CULTIVO DE MICROOGANISMOS SIEMBRAS

I. OBJETIVOS

- Aprender las principales tcnicas de siembra de microorganismos y las

condiciones de incubacin.
- Tener conocimientos sobre la siembra de diferentes microorganismos y el
desarrollo de los mismos.

II. FUNDAMENTO

- El cultivo de los microorganismos es el proceso por el cual se facilita la

propagacin de estos organismos en el laboratorio, brindndole los
nutrientes necesarios para su desarrollo.

III. MARCO TEORICO

SIEMBRA
Una de la tcnica ms empleada en el laboratorio es utilizar medios de cultivo
artificiales donde crecern bacteria, hongos y dems que desean ser
estudiadas, en cuanto a crecimiento, metabolismo, formacin de colonias,
resistencia a ciertos antibiticos y condiciones necesarias para su crecimiento.
Estos medios de cultivo deben reunir los siguientes requisitos: temperatura,
grado de humedad y presin de oxgeno adecuado, as como un grado
correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los
nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar excento de todo
microorganismo contaminante (tcnicas de asepsia adecuadas). Esto garantiza
un adecuado crecimiento del organismo seleccionado. Pero hay otras
condiciones como la consistencia del medio (semislido), la luz ambiental que
recibe y la presencia o ausencia de gases (oxgeno).

LAS PRECAUCIONES MINIMAS QUE SE DEBEN TENER EN CUENTA

PARA REALIZAR UNA BUENA SIEMBRA SON:

Trabaje en un ambiente cerrado, libre de corrientes de aire.

Trabaje cerca de la llama del mechero.
No hable.
Flamee la boca de los frascos y los tubos antes y despus de tomar las
muestras.
Esterilice a la llama las agujas o asas de kolle antes y despus de
tomar los inoculos.
Trabaje solo con materiales y medios de cultivo garantizadamente
estriles.
CLASES DE SIEMBRAS

A. Siembra de trasplante o repique

Consiste en colocar a los microorganismos ya aislado en un nuevo medio de

cultivo (estril) a fin de conservarlo a travs del tiempo, lo que permitir realizar
diferentes estudios tales como pruebas bioqumicas, morfologa, coloracin,
identificacin taxonmica, etc. Se hace con la finalidad de mantener viable a unos
microorganismos, que se tiene cultivando en el laboratorio.
El cultivo previo, generalmente corresponde a un solo tipo de microorganismos,
que recibe el nombre de CEPA, CLONA o simplemente CULTIVO PURO, y no
puede ser mantenido por mucho tiempo sin renovacin de nutrientes ni eliminacin
de sus productos de desecho, por lo que se hace necesario sacar unos cuantos
microorganismos y llevarlos a un nuevo medio de cultivo.
En el laboratorio, los repiques se hacen de tubo a tubo y se siguen los siguientes
pasos:

1. Esterilice la aguja de kolle hasta que se ponga al rojo vivo.

2. Destape el tubo con la cepa y pasarlo por llama del mechero unas dos o tres
veces.
3. Introducir la aguja de kolle y tomar el inoculo.
4. Flamee nuevamente la boca del tubo y taponarlo convenientemente.
5. Tomar el tubo con el medio virgen, destaparlo y flamearlo 2 o 3 veces en la
llama del mechero.
6. Introducir la aguja de kolle y extender la masa microbiana depositando
suavemente en la superficie del agar, haciendo una estra en zigzag en toda el
rea expuesta.
7. Flamee nuevamente la boca del tubo y taponarlo.
8. Esterilice en la llama del mechero la aguja de kolle hasta que se ponga al rojo
vivo.
9. Ponga en la estufa de incubacin a la temperatura ms favorable y pro un
tiempo conveniente.

B. Mtodos de aislamiento

El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la

mayora de los casos, mediante la produccin de colonias aisladas en cultivos
slidos. El crecimiento explosivo de las bacterias permite producir un gran nmero
de ellas a partir de una nica clula inicial de forma que, tras un periodo de
incubacin en las condiciones ambientales adecuadas, se produce una colonia
observable a simple vista y formada por individuos iguales (un clon bacteriano).
 Mtodo francs o de 21 lneas:

1. Esterilice una asa de kolle y tomar el material de muestra.

2. Haga 5 estras paralelas en un costado de la placa, con medio de
cultivo distribuido y secada previamente.
3. Esterilice el asa de kolle.
4. Hacer una serie de 5 estras paralelas, cortantes a las anteriores en un
ngulo de 120, sin tomar inoculo.
5. Esterilice el asa de kolle.
6. Hacer otras 5 estrias paralelas, cortantes a las anteriores en un ngulo
de 120, sin tomar inoculo.
7. Esterilice el asa de kolle.
8. Hacer nuevamente 5 estrias paralelas, como el paso 6, y finalizar con
una estra haca el centro.
9. Esterilice el asa de kolle.
10. Incube a 35 C por 24 horas y observar la formacin de colonias.

