CAPITULO 8

CLONAMIENTO

CONSTRUCCION DE GENOTECAS

CLONAMIENTO DE GENES

CARACTERIZACION DE CLONES
 Bibliografa
Para esta parte

Recombinant DNA

Watson JD, Gilman M, Witkowski JA , Zoller MJ

3 Edicin (2007)
2 Edicin
 GENOTECA

Conjunto o coleccin de vectores recombinantes:

Vectores con
insertos DNA

DNA forneo
fragmentado
fragmentacin

DNA genmico
TIPOS DE GENOTECAS

Segn la naturaleza del DNA forneo que portan

los vectores
DNA genmico (cromosmico)
El conjunto de recombinantes representa el
genoma (cromosoma) completo de un individuo.
Incluye DNA codificante y DNA no codificante

De cDNA
El conjunto de recombinantes representa slo
los genes expresados por un tipo celular o tejido,
en una determinada circunstancia.

Genotecas de expresin (de uso restringido)

Los vectores permiten expresar la informacin

gentica fornea que portan los recombinantes
(Obtencin de productos gnicos)

Inserto bajo el control de un promotor apropiado

 Genotecas de DNA genmico (cromosmico)

Insertos: fragmentos de DNA genmico (cromosmico)

Generacin de fragmentos: Endonucleasas de restriccin

Mecnica (cizalla)
Sonicacin
Seleccin de fragmentos segn tamao (tamices moleculares)
Vectores para construir una genoteca:
Eleccin acorde al tamao de los insertos

Ej. Vectores lambda (Insertos hasta 17 Kpb)

Cosmidios (Insertos hasta 45 Kpb)

Nmero de recombinantes en una genoteca genmica:

Nmero de recombinantes necesarios para representar

todo el genoma depender de:
tamao del genoma en cuestin
longitud promedio de los insertos

Probabilidad de encontrar un determinado segmento de

DNA (una secuencia particular) en una genoteca que
consta de N recombinantes independientes :

N= [ln(1-P)] / [ln(1-1/n)]
n= tamao del genoma /tamao promedio de los insertos
 Cromosoma (DNA genmico)

Genoteca
genmica

La secuencia del cromosoma se podra reconstruir

a partir de los insertos de todos los recombinantes
de la genoteca

..se requiere cierto grado de superposicin para alinear

los insertos
 Genotecas de cDNA

mRNAs

cDNAs

Obtencin de los insertos:

Aislar transcritos (RNA que tiene poli A)
Sintetizar cDNA (partidores: oligo dT 15-18 o
hexmeros de secuencia aleatoria)
Requisitos:
Preservar la integridad de los RNAs
Sntesis de cDNA completa
Adecuada representacin de transcritos poco abundantes

Vectores:
Frecuentemente, plasmidios o
derivados del bacterifago lambda
(aceptan insertos hasta 10-17 Kpb)

Nmero de recombinantes: variable (impredecible)

Segn nmero de genes transcripcionalmente
activos en un determinado tipo celular, en una
condicin particular.
 Construccin de genotecas enriquecidas en
un cDNA particular

Sustraccin

+ estmulo mRNA control

mRNA
cDNA

Genoteca con cDNAs sustrados

cDNAs hebra doble

Incorporacin en vector

Genoteca enriquecida en los cDNAs

que son poco abundantes en la clula
Construccin de genotecas enriquecidas en
un cDNA particular

Estmulo para la expresin de un gen particular

transcripcin

traduccin

Aislar polisomas (centrifugacin deferencial)

Inferior Superior

Extraer mRNA de fraccin polisomal

Sntesis de cDNA
Construccin de genoteca enriquecida
CLON: conjunto de clulas (individuos), genticamente
iguales, derivados de un progenitor nico

Clonamiento de genes desde una genoteca

105-106 recombinantes

Incorporacin en clulas hospedero

(frecuentemente E coli)

Condiciones
para
proliferacin

Colonias con los

recombinantes
(clones)
Genoteca en bacterifago lambda

placa de
lisis
Identificacin del clon de inters en una genoteca

Gen de inters

106 recombinantes

?
Identificacin del clon de inters en una genoteca
Rastreo de una genoteca para identificar los clones de clulas
que portan un DNA recombinante determinado

1.-Basado en secuencia nucleotdica de inters

(requiere conocimiento de la secuencia )

Hidridacin con
sonda nucleotdica

Lavados en
condiciones
estrictas
Automatizacin
Obtencin de una sonda nucleotdica
para rastreo de genotecas
Informacin: la protena codificada por el gen
...-Met - Gln - Lys - Phe - Asn- secuencia prot.
A A U U
AUG CAG AAG UUC AAC

AUG CAA AAA UUU AAU

Guessmers:
AUG CAG AAA UUU AAU
oligonucleotidos
AUG CAG AAG UUU AAU
que codifican el
AUG CAA AAG UUU AAU
polipptido
AUG CAG AAG UUU AAU
etc.

