El destino de las nanopartculas de plata en las aguas

residuales y los efectos inmunotxicos en la trucha arco iris

A. Bruneau, ,
P. Turcotte ,
Sr. Conductor ,
F. Gagn ,
C. Gagnon,
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http://doi.org.hemeroteca.lasalle.edu.co/10.1016/j.aquatox.2016.02.013
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Reflejos

AGNPS apareci como pequeos agregados no cargados en aguas

residuales despus de la exposicin 96 h.

Disuelto Ag + era biodisponible en el efluente diluido y el estrs oxidativo

inducido.

AGNPS en las aguas residuales eran biodisponibles para los peces y

producen efectos nocivos.

Abstracto
Las nanopartculas de plata (AGNPS) se utilizan actualmente en la
tecnologa, la medicina y productos de consumo, a pesar de que el destino y
los riesgos ecotoxicolgicos sobre los organismos acuticos de estos nuevos
materiales no son bien conocidos. El propsito de este estudio fue investigar
el destino, la biodisponibilidad de AGNPS y sus efectos sobre los peces en
presencia de efluentes municipales. Trucha arco iris juveniles se expusieron
durante 96 h a 40 g / L de AGNPS o 4 g / L de plata disuelto (AgNO 3 ) en
diluido (10%) de aguas residuales municipal. Plata (Ag) se midieron las
concentraciones tanto en muestras de agua y tejidos de los peces (hgado y
branquias). La toxicidad fue investigado por los siguientes parmetros
inmunolgicos en el pronefros (viabilidad, la fagocitosis) y biomarcadores en
el hgado y branquias (actividad de la ciclooxigenasa, la peroxidacin de
lpidos, glutatin-S-transferasa, metalotionenas, roturas de la cadena de
ADN y zinc lbil). Los resultados indicaron que AGNPS apareci como
pequeos agregados no cargados en las aguas residuales (11,7 1,4
 nm). En branquias, la exposicin a AGNPS indujo modificaciones
morfolgicas sin bioacumulacin nanopartcula visible. Disuelto Ag + era
biodisponible en el efluente diluido y el estrs oxidativo inducido
(peroxidacin lipdica), zinc lbil y una disminucin marginal en la superxido
dismutasa en branquias de los peces. Ag + tambin aument
significativamente los niveles de metalotionena y se inhibe la actividad de
reparacin del ADN en el hgado. Finalmente, se encontr que las dos formas
de plata en el hgado y se inducen inmunosupresin y la inflamacin
(aumento de la actividad de la ciclooxigenasa). Este estudio demostr que
ambas formas de Ag producen efectos nocivos y AGNPS en las aguas
residuales eran biodisponibles para pescar a pesar de su formacin de
agregados.

Palabras clave
nanotoxicidad ;
El destino de nanopartculas ;
De iones de plata ;
La trucha arco iris ;
aguas residuales ;
biomarcadores

1. Introduccin
Las nanopartculas de plata (AGNPS) son ampliamente utilizados en la
tecnologa, la medicina y productos de consumo. Se fabrican por sus
propiedades antimicrobianas ( Dos Santos et al., 2014 ). Sus propias
propiedades, con una alta relacin de rea de superficie, podran modificar la
toxicidad Ag y clasificarlos en una categora especfica de contaminantes
( NRC, 2012 ). En una encuesta de 2010, 1000 productos de consumo
incluyen AGNPS ( Massarsky et al, 2014A. ; Proyecto sobre Nanotecnologas
Emergentes, 2013 ). Aunque hay un uso habitual de plata (Ag), el creciente
uso de AGNPS plantea nuevos problemas de seguridad. AGNPS pueden
entrar en el medio ambiente acutico a travs de lavado de ropa tratadas y la
liberacin de productos, tales como ropa, cosmticos, pasta de dientes,
jabones y contenedores de alimentos ( Benn y Westerhoff, 2008 ; Ribeiro et
al , 2014. ). Debido a su creciente uso comercial, estn garantizados
preocupaciones legtimas sobre la liberacin y los impactos de AGNPS a los
ecosistemas acuticos.
Pocos estudios sobre el comportamiento de AGNPS en plantas de
tratamiento de aguas residuales (EDARs) se encuentran en la literatura. La
mayora de AGNPS entradas de productos de consumo basados produce a
travs de la liberacin en aguas residuales que alcanza plantas tratadas de
aguas residuales ( Kaegi et al., 2011 ). En Alemania, la liberacin intencional
o accidental de partculas de plata a nanoescala Ag-NPs se midieron en el
efluente tratado (12 ng / L) para una carga AgNP estimada de 4,4 g / da
( Siripattanakul-Ratpukdi y Frhacker, 2014 ; Li et al , 2013. ). Segn Blaser
et al. (2008) Los residuos de Ag de Europa, Asia y Amrica del Norte
alcanzaron 190-410 t / ao y entre 11.5 a 31.7% de esos residuos pasaron
por EDARs y se encontraron en la recepcin de las aguas naturales. Una
proporcin significativa (aproximadamente 10%) de los AGNPS que entran en
los WWTPs pasado por el proceso de tratamiento y son liberadas por su
efluente ( Gottschalk et al , 2009. ; Limbach et al ., 2008 ).
En el agua natural, AGNPS podran transformarse a travs de diferentes
procesos, tales como oxidacin, reduccin, disolucin, sulfuracin, la
agregacin y adsorcin ( Lowry et al., 2012 ). Estas transformaciones tienen
una influencia en la persistencia, la movilidad y la biodisponibilidad de los
AGNPS ( Lowry et al., 2012 ). En el agua natural, la materia orgnica natural
(NOM) podra estabilizar las nanopartculas (NPS) manteniendo as en
estado no agregado ( Lowry et al , 2012. ; Cumberland y plomo,
2009 ). Monovalente Ag + podra unirse a polianiones orgnicos, tales como
cidos hmicos y flvicas ( King y Jarvie, 2012 ). Por otra parte, las
sustancias hmicas tambin podran proporcionar depsito a largo plazo para
NPs y mantenerlas en la columna o la superficie del agua durante ms de
distancia grande ( King y Jarvie, 2012 ). En wasterwaters, se espera que
AGNPS ser sulfurados y formar Ag 2 S en el sistema no aireado, mientras que
en los sistemas aireados que seran inestables con una vida media de
degradacin de das a semanas ( Kaegi et al , 2011. ; Lowry et al . ,
2012 ). Kaegi et al. (2011) tambin encontr que 10% de Ag metlica (Ag 0 ) a
partir de AGNPS se encontr en el efluente.
AGNPS se demostr que la citotoxicidad causada, el estrs oxidativo, el dao
(peroxidacin de lpidos), la reduccin de la actividad mitocondrial, y la
genotoxicidad ( Gagn et al , 2012. ; Scown et al , 2010. ; Braydich-Stolle et
al ., 2005 ; Arora et al . , 2008 ; Fabrega et al , 2011. ; Bruneau et al .,
2015 ). AGNPS tambin pueden unirse a las membranas celulares y afectar
permeablity y la funcin respiratoria de las clulas por la disminucin de la
Na + / K + ATPasa ( Morones et al., 2005 ). La toxicidad de AGNPS se asoci
en parte a la liberacin de Ag inica y NPs inducidas efectos de impedimento
estrico que podra conducir a la degradacin de protenas, dao del ADN y
peroxidacin de lpidos ( Gagn et al., 2013 ).
La primera lnea del sistema inmune peces es la capa de moco encontrado
en la superficie de las branquias, la piel y los intestinos ( Jovanovi y Pali,
2012 ). Acta como una barrera de blindaje a los peces de la invasin
microbiana mediante el uso de lisozima, lectinas, inmunoglobulina M (IgM) y
otras enzimas proteolticas ( Bols et al., 2001 ). Esta capa puede tambin
NPs trampa, modificar sus propiedades de carga de superficie y disminuir su
tasa de penetracin ( Prctico et al , 2008. ; Jovanovi y Pali, 2012 ). La
segunda lnea del sistema inmune de los peces es el pronefros. Est
implicado en es decir hematopoiesistic, que participan en la maduracin de
los neutrfilos y macrfagos y sirve como un depsito de neutrfilos ( Zapata,
1979 ). NPs se puede internalizado en el compartimiento endolysosomal y
devorados aunque diferentes procedimientos de acuerdo con su
tamao. Pequeas NPs (hasta 100 nm) son preferentemente interiorizados
aunque calveolae mediada y la endocitosis mediada por clatrina, mientras
que NPs con un tamao 500 nm se envolvi aunque receptor mediada por
fagocitosis o macropinocitosis ( Dobrovolskaia y McNeil, 2007 ; Bartneck et
al ., 2010 ; Jovanovic y Palic, 2012 ). Macropinocitosis podra ser la
principal ruta de absorcin de NPs agregados ( Bartneck et al., 2010 ). Por
otra parte, la carga superficial promueve la inmersin de los PN. Walker y
Parsons (2012) demostraron que los NPs con ya sea positiva o negativa
carga superficial pero no tanto para NPs neutros activan la actividad de
fagocitosis ( Dobrovolskaia et al , 2008. ; Zahr et al , 2006. ).
Cuando las clulas se exponen a AGNPS, se producen especies de oxgeno
reactivas (ROS). Este proceso es causado en parte por la forma y la
inflamacin proceso Ag inico liberado. El ROS tales como aniones
superxido, perxido de hidrgeno y el dao oxidativo causa radical hidroxilo,
citotoxicidad y el dao del ADN ( Griffitt et al., 2013 ). Durante el estallido
oxidativo, se incrementan mecanismo de defensa y de metal libre de ligandos
del organismo, tales como tioles. Adems, los tioles de unin y
metalotionenas que son protenas ricas en cistena, se han reconocido de
aumentar la captacin de Ag +de AGNPS en el hgado de truchas expuestas a
las aguas superficiales ( Gagn et al., 2012 ).
El propsito de este estudio fue determinar el destino y los efectos de
AGNPS y Ag +(como nitrato de plata-AgNO 3 ) en la trucha arco iris, como
modelo animal, despus de la exposicin in vivo en las aguas residuales
diluida. Las concentraciones de Ag se determinaron en agua y en tejidos de
peces para evaluar la biodisponibilidad de cada forma de plata. Se realizaron
parmetros inmunolgicos y biomarcadores en el hgado y branquias para
evaluar la toxicidad de las dos formas de Ag despus de una exposicin
ambiental. AgNO 3 se eligi para comparar los efectos de la forma disuelta
con AGNPS. Disuelto Ag es letal para los organismos acuticos en una
concentracin de 20 g / L ( Griffitt et al., 2008 ). Una concentracin subletal
de disuelto Ag + fue elegido en este estudio corresponde aproximativamente a
la Ag lbil de la AgNP.

