y se
expresa en clulas/ cm3.
El porcentaje de viabilidad se obtiene multiplicando el nmero de clulas vivas *
100 y dividiendo por el nmero de clulas totales.
128
ANEXO 3
A. MUESTREO
La toma de muestras debe realizarse bajo condiciones de esterilidad y con instrumentos
previamente esterilizados 15 minutos a 15 libras de presin y 121C, segn los niveles
esperados de contaminantes y dependiendo del tratamiento previo de cada muestra se
realizan diluciones seriadas en agua tamponada agua peptonada con ayuda de micropipeta
y dentro de una cmara de flujo laminar previamente limpia, cada una de las diluciones
deseadas se vierte en cajas de petri estriles en los volmenes adecuados para la dilucin.
B. SIEMBRA EN PLACA
Para el aislamiento e identificacin de bacterias acidolcticas se utiliza el medio de cultivo
agarizado MRS /Marca Difco) y la tcnica de siembra en profundidad, el cual se prepara
utilizando 70g/L del medio de cultivo slido, calentamiento hasta ebullicin, adicin de
antifngico y posterior autoclavado15 minutos a 15 libras de presin y 121C, enfriamiento
hasta 37C, pH final 6.5 y bajo cmara de flujo laminar se vierte el medio sobre las cajas de
petri previamente adicionadas con la muestra, se espera su solidificacin y se adiciona una
segunda capa sellante para garantizar la condicin de anaerobiosis.
C. INCUBACIN
Cuando el medio de cultivo ya se ha solidificado, las cajas se invierten y se incuban en
cmaras de anaerobiosis a 37C por 48 horas, luego de transcurrido este tiempo las colonias
de bacterias acidolcticas tienen un tamao considerable y entonces se procede a realizar el
recuento teniendo en cuenta la correspondiente dilucin realizada a la muestra.
129
D. EXPRESIN DE RESULTADOS
Los resultados del recuento se expresan en UFC de bacterias acidolcticas/ml para muestras
lquidas y deben reportarse con una sola cifra decimal y el exponente que corresponda.
Peptona 10.0
Extracto de Levadura 5.0
Extracto de Carne 5.0
D(+) glucosa 20.0
Hidrogeno fosfato dipotsico 2.0
Tween 80 1.0
Citrato diamnico 2.0
Acetato sdico 5.0
Sulfato de magnesio 0.05
Sulfato de manganeso 0.1
Agar agar 12.0
ANEXO 4
AISLAMIENTO EN MEDIO SLIDO YM DE LEVADURA HIDRATADA
A. MUESTRA
130
La muestra de la levadura hidratada en agua a 41C se toma con un asa estril y se siembra
por aislamiento en el medio slido especfico, en este caso medio YM.
B. INCUBACIN
Las cajas de petri sembradas con el microorganismo se incuban de 30-32C durante 48
horas y tras este tiempo se realiza la observacin directa de las colonias.
C. INTERPRETACIN DE RESULTADOS
Las colonias redondas, grandes que presenten color crema y borde uniforme corresponden a
la levadura evaluada, las colonias ms pequeas que puedan crecer en el medio
corresponder a colonias bacterianas, sin embargo para evitar este crecimiento puede
adicionarse al medio un antibitico que evite falsos positivos y facilite el crecimiento de la
levadura nicamente ( Ej. novobiocina).
Sin embargo, es recomendable realizar una coloracin simple con cristal violeta de las
diferentes colonias para verificar su morfologa microscpicamente.
A. MUESTRA
La muestra corresponde a las mieles de caa utilizadas como sustratos de fermentacin.
131
B. INCUBACIN
Las cajas de petri sembradas con la muestra se incuban a 30C durante 48 horas y tras este
tiempo se realiza la observacin directa de las colonias.
C. INTERPRETACIN DE RESULTADOS
Cualquier colonia que crezca en este medio de cultivo es presuntiva de levadura salvaje
debido a su composicin especial diferencial, de manera que a partir de las colonias que se
registren, se realiza una coloracin simple con cristal violeta de las diferentes colonias para
verificar su morfologa microscpicamente, las levaduras salvajes presentan morfologas
variadas, algunas son alargadas, romboides, cncavas, sin embargo pueden tener
morfologa similar a la de Saccharomyces cuando se encuentran en condiciones ideales.
