Determinacin de los cidos carboxlicos voltiles (C1-C5i) y cido lctico en acuosa de cido

extractos de ensilaje por cromatografa lquida

Andrea Canale, Maria E. Valente y Angelo Ciotti

Una tcnica de HPLC isocrtica sencilla fue desarrollado para el anlisis cuantitativo simultneo de
cido lctico, frmico, actico, propinico, isobutrico, cidos n-butrico y isovalrico en extractos
cidos acuosos de ensilaje. Una columna de resina de intercambio catinico fuerte Aminex HPX-87H
a 41 C, 0.0025M H2S04 fase mvil y detector ultravioleta a 210 nm se utiliza. recuperaciones
estimadas de cidos aaden a ensilaje vari desde 98,2 hasta 103,5%.

Palabras clave: HPLC de intercambio inico; cidos carboxlicos voltiles; cido lctico; ensilaje

Introduccin

Lctico, actico, propinico, isobutrico, cidos isovalrico n-butrico y puede ocurrir en ensilado
como los principales productos de fermentacin, y su determinacin cuantitativa precisa tanto, es
importante en la evaluacin de la calidad del ensilaje. Tambin es til para determinar
cuantitativamente el cido frmico, cuando este se utiliza como un aditivo de ensilaje.

En los ltimos aos se han propuesto muchos mtodos para aumentar la precisin y la velocidad de
la determinacin de estos cidos. La inyeccin directa del extracto ensilaje acuosa en la
cromatografa de gas evita procedimientos de esterificacin que son muy laborioso y dan lugar a
recuperaciones pobres. Con los cidos voltiles de C2 a C5i, los buenos resultados pueden
obtenerse, a excepcin de algunos problema imgenes fantasma usando gas-lquido o de separacin
de gas-slido.

llama de ionizacin no responde a cido frmico y su deteccin por un catarmetro no es

satisfactoria. surgen problemas especiales con la estimacin de cido lctico, ya sea por
cromatografa de gases, colorimetra o mtodos enzimticos. Con Chromosorb 101 la respuesta,
mientras que a veces aceptable (recuperacin del 90 - 5,8%), es a menudo inconsistente o nula, en
funcin de los lotes de produccin del fabricante; una situacin similar se produce con PEG 6000 en
TPA. Los procedimientos que implican la estimacin de cido lctico a travs de su conversin en
acetaldehdo, que luego se detecta ya sea colorimtricamente por cromatografa de gases' tienen
que ser utilizados con extrema precaucin, ya que pueden dar resultados engaosos. De hecho, se
ha demostrado que el butano-2,3-diol y 3-hidroxibutan-2-ona, ocasionalmente presente en ensilaje,
se oxidan a acetaldehdo y por lo tanto se presentan como cido lctico. Con poli (cido ethy1ene
glicol ftlico ster) en TPA (PEGPE 3000 en TPA) cido lctico puede ser separado, pero los cidos
propinico y isobutrico no estn bien resueltos. mtodos enzimticos que emplean L (+) y D (-)
lactato deshidrogenasa (LDH) y la determinacin UV dan buenos resultados, pero es necesario para
determinar cada estereoismero.

resinas de HPLC de gran eficiencia estn disponibles para la separacin de cidos orgnicos, segn
lo informado por varios autores para el anlisis de los vinos, zumos de frutas, productos lcteos 14
y otros lquidos de origen biolgico. Esto ha alentado a los autores a desarrollar un procedimiento
preciso, simple y rpido para la determinacin simultnea de cidos orgnicos en los extractos de
ensilado
Experimental

la preparacin 2.

Muestra

De acuerdo con el contenido de materia seca, 60-120 g de picado ensilado, fresco o congelado, se
pes en una bolsa de polietileno de 400 ml y se extrajo con 250 ml de 0,05 M H2S04 a 20 C durante
4 min en un 'Lab-Blender Stomacher 400 '(Laboratorio de Seward, Londres). La concentracin de
H2S04 se increment para las muestras de alto contenido de cenizas y alta capacidad de
tamponamiento para asegurar un pH final dentro del intervalo 2,0 -3,0. La mezcla, primero se filtr
a travs de tela y luego a travs de filtro de membrana Schleicher y Schull (BA-83 24:02), estaba
entonces listo para la inyeccin sin tratamiento adicional.

2. Mtodo analtico

Los instrumentos utilizados fueron: un modelo 8100 Cromatgrafo de lquidos equipado con un
autoinyector que incorpora un bucle de muestra, un modelo 8440 de longitud de onda variable de
ultravioleta detector visible y un integrador de computacin modelo 4100 (Spectra Physics Ltd). A
300 x 7,8 mm idhplc anlisis de cidos orgnicos columna rellena con Aminex HPX-87H y una
columna de proteccin (40x 4. 6m m) empaquetada con Aminex HPX-85H fueron empleados (Bio-
Rad Laboratories, Richmond, CA).