2. Materiales y mtodos
2.1. Plata
Una solucin madre de PELCO AGNPS NanoXact de Ted Pella Inc se
utiliz (California, EE.UU.). De acuerdo con las especificaciones del
fabricante, los AGNPS tener un tamao medio de 22 2 nm, se suministra en
2 mM de tampn de citrato, pH 7,4 y tienen un potencial zeta de -50 mV. Para
los experimentos de exposicin con AGNPS, una concentracin de 40 g / L
total de Ag se prepar en el 10% del efluente municipal tratada fsica y
qumicamente. El nitrato de plata (AgNO 3 ) (Sigma-Aldrich, ON, Canad) se
dispers directamente en el tanque de peces a una concentracin de 4 g / L.

2.2. Pescado
Trucha arco iris hembra juvenil ( Oncorhynchus mykiss ) (media cabeza a la
longitud tenedor 121,3 5,5 mm; peso medio 24,3 2,8 g) fueron
proporcionados por un criadero local (Pisciculture des Arpents-Vert, Ste-
Edwidge, Qc), mantenido en 1000- tanques L a 15 C, alimentados
diariamente con una comida comercial de trucha durante 2 semanas y
mantenidos bajo un fotoperodo naturales (12 h de luz: 12 h de oscuridad)
antes de los experimentos de exposicin.

2.3. La exposicin a efluentes municipales diluidos y plata

Una muestra de agua residual de material compuesto se obtuvo en
noviembre de 2.013 mil forma el Montreal PTAR. El agua residual de la
exposicin se diluy 1:10 (v: v) en agua del grifo procedente de la ro St.
Lawrence que fue sin cloro y UV tratado ( Tabla 1 ). De carbono orgnico total
(TOC) y las concentraciones de carbono orgnico disuelto (DOC), as como
el pH y la conductividad se midieron al principio y al final de la exposicin
( Tabla 1 ). La contaminacin por metales del efluente Montreal se document
previamente por Gagnon et al. (2006) y el cobre y zinc eran los metales ms
acumulados en mejillones enjaulados expuestos a la pluma de dispersin de
aguas residuales.
Tabla 1.
Las caractersticas fsicas y la concentracin de carbono orgnico total (TOC) y carbono
orgnico disuelto (DOC) en el agua de control utilizado para la prueba de exposicin
experimentos. Las muestras fueron no expuestos a la plata.
agua de control TOC (mg/L) DOC (mg/L) pH Conductividad (mS / cm)
Agua del grifo 2.33 2.03 7.45 290
Aguas residuales 30.3 21.4 7.7 683
10% efluente, T = 0H 7.7 3.44 7.55 273
10% efluente, T = 96H 10.3 8.4 8.45 340
opciones de la tabla
Ocho trucha se colocaron en cada uno de 20 recipientes L forrados con
bolsas de polietileno y expuestos a 10% de aguas residuales con AGNPS (40
g / L), plata disuelto (AgNO 3 ) (4 g / L) o sin contaminante aaden. Los
controles son 10% de agua efluente diluido en agua del grifo. Los peces
fueron monitoreados diariamente para detectar cualquier signo de malestar o
cambios en el comportamiento de la natacin y respiracin. El oxgeno
disuelto se mantuvo por encima del 80%, pH entre 7.5 a 8.6, y la temperatura
a 15 C durante la exposicin. El agua no fue renovado durante el
experimento. Despus de un perodo de exposicin de 96 h, los peces fueron
sacrificados con un 0,1% de MS-222 (Sigma-Aldrich, ON, Canad) con el
Consejo Canadiense para el Cuidado de Animales mtodos. Pronefros se
mantuvo para las medidas de parmetros inmunolgicos. El hgado y
branquias se recogieron inmediatamente, se pesaron y se almacenaron a -80
C para anlisis bioqumicos posterior y qumicas.

2.4. caracterizacin AgNP

2.4.1. Microscopa electrnica de transmisin (TEM) y el anlisis de rayos X
de electrones dispersiva (EDS)
Se recogi una muestra de AGNPS en 10% de las aguas residuales despus
de 96 h y se mantuvo a 4 C. Las muestras, as como la solucin madre
fueron observadas por TEM no ms de 3 das despus del final de la
exposicin. Una gota de medio de exposicin fue colocado en una rejilla de
cobre cubiertas con una pelcula de carbono de encaje para el anlisis
TEM. Una vez que la muestra fue deshidratada durante unos pocos minutos,
se examin por TEM (JEOL, 2100-F modelo) operado a 200 kV para la
captura de imgenes en el fondo claro. Para cada imagen TEM, se realiz un
anlisis de rayos X de electrones dispersiva (EDS) para la composicin de
elemento de partculas orientadas.