132
ANEXO 5
PRUEBAS ADICIONALES PARA DETERMINACIN DE CONTAMINANTES
BACTERIANOS
Coloracin de Gram
Tomar con asa estril la colonia que desea identificarse y suspenderla en un
portaobjetos con una gota de agua estril.
Fijar la solucin en calor
Adicionar el colorante cristal violeta durante 1 minuto, lavar con agua destilada,
adicionar lugol y poner en contacto por 1 minuto, lavar con agua destilada,
decolorar con alcohol acetona por 15 segundos, lavar con agua destilada, anadir
colorante fucsina bsica, lavar con agua destilada y secar a temperatura ambiente.
Observar al microscopio y determinar morfologa celular (cocos, bacilos, coco-
bacilos) y comportamiento frente a coloracin (Gram negativos: color rosado, Gram
positivos: color violeta).
133
Bacto peptona 2.5
Sacarosa 150
Fosfato dipotsico 2
Cloruro de sodio 1
pH final 6.8 +/- 0.2
ANEXO 6
134
DETERMINACION DE ACIDEZ VOLTIL EN MIELES Y EN VINOS
CALCULOS:
AV en ppm: (Vtm Vtb) * FD * 171.4
Donde:
Vtm: Volumen de titulacin de la muestra
Vtb: Volumen de titulacin del blanco
135
FD: Factor de dilucin
171.4: Constante
136
ANEXO 7
Pesar 10g de miel, dilur en 100ml de agua destilada y transferir a un baln aforado
de 500ml, llevar a ese volumen con agua destilada y agitar.
En un balon aforado de 100ml, adicionar 25ml de la solucin anterior, 10ml de agua
y 10ml de HCl al 25%, mezclar y calentar en bao termostatazo a 70C durante 30
minutos.
Enfriar y adicionar 3 gotas de fenoftalena 1% m/v.
Neutralizar el exceso de HCl adicionando NaOH 25% hasta un viraje rosa y luego
lentamente HCl hasta su desaparicin.
Enfriar y completar el volumen a 100ml con agua destilada.
Transferir la solucin invertida y neutralizada a una bureta.
En un erlenmeyer de 500ml mezclar 5ml de solucin felhing A y 5ml de solucin
felhing B y adicionar con la bureta aproximadamente 10-15ml de la solucin
dependiendo de la miel.
Mezclar en plancha agitadora y calentar a ebullicin por dos minutos, adicionar 6
gotas de azul de metileno 1% m/v y continuar agitando.
Comenzar a titular gota a gota lentamente con la solucin invertida hasta la
aparicin de un color rojo ladrillo incluso en la espuma.
Mantener la emisin de vapor que evitar la oxidacin regresiva que podra
ocasionar el aire sobre la solucin.
Repetir la titulacin utilizando como volumen inicial el volumen hallado
anteriormente menos 1ml, promediar estos valores de titulacin y calcular.
137
CALCULOS:
Donde:
FF: factor de estandarizacin de la solucin de felhing.
VFA + VFB: volumen de la solucin de felhingA + felhingB
FD: factor de dilucin de la miel
Vt: Volumen de la solucin invertida gastado en la titulacin.
138
ANEXO 8
DETERMINACION DE PORCENTAJE DE ALCOHOL EN VINOS
Enfriar la muestra entre 20-25C y homogenizar.
En un enlenmeyer de 250ml adicionar 20ml de dicromato de potasio 0.2meq/ml,
25ml de agua destilada y 10ml de cido sulfrico concentrado, dejar enfriar esta
mezcla.
Medir volumtricamente 0.5ml de la muestra de vino y adicionarlos aun baln de
fondo plano de 250ml que contenga perlas de vidrio y 25ml de agua destilada.
Conectar estas soluciones con una manguera y tapn hermtico y calentar la
muestra a ebullicin recogiendo los vapores en la solucin de dicromato de potasio
hasta la tercera parte del volumen inicial de la mezcla.
Dejar enfriar despus de la destilacin y titular el exceso de dicromato de potasio
con una solucin de sulfato ferroso amnico (0,15meq/ml) estandarizada, utilizando
tres gotas ferrona como indicador hasta el viraje de ste a color mbar (caf-rojizo).
