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2008
i
Articulo 23 de la R resolucin No 13 de Julio de 1946
La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos
en sus trabajos de tesis. Solo vela por que no se publique nada contrario al dogma y a la
moral catlica y por que las tesis no contengan ataques contra persona alguna, antes
bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia .
ii
VALIDACIN DEL MTODO ANALTICO PARA LA CUANTIFICACIN DE
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para adoptar al titulo de
Microbiloga Industrial
DIRECTORA
VIVIANA PEA PEZ
Microbiloga Industrial
CO-DIRECTORA
JANETH ARIAS PALACIOS
Bacteriloga M.Sc- M.Ed
iii
VALIDACIN DEL MTODO ANALTICO PARA LA CUANTIFICACIN DE
AUTOR
JOHANNA CAROLINA VELANDIA CASTELLANOS
APROBADO
iv
VALIDACIN DEL MTODO ANALTICO PARA LA CUANTIFICACIN DE
AUTOR
JOHANNA CAROLINA VELANDIA CASTELLANOS
APROBADO
v
AGRADECIMIENTOS
A la Microbiologa Industrial Viviana Pea Pez, por ser una gran directora de tesis.
No me habra sido posible llevar a cabo esta investigacin sin su ayuda, sus
conocimientos, su orientacin, gua, perspicacia, su apoyo, dedicacin y por su gran
amistad.
vi
TABLA DE CONTENIDO
Pagina
1. RESUMEN 1
ABSTRACT 2
2. INTRODUCCIN 3
3. REVISIN DE LITERATURA 6
3.1 ANTIBITICOS 6
3.1.1 Definicin 6
3.1.2.3.1 Aminoglucosidos 10
3.1.2.3.2 Anfenicoles 10
3.1.2.3.3 Antimicobacterianos 10
3.1.2.3.5 Glucopeptidos 11
3.1.2.3.6 Lincosaminas 11
3.1.2.3.7 Macrlidos 11
3.1.2.3.8 Penicilinas 11
3.1.2.3.9 Quinolonas 12
3.1.2.3.11 Tetraciclinas 12
vii
3.1.2.3.12 Polipeptidicos 13
3.2 BACITRACINA 13
3.2.1 Descubrimiento 13
3.2.2 Sinnimos 13
3.2.9 Farmacocintica 16
3.2.11 Interacciones 17
3.3.2 Estabilidad 18
3.3.3 Incompatibilidades 18
3.5.2 Caractersticas 20
viii
3.5.3 Bioqumica 21
3.5.4 Patognesis 21
3.6.1 Definicin 22
3.6.3.2 Farmacopeas 23
3.7.1 SELECTIVIDAD 27
3.7.1.1 Definicin 27
3.7.2 LINEALIDAD 29
3.7.2.1 Definicin 29
3.7.3 PRECISION 30
3.7.3.1 Definiciones 30
ix
3.7.3.2 Diferentes tipos de estudio en la precisin 31
3.7.3.2.1 Reptibilidad 31
3.7.3.2.3 Reproducibilidad 32
3.7.4 EXACTIDUD 33
3.7.4.1 Definicin 33
3.7.4.4 Determinacin 34
3.7.5.1 Definicin 35
3.7.6 ROBUSTEZ 36
3.7.6.1 Definicin 36
3.7.7 ESPECIFICIDAD 38
3.7.7.1 Definicin 38
3.7.7.2 Determinacin 38
3.8.1 Generalidades 39
3.8.2 Definiciones 39
x
3.8.2.4 Potencia estimada 40
3.8.3 METODO 40
3.8.4 Validacin 41
3.8.4.1 Linealidad 41
3.8.4.3 Exactitud 42
3.8.4.4 Selectividad 42
5. JUSTIFICACION 45
6. OBJETIVOS 47
7. MATERIALES Y METODOS 48
7.8 Validacin del mtodo de cuantificacin del principio activo (USP, 30) 52
7.8.1 Especificidad 52
xi
7.8.2 Selectividad 53
7.8.6 Exactitud 55
8. RESULTADOS Y DISCUCION 57
9. CONCLUIONES 67
10. RECOMENDACIONES 69
11. REFERENCIAS 70
12. ANEXOS 74
xii
LISTA DE FIGURAS
Pagina
xiii
LISTA DE TABLAS
Pagina
xiv
LISTA DE ANEXOS
Pagina
xv
1. RESUMEN
Se realizo la validacin del mtodo analtico para la cuantificacin de Bacitracina, para ser
utilizado en el control de calidad de materias primas y en los productos farmacuticos con
este principio activo. En el presente trabajo se describi y desarrollo el proceso de
validacin de la valoracin microbiolgica de antibiticos en cilindro-placa (difusin en
agar), para la determinacin cuantitativa de Bacitracina Zinc al 15% y Bacitracina Metilen
Disalicilato al 11%, que incluye los requisitos exigidos en la determinacin de parmetros
analticos de linealidad del sistema, linealidad del mtodo, especificidad, exactitud,
selectividad, limite de deteccin, limite de cuantificacin y la precisin expresada en sus dos
formas: repetibilidad y reproducibilidad.