2.4.2. Dispersin dinmica de la luz

NPs tamao hidrodinmico y el potencial zeta se midieron utilizando
dispersin dinmica de luz (DLS) (Brookhaven Instrument Corp., ZetaPlus /
Bl-PALS) en una solucin de reserva y agua expuesta. AgNP solucin madre
tambin se diluy 1/10 con agua destilada antes de la medicin en el
DLS. Cada muestra de agua se filtr previamente en un 450 de membrana
nm mediciones anteriores.

2.4.3. anlisis de distribucin de tamao por filtracin y ultrafiltracin

AGNPS se caracterizan por su distribucin de tamaos por un procedimiento
descrito anteriormente en Bruneau et al. (2013) . Brevemente, los AGNPS se
fraccionaron mediante microfiltracin y ultrafiltracin utilizando un gradiente
de tamao de porosidad de la membrana decreciente. Una submuestra de
250 ml de suspensin de AgNP en cada tipo de agua se filtr primero en 450
nm membrana hidrfila PTFE (FHLC04700, Millipore) y 40 ml continuacin,
se muestrearon para la determinacin total de Ag. El filtrado 450 nm se hizo
pasar a travs de las membranas de tres tamaos de poro diferentes en
paralelo: 100 nm isopore hidrfilo membrana de policarbonato (VCTP04700,
Millipore) y 50 nm membrana de ster de celulosa mixto (VMWP04700,
Millipore) y 25 de la membrana de ster de celulosa mixto nm (VSWP04700,
Millipore ) siguiendo por etapas de ultrafiltracin de flujo tangencial.
Una celda de ultrafiltracin con agitacin constante se utiliz (sistema Amicon
400, Millipore) para la ultrafiltracin con 1,5 nm de tamao de filtro calculado
(mm dimetro YM176, 1 kDa de corte). La presin en el sistema se mantuvo
constante a 70 psi, 20 C, 40 ml, 32 2 min. Esta etapa de ultrafiltracin se
consider para proporcionar la fraccin realmente disuelto de
Ag. concentraciones de Ag se evaluaron con una espectrometra de masas
con plasma de iones acoplada (XSERIES 2 ICP-MS, Thermo Scientific,
EE.UU.). El lmite de deteccin de funcionamiento es de 10 ng / L y el lmite
instrumental es 3 ng / L. concentraciones de exposicin se expresaron como
Ag totales en g / L que se midi en los tanques de exposicin.
2.5. biodisponibilidad de plata
Los hgados y branquias de los peces fueron muestreados individualmente,
se pesaron y se congelaron a -80 C antes del anlisis. Los tejidos fueron
digeridos con 8 ml de HNO3 concentrado (67-70%), 1 ml de HCl concentrado
(32-35%), y 2 ml de H concentrado 2 O 2 (30-32%) aadidas en ese
orden. Los tejidos fueron digeridos durante 2 h con un programa de
temperatura de rampa (mximo 180 C) utilizando un sistema de digestin
por microondas (Ethos EZ, Milestone ScientificInc, ON, Canad). A
continuacin, cada muestra de tejido digerido se coloc en un tubo de 15 ml y
el volumen final se ajust a 12 ml con agua desionizada. La concentracin
total de Ag se determin por el ion acoplados a espectrometra de masas de
plasma (ICP-MS, xSeries 2 ICP-MS, Thermo Scientific, EE.UU.).

2.6. captacin branquias de AGNPS

Despus de la exposicin 96 h, arcos branquiales se diseccionaron y se
fijaron en una solucin de 2,5% de glutaraldehdo (Electron Microscopy
Sciences, PA, EE.UU.) en tampn cacodilato de sodio 0,1 (Electron
Microscopy Sciences, PA, USA) durante la noche a 4 C. Las muestras se
lavaron tres veces con tampn de cacodilato de lavado de sodio 0,1 M
(Electron Microscopy Sciences, PA, EE.UU.) durante 1 h. Las muestras
fueron luego despus de la fijada en 1% de solucin de tetrxido de osmio
(Mecalab, QC, Canad) con ferrocianuro de potasio acuoso al 1,5% durante
2 h. A continuacin, las muestras se lavaron 3 veces con el tampn de lavado
durante 15 min. Las clulas se deshidrataron en concentraciones crecientes
de acetona (Fisher Scientific): 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, y tres veces en
100% para cada uno de 8-15 min. A continuacin, las muestras se infiltraron
con Epon (Mecalab, QC, Canad) / mezcla de acetona. Las muestras fueron
embebidas con etiquetas apropiadas entonces polimerizados en un horno de
60 C durante 48 h. corte transversal se hicieron en los filamentos
branquiales. Las secciones se recortan y se cortan en secciones gruesas 90-
100 nm con UltraCut E ultramicrotomo (Reichert-Jung, NY, EE.UU.) por el
que sobre una rejilla de cobre de malla 200 (Electron Microscopy Sciences,
PA, EE.UU.). Por ltimo, las secciones se tieron con acetato de uranilo
(Electron Microscopy Sciences, PA, EE.UU.) durante 8 min, a continuacin, el
plomo de Reynold (Electron Microscopy Sciences, PA, EE.UU.) durante 5
min. Las secciones se analizaron con FEI Tecnai 12 120 microscopio
electrnico de transmisin kV (TEM) equipado con una cmara de AMT
XR80C 8 megapxeles CCD. Para el anlisis de rayos X de electrones y
dispersin, secciones con el mismo espesor se colocaron sobre una rejilla
recubierta de carbono. EDS se realizaron en la foto con un Philips CM200
TEM 200 kV equipado con Gatan Ultrascan 1000 2k x 2k de la cmara CCD
Sistema Modelo 895 y EDAX Gnesis EDS.

2.7. los parmetros inmunolgicos

Parmetros inmunolgicos se realizaron en leucocitos de peces de acuerdo
con un mtodo adaptado de Brousseau et al. (1998) . Brevemente, los
leucocitos extrados de los pronefros se recogieron despus mediante
centrifugacin de un gradiente de Percoll 51% (Sigma-Aldrich, ON, Canad)
a 400 g, 30 min, 20 C. Despus de lavar los pasos de la relacin en vivo a
las clulas muertas se evalu mediante exclusin de azul de tripano
colorante bajo un microscopio con un hemocitmetro y super 90%.
Viabilidad de las clulas inmunes se realiz de acuerdo con un mtodo
adaptado de Brousseau et al. (1998) . Las clulas en una concentracin de 2
millones / ml se incubaron en luz oscura durante 18 h a 15 C por
duplicado. Despus de la incubacin, las clulas se lavaron y se
resuspendieron en Roswell Park Medios Institute (RPMI) que contena 10%
de FBS, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y HEPES 10
mM. La viabilidad se observ por citometra de flujo usando yoduro de
propidio (PI; Sigma-Aldrich, ON, Canad). Fluorescencia PI para cada
muestra se midi por duplicado con un citmetro de flujo equipado con una
excitacin lser de argn ( = 488 10 nm) (Guava EasyCyte, Millipore,
EE.UU.) a 625 42 nm, y se registraron 5.000 eventos.
La actividad fagoctica de los macrfagos se midi siguiendo el protocolo
de Brousseau et al. (1998) . Brevemente, se aadi 1 ml de concentracin
celular ajustado (2 millones / ml) a los cultivos 24 celulares recubiertas placa
de pocillos por duplicado. Las clulas se incubaron con un 100 ratio: 1 de
perlas de ltex fluorescentes (Polysciences, PA, EE.UU.) con el fin de
observar la capacidad de fagocitosis de las clulas. Despus de un perodo
de incubacin de 18 h a 15 C, las suspensiones de clulas se cubrieron con
un gradiente y se fijaron en formaldehdo al 0,5% y azida sdica al 0,2% en
una solucin de PBS (Sigma-Aldrich, ON, Canad). Fluorescencia Latex
grano se midi con un Guava EasyCyte (Millipore, EE.UU.) por duplicado a
530 nm 42 nm de ancho de banda, y se registraron al menos 10.000
acontecimientos. La actividad inmunolgica se define como el nmero de
clulas que contienen una o ms cuentas y la immunoefficiency como el
nmero de clulas que contienen tres o ms perlas.