* AUG CAA AAA UUU AAU Sntesis qumica

* AUG CAG AAA UUU AAU y
* AUG CAG AAG UUU AAU
marcacin de los
* AUG CAA AAG UUU AAU
* AUG CAG AAG UUU AAU oligonucletidos
* n...
sondas

* AUG CAA AAG UUU AAU

TAC GTT TTC AAA TTA..

...ATG CAA AAG TTT AAT..
 Protena
purificada

Secuenciacin de fragmentos de la protena

secuencia
aminoacdica
parcial

secuencia nucletdica
probable

secuencia aminoacdica
secuencia nucletdica
sntesis de oligonucltidos

a c
b d partidores
e

Reaccin de PCR
b Sustrato: gDNA
e
intrones?

* * Sondas marcadas
+
 Protena

secuencia
polipeptdica

secuencia nucleotdica
probable

a c sntesis de
b d
e oligonuclotidos

e Sustrato: cDNA

e
b
PCR

*
+ Sondas marcadas
*
Uso de las sondas:
rastreo de genoteca de cDNA o de gDNA para
identificar el o los recombinantes que portan
insertos que codifican la protena de inters

*
* Hibridacin con
sondas marcadas

*
*
Situacin excepcional: Uso de anticuerpos
como sonda para el rastreo de genotecas de
expresin

transcrito

polipptido

Marco de lectura
Orientacin

Y
 Clonamiento de genes mediante
chromosome walking
(caminata por el cromosoma)

Esta estrategia ha sido utilizada para

identificar genes responsables de un
fenotipo heredable
(Ej. enfermedades hereditarias).

Se requiere de un marcador1 que est

ligado2 al fenotipo en cuestin
 Marcador gentico

Secuencia de DNA que tiene una localizacin

conocida en el cromosoma
Debe ser fcilmente identificable y trazable.

Permiten trazar la
herencia de las regiones
cromosmicas en
generaciones sucesivas
y los eventos de
recombinacin gentica.
 Ligamiento gentico

Asociacin de un fenotipo y un
cromosoma determinado

Segregacin al azar de los cromosomas

I
1 2

II

III 3 4 5 6

La herencia del gen responsable del

fenotipo parecera fcilmente trazable de
generacin en generacin

Sin embargo,. dada recombinacin

gentica que ocurre en la meiosis.
P M

Mltiples
posibilidades de
recombinacin

Etctera, etctera..
 P M
W w
z y
f e
Marcadores g g Marcadores
m n
genticos genticos
p q
c a
b b
r s

W
w
recombinacin
z
y
f W w
e
g z y
m g
n f e
q g g
p
a m n
b c
b p q
s W w a c W w
r
b b
y z z y
s r
e f f e
g g g g
m n m n
p q p q
c a c a
b b b b
r s r s

Identificacin de marcadores genticos

(cercanos), que estn ligados al fenotipo de
manera estadsticamente significativa
 Chromosome walking
Identificacin gen responsable de un fenotipo dado

Sonda
para
rastreo
genoteca
genmica

rastreos sucesivos

etc
Anlisis de clones seleccionados
Indiv. con gen normal Indiv. con gen mutado
Estrategia de Captura de Genes
(gene trapping)

No est orientada a la bsqueda de un

gen en particular
Basada en la integracin al azar de un gen reportero
y un marcador de seleccin en el genoma con en
propsito de interrumpir un gen, alterar un fenotipo
y conducir a su identificacin

Gen reportero Gen para

sin promotor seleccin
Sitio donante
Sitio aceptor de splicing
de splicing

Sitio de Poli A

Vector de integracin
 Gen normal

intrn
Sitio donante Sitio aceptor

12 3 Transcrito normal

Gen con insercin del reportero y selector

Transcrito atrapado

Fusin entre el gen endgeno

y los genes del vector

Expresin del reportero y del selector quedan bajo

el control del promotor del gen capturado
donde se incorpor la construccin
Consecuencias:
Expresin del marcador de seleccin bajo el control
del promotor endgeno
Expresin del gen reportero bajo el control del
promotor endgeno
Supresin de la expresin del producto gnico normal
En algunos casos, alteracin detectable del fenotipo

