PRACTICA N 02

MTODOS PARA EL EXAMEN MICROBIOLGICO DE LOS ALIMENTOS

DETERMINACIN DEL NMERO TOTAL DE BACTERIAS
RECUENTO MICROSCPICO DIRECTO DE BREED

I. INTRODUCCIN
El crecimiento de los microorganismos presentes en sustratos que se encuentren
en condiciones que lo propicien, se traducir primero en el aumento de los
componentes celulares, y en seguida por el aumento del tamao y el incremento
del nmero de clulas.
Los estudios relacionados con el anlisis de muestras de alimentos, leche y otro
requieren de una enumeracin cuantitativa de los microorganismos presentes en
estos compuestos, ya que la calidad microbiolgica de estos productos est en
relacin directa con la calidad sanitaria y la seguridad para el consumo de ellos.
Por lo heterogneo de los microorganismos y de las muestras, existen muchos
mtodos para tales fines que incluyen mtodos microscpicos o directos, el uso
de contadores electrnicos de clulas como el contador Coulter, mtodos
qumicos que permiten estimar la masa celular o constituyentes celulares,
lecturas turbidimtricas que se pueden relacionar con el aumento de la masa
celular y el mtodo de cuenta en placa de unidades formadoras de colonias.
En esta prctica se desarrolla la determinacin del nmero total de
microrganismos mediante el mtodo microscpico directo denominado Breed
utilizando como muestra un alimento lquido, leche.
II. OBJETIVO

Determinar el nmero total de microorganismos en un alimento, utilizando

el mtodo directo y utilizando un volumen conocido de alimento.
III. MARCO TERICO
RECUENTO MICROSCPICO DIRECTO DE BREED
Es una tcnica de laboratorio que se utiliza para el recuento de microorganismos
en la leche. Fue presentado en 1910 por los bilogos estadounidenses Samuel
Cate Prescott y Robert Stanley Breed, es el primer procedimiento microscpico
para el examen de frotis en leche, con el fin de contabilizar las bacterias y
leucocitos presentes en ella.
IV. MATERIALES Y MTODO
MATERIALES
Muestra liquida.
Microscopio compuesto, previamente calibrado.
Lmina patrn para calibracin.
Ansa calibrada o pipeta calibrada de 0.01 ul.
Lmina portaobjetos.
Lmina patrn de Breed.
MTODO
RECUENTO MICROSCPICO DIRECTO DE BREED
Estandarizacin del microscopio
a) Este debe tener una buena luminosidad, para estandarizarlo hay que
utilizar una tabla micromtrica que viene con divisiones de 0.1 0.01 mm.
b) Con el microscopio, ubicar el centro de la lmina patrn, se observar el
campo microscpico, hacer coincidir en 0 mm (que es el inicio de la
numeracin), seguir continuamente hasta lograr medir el total del campo
microscpico.
c) Determinar el rea del campo, en mm2 aplicando la frmula de la
superficie circular: . 2
d) Por ultimo pasar a cm2, para encontrar el Factor Microscpico.
Preparacin de la muestra
a) Colocar una lmina portaobjetos nueva, desengrasada y de preferencia
nueva sobre la lmina patrn de Breed (es este caso es slo una manual
que se realiz a partir de un cartn simple).
b) Homogenizar la muestra entre 20 a 25 veces.

c) Coger 0.01 ml de muestra y colocar sobre el cuadrado dibujado sobre la

lmina portaobjetos y extender delimitando el cuadrado, al final quedr
una pelcula, secar al mechero 40 a 45C.

d) Si despus del secado la muestra aparenta estar muy grasosa, realizar

un pequeo lavado con xilol, este con el objetivo de aclarar la muestra.
e) Teir la pelcula con el mtodo de Gram.
 f) Observar al microscopio y contar los microorganismos por campo,
utilizando lente de inmersin para lo cual se utiliza un nmero de campos
microscpicos que sean representativos.

g) Calcular el Nmero Promedio de Microorganismos por campo por el

Factor Microscpico por el Recproco de la dilucin.

V. RESULTADOS

El conteo de los diversos campos dio como resultado:

Campo Nmero de m.o. Campo Nmero de m.o.