2.8. biomarcadores bioqumicos

Hgado y branquias congeladas se homogeneizaron de acuerdo utilizando un
triturador de tejidos de tefln mano de mortero durante 20 s en tampn de
homogeneizacin enfriado con hielo (10 mM Hepes-NaOH, pH 7,4 que
contiene NaCl 140 mM, ditiotreitol 1 mM y 1 mg / ml de aprotinina). Se
tomaron alcuotas de las muestras para la peroxidacin lipdica (LPO),
roturas de la cadena de ADN, y las determinaciones de protenas
totales. Otra parte del homogeneizado se centrifug a 15.000 g durante 20
min a 4 C (S15). El sobrenadante de cada muestra fue tomada para el zinc
lbil (Zn lbil), metalotionenas (MT), la actividad de la ciclooxigenasa (COX),
glutatin S-transferasa, la superxido dismutasa (SOD), y protenas
determinaciones.
LPO se determin de acuerdo a la metodologa de cido tiobarbitrico
(TBARS) usando el ensayo de microplaca ( Wills, 1987 ; Gagn,
2014 ). Reactivos del cido tiobarbitrico se detectaron por la fluorescencia a
540 nm de excitacin y 590 nm de emisin. Los datos se expresaron como g
TBARS / mg de protenas. Roturas de la cadena de ADN se determinaron
usando la precipitacin alcalina de oliva (1988) con la deteccin de cadenas
de ADN basada en fluorescencia. Cadenas de ADN se detectaron utilizando
el colorante Hoechst a 360 nm de excitacin y 460 nm de emisin (Synergy
4, BioTek, EE.UU.). La cuantificacin de ADN se midi con soluciones
estndar de ADN de esperma de salmn. Los datos se expresaron como
ADN ug / mg de protenas.
Se detectaron niveles de lbil Zn en la fraccin de S15 por una metodologa
de sonda de fluorescencia ( Gagn y Blaise, 1996 ). La lectura de
fluorescencia se tomaron a 360 nm de excitacin y 460 nm de emisin en un
lector de microplacas (Synergy 4, BioTek, EE.UU.) y calibrado con soluciones
estndar de sulfato de zinc. Los datos se expresaron como protenas ng de
zinc equivalentes / mg. El glutatin S-transferasa (GST) se determin una
metodologa espectrofotomtrica usando 2,4-dicloronitrobenceno como el co-
sustrato y reduce GSH como se describe en otra parte ( Gagn, 2014 ). Los
datos se expresaron como el incremento en la absorbancia a 340 nm / min /
protenas totales. La actividad de la superxido dismutasa (SOD) se
determin usando un generador de superxido qumica de aniones ( Ewing y
Janero, 1995 ). El principio del ensayo consiste en la capacidad de SOD para
evitar la reduccin de la colorimtrico de colorante p -iodonitrotetrazolium en
presencia de una mezcla equimolar de metosulfato de fenazina y reducida
NADH (generador de superxido). Los datos se expresaron como unidades
de absorbancia / min / mg de protenas. La actividad de la ciclooxigenasa
(COX) en hepatocitos se midi de acuerdo con el protocolo de Gagn
(2014) . La actividad de la enzima COX aumenta la oxidacin del cido
araquidnico y cicloendoperxido producido. El ensayo mide la eliminacin
de cicloendoperxido por la peroxidasa y el sustrato diclorofluorescena. Las
lecturas de fluorescencia se tomaron cada 5 min de acuerdo con una cintica
de 0 a 30 min, a 485 nm para la excitacin y 535 nm para la emisin
(Synergy 4, BioTek, EE.UU.). Los datos se expresaron como RFU (aumento
de las unidades relativas de fluorescencia) / (min x mg protenas).
Todos los biomarcadores se normalizaron con la concentracin total de
protena individual de acuerdo con la metodologa de Bradford ( Bradford,
1976 ) con albmina de suero bovino para la calibracin. La concentracin
total de protena se midi a 595 nm por un lector de microplacas
(PowerWave, BioTek) en los duplicados.
Nivel total de metalotionenas (MT) se determin usando un ensayo de
saturacin Ag adaptado de Scheuhammer y Cherian (1986) . El mtodo
consiste en la saturacin de MT con un exceso de Ag y este exceso se
elimina con la hemoglobina. Una muestra de 50 l de la S15 se mezcl se
mezcl con 50 l de 10 ppm de Ag + en 0,2 M glicina-NaOH, pH 8,5. La pieza
en bruto compuesta por 50 l de tampn de homogeneizacin. Un control
positivo compuesta por un nivel de 20 ng MT (Enzo Life Sciences, Inc., NY,
EE.UU.) en Tris HCl 25 mM, se aadi tambin 0,1, DTT pH 6,4. Despus de
10 min de incubacin, se aadieron 400 l de tampn de glicina-NaOH y se
aadi 50 l de hemoglobina 2% y se incub durante 5 min. Las muestras se
calentaron durante 2 minutos a 100 C y se centrifugaron a 10.000
g durante 5 min para precipitar Hb y otras protenas. El ltimo paso se
repiti en ms tiempo. El sobrenadante se analiz por triplicado diluida 1/10
en agua por grafito absorcin horno-atmica (GF-AAS) equipado con
correccin de fondo Zeeman (AA 240Z con Zeeman GFAA, Agilent). Cada
absorbancia de la muestra se calcul de acuerdo con un Ag + curva de
calibracin (0-15 g / L). La concentracin de MT equivalente en el hgado se
estim con la MT estndar y los datos se normalizaron con la concentracin
de protena total individual (g MT equivalente / mg de protenas).

2.9. Anlisis de los datos

La normalidad de la distribucin de datos se verific con la prueba de
Kolmogorov-Smirnov'. Las diferencias entre los tratamientos control y
expuestas fueron examinadas usando emparejado t -test, cuando se confirm
la normalidad de los datos. Los datos fueron log-transformados cuando se
produjo desviacin significativa de la normalidad y se utiliz Kruskal Wallis
ANOVA. La significacin se fij en p <0,05.
correlaciones de Pearson-momento se realizaron para estudiar la relacin
entre los resultados bioqumicos para ambas formas AG. Se realiz un
anlisis discriminante para examinar los patrones de respuesta globales de
los 9 marcadores biolgicos y datos de bioacumulacin (bioacumulacin,
inmunoactividad, immunoefficiency, la actividad COX, la actividad GST, LPO,
SOD, genotoxicidad, Zn lbil, y MT) entre el control y los grupos
expuestos. Todos los anlisis estadsticos se realizaron con STATISTICA
(versin 7, StatsoftInc., 1995).