De esta forma mediante los estudios realizados se establece que las caractersticas de
desempeo analtico cumplen con los requisitos para la aplicacin analtica propuesta
siendo confiable para ser utilizado en la comprobacin de las especificaciones de calidad.
1
ABSTRACT
The validation of the analytical methods method for the quantitative of Bacitracin was carried
out to be used in the quality control in a raw material and the pharmaceutical products
finished with this active principle. In this work was described and developed the validation
process of microbiological cylinder-plate determination method for antibiotics (diffusion in
agar) for the quantitative determination of Bacitracin Zinc 15% and Bacitracin Methylene
Disalicylate 11%, it includes the necessary requirements in the determination of the analytic
parameters: method linearity, system linearity, specificity, exactness, selectiveness,
detection limit, quantification limit and accuracy, which was expressed in its 2 forms:
repeatability and reproducibility.
It was demonstrated by through experimental design, with the statistical evaluation of the
experimental data and having like base the allowed approaches of acceptance that the
analytic method is specific, selective, lineal (r2 0. 993 system linearity, r2 0.995 method
linearity of Bacitracin Zinc y r2 0.99 method linearity Bacitracin Methylene Disalicylate),
precise (CV< 5%), exact (Sesgo < 3% y texp.< ttab.) in the interval of studied concentrations.
The quantification limit and detection limit was 0.02 UI/ml and 0.005 UI/ml respectively. For
that reasons, states that the characteristics of analytic acting fulfill the requirements for the
application analytic proposal, therefore, they are reliable and may be used in the checking of
the quality specifications of the raw material and the pharmaceutical products finished with
this active principle.
2
2. INTRODUCCIN
3
y clostridio. Es tambin activa frente a Actnomyces, Treponema pallidum y algunas
especies Gram negativas, como Neisseria y Haemophilus influenzae; sin embargo, la
mayora de los microorganismos Gram. Negativos son resistentes. (Sweetman, C.
2003). Su espectro de accin abarca tambin, algunos corinebacterias, espiroquetas,
Nocardidia, Entamoeba histolytica. (Trolldenier, 1985). Las salmonellas, E.coli, Proteus,
los hongos y los virus son resistentes. Los grmenes sensibles son inhibidos por una
concentracin comprendida entre 0,005 y 2,0 UI/mg. Los que necesitan 50 UI/mg o mas
se consideran resistentes. (Trolldenier, 1900). La accin de la bacitracina es
bacteriosttica y bactericida. La dosis requerida para que sea bactericida es 5 10
veces mayor. La bacitracina influye sobre importantes sistemas enzimticos. Impide la
construccin de la pared celular bloqueando la desfosforilizacion (Parthier, 1969). La
Bacitracina interfiere en la sntesis de la pared celular bacteriana al bloquear las
funciones de las molculas transportadoras de lpidos que transfieren las subunidades
de la pared celular a travs de la membrana. La Bacitracina se une al undecaprenol-
pirofosfato, bloqueando su desfosforilacin, e impidiendo por lo tanto, la regeneracin
del transportador de membrana.. (Sweetman, C. 2003). En los estafilococos inhibe la
incorporacin del acido glutmico durante la fase de proliferacin. (Trolldenier, 1984)
La Bacitracina y la Bacitracina zinc se aplican por va tpica, a menudo junto con otros
antimicrobianos como la Neomicina o Polimixina B, y algunas veces con
corticosteroides, en el tratamiento de las infecciones locales. La bacitracina se emplea
en infecciones de piel (piodermitis, heridas infectadas, Impetigo contagioso, foliculitis,
furunculosis, ulcera decubitus, dermatitis infecciosa eczematoid, escabiosis, y
dermatofitosis), conjuntivas (causadas por S. aureus, S. pyogenes, entre otros),
sinusitis, faringitis, traqueobronquitis, infecciones mandibulares (actinomicosis),
oculares, entre otros. La bacitracina ha sido efectivamente usada oralmente para el
manejo de amebiasis intestinal, pero se encuentran disponibles otros amebicidas ms
potentes. (Remingtons. 1980)
El presente trabajo tiene como objetivo describir el proceso de validacin del mtodo
analtico para la cuantificacin de Bacitracina efectuado en el laboratorio de VICAR
FARMACEUTICA S.A. mediante estudios de laboratorio que permitan la determinacin
y el estudio de las caracterstica de desempeo analtico para la validacin del mtodo.