Hacer un blanco con agua destilada y calcular.
CALCULOS:
139
REGISTROS DE RESULTADOS DE ENSAYO ETAPA DE REPRODUCCION
140
Acidez Concentracin
Antibitico / Densidad
Sustrato Ensayo Voltil de BAL
pH (g/ml)
(ppm) (UFC/ml)
1 1.100 714 1.1 E+03
2 1.098 701 1.0 E+03
Penicilina
3 1.098 689 2.0 E+03
4 1.098 714 4.1 E+03
1 1.100 802 3.2 E+03
2 1.100 816 1.6 E+03
Melaza Virginamicina
3 1.098 841 1.9 E+03
4 1.100 795 1.4 E+03
1 1.100 809 2.6 E+03
2 1.110 830 3.2 E+03
pH
3 1.100 822 3.6 E+03
4 1.100 804 4.1 E+03
1 1.081 338 2.6 E+02
2 1.082 351 3.1 E+02
Penicilina
3 1.080 342 3.7 E+02
4 1.081 319 4.0 E+02
1 1.080 340 2.6 E+02
Jugo de Caa 2 1.081 335 4.2 E+02
Virginamicina
Concentrado 3 1.079 331 3.7 E+02
4 1.080 328 1.5 E+02
1 1.077 327 1.2 E+02
2 1.079 332 1.5 E+02
pH
3 1.078 345 3.1 E+02
4 1.078 322 3.1 E+02
141
P1A 0.50 3.1 E+08 100 3.1 E+05 1615
P2A 1.00 2.9 E+08 100 3.9 E+05 1511
P3A 2.00 2.9 E+08 100 4.1 E+05 1596
Control P4A 0.00 3.0 E+08 100 2.5 E+05 1608
P1A 0.50 3.1 E+08 100 3.4 E+05 1700
3
P2A 1.00 3.2 E+08 100 4.0 E+05 1689
P3A 2.00 2.9 E+08 100 4.0 E+05 1664
Control P4A 0.00 2.9 E+08 100 3.6 E+06 1598
P1A 0.50 2.8 E+08 100 3.3 E+05 1640
4
P2A 1.00 3.1 E+08 100 3.8 E+05 1600
P3A 2.00 2.9 E+08 100 2.9 E+04 1602
142
Tabla 40. Variables de respuesta etapa de reproduccin de Jugo de caa concentrado
tratado con Penicilina (24 horas)
Recuento Viabilidad
Concentracin Recuento Acidez
de de
Ensayo Tratamiento de antibitico BAL Voltil
Levadura Levadura
(ppm) (UFC/ml) (ppm)
(UFC/ml) (%)
Control P4B 0.00 3.0 E+08 100 3.9 E+06 2714
P1B 0.50 3.1 E+08 100 2.8 E+06 2904
1
P2B 1.00 3.1 E+08 100 3.1 E+06 2876
P3B 2.00 2.9 E+08 100 2.5 E+05 2708
Control P4B 0.00 3.0 E+08 100 3.8 E+06 2729
P1B 0.50 3.2 E+08 100 3.9 E+06 2859
2
P2B 1.00 3.1 E+08 100 4.2 E+06 2814
P3B 2.00 3.0 E+08 100 3.1 E+05 2759
Control P4B 0.00 2.9 E+08 100 3.3 E+06 2802
P1B 0.50 2.9 E+08 100 3.2 E+06 2755
3
P2B 1.00 3.0 E+08 100 3.6 E+06 2802
P3B 2.00 2.9 E+08 100 3.5 E+05 2806
Control P4B 0.00 3.0 E+08 100 4.1 E+06 2745
P1B 0.50 2.9 E+08 100 4.0 E+06 2856
4
P2B 1.00 3.0 E+08 100 3.9 E+06 2771
P3B 2.00 3.0 E+08 100 4.0 E+05 2821
143
Control V4B 0.00 2.9 E+08 100 2.4 E+06 3002
V1B 0.50 2.9 E+08 100 2.3 E+06 3009
3
V2B 1.00 2.8 E+08 100 2.6 E+05 2994
V3B 2.00 3.0 E+08 100 2.5 E+05 2708
Control V4B 0.00 3.0 E+08 100 3.3 E+06 2856
V1B 0.50 3.1 E+08 100 3.4 E+06 2859
4
V2B 1.00 3.1 E+08 100 3.2 E+05 2896
V3B 2.00 3.1 E+08 100 3.5 E+05 3002
144