3. resultados
3.1. Caracterizacin de AGNPS en 10% efluente
Despus de 96 h de exposicin, TOC se aument desde 7,7 hasta 10,3 mg /
L (+ 34%) y DOC se increment desde 3,44 hasta 8,4 mg / L (+ 41%) ( Tabla
1 ). Estos resultados reflejan la liberacin de los excrementos de los peces
durante el experimento. Tambin se incrementaron los valores de pH (de 7.45
a 8,5).
AGNPS en solucin madre tenan un dimetro medio inicial de 20 nm ( Fig.
1 ) como se muestra por anlisis de imagen TEM, que corresponde a la
informacin del fabricante. Tenan una forma esfrica y fueron principalmente
en forma monomrica. Una vez en el agua residual diluida, anlisis de
imgenes TEM revel que las aguas residuales inducida por cambios en el
tamao NPs y la forma ( Fig. 2 ). Se observaron pequeos agregados de 3-4
NPs ( Fig. 2 ). El EDS representa grficamente 1-3 confirman que todos los
NPs observados eran AGNPS ( Fig. 2 ). AGNPS mantuvieron su forma
esfrica originado ( Fig. 2 A y B), pero tambin se observaron
transformaciones morfolgicas ( Fig. 2 B) confirmando que AGNPS podran
perder su forma original en el efluente diluido en agua del grifo. Por un lado,
la ruptura se detect ( Fig. 2 B) en el efluente diluido, donde se observaron
AGNPS de 20 nm de dimetro con otros NPs pequeas que las rodean. Por
otra parte, el fenmeno de agregacin se ve en la Fig. 2 C sugiere
agregacin de las AGNPS involucran con la capa de cobertura. El EDS
representa grficamente 1-3 confirman que todos los NPs observados eran
AGNPS ( Fig. 2 ).

Higo. 1.
microscopio electrnico de transmisin (TEM) de AGNPS en Ted Pella solucin
madre. Todas las nanopartculas se separaron individualmente y presentan una forma
esfrica. Las barras de escala indican 20 y 5 nm.
opciones figura
 Higo. 2.
morfologa de plata en el agua residual despus de la exposicin 96 h y anlisis de la
composicin elemental. nanopartculas de Ag se recuperaron en pequeos agregados. Los
espectros de energa dispersiva (EDS) de datos de anlisis elemental se presentan a
continuacin para cada imgenes confirman que cada imagen muestran las nanopartculas
de plata. Las barras de escala indican 5 nm.
opciones figura
El dimetro medio de AGNPS medido por DLS en el agua stock estaba bajo
las especificaciones del fabricante ( Tabla 2 ). En las aguas residuales, el
tamao medio de AGNPS fue de aproximadamente 12 nm, correspondiente a
partculas pequeas degradados (o fragmentos de NP). Diferencia entre las
observaciones de TEM y mediciones DLS sera debido a la etapa de filtracin
(en 450 membrana nm) como un procedimiento de pre-tratamiento antes de
la DLS mediciones. La etapa de filtracin se llev a cabo medidas de DLS
anteriores para eliminar los agregados y aumentar la precisin del
resultado. El potencial zeta de cero podra ser debido a la neutralizacin de la
carga total de los NPs en el efluente diluido.
Tabla 2.
La media de tamao y potencial zeta de AGNPS en solucin de reserva y 10%
efluente. Estos resultados se observaron con un DLS despus de la filtracin a travs de
una membrana de 0,45 micras para eliminar grandes agregados en la solucin y medir el
tamao del dimetro medio de las partculas.
Las muestras La media de tamao de dimetro (nm) potencial Zeta (mV)
Solucin de reserva 19.2 0.3 58.02 4.21
10% efluente 11.7 2.1 0.00 0.00
opciones de la tabla

3.2. distribucin de tamao de plata en el agua residual diluida

Despus de una etapa de filtracin en 450 nm, slo el 26% de Ag de AGNPS
y 32% de Ag de AgNO 3 se detectaron en las aguas residuales diluida, lo que
indica que alrededor del 75% de Ag fue preferentemente ligado a partculas
450 nm ( Fig. 3 ). Curiosamente, 5,5% (1,4 g / L) de los AGNPS pasaron a lo
largo del filtro de 25 nm, lo que confirma que slo un pequeo porcentaje de
los AGNPS permaneci en la forma monomrica inicial. No se detect AG en
1 kDa o menos. Ag desde el AgNO 3 se encontr en la fraccin nm 25 filtrada
(0,44 g / L = 12%), pero la mayor parte del 10% (0,37 g / L) fue encontrado en
el (kDa 1) fraccin verdaderamente disuelto ( Fig. 3 ), lo que sugiere que slo
el 10% de Ag de AgNO 3 se consider verdaderamente disuelto.

Higo. 3.
Porcentaje de Ag en agua despus de la exposicin 96 h. La concentracin total de Ag
despus de 96 h fueron 25,7 g / L y 3,75 g / L para AGNPS y
AgNO 3 respectivamente. Total corresponde a la fraccin no filtrada, 450 nm, 100 nm, 50
nm, y 25 nm significa fracciones filtradas; 1 kDa corresponde a la fraccin verdaderamente
disuelto (Ag + ).
opciones figura

3.3. Plata en tejidos de peces

Un aumento significativo en la concentracin de Ag se midi en las branquias
y los hgados de los peces expuestos a AGNPS ( Fig. 4 ). El hgado
acumulado ms Ag de branquias que sugieren una distribucin sistmica de
AGNPS en los peces. Se observ una bioacumulacin significativa de Ag con
con AgNO 3 solucin en el hgado (0.11 mg / kg de peso hmedo de Ag), pero
no se detect significativamente en las branquias (0,007 mg / kg de peso
hmedo de Ag).
 Higo. 4.
Concentraciones de Ag (mg / kg de peso hmedo) en las branquias y los hgados de la
trucha arco iris expuestos 96 h a AGNPS y AgNO 3 . Los peces fueron expuestos
inicialmente a 40 g / L de AGNPS y 4 g / L de AgNO 3 . Las barras de error corresponden a
error estndar. Las estrellas indican diferencias significativas entre los tratamientos y el
control (de plata p <0,05).
opciones figura
TEM imgenes de los controles branquias de los peces ( Fig. 5 A-C) clulas
de cloruro de espectculo con algunas mitocondrias. No encontramos
AGNPS en los filamentos de las branquias. EDS se realizaron en las
imgenes y no indican una acumulacin Ag sugiere la ausencia de Ag
coloidal en branquias de los peces expuestos al efluente diluido. Sin
embargo, las branquias expuestas ( Fig. 5 D-F) mostraron dao celular tales
como vacuolas agrandados, aumento del nmero mitocondrias, y la
compactacin del retculo aunque no se detectaron AGNPS. Por otra parte,
tambin se observaron cuerpos de inclusin que indica un efecto de los
AGNPS sobre la estructura branquias.
 Higo. 5.
TEM imgenes de agallas de los no expuestos (A-C) y peces expuestos (D-F) a AGNPS
para 96 h. M = mitocondrias, N = ncleo. Las flechas indican las branquias morfolgicas
modificaciones. No se observ acumulacin significativa de AGNPS en las branquias, pero
se observaron cambios estructurales, tales como: aumento mitocondrias nmero (D),
ncleo invaginacin (E) y la compactacin del retculo (E) y vacuolas (E y F). Todas las
imgenes fueron hechas con 2900 magnificacin y 120 KeV. Las barras de escala
indican 2 m.
opciones figura