5
3. REVISION DE LITERATURA
3.1. ANTIBITICOS
3.1.1 Definicin
El primero que expres el concepto de antibitico fue Waksman (1942): los antibiticos
son sustancias de accin antimicrobiana producidas por microorganismos o plantas
superiores en el curso de su metabolismo normal, sustancias que inhiben el crecimiento
de otros microorganismos en concentraciones mnimas. Esta definicin ha sido
ampliada posteriormente en virtud de los conocimientos adquiridos sobre su obtencin,
y con objeto de deslindar otros productos metablicos: un antibitico es una sustancia
qumicamente definida, producida en el metabolismo de clulas vivas y aislada de ellas
por primera vez, o uno de sus derivados producidos por mtodos sintticos o
biosintticos, el cual ejerce su accin bacteriosttica o bactericida en pequea
concentracin contra microorganismos vegetales y animales.( Brunner y Machek,
1962).
6
2. fase de muerte: inhibicin del crecimiento o muerte de los grmenes. El nmero de
bacterias que sobreviven disminuye espontneamente mientras dura la accin letal si la
concentracin es constante.
3. fase tardida: la reduccin de grmenes disminuye, pero sin que ces por completo.
Esta fase tambin se puede llamar persistencia. (Thrum y Bocker, 1971)
Todos los antibiticos poseen un espectro de actividad conocido sobre los grmenes
patgenos en virtud a su mecanismo de accin especfica. Por los microorganismos o
agentes afectados, dividimos los antibiticos en bacteriostticos, bactericidas,
fungistticos, virostticos, rickettsiostticos y citostticos. En cuanto al nmero de
especies o familias sensibles el espectro de los antibiticos puede ser reducido, medio o
amplio. El espectro es muy variable siendo la mayora de tipo amplio el mayor en
cefalosporinas de 4 generacin, carbapenemas y piperacilina-tazobactam, seguido de
cefalosporinas de 3 generacin incluyendo Gram Negativos, Gram Positivos y
espiroquetas. De espectro ms reducido destacan la bencilpenicilina y
fenoximetilpenicilina (estreptococos y Neisseria), cloxacilina (antiestafilococo) y
aztreonam (slo Gram negativos) y los de espectro medio suelen ser activos frente a
grmenes Gram Positivos y Gram negativos y a ellos pertenecen las penicilinas, los
antibiticos macrlidos, algunos polipeptdicos y los aminoglucosdicos, la amoxicilina-
clavulnico y cefalosporinas de 1 y 2 generacin.(Trolldenier, 1900)
Otra forma de agrupar los antibiticos es en funcin de las "dianas" sobre las que
actan y con las que interfieren:
7
antibiticos no lesionan las clulas humanas ya que stas no poseen pared celular.
