Em um microscpio ptico de luz composto, a radiao atravessa a

amostra (modo de transmisso) ou reflete (modo reflexo) a

superfcie de uma amostra, sendo difratada, recolhida pela lente
objetiva e formando uma imagem aumentada que chega aos olhos
pela lente ocular ou que chega uma CCD.
A lente condensadora utilizada no modo transmisso e
responsvel por focalizar a luz vinda de um iluminador.
A denominao composto refere-se ao fato de que o aumento final
uma composio dos aumentos da lente objetiva e da ocular (ou
CCD). O aumento final ento M = M(obj) x M(ocu). Dessa forma,
se estamos usando uma lente objetiva de M(obj) = 100 X, e M(ocu) =
10 x, o aumento final de M = 100 x 10 = 1000 x. No caso da CCD,
geralmente M(ccd) = 12 x. Nesse caso, para a mesma objetiva, o
aumento final seria de M = 1200x. O comprimento de onda da
radiao (luz visvel) de cerca de 700 nm e um dos fatores que
define a resoluo da tcnica.
O poder de resoluo do microscpio, considerando-se objetos
pontuais, definido por d = 0,61 /AN (Eq. 1), onde AN a abertura
numrica da lente objetiva, d a distncia mnima resolvida, em m,
e o comprimento de onda da radiao, tambm em m.
A expresso essa tambm (Eq. 1) no caso de microscopia de campo
claro no modo transmisso se a abertura numrica da lente
condensadora for maior ou igual abertura numrica da lente
objetiva, ou AN(cond) >= AN(obj). Exemplo: se uma objetiva de 10x
tem AN(obj)=0,25 e a configurao tal que AN(cond) = 0,30,
temos d = (0,61 x 0,7 m)/0,25, d=1,71 m. Mas se a abertura
numrica da lente condensadora for menor do que a abertura
numrica da lente objetiva, AN(cond) < AN(obj), utilizada a
expresso d = 0,61 /(AN(cond) + AN(obj) (Eq. 2). Como exemplo,
se AN(obj) = 0,25 e AN(cond) = 0,20, temos d = (0,61 x 0,7
m)/(0,20 + 0,25), d=0,95 m. Nota-se que a resoluo melhora
quando AN (cond) < AN(obj), razo pela qual configuramos a lente
consensadora (que possui AN varivel) como AN(cond) ~ 0,8 *
AN(obj).
As equaes 1 e 2 descrevem o critrio de Rayleigh para que dois
pontos de difrao espaados no plano de imagem sejam resolvidos.
Pelo critrio de Rayleigh, dois objetos pontuais adjacentes so
resolvidos quando o centro do disco de Airy (regio circular de
difrao de um ponto bem focalizado) de um ponto coincide com o
primeiro mnimo do disco de Airy de outro ponto no ponto de
imagem (figura 1).

Figura 1

Microscopia ptica de Fluorescncia (18/06/2013)

Fotoluminescncia nome que se d ao efeito de uma amostra
absorver e re-erradiar luz. Se a luz interrompida, mas a re-emisso
persiste por alguns segundos, o efeito chamado de fosforescncia.
A fluorescncia ocorre quando a re-emisso ocorre apenas durante
a absoro da radiao excitante. O intervalo de tempo entre os
processos de absoro e re-emisso da ordem de um milionsimo
de segundo. Quando uma molcula fluorescente absorve um fton
de comprimento de onda adequado, um eltron excitado para um
estado de energia mais alto e quase imediatamente volta ao seu
estado inicial. Nesse processo, a molcula pode liberar a energia
absorvida como um fton fluorescente. Como um pouco da energia
absorvida perdida no processo, o fton fluorescente emitido possui
uma menor freqncia de vibrao, ou seja, um comprimento de
onda maior do que do fton inicialmente absorvido. Esse efeito
forma a base da microscopia de fluorescncia.

Atravs da Microscopia de ptica de Fluorescncia possvel

visualizar molculas especficas que fluorescem na presena de
radiao excitante. A tcnica pode ser usada para determinar a
quantidade, distribuio e dinmica de macromolculas especficas
em clulas, possibilitando o estudo de diversos mecanismos
celulares.

