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Existe una gran variedad de tinciones que pueden ser aplicadas dentro del campo de la
microbiologa.
Las tinciones se pueden clasificar como simples cuando toda la muestra se tie del mismo color
y se utiliza un slo colorante (azul de lactofenol o tinta china); tincin diferencial, cuando se
visualiza ms de un color porque se utiliza ms de un colorante (Gram o Ziehl-Neelsen); tincin
especfica, cuando se utilizan anticuerpos marcados con una molcula fluorescente para
identificar una estructura celular en particular (inmunocitoqumico). El control de calidad de los
mtodos tintoriales es importante, ya que as se asegura que la preparacin de la muestra haya
sido adecuada, por lo que se recomienda realizar al mismo tiempo de la evaluacin de la muestra
clnica, la tincin de un agente infeccioso ya identifi cado mediante esa tincin, el cual funcionar
como un control positivo. Algunas tcnicas tintoriales como Gram o ZiehlNeelsen requieren
antes de su proceso la fijacin de las muestras, con la finalidad de preservar la arquitectura
estructural y qumica de las clulas. Existen dos tipos de fijadores: fsicos y qumicos. Entre los
procesos de fijacin fsicos se tienen los siguientes: desecacin, calor seco, calor hmedo,
ultrasonido y microondas, mientras que los procesos de fijacin qumicos se pueden clasificar
como oxidantes y reductores, de acuerdo con sus propiedades qumicas. Entre los agentes
qumicos oxidantes se encuentran: xido crmico, cido actico, cido pcrico, acetona,
dicromato de potasio. Los agentes qumicos reductores son: formaldehdo, glutaraldehdo,
etanol, metanol, paraldehdo, etctera. Quiz el mtodo fsico con mayor utilizacin en
microbiologa es el calor seco, que consiste en exponer directamente la laminilla a la fl ama del
mechero, con esto se logra detener los procesos vitales de las clulas y los microorganismos. Sin
embargo, la sobreexposicin, o la exposicin en una zona incorrecta de la flama (zona fra, zona
caliente y zona de fusin) repercutir en el efecto deseado; es muy comn provocar alteraciones
morfolgicas y destruccin celular. Este mtodo preserva el extendido por poco tiempo, por lo
que se recomienda utilizar un mtodo qumico, que precipite protenas, antes de teir. Los
mtodos qumicos ofrecen mejores resultados para la fijacin, ya que son lquidos con potencial
alto de difusin intracelular y detienen procesos enzimticos que provocan autolisis. Los
reactivos poseen la capacidad de interactuar con biomolculas como protenas, glicoprotenas,
peptidoglicanos, lpidos, glicolpidos, lipoprotenas, pigmentos, cidos pcticos y nucleicos. El
metanol es el reactivo que se encuentra al alcance de todos los laboratorios; es un reactivo
reductor, deshidratador, y es clasificado como fijador coagulante, de tal manera, coagula
protenas y las hace insolubles, pero sin desnaturalizarlas. Se preserva la arquitectura de la pared
celular y evita la sobrecoloracin. El metanol tiene un potencial reductor mayor que el etanol.
La concentracin ideal es > 12 Investigacin en Discapacidad Las tinciones bsicas en el
laboratorio de microbiologa www.medigraphic.org.mx 99%. El metanol preserva la integridad
de los cidos nucleicos, por lo que tambin es ideal para inmunohistoqumica e hibridacin in
situ .A continuacin se mencionarn las principales tcnicas de tincin utilizadas en
microbiologa, as como su fundamento e interpretacin para realizar la correcta identificacin
de los microorganismos.
TIPOS:
- Giemsa
- Frotis sanguneo
d) Negativas: El fondo se tie de oscuro para observar la clula o estructuras refringentes.
