OXIDADIONES BIOLOGICAS

Experimento 1: ACCION DE LA XANTINO DESHIDROGENASA DE LA LECHE

INTRODUCCION

La mayor parte del oxgeno celular se utiliza para quemar combustibles y generar ATP a partir
de ADP y Pi. Un nico tipo de complejo enzimtico localizado en la membrana mitocondrial
interna cataliza esta reaccin en la que el ultimo aceptor de electrones. La formacin de ATP por
fosforilacin del ADP ocurre al mismo tiempo que la combustin de las grasas, los carbohidratos
e incluso las protenas. Las clulas modifican estas reacciones a fin de producir la fosforilacin
de una gran cantidad de molculas de ATP por molcula de combustible consumido; cada uno
de estos procesos representa la suma de muchas reacciones individuales.

Ms del 85 % de los fosfatos de alta energa consumidos durante un da por todo el organismo
son producidos por fosforilacion oxidativa; esto es, la generacin de enlaces pirofosfatos
acoplados a la reduccin del oxgeno. La oxidacin de un sustrato tpico por el oxgeno libera
suficiente energa libre para producir dos o tres molculas de ATP por cada tomo de oxigeno
consumido. La transferencia de electrones desde el sustrato hacia el oxigeno para reducir ste
a agua se descompone entonces en un mximo de tres pasos. Tres complejos enzimticos de
bombeo de protones a travs de la membrana mitocondrial interna para impulsar la formacin de
una molecula de ATP a partir de ADP y Pi por cada par de electrones transferidos a travs de
una serie de intermediarios que constituyen la cadena respiratoria.

Los tres complejos enzimticos catalizan las siguientes transferencias sucesivas de electrones a
la vez de bombear protones. En las clulas vivas los electrones que son liberados, no
permanecen en el medio, ya que inmediatamente son tomados por otro compuesto, el que al
hacerlo se reduce. Estos procesos de oxido- reduccin son catalizados por deshidrogenasas
mas o menos especificas; algunas utilizan + como agente oxidante, mientras que otra
utilizan directamente la ubiquinona. El consumo de oxigeno puede ser estimado en el
respirometro de Warburg. Otra manera de medir el consumo de oxigeno es a travs de la
determinacin (Hb2 ) y la desoxigenada muestra una regin donde es claramente diferente. El
objetivo des presente experimento es verificar la actividad de la xantina deshirogenasa de la
leche, utilizando como sustrato artificial al aldehdo formico hidratado, analizando el efecto de los
inhibidores cianuro y uretano sobre la oxidacin del aldehdo formico hidratado por la xantina
deshidrogenasa de la leche, a travs del descolorimiento del azul de metileno.

PROCEDIMIENTO

1. Establezca el siguiente sistema de tubos de ensayo

COMPONENTES SISTEMA DE TUBOS DE ENSAYO

I. II. III. IV.

Leche cruda 5.0 ml 5.0 ml 5.0 ml
Leche hervida 5.0 ml
Uretano 0.5 ml
Cianuro de sodio 0.5 ml
Aldehdo formico 0.8 ml 0.8 ml 0.8 ml 0.8 ml
Azul metileno 0.4 ml 0.4 ml 0.4 ml 0.4 ml

2. Mezclar y agregar a cada tubo 1 ml de parafina liquida e incubarlos a 37 C

3. Observe el decoloramiento cada cinco minutos.
RESULTADOS

Construya la siguiente tabla para anotar sus observaciones cada cinco minutos expresando el
decoloramiento con cruces (de cero a 4).

SISTEMAS I. II. III. IV. Observacin

Sustrato
Enzima
Decoloracin de 0 5
Decoloracin de 5 10
Decoloracin de 10 15

Experimento 2: OXIDACION DEL SUCCIONATO POR CADA CADENA RESPIRATORIA

El objetivo del presente experimento es evidenciar el funcionamiento de la cadena respiratoria

del corazn del mamfero a travs de la medida del consumo de oxgeno por la tcnica
manomtrica de Warburg, analizar el efecto de los inhibidores, donantes y aceptores durante la
oxidacin del succionato por la cadena respiratoria y entender el funcionamiento del citocromo
oxidasa de corazn de mamfero.