3.4. evaluacin inmunocompetencia

No se observ disminucin en linfocitos y macrfagos viabilidad despus de
una exposicin a AGNPS. Slo se observ una disminucin significativa de la
viabilidad de macrfagos entre el control y AgNO 3 tratamiento ( p <0,05).
Se observaron disminuciones significativas en inmunoactividad y
immunoefficiency entre el control y AgNO 3 tratamiento ( Fig. 5 ). Con AGNPS,
se observ una disminucin significativa en immunoefficiency entre el control
(diluido efluente solo) y las muestras expuestas. Estos resultados indican que
AGNPS tienen un efecto inmunosupresor sin afectar a la viabilidad de las
clulas ( Fig. 6 ).
 Higo. 6.
Inmunoactividad (fagocitosis de 1 grano y ms) y immunoefficiency (fagocitosis de perlas
de 3 y ms) de la trucha arco iris expuestos a AGNPS y AgNO 3 para 96 h. Las barras de
error corresponden a error estndar. Las estrellas indican diferencias significativas entre
los tratamientos y el control (de plata p <0,05).
opciones figura

3.5. Biomarcadores de estrs txico

En branquias, se observ un aumento significativo en Zn lbil con ambas
formas de Ag ( Fig. 7 ) que sugiere la libertad de Ag + de AGNPS y AgNO 3 en
el tejido branquias. Lbil Zn tambin se correlacion significativamente con
branquias Ag niveles ( r = 0,40, p <0,05) ( Tabla 3 ). LPO no fue
significativamente aument con AgNO 3 en branquias de los peces ( Fig.
7 ). El aumento de LPO se correlacion negativamente con el parmetro
inmunolgico (inmunoactividad: r = -0,52, p <0,05; immunoefficiency: r =
-0,42, p <0,05). Aunque SOD no fue inducida significativamente, la actividad
se correlacion negativamente con LPO lo que sugiere que la disminucin de
SOD estuvo involucrado en LPO en las branquias al menos en parte. Se
observaron aumentos significativos en GST con AGNPS y AgNO 3 . No
variacin significativa en roturas de la cadena de ADN se observaron con
AGNPS y AgNO 3. GST se correlacion significativamente con SOD ( r =
0,46, p <0,05) y de ADN roturas de la cadena ( r = 0,77, p <0,05) que indica
que los efectos bioqumicos de enmalle eran en parte asociada con el estrs
oxidativo y dao de la membrana debido al contacto directo con ambas
formas AG.
Higo. 7.
Los biomarcadores en las branquias y el hgado de los peces expuestos a AGNPS y
AgNO 3 para 96 h. Actividad = ciclooxigenasa de COX, el dao del ADN, lbil Zn = linc lbil,
 peroxidacin LPO = lpidos, = actividad de la glutatin S-transferasa GST, SOD =
superxido dismutasa, y MT = nivel de metalotionena. Las barras de error corresponden a
error estndar, estrellas indican diferencias significativas entre los tratamientos de plata y
de control ( p <0,05).
opciones figura
Tabla 3.
Correlaciones de Pearson calculan entre 9 biomarcadores (COX = ciclooxigenasa, GST =
glutatin S-transferasa, SOD = superxido dismutasa, el ADN = roturas de la cadena de
ADN, laboratorio Zn = zinc lbil, LPO = peroxidacin lipdica, MT = metalotionenas,
actividad phago = inmunoactividad, phago eficiencia = immunoefficiency) y datos de
bioacumulacin Ag (hgado Bio = bioacumulacin en el hgado y Bio branquias =
bioacumulacin en branquias) a partir de todos los datos de AGNPS y AgNO 3 .
opciones de la tabla
En el hgado, no se observ aumento significativo de la actividad de la
ciclooxigenasa con las dos formas de Ag, lo que indica una inflamacin que
se correlacion con la disminucin de la actividad de fagocitosis ( r =
-0,43, p <0,05), y en la eficiencia de la fagocitosis ( r = -0,44, p <0,05)
( Tabla 3 ). En el hgado, la actividad de la COX tambin se correlacion con
Zn lbil ( r = -0,41, p <0,05), el nivel de MT ( r = 0,41, p <0,05), y los
niveles tisulares de Ag ( r = 0,55, p <0,05) ( Tabla 3 ). Se observaron
disminuciones significativas en lbil Zn en la actividad oxidativa del hgado en
las clulas ( Fig. 7 ). En el hgado, las roturas de la cadena de ADN se
correlacion negativamente con la LPO ( r = -0,46, p <0,05), lo que sugiere
que las modificaciones en el proceso de reparacin del ADN est relacionada
con el aumento de la LPO. Una inhibicin de la actividad de reparacin del
ADN se sugiri en el hgado, debido a una disminucin significativa en
roturas de la cadena de ADN se observ con AgNO 3 y no con AGNPS ( Fig.
7 ). El nivel de MT tambin se correlacion con la actividad GST ( r =
0,81, p <0,05) ( Tabla 3 ). Un aumento significativo en los niveles de MT con
AgNO 3 se observ, lo que confirma la implicacin de MT en la exposicin Ag
y la toxicidad (la Fig. 7 ). El aumento en el nivel de MT no se observ con
AGNPS lo que sugiere que no hay liberacin importante de Ag +se produjo
durante el tiempo de exposicin ( Fig. 7 ).
Los tratamientos fueron bien separados de acuerdo con la fonction
discriminante (DA). Segn lambda de Wilks, los 2 ejes fueron significativas
( F (22,94) = 5,1665 p <0,001) en la que 30% de la varianza se explic por el
eje x y el 23% de la varianza se explica por eje y . Los efectos de AGNPS
fueron bien separados por las x eje donde la actividad fagoctica y la
eficiencia fueron los principales biomarcadores que discriminaban la
respuesta bioqumica de expuesta a partir de pescado no expuesta, mientras
que GST y SOD fueron los principales biomarcadores que discriminaban
AgNO 3 de tratamientos AGNPS. DA confirm que las formas de Ag diferan
en la presencia de agua residual diluida ( Fig. 8 ); oxidativo y las vas de anti-
oxidantes estaban involucrados con AgNO 3tratamiento mientras que la
inflamacin e inmunitarias vas estaban involucrados con el tratamiento
AgNP.
 Higo. 8.
El anlisis discriminante entre todos los resultados y tratamientos. No se observ
asociacin entre los tratamientos. La actividad fagoctica y la eficiencia fueron los
principales biomarcadores que discriminaban la respuesta bioqumica de expuesta a partir
de pescado no expuesta y explican 30% de la varianza de datos (componente 1). El
glutatin S-transferasa (GST) y la superxido dismutasa (SOD) fueron los principales
biomarcadores que discriminaban el AgNO 3 de tratamientos AGNPS y explican un
porcentaje acumulado del 53% de la varianza (componente 2). Elipses corresponden al
intervalo de confianza alrededor de todos los datos para todo el tratamiento. Los intervalos
de confianza se fijan en 95%. De acuerdo con la figura, hay un cierto grado de similitud de
Ag y AGNPS. AGNPS difiere de AgNO 3de la x eje es decir, la fagocitosis.
opciones figura