Geralmente, as amostras no so auto-fluorescentes e o uso de

corantes chamados fluorforos (ou fluorocromos) necessrio para
torn-las fluorescentes. Os fluorforos so molculas que absorvem
ftons com energia de determinado espectro de excitao e re-
emitem ftons com energia em determinado espectro de emisso (ou
de fluorescncia). Os espectros de excitao e de emisso possuem
um pico de intensidade. A diferena em nanometros entre os picos
do espectro de excitao e do espectro de emisso chamado de
desvio de Stokes. Quanto maior o desvio de Stokes, mais vantajoso
o corante, pois as bandas de excitao e fluorescncia so mais
fceis de serem isoladas usando filtros de interferncia. Para o
fluorforo DAPI, por exemplo, o comprimento de onda de absoro
referente ao pico de intensidade de 345 nm, enquanto que o pico
de emisso fluorescente ocorre para comprimento de onda de 460
nm, o que d uma diferena de 115nm (desvio de Stokes). Outra
caracterstica importante de um fluorforo a eficincia quntica
de emisso de fluorescncia, que a razo entre ftons fluorescentes
emitidos e ftons absorvidos. O coeficiente de extino molar
descreve a capacidade do corante em absorver um fton e dado em
unidades de absorbncia para o comprimento de onda referente ao
mximo de intensidade. Outras caractersticas relevantes dos
fluorforos so sua resistncia fotodegradao, sua solubilidade
em meio aquoso e sua estabilidade qumica. Mais de um fluorforo
pode ser utilizado ao mesmo tempo em uma amostra, registrando
diferentes estruturas ou processos da amostra. Existem algumas
subtncias naturalmente fluorescentes em produtos comuns, tais
como extrato de espinafre (vermelho), extrato de cenoura (amarelo),
leite em p (azul) e margarina (azul).

O microscpio de fluorescncia possui uma srie de modificaes

importantes para se obter imagens brilhantes e bem definidas. Eles
possuem filtros especiais e mtodo nico de iluminao para a
produo de imagens. Para imagem eficiente de alto contraste, a
iluminao e a objetiva so posicionadas do mesmo lado da amostra.
Assim, as lentes objetivas funcionam tanto como lentes
consensadoras, entregam a radiao excitante, quanto coletando a
luz fluorescente emitida pela amostra. Os filtros so projetados para
isolar e manipular dois conjuntos distintos de comprimentos de
onda, os de excitao e os de fluorescncia (ou emisso). A banda de
comprimentos de onda de excitao (que so curtos) vinda do
iluminador e filtros direcionada para a amostra, enquanto que a
banda de comprimentos de onda longos de fluorescncia emitida
pela amostra forma a sua imagem. So usadas objetivas de alta
abertura numrica para maximizar a coleta de luz e fornecer a
melhor resoluo e contraste possveis.

Uma fonte de luz brilhante como uma lmpada de arco de xenon ou

de mercrio, chamada de epi-iluminador, necessria j que uma
banda fina de comprimentos de onda curtos usada para excitar os
fluorforos. A iluminao consiste de uma lmpada, lentes
coletoras, outras lentes e filtros. Quanto lmpada, 100 W de
mercrio ou 75 W de xenon so geralmente usadas. Ambas as
lmpadas fornecem a banda entre 400-700 nm, mas a lmpada de
mercrio, conhecidamente, possui linhas de emisso bem definidas
em 366 (UV), 405, 436, 546 e 578 nm. Essas linhas so teis para
excitar certos fluorforos, como DAPI, por exemplo. Em 546 nm,
essas lmpadas so de 10 a 100 x mais brilhantes do que a lmpada
de 100W halognea, comumente utilizada em microscopia de campo
claro e essa vantagem necessria para a Microscopia de
Fluorescncia.

Conjuntos de filtros fluorescentes contendo trs filtros essenciais

(filtro de excitao, espelho dicrico e filtro de barreira, para
emisso) so montados na forma de um cubo no caminho ptico
entre o epi-iluminador e a objetiva (veja figura 2). O filtro de
excitao seletivamente transmite uma banda de comprimentos de
onda curtos para excitar o fluorforo na amostra. O espelho
dicrico reflete a luz de comprimento de onda curto em direo s
lentes objetivas e amostra, mas transmite a luz fluorescente de
comprimento de onda longo em direo ao detector. O filtro de
barreira transmite a banda de comprimentos de onda fluorescentes,
mas bloqueia qualquer comprimento de onda curto de excitao
residual. Os comprimentos de onda fluorescentes formam ento a
imagem no olho ou na cmera.

Figura 2 - Cubo de Filtros

Para realizar imagens de fluorescncia deve-se saber selecionar

corretamente o(s) fluorforo(s), os filtros e iluminao adequada,
alm de avaliar corretamente a qualidade dos sinais de
fluorescncia. Deve-se tambm tentar evitar a fotodegradao,
interrompendo a iluminao para a amostra nos momentos em que
ela no est sendo observada.
A seguir uma imagem de leite em p visto em Microscopia de
Fluorescncia utilizando-se cubo para DAPI (filtro de excitao de
330 nm - 385 nm e filtro de emisso de 420 nm)
 Figura 3 - Imagem de leite em p visto em Microscopia de Fluorescncia

Referncias
-
http://www.olympusmicro.com/primer/lightandcolor/fluorointroductio
n.html
- Douglas B. Murphy. "Fundamentals of Light Microscopy and
Electronic Imaging". John Wiley & Sons. (2001).