- Cryptococcus neoformans
f) Selectivas: Son utilizadas para dar color y aislar partes especficas de los microorganismos
- Flagelo: Proteus sp
- Ncleo
- Gram
Tincin de Gram
Tincin de Wright
La tincin de Ziehl-Neelsen
Tincin negativa
La tincin negativa fue desarrollada originalmente para microscopia de luz con el fi n de rodear
y delinear las bacterias no teidas u otros materiales biolgicos. Utilizamos diferentes mtodos
de tincin negativa para evaluar estructuras individuales, tan pequeas como las vesculas
sinpticas e incluso de gran tamao, como los microorganismos unicelulares. Este mtodo es
muy til, aunque est limitado por la presencia de un fondo oscuro que no permitir la correcta
identificacin de forma ntida y detallada de los componentes de dichas estructuras. En
microbiologa, la tincin negativa proporciona un resultado presuntivo de la presencia de
Cryptococcus neoformans, microorganismo causante de meningitis en pacientes con
inmunosupresin, siendo la tcnica ms utilizada para poner de manifi esto su cpsula. Este
hongo presenta dos formas durante su ciclo vital: una forma asexual y una forma sexual; en la
primera se presenta como levaduras encapsuladas que se reproducen por gemacin y puede ser
visualizada por medio de la tinta china. El principio es simple, ya que slo se requiere depositar
una gota de la muestra clnica sobre un portaobjetos, posteriormente se coloca el colorante y
se observa al microscopio sin necesidad de fijacin, algunas estructuras difundirn el colorante
y otras no, lo que permitir un contraste de las estructuras observadas. Se han utilizado
diferentes colorantes: uno de ellos es la mencionada tinta china, la cual tie el fondo de la
muestra de un color oscuro y la cpsula del C. neoformans permanece sin teir. La principal
dificultad con la tincin negativa es que los microorganismos tienden a contraerse durante el
periodo de secado; para evitarlo, se ha optado por usar la tincin negativa hmeda, en la cual
los organismos se suspenden en una pelcula de tinta china o mancha oscura y el contorno de la
cpsula puede ser observado sin el peligro de contraccin. Adems de ser una tcnica sencilla,
es muy barata, ya que no requiere equipos o material costoso para su realizacin. Pueden
producirse falsos positivos en presencia de levaduras de los gneros Rhodotorula, Candida y
otras especies de Cryptococcus, igual que por artificios como los leucocitos. Es importante
diferenciar bien la levadura con doble pared refringente, con su cpsula, y siempre hay que
confirmar el diagnstico inicial con cultivo. En los pacientes con diagnstico previo de
criptococosis que se encuentren bajo tratamiento, es probable que la cpsula no se observe, ya
que el tratamiento antifngico est dirigido hacia sta; sin embargo, pueden observarse
estructuras levaduriformes. Adems de proporcionar informacin temprana sobre un
microorganismo patgeno y propiciar as el inicio del tratamiento adecuado, se considera un
examen til para la monitorizacin del tratamiento y pronstico de los pacientes. Se recomienda
utilizar como control negativo una gota de tinta china y colocarle un cubreobjetos; esto
permitir discernir entre burbujas formadas al agregar el cubreobjetos o el acmulo de
partculas que podran crear una zona de aclaramiento que pudiera confundir al realizar la
revisin de las laminillas. Durante el procedimiento de la tincin se deben tener precauciones,
por lo que se debe realizar en una campana de bioseguridad 2A. La muestra ms til para su
aplicacin es el lquido cefaloraqudeo, por la predisposicin que tiene este hongo en los
pacientes inmunosuprimidos para infectar el sistema nervioso central. La cpsula aparece como
un halo claro y ntido en torno a una levadura redonda, delimitada por las partculas de carbn
en suspensin coloidal de la tinta china, exhibiendo un ntido contraste Tincin de azul algodn
de lactofenol El examen microscpico es de gran importancia en micologa para la observacin
de las diferentes especies de hongos de inters clnico. Se deben utilizar tinciones que logren
preservar la integridad de las estructuras fngicas. Para la correcta identificacin de hongos de
inters clnico, ya sea con fines de diagnstico o estudios taxonmicos, es necesario observar las
estructuras fngicas con una alta calidad y contraste; para ello se utilizan diversos compuestos
qumicos que permitan la tincin entre la pared y el citoplasma de las clulas fngicas. La tincin
de azul algodn de lactofenol no es considerada una tincin diferencial, sin embargo, posee
caractersticas tintoriales que permiten observar cada uno de los componentes fngicos y
apreciar fcilmente las estructuras para una adecuada identificacin. El fenol inactiva las
enzimas lticas de la clula e impide que sta se rompa; de igual forma, destruye la flora
acompaante e inactiva a la clula, quitndole el grado de patogenicidad; adems, acta como
mordiente cuando se usa en combinacin con colorantes. El cido lctico preserva las
estructuras fngicas al provocar un cambio de gradiente osmtico con relacin al interior
fngico, lo que genera una pelcula protectora. El azul de algodn es un colorante cido, que
tie el citoplasma y la quitina presente en las clulas fngicas, mientras que el glicerol mantiene
hmeda la preparacin. Una vez preparado el colorante, se debe colocar la muestra
microbiolgica en un portaobjetos por medio de una impronta (proceso en el cual se coloca una
impresin de la muestra sobre una estructura utilizando una cinta adhesiva transparente).
COLORANTES
Un colorante se define como una sustancia capaz de dar color a clulas, tejidos, fibras, etctera.