Tabla 43. Variables de respuesta etapa de reproduccin de Jugo de caa concentrado
con ajuste de pH (24 horas)
Recuento Viabilidad
Recuento Acidez
de de
Ensayo Tratamiento pH BAL Voltil
Levadura Levadura
(UFC/ml) (ppm)
(UFC/ml) (%)
H1B 3.0 2.9 E+06 78 3.5 E+04 1860
H2B 3.5 2.6 E+07 86 3.7 E+04 1900
1
H3B 4.0 2.7 E+07 99 2.8 E+06 1870
Control H4B 4.6 2.9 E+08 100 3.2 E+06 2100
H1B 3.0 2.8 E+06 79 4.1 E+04 1794
H2B 3.5 3.1 E+07 86 3.8 E+04 1879
2
H3B 4.0 3.0 E+07 100 3.9 E+06 1855
Control H4B 4.6 2.9 E+08 100 3.6 E+06 2021
H1B 3.0 2.5 E+06 79 2.6 E+04 1809
H2B 3.5 2.6 E+07 81 2.7 E+04 1824
3
H3B 4.0 2.5 E+07 99 3.4 E+06 1861
Control H4B 4.6 2.8 E+08 100 3.0 E+06 2300
H1B 3.0 2.9 E+06 81 3.4 E+04 1800
H2B 3.5 2.8 E+07 84 3.2 E+04 1872
4
H3B 4.0 3.1 E+07 100 3.3 E+06 1880
Control H4B 4.6 3.1 E+08 100 3.6 E+06 2205
145
ANEXO 10
Tabla 44. Variables de respuesta etapa de fermentacin de Melaza inoculo tratado con
Penicilina (30 horas)
Azcar Miel 3 Miel 2
Residual dilucin dilucin
Concentracin Alcohol
despus de (% m/v (% m/v Rendimiento Eficiencia
Ensayo Tratamiento de antibitico producido
30h de de de (%) (%)
(ppm) (% v/v)
fermentacin azcar azcar
(% m/v) reductor) reductor)
Control
0.00 8.06 2.01 39 80.66
P4A
1 P1A 0.50 8.11 2.32 6.78 20.32 40 81.16
P2A 1.00 8.29 1.96 41 82.96
P3A 2.00 8.35 1.43 41 83.57
Control
0.00 8.13 2.08 38 78.62
P4A
2 P1A 0.50 8.09 2.00 7.08 21.01 38 78.23
P2A 1.00 8.30 2.00 39 80.27
P3A 2.00 8.34 2.41 39 80.65
Control
0.00 7.92 1.76 39 81.71
P4A
3 P1A 0.50 8.00 1.78 6.84 19.61 40 82.52
P2A 1.00 8.25 1.84 41 85.12
P3A 2.00 8.39 1.89 42 86.55
Control
0.00 8.15 1.35 40 83.05
P4A
4 P1A 0.50 8.12 2.18 7.02 19.81 42 82.74
P2A 1.00 8.38 1.70 42 85.41
P3A 2.00 8.43 1.96 40 85.91
Tabla 45. Variables de respuesta etapa de fermentacin de Melaza inoculo tratado con
Virginamicina (30 horas)
Miel 3 Miel 2
Azcar
dilucin dilucin
Residual
Concentracin Alcohol (% m/v (% m/v
despus de Rendimiento Eficiencia
Ensayo Tratamiento de antibitico producido de de
30h de (%) (%)
(ppm) (% v/v) azcar azcar
fermentacin
reductor reductor
(g/ml)
g/ml) g/ml)
Control
0.00 8.04 2.01 42 85.23
V4A
1 V1A 0.50 8.11 1.76 6.78 19.20 42 85.87
V2A 1.00 8.25 1.92 43 87.46
V3A 2.00 8.48 2.05 44 89.90
146
Control
0.00 8.09 1.38 40 81.67
V4A
2 V1A 0.50 8.03 1.76 7.01 20.02 40 81.06
V2A 1.00 8.23 1.28 40 83.09
V3A 2.00 8.34 1.32 41 84.19
Control
0.00 7.95 1.86 39 80.56
V4A
3 V1A 0.50 8.02 2.01 6.69 20.07 40 81.27