Mtodo de estrias:

Con este procedimiento se puede conseguir una buena separacin de las colonias y
aislarlas fcilmente. Para ello se funde el medio de cultivo, se vuelca en caja petri y
se deja molificar. Con el asa de kolle previamente esterilizada se toma material de un
cultivo heterogneo y se descarga sobre la superficie del medio formado una estra y
se puede realizar de varias formas.

Bacillus subtilis

Es una bacteria Gram positiva, Catalasa-positiva,

aerobio1 comnmente encontrada en el suelo.
Miembro del Gnero Bacillus, B. subtilis tiene la
habilidad para formar una resistente endospora
protectora, permitiendo al organismo tolerar
condiciones ambientalmente extremas.

Salmonella typhi

La S. typhi es una bacteria anaerbica facultativa, que

puede en ocasiones sobrevivir en bajas condiciones de
oxgeno. Pertenece al serotipo 9,12, en base a los
eptopes de la tivelosa, el azcar repetida en su antgeno
O. El antgeno flagelar "d" es el ms preponderante,
aunque algunas cepas de Indonesia poseen otro
antgeno denominado "z"; lo que significa que expresan
un flagelo muy diferente en secuencia de aminocidos al
encontrado en las cepas de otras regiones del mundo.
Adems de los antgenos O y H, tiene en su exterior una
cpsula de polisacridos denominada Vi (por antgeno de "virulencia").
 IV. PARTE EXPERIMENTAL

Materiales, equipos y reactivos

- Tubos de prueba
- Placas petri
- Agar nutritivo
- Caldo nutritivo
- Agujas y asas de kolle
- Cepas de trabajo (bacillus subtilis, salmonella typhi)
- Estufa a 37C

Procedimiento

A. SIEMBRA DE TRASPLANTE O REPIQUE

Solido Solido

- Retirar la aguja pasndola por

ntroducir la aguja de kolle en la - Abrir el tubo con el medio virgen la parte inclinada, tomando la
arte media de la llama - Flamearlo cepa
Esperar que se ponga - Introducir la aguja, pegada a la
ncandescente pared para secarla

- Taponear el tubo
- llevarlo a la estufa a
37 C por 24 horas

rar la aguja con la cepa. - Destapar el tubo con el medio virgen

ear nuevamente el tubo - Flamearlo.
y tapar. - Introducir la aguja, realizando un zigzag en el
rea expuesta
 Solido Liquido

- Introducir la aguja de kolle en la - Abrir el tubo con la cepa - Retirar la aguja pasndola por
parte media de la llama - Flamearlo la parte inclinada, tomando la
- Esperar que se ponga - Introducir la aguja, pegada a la cepa
incandescente pared para secarla

- Taponear el tubo
- llevarlo a la estufa a
37 C por 24 horas

- Retirar la aguja con la cepa.

- Introducir el asa en el medio
- Flamear nuevamente el tubo y
(liquido) virgen y agitar
tapar.

Liquid Solido
o

- Introducir el asa de kolle

- Introducir el asa de kolle en la - Abrir el tubo con la cepa
- Agitar el asa
parte media de la llama - Flamearlo
- Esperar que se ponga
incandescente

- Taponear el tubo
- llevarlo a la estufa a
37 C por 24 horas

- Destapar el tubo con el medio virgen

irar el asa con la cepa. - Flamearlo.
ar nuevamente el tubo y - Introducir el asa, realizando un zigzag en el
tapar. rea expuesta
 Liquid Liquido
o

- Introducir el asa de kolle

- Introducir el asa de kolle en la - Abrir el tubo con la cepa
- Agitar el asa
parte media de la llama - Flamearlo
- Esperar que se ponga
incandescente

- Taponear el tubo
- llevarlo a la estufa a
37 C por 24 horas

- Destapar el tubo con el medio virgen

- Retirar el- asa
Flamearlo.
con la cepa.
- Introducir
- Flamear nuevamente el el asa,yagitar
tubo
- tapar.
Retirar el asa

B. SIEMBRAS DE AISLAMIENTO

- Mtodo francs o de las 21 lneas

- Tomar la aguja de kolle, con

la cepa , empezar a dibujar
las lneas (esterilizando la
aguja al termino de cada 5
lneas)

- Tcnica para dibujar las 21

lneas, se tienes que cruzar
por el final de las 5 lneas
anteriores.
 - Mtodos de estrias

Dividir la placa petri

con agar en 4 zonas

Tomar el inoculo

Realizar estras en
cada zona

Resultados

- TECNICA DE TRASPLANTE
- Mtodo francs o de las 21 lneas
bacillus subtilis, salmonella typhi

Solid
Solido
o

Solid Liquido
o

Liquido Solido

Liquido Liquido
- Mtodo de estrias
 DISCUCIONES

- De lo citado por el libro medios de cultivo en microorganismos

dice:
1. Flamear el asa de siembra y luego dejarla enfriar.
2. Quitar el tapn de algodn del tubo con la muestra y con la otra mano
tomar el inoculo. Tapar el tubo y retirarlo.

De acuerdo a nuestra prctica de laboratorio, se procedi un poco

diferente a lo citado anteriormente, no se dejo enfriar el asa de
kolle sino que lo pusimos en el medio lquido y agitando para que
se enfri, al retirar el asa se volvi a flamear para luego cerrarlo.

