Resumen: (200 palabras)

Las enzimas con actividad invertasa hacen referencia a un conjunto de enzimas capaces de transformar la sacarosa en
azucares fermentables (D-glucosa). El tipo ms conocido es la enzima -fructofuranosidasa presente en las levaduras de
uso comercial para la elaboracin de masas y bebidas alcohlicas. Segn su origen filognico existen ms de 300
variedades de la enzima en diferentes tipos de organismos, los cuales se aprovechan para generar distintas variedades de
un mismo producto fermentado diferenciados, que cambian el producto de manera de atraer el inters tanto cientfico
(en uso industrial) como gastronmico (nuevos sabores). En este estudio se determinaron los parmetros cinticos de la
invertasa -fructofuranosidasa presente en Saccharomyces cerevisiae mediante la propiedad reductora de la D-glucosa
generada al reaccionar junto al 3,5-dinitrosalicinato (DNS) como aceptor de protones. Adems se examina la influencia de
la temperatura, el pH y la presencia de un inhibidor enzimtico conocido como el CUSO4. Se determin su masa molar
entre 100kDa y 130kDa para la invertasa, y obteniendo valores de Km=65,7 mM y un VMAX=0,060 mM/min.

Palabras Claves: invertasa, -fructofuranosidasa, D-glucosa, Western Blot, SDS-PAGE, DNS,

Introduccin. metabolismo de cido malico y la produccin de varios

El organismo modelo Saccharomyces cerevisiae se
conoce comnmente como levadura de panadera o
levadura de cerveza (Mortimer 2000). La levadura puede
aadirse a otras fuentes de azcares, tales como granos,
maltas u otros materiales vegetales, para producir otras
bebidas alcohlicas. (Greig y Leu 2009), sin embargo, las
cepas de S. cerevisiae utilizadas en la coccin moderna,
la fermentacin, la fermentacin y la elaboracin del
vino han sido cuidadosamente cultivadas, seleccionadas
y purificadas por estas respectivas industrias; Cada cepa
tiene sus propias caractersticas particulares y no son
intercambiables (Mortimer 2000). Estas caractersticas
particulares estn definidas por el metabolismo, ya que
sus metabolitos tienen carcter degustativo, definiendo
una cepa de S. Cerevisiae, la calidad del producto
alimenticio, por ejemplo, para la seleccin de la mejor
levadura del vino, depende esencialmente de sus
caractersticas enolgicas/fenotpicas, como la velocidad
fermentativa, la tolerancia al etanol, y al SO2, la
respuesta a la temperatura, las caractersticas
floculantes, la presencia de factor asesino, el
subproductos de la fermentacin, ctales como cido
actico, H2S, alcoholes superiores, glicerol y acetaldehdo
[4 - 8]. Una gran variedad de mecanismos, incluyendo
heterocigosidad, nucletidos y las variaciones
estructurales, introgresiones, la transferencia de genes
horizontales y la hibridacin, contribuyen a la diversidad
gentica y fenotpica de S. cerevisiae vino levaduras [9 -
12], y varias huellas dactilares de domesticacin se han
identificado en su Genomas [13]. Las diferentes cepas de
la S.Cerevisiae sean parte de la industria alimentaria, y
que la diferenciacin de sus metabolismos generen un
producto diferenciado, la han transformado uno de los
materiales preferidos en los primeros estudios
bioqumicos. Especficamente, la levadura invertasa
(Saccharomyces invertasa (SInv) )se convirti en una de
las enzimas modelo clsicas. Mitscherlich describi en
1842 la existencia en la levadura de una sustancia capaz
de invertir el azcar de caa dextrgiro en un azcar
levgiro que fue identificado en 1847 por Dubrunfaut
como una mezcla de glucosa y fructosa (Ec 1). En 1860,
por primera vez, Berthelot llev a cabo el aislamiento de
la invertasa . Algunos aos ms tarde, toda la teora de la
cintica enzimtica se bas en los resultados
experimentales obtenidos con la invertasa de levadura
(2), se ha descrito que la levadura produce dos tipos de
invertasa, codificada por una familia de genes SUC : una
forma secretada altamente glicosilada y una forma
intracelular no glicosilada (4, 5). La enzima es secretada
normalmente por la levadura como una protena
pesadamente glicosilada octamerica. La gran masa de la
protena conduce a que est atrapada en la pared celular
(10, 11). Tanto la forma citoplasmtica no glicosilada
como la forma secretada de la invertasa estn
codificadas por el mismo gen (8). Estas dos formas se
transcriben como dos mRNAs de diferente longitud, que
se traducen en polipptidos de diferentes tamaos.
Adems, el ms largo codifica el pptido seal necesario Fig 2. Estructura octamerica de Slnv. A, Octamero de Slnv
para la secrecin (12). describiendo las hojas plegadas (Izquierda) y describiendo la
representacin de superficie accesible a al disolvente (derecha)
mostrando cada subunidad. En B, se rota en un angulo de 90 lo que
ilustra que se puede describir mejor como un tetrmero de dos tipos
diferentes de dmeros, AB / CD y EF / HG,en C, sera necesaria una
Sobre la base de la similitud de secuencia, la invertasa se rotacin de 15 para sacar la subunidad E a la posicin A. Tres
clasifica dentro de la familia 32 de las hidrolasas regiones de la cadena polipeptdica actan como bisagras, que son de
color azul en D (izquierda). Las diferentes asociaciones de dmeros
glucsidas (13). La reaccin cataltica procede a travs producen diferencias de conformacin locales en la interfaz de
de la unin del nuclefilo aspartato a una unidad fructosil dmeros en regiones especficas representadas en rojo (A, B, C y D) y
verde (E, F, G y H). SInv se pliega en dos dominios, un propulsor \
del sustrato donante. El fructosilo se libera cataltico que se colorea de acuerdo con sus cinco hojas (I - V) y un
posteriormente por hidrlisis o se transfiere a un dominio C - terminal \ - sndwich formado por dos hojas
sustrato de azcar aceptor (transglicosilacin), Que antiparalelas \ de seis hebras (derecha). La posicin putativa de una
molcula de sustrato de 1 kestosa (fructooligosacarido) determinada
rodean una cavidad del sitio activo central por indiferencia estructural para mostrar el sitio cataltico se ve en
negativamente cargada. claramente en C y D.