PROCEDIMIENTO

1. En 8 frascos de Warburg mida lo siguiente:

SISTEMA DE FRASQUITOS DE WARBURG

COMPONENTES I II III IV V VI VII VIII

Succionato 0.1 M
Cianuro
Azul de metileno
Malonato
Ascorbato
Agua destilada
Extracto enzimatico

2. Equilibrar los sistemas por a 10 a 15 minutos, permitiendo el libre intercambio gaseoso

con el medio ambiente. Cerrar la llave de los manometros y la llave lateral de los frascos
de Warburg y realizar las lecturas cada 10 minutos hasta completar 1 hora.

RESULTADOS

1. Construir una tabla en la que figuren el consumo de oxgeno en microlito/hora para los
siete sistemas experimentales.
2. Anotar en la misma tabla el porcentaje (%) de inhibicin o estimulo en el consumo de
oxigeno con relacin al sistema I.
3. Con los valores parciales para el consumo de oxgeno en el sistema I. construya la curva
de progreso de la reaccin.
 Complete el siguiente cuadro con los resultados obtenidos:

TB 2 =1 2 =2 2 =3 2 =4 2 =5 2 =6 2 =7
0
10

20

30

40

50

60

TOTAL
Oxigeno *
(*) Oxigeno consumido/ Hbr
CUESTIONARIO

1. Haga una interpretacin adecuada de los resultados obtenidos en el experimento 1, anote

sus observaciones y conclusiones:
SISTEMA I: _______________________________________________________
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
______________________________________________

SISTEMA II: ______________________________________________________

_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
______________________________________________

SISTEMA III: ______________________________________________________

_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
______________________________________________

SISTEMA IV: ______________________________________________________

_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
______________________________________________

2. Esquematice el mecanismo de la reaccin catalizada por la xantina deshidrogenasa,

utilizando como sustrato artificial el aldehdo frmico hidratado.
3. El cianuro es capaz de inhibir la oxidacin del succinato por la cadena respiratoria. Cmo
podra superar esta inhibicin aun en presencia de cianuro?
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_____________________________________

4. De haber aadido uretano al sistema I del experimento 2. cul habra sido el resultado
esperado en cuanto al consumo de oxigeno?
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
______________________________________________

5. Los potenciales redox de los sistemas oxido- reduccin A y B son respectivamente 0.23 y
0.32 voltios. Indique cual es el sistema oxidante y cual es reductor.
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
______________________________________________

6. Seale las consecuencias de los siguientes factores para el funcionamiento de la cadena

respiratoria y de la fosforilacin oxidativa:

a) Presencia de cianuro de potasio o cobalto: _________________________________

__________________________________________________________________

b) Deficiencia de fosfato inorgnico (Pi): ____________________________________

__________________________________________________________________

c) Deficiencia de ADP: __________________________________________________

__________________________________________________________________

d) Presencia de denitrofenol (DNF): _______________________________________

__________________________________________________________________

e) Carencia de Pi y/o ADP en presencia de DPN: _____________________________

__________________________________________________________________

7. Calcule el rendimiento de la oxidacin biolgica de la glucosa y el cido palmtico:

6 12 6 + 62 62 + 2 F= -686 kcal/mol Rendimiento: ______

16 32 2 + 232 162 + 162 F= -2338 kcal/mol Rendimiento: _____

8. Haga una justificacin desde el punto de vista termodinamico de los lugares en donde se
sintetiza ATP en la cadena respiratoria.
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_____________________________________

9. Qu son desacopladores de la fosforilacion oxidativa? Distinga los tipos de

desacopladores y coloque al menos dos ejemplos.
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________
10. Nombre al menos cuatro inhibidores de la transferencia de electrones.
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________

11. Con que objeto se usa la capa de parafina liquida en cada tubo?
________________________________________________________________

12. Cmo actual el azul de metileno?

_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
______________________________________________

ALUMNO: _________________________________________ CODIGO: __________