- De lo citado por el libro medios de cultivo en microorganismos

dice:

1. Tomar el inoculo con asa en aro.

2. Siembra de inoculo de la placa petri con agar.
3. Formar de distribucin, estria en plano, estria en 2 planos, estria en 4
planos.

Segn nuestra prctica se puede verificar el procedimiento citado

ya que se realizo de esa forma en el laboratorio, teniendo la
distribucin de estrias en 4 planos.

Deacuerdo a lo citado por el autor M. Barzizza

Despus del tiempo necesario de estufa, los grmenes desarrollan sobre el

trazo, apareciendo, en general, en forma de la capa continua, cuya
caracterstica varia Deacuerdo a la especie.

De acuerdo a los resultados obtenidos en el laboratorio se

verifican que los microorganismos se desarrollaron de forma
continua de acuerdo de cada estria que se dibujo.
 CONCLUSIONES:

- Se logr aprender a realizar algunos de los mtodos que

existen para cultivar bacterias.
- Se concluye que los microorganismos se proliferan rpidamente.
- Los microorganismos son seres vivos que se reproducen formando
colonias.
MTODO DE SIEMBRA POR AGOTAMIENTO O EN ESTRA

Necesitamos:

Placa petri con medio de cultivo

Muestra (slida o lquida)

Asa de siembra de platino

Con el asa estril tomamos la muestra y hacemos extensiones en la placa. Volvemos a

esterilizar el asa de siembra y extendemos parte de la extensin anterior en otra direccin.
Volvemos a esterilizar el asa de siembra y volvemos a extender parte de la segunda
extensin en otra direccin. Esterilizamos y repetimos la operacin.

Incubamos a 37 durante 24 horas y, en la primera zona, habr un amasijo de clulas. En

la segunda, parte de la primera zona estar mejor extendida, y en la tercera y en la 4
mejor an.

Si tomamos una colonia y la ponemos sobre una placa petri, tendremos un cultivo puro.

MTODO DE LAS DILUCIONES SUCESIVAS

Consiste en diluir una muestra hasta conseguir muy pocas clulas que, tras inocularse en
un medio de cultivo, generen colonias aisladas. Metodologa:

Ahora tomamos 0.1 ml de cada tubo y lo depositamos en una placa petri con medio de
cultivo. Con un asa de vidrio se extiende esa cantidad sobre la placa, e incubams a 37 C
durante 24 horas.

En la primera dilucin habr un amasijo de colonias. En la siguiente habr diez veces

menos nmero de colonias, y as sucesivamente hasta conseguir colonias aisladas.

Este mtodo nos permite calcular el nmero de microorganismos viables que existen en la
muestra que estamos analizando:

N=C 1/D 1/i donde:

N es el nmero de microorganismos presentes en la muestra

C es el nmero de colonias contadas UFC (unidades formadoras de colonias)

D es la dilucin

I es el inculo

Debe haber entre 30 y 300 colonias. Si hay menos, no es significativo (puede tratarse de
una contaminacin) y, si hay ms, no estn aisladas.
TCNICA DEL CULTIVO POR ENRIQUECIMIENTO

Consiste en ajustar las condiciones de cultivo para seleccionar el microorganismo que nos
interesa aislar. Ejemplo: Nos interesa aislar bacterias fotoauttrofas. Tomamos un matraz
con agua y sales y lo incubamos a la luz, de manera que crezcan las bacterias
fotoauttrofas.

Ejemplo 2: Queremos aislar bacterias quimiolittrofas del azufre; ponemos azufre, CO2
como fuente de carbono (disuelto en agua) e incubamos en la oscuridad para eliminar
fotoauttrofos.

Para incubar enterobactrias como enterobacter hay que incubar a 37, mientras que para
incubar otra enterobacteria, E. Coli, hay que incubar a 45.

ALMACENAMIENTO A TEMPERATURAS BAJAS

Ponemos las bacterias con glicerol al 20% - 50% a -70 y podemos mantenerlas as
durante aos, dcadas...

LIOFILIZACIN

Es un mtodo ms eficaz. En un vial de liofilizacin ponemos leche desnatada y las

bacterias, lo congelamos, lo llevamos al liofilizador y lo sometemos al proceso de
liofilizacin.

La liofilizacin es una evaporacin por condensacin. Se basa en el punto triple del agua;
podemos pasar de slido a gas. El agua se evapora y queda un polvillo formado por la
leche y las bacterias. Cerramos el bote y podemos almacenar el cultivo durante dcadas.

COLECCIONES DE CULTIVO

En todos los pases hay organizaciones que preparan o almacenan colecciones de

cultivos puros o tipo. En Espaa existe la C.E.C.T (Coleccin espaola de cultivos tipo),
que est en Valencia. La ms grande del mundo es la americana, A.T.C.C. (American
type cultive collection)
Bibliografa

Manuel mendo rubio(2003) lima Per medios de cultivo en microbiologa Ediciones

laborales SRL

M Barzizza(1962) microbiologa. Editorial. el palacio del libro.