La invertasa juega un papel crucial en metabolismo de

sucralosa y almidon de la Saccharomyces Cervesiae (Fig
XX, anexo) dando como producto un D-Glucosa y D-
fructosa (ec 1), Para ver el efecto que tiene un inhibidor
en la SInv, se necesita determinar la actividad de la
invertasa, la cual la podemos medir a travs de la
propiedad reductora de D-Glucosa, hacindola
reaccionar con 3,5-dinitrosalicilato (DNS), posteriomente
de la denaturacion de la invertasa, esta al reaccionar
genera mezcla de color naranjo oscuro. posteriormente
hay que definir los parmetros con los cuales se va a
trabajar, encontrar el pH y temperatura optima en la cual
la enzima presenta la mxima actividad posible, por
medio de una curva de saturacin, se debe de
determinar la Km y la Vmax, que son parmetros
cinticos que describen el comportamiento enzimtico
de la enzima respectiva. El inhibidor a estudiar es el
sulfato de cobre, del cual en la actualidad no se ha
descrito su mecanismo de inhibicin, sin embargo sin
embargo se especula acerca de la perturbacin del
centro cataltico mediante la coordinacin entre el catin
divalente Cu2+ y los residuos del bolsillo cataltico,
especficamente cistenas y metioninas, el objetivo
principal seria ver que efecto tiene el sulfato de cobre
sobre la invertasa reversa. La comprensin de cmo
funciona este inhibidor, podra ayudarnos a tener un
inhibidor para estudiar el metabolismo completo de la
sucralosa y almidn, viendo cmo se adapta cuando esta
enzima esta inhibida, por ello se postula que el inhibidor
en si es reversible, permitindonos distinguir entre tres
posibles mecanismos de inhibicin: competitivos, no
competitivos y no competitivos, los cuales seran
dilucidado al ver el cambio de comportamiento de Km y
Vmax de la SInv despus de agregar el Sulfato de cobre
en el grfico de doble recprocos.
Metodologa
La enzima invertasa fue aislada y extrada desde una
fuente comercial de Saccharomyces cerevisiae para la
elaboracin de productos fermentados. La aislacin de la
enzima es un paso necesario, ya que est viene asociada
a muchas otras protenas y polipptidos presentes en el
organismo, adems de otros productos similares que no
pertenecen al organismo en s, sino a agregados para
mantener la muestra estable en el tiempo
(conservantes). El proceso se lleva a cabo en 4 etapas las
cuales se basan en las propiedades fsicas y qumicas de
la enzima.
1.1 Purificacin
Se realiz una lisis de la pared celular del organismo, para
esto se mas 0,6g de levadura comercial liofilizado, se
traspas a un tubo Falcon y se aadi 10ml de una
solucin de NaHCO3 la cual se agit y luego incub a 35
en estufa por 15hrs.
Pasado el tiempo anterior se somete a una
centrifugacin por 30min a 15000rpm, una vez
terminada se rescata el sobrenadante, midiendo un
volumen aproximado de 0,8mL, el cual es considerado
como el extracto crudo. Del extracto crudo se toma una
alcuota de 500uL el cual se traspasa a un tubo Eppendorf
rotulando debidamente como AL1 para ser analizado
posteriormente.
1.2 Precipitacin con etanol
La precipitacin con etanol es una de las tcnicas ms
antiguas y efectivas en el proceso de purificacin, en
donde una gran cantidad de volumen puede volver a ser
concentrada para luego separar la protena deseada por
cromatografa (lo que se ver ms adelante)
La enzima se encuentra en un medio acuoso en forma
solvatada , el etanol se encarga de volver insoluble a la