V2A 1.00 8.21 1.9 41 83.29
V3A 2.00 8.26 1.94 41 83.71
Control
0.00 8.09 2.19 40 82.77
V4A
4 V1A 0.50 8.05 1.78 6.81 19.80 40 82.36
V2A 1.00 8.28 2.02 41 84.71
V3A 2.00 8.31 2.14 41 85.02
147
Tabla 47. Variables de respuesta etapa de fermentacin de Jugo de caa concentrado
inoculo tratado con Virginamicina (30 horas)
Miel 3 Miel 2
Azcar
dilucin dilucin
Residual
Concentracin Alcohol (% m/v (% m/v
despus de Rendimiento Eficiencia
Ensayo Tratamiento de antibitico producido de de
30h de (%) (%)
(ppm) (% v/v) azcar azcar
fermentacin
reductor reductor
(g/ml)
g/ml) g/ml)
Control
0.00 8.05 0.30 40 82.25
V4B
1 V1B 0.50 7.99 0.46 6.60 19.92 39 81.63
V2B 1.00 8.19 0.72 41 83.68
V3B 2.00 8.23 0.91 41 84.09
Control
0.00 8.04 0.92 40 81.89
V4B
2 V1B 0.50 7.98 0.75 6.56 20.01 40 81.28
V2B 1.00 8.19 0.63 41 83.41
V3B 2.00 8.15 0.62 40 83.09
Control
0.00 7.99 0.70 38 78.61
V4B
3 V1B 0.50 8.05 0.78 7.20 20.54 39 79.21
V2B 1.00 7.93 0.91 38 78.02
V3B 2.00 8.18 0.61 39 80.48
Control
0.00 8.01 0.71 40 81.34
V4B
4 V1B 0.50 8.02 0.41 6.72 20.01 40 81.44
V2B 1.00 8.18 0.62 40 83.06
V3B 2.00 8.23 0.78 41 83.57
Tabla 48. Variables de respuesta etapa de fermentacin de Melaza inoculo tratado con
ajuste de pH (30 horas)
Miel 3 Miel 2
Azcar
dilucin dilucin
Residual
Alcohol (% m/v (% m/v
despus de Rendimiento Eficiencia
Ensayo Tratamiento pH producido de de
30h de (%) (%)
(% v/v) azcar azcar
fermentacin
reductor reductor
(g/ml)
g/ml) g/ml)
H1A 3.0 7.20 3.38 36 73.67
H2A 3.5 7.54 3.01 38 77.15
1 H3A 4.0 8.13 2.21 7.04 19.70 41 83.18
Control
4.6 8.10 2.08 40 82.87
H4A
H1A 3.0 7.35 3.49 36 74.01
H2A 3.5 7.41 2.72 36 74.6
2 H3A 4.0 8.17 2.25 7.20 20.00 40 82.26
Control
4.6 8.25 2.11 41 83.06
H4A
148
H1A 3.0 7.15 3.55 35 72.31
H2A 3.5 7.37 2.01 36 74.54
3 H3A 4.0 8.04 2.01 6.96 20.00 40 81.31
Control
4.6 8.13 2.04 40 82.22
H4A
H1A 3.0 7.41 3.64 37 74.77
H2A 3.5 7.70 2.34 38 77.70
4 H3A 4.0 8.24 2.13 6.94 20.06 41 83.15
Control
4.6 8.36 1.98 41 84.36
H4A
149
ANEXO 11
Reproduccin
Fermentacin
Rendimiento
m alcohol producido * 100
(m azcar total que entra al proceso m azcar residual)
Eficiencia
m alcohol producido * 100
m alcohol terico
Productividad
m producto/volumen * tiempo (g/L* h)
150
Ejemplo
Reproduccin
Fermentacin
Rendimiento
181.78 g de alcohol * 100 = 39 %
(471.78 g azcar 0.87)
Eficiencia
181.78 g de alcohol * 100 = 79.35 %
229.08 g de alcohol terico
Productividad
181.78 g de alcohol 2.01g alcohol
3 Litros * 30 horas L* h
151