(Pareja Iaez, 1998)
A diferencia de los antibiticos que actan a nivel de pared, los que interfieren con la
membrana celular ejercen sus efectos independientemente de que el microorganismo
8
est o no creciendo. Suelen carecer de especificidad (afectan a membranas de
procariotas y de organismos superiores), por lo que resultan ms o menos txicos para
los mamferos y, en general, han encontrado escasa aplicacin clnica. Algunos de los
antibiticos que pertenecen a este grupo son: Polienos, Polimixinas, Imidazoles, entre
otros. (Pareja Iaez, 1998). La Estreptomicina, la Polimixina B y la Colistina, perturban
las funciones de la membrana citoplasmtica que regula las condiciones de
permeabilidad, de tal modo que puede producirse la muerte de la clula por
desregulaciones osmticas. Esta accin no exige divisin celular y es posible tambin
en la fase de reposo. (Trolldenier, 1984)
Esta accin inhibidora del metabolismo no depende tampoco de la divisin celular, pero
se desarrolla con mayor rapidez y seguridad durante la fase de proliferacin.
(Trolldenier, 1900). Algunos de los antibiticos que pertenecen a este grupo son:
Tetraciclinas, Aminoglucsidos, Anfenicoles, Lincosamidas, Macrlidos, entre otros.
(Pareja Iaez, 1998)
9
Sus mecanismos de accin son: a). Por bloqueo de la trascripcin:- Impide que actu la
ARN polimerasa bacteriana que es la que sintetiza el ARN. - Rifampicina. b). Por
bloqueo de la duplicacin del ADN:- Actan inhibiendo la accin de las enzimas que
enrollan y desenrollan la cadena de ADN, estos antibiticos impiden que la cadena se
desenrolle. - Quinolonas: Oflozacino, cinoxacino, norfloxacino. - Novobiocina:
Benzamida. c) Por interferencia en la sntesis de bases nitrogendas:- Impiden la sntesis
de bases nitrogenadas, Adenina, timina, etc. (mtodo exclusivo de las bacterias). -
Sulfamidas - Diaminopirimidinas. Algunos de los antibiticos que pertenecen a este
grupo son: Quinolonas, Ansamicinas, Sulfonamidas, entre otros. (Pareja Iaez, 1998)
3.1.2.3Estructura qumica
3.1.2.3.1 Aminoglucosidos
3.1.2.3.2 Anfenicoles
3.1.2.3.3 Antimicobacterianos
10
utilizan para el tratamiento de tuberculosis, la lepra y otras infecciones micobacterianas.
(Sweetman, 2003).
3.1.2.3.5 Glucopeptidos
3.1.2.3.6 Lincosaminas
3.1.2.3.7 Macrlidos
3.1.2.3.8 Penicilinas
11
principio como una mezcla de penicilinas conocidas como F, G, X y K, a partir del moho
Penicillium notatum. Se obtuvieron mejores rendimientos utilizando P. chrysogenum.
Son bactericidas por medio de su accin inhibitoria sobre la sntesis de la pared
bacteriana. La bencilpenicilina puede considerarse el compuesto original de las
penicilinas y es activa principalmente frente a bacterias grampositivas y Neisseria spp.
Algunas penicilinas son activas frente algunos microorganismos gramnegativos (ejemplo
ampicilina, mecilinam, temocilina, entre otros). (Sweetman, 2003).
3.1.2.3.9 Quinolonas
3.1.2.3.11 Tetraciclinas
12
colera, acne), espiroquetas, algunas micobacterias y algunos protozoos. (Sweetman,
2003)
3.1.2.3.12 Polipeptidicos
3.2 BACITRACINA
3.2.1 Descubrimiento
En Junio de 1943, Una nia de 7 aos llamada Margaret Tracy, ingreso a la sala de
urgencias del Hospital Presbiteriano de Columbia de la ciudad de Nueva York, pues la
haba atropellado un coche, ocasionndole una fractura abierta en la tibia. De esta
herida se tomo una muestra y en el anlisis microbiolgico inicial se determino la
presencia de Staphylococus aureus. Sin embargo, a su vez otras muestras fueron
enviadas al laboratorio de bacteriologa, donde su directora, Balbina Jonson, describi
que el Staphylococus aureus visto en el examen inicial microscpico haba
desaparecido de la noche a la maana. Con la ayuda de Fran L. Meleney y H. Anker,
consiguieron aislar a partir de la muestra de la herida una cepa de un bacilo muy activo
frente S. Aureus, al que dominaron Tracy I. Tras filtrar el caldo de cultivo se detecto la
presencia de un potente antibitico a este antibitico le dieron el nombre de Bacitracina,
de la combinacin del termino bacilo y tracy, apellido de esta nia. (Martn, 2005)
3.2.2 Sinnimos
Bacitracina A: C66H103N17O16S
Bacitracina F: C66H97N15O17S
(Trolldenier, 1900)
(Trolldenier, 1900)
Es un polvo higroscpico de color blanco a amarrillo plido, inodoro o con ligero olor.