Posibilidades de la tcnica:

Identificar un gen responsable de un fenotipo

Aislar el gen
Estudiar el patrn de expresin tisular del gen
Generacin de mutante con el gen inactivo

Sondas para rastreo de genoteca: clonamiento del gen de

inters
Clonacin de un gen basndose en
la funcin del producto gnico

Insertos cDNA bajo el

control transcripcional
de promotor
apropiado

mRNAs

protenas A
B
1 2 3 4 5 6 7

Expresin de funcin

Ensayo de la funcin
A Unin de ligando a receptor
B Transporte de molculas o iones
Actividad enzimtica
Ejemplo: expresin de etc.
protena fluorescente
 Clonacin de un gen basndose en la
expresin de la funcin

mRNAs

Fraccionamiento
segn tamao
Expresin y
ensayo funcional
en cada fraccin
de mRNAs

+ Subpoblacin
enriquecida en el
mRNA de inters

cDNA

construccin de genoteca enriquecida

 genoteca

- - - - + - - Rastreo por expresin

funcional

Rastreo funcional
- - + - - - -
Rastreos sucesivos
Ciclo de rastreo N clones

1 20.000
2 2.000
3 200
4 20
5 2
6 1

Identificacin de 1 clon que

expresa la funcin de inters
 Caracterizacin fsica del DNA clonado

Mapa de restriccin
Secuenciacin
Prediccin de secuencias regulatorias
Identificacin de marco de lectura abierto
Predicin de secuencia polipeptdica
Prediccin de estructura secundaria
Anlisis de homologa (funcin probable)
Nmero de copias por genoma

Caracterizacin funcional del DNA clonado

Anlisis de regulacin transcripcional

Identificacin de promotores y otras
secuencias reguladoras
Anlisis del transcrito codificado
Transcripcin (expresin gnica)
Expresin funcional in vitro e in vivo
 Deteccin de los transcritos intracelulares
complementarios al DNA clonado

Dnde se expresa en gen de inters?

Extraccin del RNA

de distintos tejidos

RNA tejido a b c d -
Inmovilizado
sobre membrana

Hibridacin con
sonda
nucleotdica

a b c d -

a b c d -
 Deteccin de los transcritos intracelulares
complementarios al DNA clonado

Tejido o clulas

RNA

-
Transferencia
a membrana

electroforesis
Inmovilizacin

+
Fraccionamiento Sonda marcada
segn tamao
Hibridacin

NORTHERN BLOT
Northern blot
Cuantificacin de transcrito mediante
mapeo con nucleasa S1

DNA clonado
RNA desnaturado
y marcado
(cantidad conocida)

Digestin con
nucleasa S1

Desnaturacin

electroforesis

+
cuantificacin
 Comparacin del tamao del DNA clonado
y el transcrito respectivo

Nucleasa S1

DNA genmico

cDNA completo

cDNA parcial

Extensin del cDNA clonado a partir del transcrito

respectivo

mRNA
cDNA
Transcriptasa reversa
+ dNTPs
 Nmero de copias por genoma
del gen de inters
DNA genmico
fragmentado

Copias del gen clonado

0.5 1.0 2.0 5.0

Intensidad relativa

N copia estndar
 Desnaturacin Renaturacin

DNA Genmico ss DNA ds DNA

fragmentado

Velocidad de
renaturacin

dc/dt = -kC2 C: conc. de DNA desnat.

a tiempo t
C/Co = 1/kCot +1 Co: conc. de DNA
desnat. a tiempo 0

Cuando el 50% del DNA se ha renaturado

C/Co = 0.5 Cot 0.5 = k-1
 Tamao de genoma

C/Co
0

0.5

1.0
10-4 10-2 1 102 10-2 1 102
Cot (mol seg/l) Cot (mol seg/l)

Genomas simples Genomas complejos

cada fragmento presente fragmentos muy repetidos
una vez por genoma fragmentos poco repetidos
fragmentos nicos
Nmero de copias de un gen clonado
(cintica de hibridacin)
Marcar el clon
Hibridar con DNA genmico fragmentado y desnaturado
Deterninar el valor de Cot

C/Co
0

0.5

1.0
10-2 10-1 1 101 102
Cot (mol seg/l)
Cot del clon

Nmero de copias = Cot gen nico

Cot del clon

Tiempo renaturacin muy largos

genomas complejos y grandes
genes con bajo nmero de copias