01 2 16 3
02 1 17 1
03 3 8 2
04 1 19 0
05 0 20 0
06 1 21 1
07 1 22 1
08 0 23 3
09 4 24 3
10 1 25 0
11 2 26 1
12 1 27 1
13 0 28 0
14 1 29 2
15 1 30 0
 Nmero Promedio de Microorganismos por campo:
. 37
= = .
30
Factor Microscpico: Como no se determin el campo microscpico, ya
que no se contaba con una lmina patrn micromtrica que calibre al
microscopio se us su equivalencia segn: Standard Methods for the
Examination of Dairy Products APHA, indica que el factor microscpico
tiene que estar entre:

300,000 - 400,000 - 500,000 - 600,000

Recproco de la dilucin

0.01 = 100

Recuento microscpico de microrganismos totales:

N Promedio de m.o. por campo X F.M. X Recproco de la dilucin

1.23 X 400,000 X 100

49, 200 000 m.o./mL

VI. CONCLUSIONES

Se determin que el nmero total calculado de la muestra de leche

trabajada es de 49, 200 000 microorganismos por cada mililitro.
Es una tcnica sencilla y rpida, los resultados no deben ser considerados
precisos ya que no se pudo calibrar a los microscopios, pues no se
contaba con una lmina patrn para calibrar, tambin se debe tener en
cuenta que esta tcnica se considera a todo tipo de clulas ya sean
viables y no viables.
De alguna u otra manera se pudo conocer este mtodo, que servir de
mucha ayuda durante nuestra formacin profesional.
VII. CUESTIONARIO

1. Para qu otros alimentos se podr utilizar el Mtodo de Breed?

Principalmente se analizan alimentos de tipo lquido:

Leche pasteurizada.
Leche no pasteurizada.
Leche Cruda O Bronca (De Establo).
Vino Caducado.
Sidra.
Qu otros mtodo de contaje directo existen para determinar el nmero
total de microrganismos?
CONTEO MICROSCPICO DIRECTO EN CMARA DE PETROFF HAUSER
Es una placa de vidrio con una cuadricula en depresin donde se deposita la
muestra medida. Es posible relacionar el nmero de clulas observadas en la
superficie del cuadro, con el volumen de esa rea. Considerando los volmenes
en la cuadricula se puede calcular la concentracin de microorganismos por ml.
CONTEO TURBIDIMTRICO
En una suspensin microbiana la cantidad de clulas est directamente
relacionada con la turbiedad o densidad ptica de la misma e inversamente
relacionada con la cantidad de luz que pasa a travs de ella. Esto permite
determinar con bastante exactitud la cantidad de microorganismos en la
suspensin mediante la determinacin de la turbiedad mediante un nefelmetro
o un espectrofotmetro. Los resultados se comparan con una curva estndar
construida con una suspensin testigo de concentraciones conocidas. La
turbiedad que resulta en la suspensin microbiana se aproxima a la producida
por un cierto nmero de clulas en suspensin.
Esta tcnica es til solamente para organismos unicelulares de pocos mm, como
las bacterias, lo que les permite mantenerse suspendidos y homogneamente
distribuidos.
CONTADORES ELECTRNICOS
Se hace pasar un volumen conocido de la muestra con microorganismos a travs
de un orificio de 5 a 10 mm de dimetro, mediante la manipulacin con una
micropipeta de mercurio. La resistencia elctrica a travs del orificio est
normalizada y se altera cada vez que un microorganismo pasa a travs de l. La
modificacin de la resistencia se amplifica y se registra electrnicamente.
MTODOS DE CONTEO EN MEDIO DE CULTIVO
Mediante un cultivo de la muestra se detectan nicamente las clulas vivas. En
todos los casos se parte de un volumen o peso de muestra conocido.
Conociendo la procedencia de la muestra se puede esperar la obtencia s de
cuentas bajas o altas o incluso ausencia de organismos. Si se esperan pocos
microorganismos, las muestras se pueden centrifugar o filtrar. Si se esperas
cuentas altas, se puede diluir la muestra en cantidades conocidas del diluyente,
utilizando solucin salina, agua peptonada u otros.
Mtodo de las diluciones y vaciado en placa.
Tcnica de conteo en placa por extensin superficial.
Recuento por filtro de membrana.
Siembra en tubo o recuento del nmero ms probable.
Mtodo de la gota o de miles y Misra
OTROS MTODOS
Determinacin del peso seco, determinacin del Nitrgeno en las clulas
cultivadas, medicin de actividades bioqumicas.
Qu otros colorantes se pueden usar para realizar el mtodo de Breed en
el caso de trabajar con una muestra tipo liquida: leche?
Se puede utilizar:
Azul de metileno de Leffler.
Cristal violeta.
Se puede utilizar un microscopio de fluorescencia, en el cual se utilizar
un tipo decolorante distinto (fluorenscentes) como el azul de anilina
modificado.
Las clulas viables se pueden diferenciar de las no viables, para eso se
puede usar lanaranja de acridina (0,01%), este es el mtodo de recuento
directo con naranja deacridina (AODC).
Tambin se pueden usar coloraciones por los mtodos de Levowitz
Weber o BroadhurstPaley que permiten observar especficamente
clulas somticas en leche.
VIII. BIBLIOGRAFA
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