Fcilmente soluble en agua; soluble en alcohol, acido actico glacial y metanol; la
solucin en disolventes orgnicos a menudo presenta un residuo insoluble; insoluble en
acetona cloroformo y ter. Estas soluciones se deterioran fcilmente a temperatura
ambiente. Precipita en estas soluciones y se inactiva por sales de algunos metales
14
pesados. (USP 30). Forma sales estables con el cinc y el manganeso, las cuales son
relativamente insolubles (0,23 0,45 % a 25oC). (Trolldenier, 1984)
15
Tabla 1. Espectro de accin de la Bacitracina (Segn Wege, 1969)
3.2.9 Farmacocintica
16
3.2.10 Indicaciones y administracin
3.2.11 Interacciones
17
3.3 BACITRACINA ZINC
3.3.2 Estabilidad
3.3.3 Incompatibilidades
Antibitico polipeptdico. Inhibe la sntesis del mucopptido que forma la pared celular.
De esta manera, impide la formacin de la pared celular y hace a la bacteria
osmticamente sensible, llevndola a la lisis.
18
3.3.5 Indicaciones de uso, dosis recomendadas, vas de aplicacin.
Especies a las que se destina (Pollos, pavos, cerdos, conejos, entre otros) se emplea
como promotor de crecimiento y teraputico para infecciones entricas y superficiales.
Para mejorar la produccin de huevo, la eficiencia alimenticia en la gallina y el peso de
la carcasa o canal. (Abecia et al. 2004), (King et al.1980).
Es un polvo granular de color amarrillo a caf, olor tenue, de sabor amargo, es insoluble
en agua y soluble en alcohol y metanol. (Tianjin XinXing, 2007). Debe almacenarse en
un lugar fro y seco protegido de la luz solar directa y la humedad. (Alpharma Inc. 2007).
19
contagiosa (cresta azul, fiebre del lodo) en pavos, complicada por organismos
susceptibles a la Bacitracina. En cerdos se administra para el tratamiento de la
disentera porcina asociada a Treponema hyodysenteriae. Tambin se est indicado su
uso como mejorador del desempeo y para prevenir o controlar la enteritis necrtica en
pollo de engorde, gallinas de postura y reproductoras, aves de reemplazo y pavos. Es
eficaz en el control de bacterias Gram Positivas y altamente efectivo contra Clostridium
perfringens, causante de enteritis necrtica. (Alpharma Inc. 2007).
Dominio: Bacteria
Phylum Actinobacteria
Orden: Actinomycetales
Familia: Micrococcaceae
Genero: Micrococcus
Especie: M. luteus
3.5.2 Caractersticas
3.5.3 Bioqumica
M.luteus produce pigmentos insolubles en agua de amarrillo crema. Puede crecer sobre
agar de nitrgeno inorgnico y pocos pueden reducir nitrato. Son oxidasa positiva.
M.luteus no produce cido a partir de glucosa o glicerina bajo condiciones aerbicas y
no produce arginina hidrolasa o galactosidasa. Los carbohidratos son oxidados a CO2 y
a agua. (Sciencenet Multimedia Publishing, 2003).
3.5.4 Patognesis
Mientras algunas especies son utilizadas para el mejoramiento del sabor y olor de
productos carnicol fermentados M.luteus han sido usado en la produccin econmica de
hidrocarburos alifticos de cadenas largas (C21 - C34). stos podran ser tiles como
aceites de lubricacin y poder ser sustitutos de productos del petrleo. (Sciencenet
Multimedia Publishing, 2003)
21
3.6 VALIDACION DE METODOS ANALITICOS
3.6.1 Definicin
Definicin General
Definicin Analtica
Son validables los mtodos analticos clasificados en la siguiente forma (AEFI, 2001):
Ensayos de identificacin
Ensayos para la identificacin del analito de inters de una materia prima o de una
especificidad farmacutica.