4. Discusin
4.1. especiacin de plata
Este estudio investig el destino, la biodisponibilidad y la toxicidad de Ag y
AGNPS disuelto en la presencia de agua residual diluida. El estudio revel
que 75% de la concentracin original de Ag como AGNPS o AgNO 3 se
recuper en forma de grandes coloides (> 450 nm). Sin embargo, AGNPS
tambin se recuperaron en la fraccin filtrada 25 nm. Es de destacar que
algunos AGNPS tambin perdieron su original de la degradacin forma que
muestra en las aguas residuales. En otros estudios, la materia orgnica
disuelta (DOM) interacta con la capa AGNPS y se indujo su superficie
neutralizacin de carga, por tanto, la disolucin ( Unrine et al , 2012. ;
Philippe y Schaumann, 2014 ). En nuestro estudio, sin Ag + se midi en la
fraccin verdaderamente disuelto (1,5 nm), lo que sugiere que la toxicidad
debe haber procedido por diferentes medios en lugar de Ag + efectos
mediados. Esto fue apoyado adems por la falta de induccin de MT en el
hgado de los peces expuestos a AGNPS aunque se aumentaron los niveles
de Zn lbiles. Un estudio previo mostr que una fraccin de AGNPS aadido
(1-2%) se disolvi en un pH de 6 a 9 en una 24 h in vivo la exposicin de la
cepa bacteriana ( Siripattanakul-Ratpukdi y Frhacker, 2014 ; . Fabrega et al,
2009 ) . Esto fue en la misma gama de nuestros datos, donde en el orden de
5% de Ag aadida se encontr en el filtrado 25 nm ( Fig. 3 ). Osborne et
al. (2013) , tambin demostraron que AGNPS liberan lentamente Ag + (0,1-
2%) durante la exposicin que explica la funcin antimicrobiana de
AGNPS. Por lo tanto, una pequea parte de los AGNPS se puede esperar
que se disuelva en los medios de comunicacin en funcin del pH, la
conductividad y NOM. Como se observa en nuestros TEM imgenes estas
pequeas fracciones seran todava en forma monomrica en las aguas
residuales diluidas, mientras que en la superficie o agua del grifo, AGNPS
tomaron una apariencia forma de cadena y estrella despus de 96 h de
exposicin ( Bruneau et al., 2015 ).
El potencial zeta neutro de las AGNPS y los resultados de TEM sugieren que
NPs de agregacin y la carga superficial se neutraliz mediante la DOM
como se observ por Unrine et al. (2012) . Como se observa en Bruneau et
al. (2015) de agua natural neutraliza la carga superficial de AGNPS 20 nm
despus de 96 h en la exposicin in vivo con la trucha arco iris. Por otra parte
los AGNPS se recuperaron en los agregados despus de la exposicin 96 h
como se observ en este estudio ( Bruneau et al., 2015 ).
El aumento de la DOC y conductividad podra haber impedido una disolucin
ms completa de los monmeros en AGNPS Ag <1 kDa. Estudios anteriores
mostraron que NOM podra unirse de metal y reducir la toxicidad de metal
para los organismos acuticos ( Welsh et al., 1993 ). Erickson et
al. (1998) tambin proporcionado pruebas del efecto del pH en Ag capacidad
de formacin de complejos de DOC. El potencial de Ag + que se une a
molculas DOC disminuye con el aumento de H + concentracin. En nuestro
caso, el pH alcalino de los medios aumenta la cantidad de Ag + que DOC se
puede unir y podra explicar la formacin de pequeas NPs observadas en
TEM y el bajo porcentaje de forma inica en el agua.
En este estudio, AgNO 3 era biodisponible como fracciones pequeas (0,5 g /
L en la membrana de tamao de poro 25 nm), y como Ag + porque una
pequea cantidad (0,4 g / L) de la concentracin inicial Ag todava estaba
biodisponible en los verdaderamente fraccin disuelta o fraccin de
permeado. Ag + , que se recupera en la fraccin de permeado de 1 kDa
probablemente est asimilada por el pescado. Aunque ambas formas de Ag
fcilmente formaron grandes agregados incluyendo Ag 2 S, AGNPS tambin
ocurrieron como pequeos agregados (25-450 nm) y estaban ausentes de la
fraccin realmente disuelta de Ag (<1 kDa). Este resultado indica que las
formas tanto Ag tienen diferente destino en la misma agua residual diluida,
pero an eran biodisponible.

4.2. la captacin de plata

AGNPS entran en el organismo como NPs monomricos sin acumulacin
acumulacin aparente en la superficie y en las branquias, lo que sugiere un
bioconcentracin dbil en este tejido. Otras rutas de captacin tambin
pueden ser sugeridas tales como la entrada gastro-intestinal ( Scown et al.,
2010 ). Por otra parte los parmetros del agua tales como la conductividad, el
pH y NOM podra reducir la bioacumulacin Ag; Bury y McGeer Wood
(1999) han demostrado previamente que el Ag bioacumulacin podra
reducirse con el aumento en el DOC. Nuestros resultados no estn de
acuerdo con los de Scown et al. (2010) , quienes observaron AgNP inclusin
en las branquias de trucha comn con dao tisular baja. Farkas et
al. (2011) tambin se observ acumulacin AGNPS alrededor del ncleo de
las clulas branquias. En otros estudios, Ag se recuperaron tanto en el pez
cebra ( Griffitt et al., 2009 ) y las branquias Perch ( Bilberg et al., 2010 )
mucho ms altas concentraciones de Ag (0,3-1 mg / L) que en el presente
estudio. No obstante esto, hubo algunos daos branquias en este estudio
trivial. Nuestros resultados histolgicos mostraron tejidos de papada con
vacuolas que estaban de acuerdo con los resultados de Farmen et
al. (2012) que observaron una elevacin de las laminillas secundaria de la
capa de branquias stano despus de una exposicin a 100 AGNPS g /
L. Tambin se observ un aumento en el nmero de mitocondrias, y una
compactacin del retculo, lo que indica un deterioro de la funcin de las
branquias y tal vez un deterioro de la osmorregulacin causada por el
contacto con AGNPS.
Nuestros datos muestran que AGNPS fueron asimilados principalmente a
travs de la ingestin de agua. Esto es consistente con la mayor presencia
de AGNPS agregados y niveles hepticos AG. Esto es de acuerdo con la
observacin de que el pescado absorbe alrededor del 30% de su masa
corporal como agua por da durante beber y comer, lo que podra contribuir
significativamente a la absorcin de Ag. Basndose en los datos de hgado
de Ag de contenido, un factor de bioconcentracin (BCF) de 11.5 y 26.5 se
calcularon para AGNPS y AgNO 3 sugiriendo respectivamente que Ag
agregados en el efluente diluido a partir de AgNO 3 eran 2,3 veces ms
biodisponible que Ag agregados de AGNPS en los mismos medios . En este
estudio, la concentracin total de Ag en el hgado para la exposicin AgNP
fue de 0,3 mg / kg y en los medios de exposicin de la concentracin total de
Ag fue de 26 mg / L despus de 96 h. Resultados nuestros son similares a los
de Scown et al. (2010) , que observ acumulacin significativa de AGNPS
(100 g / L) de 10 nm y 35 nm de dimetro despus de una exposicin de 10
das en el hgado de pescado; Concentraciones de Ag variaron desde 0,3
hasta 0,6 mg / kg y de 1 a 1,6 mg / kg en las branquias y en el hgado,
respectivamente. Para AgNO 3 tratamiento, la bioacumulacin hgado alcanz
un promedio de 0,1 mg / kg y en los medios de exposicin de la
concentracin total de Ag en AgNO 3 era 3,75 g / L; Estos resultados indicaron
un BCF con Ag + , que es mayor que la observada con AGNPS. Disuelto Ag
fue probable absorbe ms fcilmente y se concentr en el pescado que eran
AGNPS por estos organismos. Por lo tanto, las aguas residuales promovera
la tasa de absorcin de la forma Ag disuelta. Nuestros resultados
bioacumulacin era tambin de acuerdo con los de Gomes (2014) que
observaron un aumento significativo en las concentraciones de Ag en la
glndula digestiva de los mejillones despus de 3 das de exposicin con
AgNO 3 y AGNPS. Estos autores tambin demostraron que la acumulacin de
Ag de AGNPS se produce ya sea por absorcin de AgNP y AGNPS disuelto.