protena para que precipite. Se calcul el volumen
deseada de etanol a utilizar para obtener un 24% de
concentracin, el cual resulto ser 3,27mL de etanol puro
los cuales se agregaron a los 0,8mL de sobrenadante
obtenidos en el paso 1.1. la cual se agit y se conserv a
una temperatura de 4C. Luego pasa a centrifugacin por
10min a 5000rpm y 4C. Se rescata nuevamente el
sobrenadante y se mide el volumen obtenido.
Ahora se procede a realizar una segunda precipitacin
con etanol. Esta vez es necesario obtener una
concentracin al 40% V/V de etanol por lo tal se adicion
un volumen de 2,4mL de etanol 100% a los 12mL de
sobrenadante. Una vez mezclado se agit y dej reposar
a temperatura ambiente por 15min.
1.3 Separacin de invertasa por cromatografa de
intercambio inico
En esta etapa se arma una columna de intercambio
inico improvisada usando un portaobjetos, un tubo
relleno de con DEAE celulosa y un control manual de paso
del extracto por la columna. Antes de usar se equilibr la
columna lavando con 10mL de tampn fosfato 5mM
1.4 Anlisis de muestra por ensayo invertasa
En este mtodo se seleccionarn las fracciones
recolectadas para medir su actividad usando DNS.
Este anlisis se basa en la actividad de los azucares
reductores (sacarosa en este caso) en donde en
presencia de DNS, con una base y calor ,son oxidados
cambiando su grupo CHO en COOH, esto se observa
por el cambio de color en la solucin.
Se prepar una serie de tubos de vidrio para las
fracciones seleccionadas obtenidas de los tubos
recolectados entre lavado y la elucin de la enzima.
1.5 Analisis espectrofotomtrico
Con las muestras de sacarosa y DNS ya preparadas en 3.0
se dejan a temperatura ambiente para luego medir su
absorcin a 570nm.
Este mtodo se basa en la Ley de Beers en donde la
absorbancia de una solucin es proporcional a los
productos (a.b.c). En donde a representa la constante de
absortibidad del soluto expresado en mM-1 o cm-1, b
define la distancia del paso de la luz en la cubeta (en este
caso se usaron cubetas de policarbonato de 1cm) y c es
la concentracin del soluto expresado en mM.
La absorbancia se midi utilizando un espectrofotmetro
a =570nm
1.6 Determinacin de protenas
1.7 Curva de calibracin de glucosa
En este paso se realiza una curva de calibracin, usando
glucosa de concentracin conocida para que sea el
estndar a comparar en los anlisis posteriores.
Se usaron glucosa 40mM y reactivo DNS, y se realiz un
protocolo de preparacin descrito en la siguiente tabla
=570nm para todos los tubos calibrando el
espectrofotmetro con el blanco.
1.8 Curva de calibracin por Mtodo de Bradford
Este mtodo se basa en una unin colorimtrica entre
azul de Coomassie G250 y una protena, la cual ser
albmina de bovino, formando una forma aninica
medible por espectrofotmetro a 590nm. Esta luego ser
usada como estndar para comparar respecto a la
invertasa presente en la muestra.
1.9 Cuantificacin de muestras
Se eligieron las tres muestras con mayor absorbancia de
tabla N de 3.1 las cuales deberan poseer la mayor
actividad enzimtica, estos son de origen de la elusin y
son los tubos 11 - 11,5 12, los cuales sern
renombrados en los resultados a E5, E6 y E7.
Adems, analizamos los extractos obtenidos en 1 y en 2.0
marcados como AL1 y AL2. La lectura se midi basando
en el rango de la curva de calibracin de glucosa.
1.11 Determinacin de la actividad invertasa