Ensayos microbiolgicos.
22
3.6.3 Entorno Legal
3.6.3.2 Farmacopeas
No existe una gua oficial que indique la optima secuencia de experimentos analticos
necesarios para el desarrollo de un mtodo, ya que esto depende del mtodo en si
mismo. No obstante, el desarrollo lgico de un mtodo analtico transcurre en diferentes
fases.
23
calificacin del personal, tipo de equipo e instrumentacin, condiciones de seguridad,
entre otras. (AEFI, 2001)
La puesta a punto del mtodo analtico, incluye desde los primeros estudios de tanteo
con patrones, hasta la utilizacin del mtodo en muestras reales que garanticen el buen
funcionamiento del sistema en el momento de anlisis. (AEFI, 2001)
El estudio de robustez se utiliza para optimizar y ver la criticidad del valor de los
parmetros del mtodo antes de validar. A partir de este estudio se definirn las
caractersticas de idoneidad o conjunto de parmetros que garantizan que el sistema
responde, en el momento del anlisis, a los requisitos fijados. Dichas caractersticas se
renen en un ensayo conocidas como ensayo de idoneidad. (System Suitability Test).
(AEFI, 2001)
24
3.6.4.4 Caractersticas de fiabilidad
Esta ltima permitir conocer las caractersticas de fiabilidad del mtodo para su
aplicacin rutinaria. Dichas caractersticas son las que demuestran la capacidad de un
mtodo analtico para mantener a lo largo del tiempo los criterios fundamentales de
validacin. Las caractersticas de fiabilidad comprenden los cinco criterios
fundamentales de validacin. (No necesariamente aplicados a todos los casos) y de los
que derivan en la prctica todos los parmetros de validacin (AEFI, 2001):
Selectividad
Linealidad
Rango
Precisin
Exactitud
Limite de Cuantificacin
Limite de Deteccin
Los requisitos de las pruebas farmacopeicas varan desde valoraciones analticas muy
rigurosas hasta evaluaciones de tributos subjetivos. Considerando esta amplia variedad,
es lgico que diferentes procedimientos de prueba requieran diferentes esquemas de
validacin. A continuacin se indican las categoras de pruebas ms habituales para
las que se exigen datos de validacin segn la USP 30:
25
Para cada categora se requieren diferente informacin analtica. En la Tabla 2 se
indican los elementos de datos que normalmente se requieren para cada una de estas
categoras.
Categora II
Caractersticas de
Desempeo
Categora Categora Categora
Pruebas Pruebas de
Analtico
I III IV
de Limite Limite
Cuantitati Cualitativas
vas y Limite
Exactitud Si Si * * No
Precisin Si Si No Si Si
Repetibilidad Si No Si No
Precisin Si No Si No
Inmediata
Especificidad Si Si Si * Si
Limite de No No Si * No
Deteccin
Limite de No Si No * No
Cuantificacin
Linealidad Ni Si No * No
Intervalo Si Si * * No
26
3.7 CARACTERSTICAS DEL DESEMPEO ANALTICO
3.7.1 SELECTIVIDAD
3.7.1.1 Definicin
27
3.7.1.2 mbito de aplicacin
Los criterios de selectividad que debe satisfacer un mtodo puede diferir dependiendo
de la finalidad con la que se aplique. El grado de selectividad asociado a un mtodo
adquiere mayor relevancia segn su finalidad. En un mtodo de control de calidad de
rutina la exigencia de alguna interferencia se podra aceptar si esta es conocida y de
magnitud aceptable. En estos casos la selectividad puede entrar en conflicto con el
coste y el tiempo necesario para la determinacin del analito. (AEFI, 2001)
28
3.7.2 LINEALIDAD
3.7.2.1 Definicin
Aunque el proceso lgico consistira en evaluar cuales son los limites de concentracin
en los que el mtodo analtico pierde su linealidad, normalmente se toma como punto de
partida un intervalo de concentraciones ya establecido de acuerdo con la experiencia, el
conocimiento analtico de la tcnica empleada y principalmente en funcin de las
especificaciones. (AEFI, 2001)
29
Valoracin de un frmaco o de un producto terminado: de 80% a 120% de la
concentracin de la prueba.