4.3. Los efectos txicos

De acuerdo con nuestros resultados, los AGNPS bioacumulables y
AgNO 3 efectos txicos inducidos. Por un lado, AgNO 3 aument la LPO y su
correlacin con Zn lbil, confirmar los efectos nocivos de contacto directo
entre Ag + y las branquias. Tambin la disminucin marginal en la actividad de
SOD indica una prdida del control del estrs oxidativo en este
tejido. Ag + tambin indujo significativamente los niveles de MT y se indujo
dao al ADN. La disminucin de roturas de la cadena de ADN sugiere una
inhibicin de la actividad de reparacin del ADN que se observ previamente
en mejilln de agua dulce expuestas a los puntos cunticos ( Gagn et al.,
2008 ). Finalmente, Ag +induce inmunosupresin y leucocitos
citotoxicidad. Por otro lado, con AGNPS un pequeo aumento en zinc lbil en
las branquias indic que AGNPS podra liberar Ag + y desplazar Zn pero este
fenmeno no se asoci con mecanismo de estrs oxidativo. Como se
observa por los resultados MT, AGNPS o radicales libres fueron
potencialmente quelado a cistena protenas ricas pero que no era la va
predominante en comparacin con Ag disuelta. Anlisis DA revel similitudes
en las respuestas de los biomarcadores entre AGNPS y AgNO 3 tratamiento
que indican que la toxicidad de AGNPS est en parte vinculada a
Ag + . Nuestros resultados coinciden con los de un tanto Gagn et
al. (2013) que demostr que los efectos de AGNPS en MT se asociaron
parcialmente con los de Ag + en la glndula digestiva del mejilln Elliptio
complanata ( Gagn et al., 2013 ). Como se ha mencionado por Jung et
al. (2014) , AGNPS podran ser almacenados en las reas no especficos en
el hgado en la regin citoplasmtica; esta observacin podra estar de
acuerdo con nuestra hiptesis, por desgracia no la histologa heptica se
llev a cabo en este estudio.
Disminucin de la fagocitosis se observ con los AGNPS y se correlacion
con el aumento de la actividad de la COX. La disminucin de la
immunoefficiency podra dar una idea del tamao de AGNPS. De hecho,
cuando AGNPS exceden el tamao de poro de la membrana de la pared o
intersticio de la clula, la fagocitosis se produce ( Lowry et al., 2012 ). Otro
estudio ha demostrado que el punto de corte crtico de medio de endocitosis
podra ser 50 nm ( Jiang et al., 2008 ). AGNPS pueden ser internalizados por
cualquiera de fagocitosis o endocitosis en funcin de cmo AGNPS se
presentan a las clulas (agregados, productos de degradacin, disueltos Ag).
Segn los resultados de biomarcadores, las dos formas de Ag inducen
procesos de inflamacin en la superficie de las branquias y suprimen la
fagocitosis. Resultados inmunes eran diferentes de los observados en
nuestro estudio anterior; en Bruneau et al. (2015) se observ que no
perturbacin inmune y un ligero inmunoestimulacin en el pescado despus
de 96 h de exposicin con 50 g / L de AGNPS en grifo y aguas marrones
respectivamente. Sin embargo, AgNO 3 inmunodepresin inducida y un
aumento significativo en tioles reducidos que sugieren que el agua del grifo
promueve los efectos de estrs oxidativo de la forma disuelta ( Bruneau et al.,
2015 ) como se observa en este estudio. Los efectos txicos de AGNPS a los
peces eran diferentes segn el tipo de agua de la superficie; esta conclusin
estaba de acuerdo con los elaborados en Bruneau et al. (2015) . En este
estudio, se observaron diferentes rutas bioqumicas para las dos formas de
Ag. Oxidativo mecanismo de defensa tales como GST y SOD fueron los
principales biomarcadores que discriminaban el AgNO 3 de tratamientos
AGNPS. El efecto nocivo de los ROS podra ser controlado por la produccin
de protenas que desintoxican y reparar el dao ( Kim y Ryu, 2012 ). Las
enzimas antioxidantes como la SOD catalasa, GST y peroxirredoxinas son
esenciales en el mantenimiento del organismo contra el estrs oxidativo. En
el presente estudio, el efecto txico de la forma disuelta (Ag + ) y producen
ms estrs oxidativo que forma nanoparticulada. Un estudio de Massarsky et
al. (2014b) tambin encontr que Ag +reduce ms la actividad GST que
AGNPS en hepatocitos de trucha despus de una exposicin in vitro. Una
investigacin toxicogenmicos de Gagn et al. (2012) tambin encontraron
resultados similares en los Ag + conduce al estrs oxidativo, mientras que
AgNP conduce a efectos inmunes. Adems, se observ una disminucin en
la viabilidad leucocitos con Ag disuelta y no con AGNPS. Los efectos
mecnicos de los AGNPS pueden estar vinculados a la desagregacin de
desglose de NPs o como resultado de la produccin de O libre de 2 especies
reactivas. Slo, se midi un aumento de Zn lbil en las branquias, junto con
AGNPS, lo que sugiere un aumento en el mecanismo de defensa
antioxidante, tal vez debido al contacto inmediato con AGNPS y lbil Ag a
partir de los AGNPS.
Para concluir, ambas formas de Ag se asociaron a los coloides donde
AgNO 3 eran 2,3 veces ms biodisponible que AGNPS. AGNPS pueden
causar daos al sistema inmune y la inflamacin, mientras que disuelto Ag
produce ms estrs oxidativo como se evidencia por el aumento de GST, los
niveles de MT y SOD. Tambin se sugiere que las pequeas NPs se podran
encontrar en el hgado de los peces en la presencia de la materia orgnica de
las aguas residuales municipales diluidos. Curiosamente, la falta de induccin
de MT por los AGNPS sugiere tambin diferentes vas de toxicidad que
AgNO 3 .
Este estudio nos permite comprender mejor las preocupaciones de seguridad
ambiental sobre AGNPS en los organismos acuticos. aguas residuales
diluidas, juega un papel importante en el destino y la posterior
biodisponibilidad de los nanomateriales y sus productos de transformacin. A
concentraciones ambientales esperados de AGNPS, AGNPS deben
representar una amenaza para los organismos acuticos. Finalmente, las
interacciones entre AGNPS y otros contaminantes que se encuentran en las
aguas residuales deben considerarse ms.
Conflicto de intereses
El autor (s) declaran (s) que no hay conflicto de intereses en relacin con la
publicacin de este documento.

Expresiones de gratitud
Nos gustara dar las gracias a Jean-Philippe Masse desde el
CM 2 (Caracterizacin microscpica del Centro de Materiales, Escuela
Politcnica de Montreal, Montreal, QC) para abastecer el TEM. Agradecemos
a Gwenal Chamoulaud de NanoQAM (Universidad de Quebec en Montreal,
Montreal, Qc) para el anlisis DLS. Agradecemos al equipo de centro de
microscopa electrnica de McGill branquias TEM imgenes. Agradecemos a
Chantale Andr, Environment Canada, para la elaboracin del protocolo de
saturacin de plata MT. Agradecemos a Carole Fleury de la planta de
tratamiento de aguas residuales de Montreal para el proveedor proporcionar
muestras. Gracias al Dr. Richard Cooper por los consejos de escritura en
ingls. Fue este trabajo el apoyo de Plan de Gestin de Productos Qumicos
de Environment Canada fondos.

referencias