Utilizando el mtodo de DNS ya descrito se procede a
realizar un anlisis de la actividad cataltica de la enzima
midiendo su cantidad de glucosa producida desde
glucosa. Para esto se eligieron las elusiones E5, E6 y E7
con la mayor absorbancia y determinaremos cual es la
ideal para el resto del anlisis cuantitativo.
1.12 Determinacin de pH y temperatura optimas
En este anlisis se comparan distintas condiciones de
trabajo de pH y temperatura en donde la enzima alcanza
una actividad optima, as como tambin ocurre su
inactivacin por condiciones desnaturalizantes.
1.13 Efecto pH
Se determin la actividad enzimtica a diferentes pH,
utilizando los tampones correspondientes y 2.1 Concentracin de protenas
manteniendo todos los otros factores constantes.
1.14 Efecto temperatura
Se determin la actividad enzimtica a diferentes
temperaturas, destacando en especial en donde la
actividad enzimtica es la ptima.
1.15 Construccin curva de progreso
Se realiza este experimento utilizando diferentes
concentraciones de sustrato y manteniendo todo el resto
de los parmetros constantes, se obtiene la curva de
saturacin de la enzima, en la cual se grafica la velocidad
inicial v/s [S]. A partir de cada curva de progreso se puede
obtener un punto para la curva de saturacin.
1.16 Construccin curva de saturacin
Se dispuso de 8 tubos para probar distintas
concentraciones de sustrato y un tubo blanco. Al medir
la reaccin a los 10 minutos para cada tubo, estar
determinando los valores de Vi a cada una de las
concentraciones. Estos datos permiten construir una
Curva de Saturacin para la enzima. Esta curva de
saturacin permite obtener los parmetros cinticos de
invertasa utilizando los dobles recprocos.
Los ensayos de actividad se realizan de acuerdo a la
metodologa realizada para la curva de progreso, a
diferentes concentraciones de sustrato de acuerdo a la
(ver anexo):
Repitiendo el procedimiento anterior con DNS se mide
nuevamente la absorbancia obtenida a 570nm para
luego armar la curva en resultados.
1.17 Efecto de la concentracin de enzima
Se determin el efecto de la concentracin de la enzima
sobre su actividad manteniendo el resto de los factores
constantes (pH, temperatura, etc)
Se prepararon una serie de tubos con tampn acetato
0,5M (pH 5), sacarosa 0,4M y reactivo DNS.
Una vez preparados de acuerdo al protocolo se midi su
absorbancia respectiva a 570nm
1.18 Efecto de los inhibidores
Se determin el efecto de los inhibidores en la actividad
enzimtica, en este caso se trabaja con CuSO4 en 3
condiciones que influyen en la curva de saturacin,
comparando el efecto de la actividad enzimtica sin
presencia de CuSO4, con leve presencia de CuSO4 y con
sobresaturacin de inhibidor.
Estas mediciones se hicieron midiendo ABS de reactivo
con DNS y azcar reductor.
Resultados
Las concentraciones estimadas para las distintas
soluciones AL1, AL2, E5, E6 y E7 (descrito en materiales y
mtodos) fueron interpolados en el grafico obtenido con
BSA (ver Figura 1). Los resultados obtenidos nos entregan
una estimacin de la concentracin de proteinas totales
presentes en cada alcuota (Tabla N1), usadas para
confeccionar la tabla de purificacin.
2.2 SDS-PAGE y Western Blot
Se identificaron levemente dos bandas en Western Blot
en 100kDa y 130kDa indicado en flechas amarillas en
SDS-PAGE y WB que nos indican la presencia de invertasa
en forma de monmero (figuras 4A Y 4B)