Los anlisis se realizaron isocrticamente en las siguientes condiciones: 0.0025M fase mvil H2S04
desgasificado con He, caudal 0,6 ml min-I, temperatura de la columna 41" C, volumen de inyeccin
10 PI, deteccin UV a 210 nm.

Cuatro patrones de calibracin se prepararon diluyendo una solucin madre de 20, 10, 5 y 3,33
veces, respectivamente, en 0,05 M H2S04. Esta solucin madre contena las siguientes cantidades
(mg ml-l) de los cidos puros (Hoechst AG): 18,01 lctico, 5,98 frmico, 10,29 actico, 9,85
propinico, 9,40 isobutrico, 9,50

Figura 1. Cromatograma de una solucin estndar que contena los siguientes cidos (pg m1-l): (I)
1.801 lctico; (2) 598 frmico; (3) 1029 actico; (4) 985 propinico; (5) 940 isobutrico; (6) 950
nbutyric; y (7) 911 isovalrico en una columna HPX-87H Aminex. Condiciones cromatogrficas
fueron: fase mvil, H2S04 0.0025M; temperatura de la columna, 41 C, la tasa, 0,6 ml min,
volumen de inyeccin, 10 PI de flujo: deteccin UV a 210 nm
n-butrico, y 9,11 isovalrico. El mtodo estndar externo se utiliz para convertir reas de los picos
de concentraciones, y se hicieron anlisis duplicados. curvas de calibracin estndar se definen
como y = a + bx, donde y es la concentracin de cido en ug ml-1 y X es el rea del pico en unidades
integrador. Las pendientes de estas lneas (B) son los factores de respuesta para cada cido. Acids
aade en cantidades conocidas por los extractos de ensilaje fueron recuperados, siguiendo el
procedimiento habitual, para probar la eficacia global del mtodo. anlisis duplicados se realizaron
antes y despus de la adicin de la solucin estndar. Tanto ensilajes buenos y de mala calidad se
utilizaron para cubrir una gama de niveles de cido.

Resultados y discusin

La Figura 1 muestra la separacin de los cidos contenidos en una de las soluciones estndar
utilizadas para preparar las curvas de calibracin. Los datos de estas lneas, y los factores de
capacidad (k ') se dan en la Tabla 1. La precisin analtica excelente obtenido se muestra por los
bajos valores de la ordenada en el origen y por los coeficientes de correlacin lineal (r).
El nivel detectable mnimo (a la altura del pico correspondiente a dos veces el ruido del detector)
vari de 30 ug ml-1 para el cido isovalrico a 8 ug ml-1 para el cido frmico. Esta sensibilidad,
teniendo en cuenta la dilucin utilizada en la preparacin de la muestra, corresponde a tan poco
como 0,4 y 0,1 g kg-' DM respectivamente.

La Figura 2 muestra los cromatogramas de una buena (a) y pobres ensilado de hierba (b) de calidad.
Bajo las condiciones adoptadas, que fueron optimizados despus de varias pruebas, los cidos de
inters se resolvieron satisfactoriamente. Oxlico, mlico, tartrico, ctrico y succnico se eluyeron
antes de cido lctico, cido fumrico y otros componentes no identificados fueron separados sin
co-elucin o causar otro tipo de interferencia. monitoreo ultravioleta a 210 nm evitarse la
interferencia de azcares y etanol que se producen usando la deteccin refractomtrico.

Las concentraciones de cidos voltiles determinado por HPLC y por cromatografa de gases con
Chromosorb 101 estaban de acuerdo con los mismos dos extractos de ensilado (Tabla 2). Las cifras
de cido lctico eran ms bajos usando la cromatografa de gas, probablemente debido a la
adsorcin al polmero poroso. Los resultados de la prueba de recuperacin confirmaron la eficacia
de la tcnica (Tabla 3).

La columna HPX-87H de Bio-Rad se ha utilizado peridicamente para analizar alrededor de 1000

muestras de ensilaje durante un perodo de un ao. no se observ deterioro de las capacidades de
separacin. Aunque se observaron ni aumento de la presin de retorno, ni la prdida de resolucin,
el cartucho HPX-85H fue reemplazado cada 300 inyecciones, como medida de precaucin. En
conclusin, el mtodo combina la simplicidad y la preparacin de la muestra mnima con la velocidad
adecuada y la precisin para el anlisis simultneo de los cidos carboxlicos voltiles (C1-C5i) y de
cido lctico en ensilajes.

J. Sci. FoodAgric. 1984,35,1178-1182