TCNICAS BIOQUMICA

Ciudadela Universitaria Km. 7 Va Puerto Colombia,

Barranquilla, Colombia.

Facultad de Ciencias Bsicas

El objeto de la Bioqumica es estudiar la composicin qumica de los seres vivos, las relaciones
entre dichos materiales, sus transformaciones, la regulacin y el funcionamiento de estos procesos y
las repercusiones que tienen en la fisiologa de los organismos.

El estudio de las clulas a un nivel molecular se ha realizado de manera indirecta con la ayuda de
instrumentos y tcnicas que permiten percibir lo que ocurre dentro de la clula.Se pueden llevar
diferentes tipos de estudios: con un animal entero, rganos aislados, cultivos de tejidos y de clulas,
orgnulos celulares, estudios moleculares.

-Animal entero: por ejemplo, estudiar el efecto de una dieta determinada en la evolucin del peso
del animal, la actividad termognica, la composicin corporal.

-rganos aislados: experimentos in situ o in vitro que permiten un control ms fino de las
condiciones experimentales. Se extirpa el rgano y se mantiene en un medio de incubacin
controlando las concentraciones de nutrientes, hormonas, temperatura, y se aaden diferentes
compuestos para estudiar sus efectos.

-Cultivos de tejidos y clulas: se disgrega el tejido y se deja crecer y diferenciarse. Pueden ser
cultivo de rganos, de explantes primarios y de clulas. Existen lneas celulares inmortales,
procedentes de un tumor.

-Orgnulos celulares: se lleva a cabo un fraccionamiento celular en condiciones en que no se

rompan los orgnulos celulares que se han de aislar posteriormente. En la homogenizacin se
emplean medios mecnicos y compuestos que facilitan el proceso.

-Estudios moleculares: se aislan las molculas a partir de homogeneizados de diferentes tejidos.

Estudios de efectores alostricos sobre actividades enzimticas, estructura por difraccin de rayos
X.

Fundamentos de los mtodos bioqumicos

Los mtodos para la determinacin de las molculas biolgicas se basan en las caractersticas
diferenciales de las mismas; propiedades qumicas, fsicas y bioqumicas. En el caso de que la
sustancia buscada no presente ninguna propiedad que permita su deteccin, se le puede hacer
reaccionar con alguna sustancia que le confiera una caracterstica como color, precipitar...

Una vez aislado el grupo de molculas de inters se aplican tcnicas separativas.

La cuantificacin de una biomolcula consiste en medir una caracterstica que sea proporcional a la
cantidad de molculas que haya, como color, radiactividad, funcin enzimtica.

Mtodos qumicos

Algunas molculas absorben radiacin electromagntica en la regin del ultravioleta-visible, de

forma que la absorcin sirve para su cuantificacin.

Otras veces hay que emplear un reactivo en exceso que reaccionar con la molcula para
proporcionarle color, fluorescencia, radiactividad y permitir cuantificar el producto formado.

Mtodos fsicos

A veces las propiedades qumicas no son lo suficientemente especficas para aislar una molcula.
Por ejemplo, un aminocido concreto en presencia del resto de aminocidos. Existen tcnicas
separativas que se fundamentan en las propiedades fsicas como solubilidad, polaridad, punto
isoelctrico.

Mtodos enzimticos

Para un enzima, una forma de cuantificacin es medir la cantidad de funcin, dado que son
especficas de reaccin y sustrato. Se mide la aparicin de producto o bien la desaparicin de
sustrato en funcin del tiempo, que es la velocidad de reaccin, directamente proporcional a la
cantidad de enzima presente.

Las enzimas tambin pueden utilizarse como sistema de marcaje alternativo a la radiactividad, por
ejemplo produciendo color o luminiscencia al suministrarle un sustrato adecuado.

Mtodos inmunolgicos

La diferencia entre todas las protenas radica en su configuracin tridimensional, que es reconocida
por los anticuerpos. Es necesario un sistema de deteccin posterior a la reaccin inmunolgica
Mtodos de hibridacin

Los cidos nucleicos son difciles de determinar por las tcnicas anteriores. Difieren en la secuencia
de nucletidos. Se utilizan sondas, o fragmento de ADN complementario a un segmento de un cido
nucleico determinado, para realizar el reconocimiento especfico. Tambin en este caso es necesario
un sistema de marcaje que permita la cuantificacin del cido nucleico.

Valoracin de los mtodos analticos:

Viabilidad de un mtodo: Hace referencia a la posibilidad de llevarlo a cabo, en funcin de sus

problemas de seguridad, el tiempo de procesamiento de las muestras y la disponibilidad de
instrumentacin adecuada.

Precisin y exactitud: permiten medir por un lado la concordancia en la repeticin de las medidas, y
por otro, lo correcta que es la determinacin, es decir, lo prxima que est al valor real.

Sensibilidad y especificidad: la sensibilidad hace referencia al lmite de deteccin, la cantidad

mnima de sustancia que puede ser cuantificada por ese mtodo. La especificidad indica la
capacidad para medir nicamente la sustancia de inters, sin interferencia de otras que se
encuentren en la muestra. Si se usa un mtodo demasiado sensible el resultado es menos preciso,
debido a que la muestra ha de diluirse con un factor de dilucin muy grande, por lo que pequeos
cambios en la lectura del mtodo se traducen en grandes cambios en la concentracin final.

Extraccin y purificacin de molculas biolgicas

La extraccin supone un tratamiento mecnico del tejido en un medio lquido tamponado. La

homogenizacin puede ser total (tratamiento enrgico) o limitada (tratamiento suave).

Para la homogenizacin total se emplean morteros de cermica, mezcladores de cuchillas, como

batidoras, o bien homogenizadores de mbolo, empleados con cultivos celulares o para mejorar la
extraccin realizada con los sistemas anteriores. Los politrones combinan la rotacin de cuchillas
con la creacin de vaco y ultrasonidos. Dan extractos muy finos.

La homogenizacin limitada se consigue mediante ensayo y error. Se ajustan las condiciones para
obtener el rendimiento deseado. Requiere una puesta a punto.
Para obtener clulas a partir de un tejido se emplea la digestin enzimtica, por ejemplo para
obtener protoplastos a partir de tejido vegetal (celulasa). Es un proceso ms lento y ms caro que la
homogenizacin.