De acuerdo con su origen, se pueden dividir en: colorantes naturales, los cuales son extrados
de plantas o animales, y colorantes artificiales, que son aquellos de minerales procesados y
manipulados en el laboratorio. Qumicamente, el colorante est constituido de un componente
cromforo y un auxcromo. El cromforo es todo grupo aislado, covalente e insaturado, que
tiene una absorcin caracterstica en la regin ultravioleta o visible; dicho de otra forma, es la
capacidad que tiene la molcula para que sus electrones absorban energa o luz visible, se
exciten y emitan diversos colores de acuerdo con la longitud de emitida como resultado del
cambio en el nivel energtico. Cabe mencionar que esta longitud de onda corresponde al rango
de espectro visible. Los cromforos se pueden presentar en dos formas fundamentales: en
sistemas conjugados pi o complejos metlicos. Los cromforos son principalmente grupos
funcionales con dobles y triples enlaces carbono-carbono, anillos aromticos, grupos carbonilos,
imino, diazo, nitro y enlaces entre carbono-y (y es un tomo con pares libres).Los aux- cromos
son grupos funcionales o radicales que constituyen una molcula y poseen carga parcial positiva;
tienen la funcin de intensificar la formacin de color mediante la accin de grupos de tomos
no saturados; su funcin es desplazar a los cromforos hacia longitudes de ondas largas para
aumentar la intensidad. Los siguientes grupos funcionales son considerados auxcromos: grupo
metilo, halgenos, hidroxi, alcoxi y amino. Aunque los microorganismos vivos se pueden
observar directamente en fresco al microscopio ptico, la mayora de las veces es necesario
teirlos para que por medio del uso de colorantes, sea mucho ms fcil su identificacin;
adems, la presencia de ciertas estructuras, as como su reaccin a determinadas tcnicas, nos
permite clasificar a las bacterias.
Adems son compuestos coloridos que al combinarse con otras sustancias les imparten color;
estn formados por un grupo cromforo que es la parte responsable del color, y un grupo
auxcromo que al formar sales le permite disociarse y combinarse.
Tipos de colorantes azo Las dos principales formas de clasificar los colorantes azo son por, su
estructura qumica y por su mtodo de aplicacin en el teido.
Colorantes cidos
Este trmino se le da a los colorantes capaces de tener interacciones de carga con el sustrato
como la fibra de lana o seda. Los colorantes cidos son compuestos orgnicos aninicos que
requieren para fijarse a la fibra que sta est disponible con sitios catinicos. La ionizacin del
colorante se logra al aplicar junto con l un cido orgnico, puede ser cido actico o sulfrico,
a un pH entre 2-6 unidades. El colorante que sobresale por su produccin es el colorante diazo
Rojo cido.
Colorantes bsicos
Son colorantes cationicos que llevan una carga positiva en la porcin cromfora de la molcula,
aunque tambin la caga puede estar deslocalizada o distribuida a travs de la porcin catinica
del colorante. El catin es formado por protonacin bajo condiciones cidas. En condiciones
alcalinas o neutras estos colorantes se comportan como colorantes dispersos (Cruz, 2003) Estos
colorantes se utilizan a menudo para teir fibras de polister y nylon modificado debido a que
producen alta intensidad de color y mayor brillantez en la fibra que otros colorantes. Se aplican
en solucin acuosa con suficiente cido actico para mantener el pH entre 4 y 6 unidades, tienen
gran capacidad de teido ya que slo 1 mg/l de colorante produce una fuerte coloracin al agua,
adems de que tiene la capacidad de ser adsorbido en muchos minerales y en la materia
orgnica del agua (Kirk-Othmer, 1993).Colorantes azo reactivos Son colorantes aninicos con
varios grupos sulfnicos, que los hacen ser muy solubles en agua.
Permiten observar los organismos suspendidos en un liquido en condiciones de vida normal, sin
sufrir alteraciones ocasionadas por algunos colorantes, permite apreciar la movilidad, los
cambios citolgicos durante el proceso de divisin celular y en la formacin de esporas.
Es cuando entre la lente frontal del objetivo y el preparado existe una sustancia llamada aceite
de cedro con un ndice de refraccin como el vidrio.
En general las bacterias y otros microorganismo son transparentes, lo que dificulta su estuido
cuando los exmenes se realizan en fresco. Por tal razn cuando se quiere conocer los detalles
morfolgicos, es necesario recurrir a tincin, es decir debido a que el ndice de refraccin de las
bacterias y otros microorganismos es muy semejante al del medio de montaje, las bacterias
pueden a menudo no ser visibles al microscopio ptico compuesto. Por ende, es necesario
utilizazr extensiones o frotices de muestras fijadas y teidas.
Como preparar una lmina y laminilla:
Este tipo de preparacin permite observar vivos a los microorganismos y resulta muy til cuando
se quiere determinar su motilidad. Estas preparaciones son muy fciles de realizar, pues slo se
coloca sobre la lmina portaobjeto la suspensin de microorganismos a observar y luego sta se
cubre con una laminilla. Entre los principales inconvenientes que tiene esta preparacin, es que
al no estar los microorganismos teidos, se dificulta su observacin al microscopio y se puede
confundir el movimiento microbiano con las corrientes internas que se producen a causa de la
evaporacin del medio a travs del borde de la laminilla.
PROCEDIMIENTO
PREPARACIN DE LAS LMINAS
Para realizar una coloracin, ya sea simple o diferencial, es necesario como primer paso,
preparar el extendido de la muestra sobre la lmina portaobjeto y fijarlo, para posteriormente
aadir el o los colorantes y observar la muestra teida bajo el microscopio de luz.