2.3 Determinacin de actividad de invertasa y tabla de

purificacin
Mediante el agente oxidante DNS frente a la glucosa
reductora se midi la actividad enzimtica de la invertasa
en las soluciones AL1, AL2, E1, E2 y E3. Las mediciones
espectrofotomtricas y los clculos de las actividades se
resumen en la tabla N2

Fig.1: Curva de calibracin realizada con el mtodo de Bradford

con solucin de BSA. La absorbancia medida a 570nm indica la
densidad ptica de la solucin. Las concentraciones de AL1, AL2,
E5, E6, E7 se interpolan en la curva

Figura 2B: Western Blot correspondiente a la elucin purificada, se

seala con flechas en amarillo el sector donde debera encontrarse las
bandas marcadas por la inmunodeteccin correspondiente a SInv. A la
izquierda se muestra los pesos moleculares correspondientes a los
marcadores.

Tabla N1: Tabla que muestra la cantidad de protena en cada

alcuota obtenida y adems la actividad enzimtica presente en
cada una producto de la invertasa

[Enzima] mM Absorbancia [Glucosa] V ([P]/min)

0 0 0 0
25 0,493 17,0761246 1,70761246
50 0,989 34,2387543 3,42387543
100 1,547 53,5467128 5,35467128 Figura 3: Curva de saturacin obtenida por actividad de DNS a
150 1,903 65,8650519 6,58650519 distintas concentraciones de SInv. Se describe una relacin lineal
200 2,154 74,550173 7,4550173 de proporcionalidad.

Tabla N2: Velocidades iniciales de las curvas de progreso.

Obtenidas a distintas concentraciones de enzima posteriormente
utilizadas para la construccin del grafico de saturacin y del doble
reciproco.
Figura 4B: Curva de actividad enzimtica SInv en tiempo 0 en
funcin de la temperatura. Se manifiesta un pick a una
temperatura de 60C correspondiente a la temperatura optima de
catlisis enzimtica

Figura 5: Grfico de los dobles recprocos. obtenida por la

actividad de la invertasa sobre el sustrato a distintas.
Concentraciones.
Materiales y mtodos: (Max.3 pag)

Resultados y discusin. (max. 8 pag)

Conclusiones: MW, Ph OPTIMO Km

Bibliografia

Una nueva aplicacin potencial es la sntesis de

fructooligosacridos prebiticos usados en alimentos
funcionales y formulaciones farmacuticas (23). El uso
de prebiticos para orquestar la composicin
microbiana intestinal, con el beneficio asociado para la
salud humana, es un tema emergente de gran inters
biotecnolgico (24).