Segn la gua ICH Q2A se estudia la linealidad en todos los mtodos de tipos
cuantitativo:
3.7.3 PRECISION
3.7.3.1 Definiciones
30
3.7.3.2 Diferentes tipos de estudio en la precisin
P R E C IS IO N
R epetibilidad R epetibilidad
Instru mental D el M to do
En la tabla (Huber, 1999) se resumen los factores que pueden o no variar en el estudio
de repetibilidad, precisin intermedia y reproducibilidad.
Estudia la variabilidad del mtodo efectuando una serie de anlisis sobre la misma
muestra en las mismas condiciones operativas (por un mismo analista, con los mismos
aparatos y reactivos, entre otros), en un mismo laboratorio y en un periodo de tiempo
corto. (AEFI, 2001)
Uno de los factores que pueden influir en la repetibilidad del mtodo de anlisis es la
concentracin del analito, ya que la desviacin estndar de las respuestas obtenidas
aumenta al disminuir la concentracin del analito. Por otro lado el valor aceptado del
coeficiente de variacin depende del intervalo de aceptacin especificado en el mtodo
de anlisis. El numero de replicas se deduce a partir del coeficiente de variacin de
repetibilidad del mtodo. (AEFI, 2001)
31
3.7.3.2.1.1 Repetibilidad del sistema instrumental
El ensayo de repetibilidad del mtodo se efecta sobre una serie de alcuotas de una
muestra homognea que se analiza independientemente desde el principio (preparacin
de la muestra) hasta el final (lectura de resultados) por el mismo instrumento y mismo
analista. Se proponen dos alternativas para realizar este estudio: un mnimo de 6
muestras a la concentracin nominal. (AEFI, 2001)
Estudia la variabilidad del mtodo efectuado una serie de anlisis sobre la misma
muestra pero en condiciones operativas diferentes (diferentes analistas, aparatos, das,
entre otros) y en un mismo laboratorio. El objeto del estudio de precisin inmediata es
determinar la variabilidad del mtodo efectuando una serie de anlisis sobre la misma
muestra, en un mismo laboratorio pero en condiciones operativas diferentes. (AEFI,
2001)
3.7.3.2.3 Reproducibilidad
32
tanto la evaluacin de la precisin no es necesaria ni en el ensayo de identificacin ni
en el test limite de impurezas. (AEFI, 2001)
3.7.4 EXACTITUD
3.7.4.1 Definicin
Segn la gua (ICH, Q2A) debe ensayarse la exactitud en mtodos de anlisis para la
valoracin en materia prima y en producto terminado y en mtodos de anlisis de
cuantificacin de impurezas, segn la USP 30 tambin debe evaluarse en mtodos de
anlisis de estudios de la velocidad de disolucin.
33
Impurezas: desde el 50% del nivel de especificacin hasta el 120% de dicho nivel.
3.7.4.4 Determinacin
del procedimiento analtico con respecto a un analito de pureza conocida (por ejemplo
un estndar de referencia), o comparando los resultados del procedimiento con los de
un segundo procedimiento bien caracterizado, cuya exactitud se haya comprobado o
definido. En la valoracin de un frmaco en un producto formulado, la exactitud puede
determinarse mediante la aplicacin del procedimiento analtico a mezclas sintticas de
los componentes del producto farmacutico al que se hayan aadido cantidades
conocidas de analito dentro del intervalo de procedimiento. Si no resulta posible obtener
muestras de todos los componentes del producto farmacutico, se puede aceptar tanto
el agregado de cantidades conocidas del analito al producto farmacutico (Spike)
como la comparacin de los resultados con los de un segundo procedimiento bien
caracterizado, cuya exactitud haya sido comprobada o definida. (USP 30)
3.7.5.1 Definicin
35
3.7.5.2 mbito de aplicacin
Segn ICH Q2B, tanto el LD como el LQ podran determinarse a partir del anlisis de
muestras con concentraciones conocidas y decrecientes del analito, establecindose
visualmente la mnima concentracin detectable como aquella concentracin limite que
permite cuantificar con razonable precisin y exactitud la seal obtenida. (AEFI, 2001)
3.7.6 ROBUSTEZ
3.7.6.1 Definicin
36
empleo. Es por lo tanto la capacidad que demuestra el procedimiento de anlisis para
proporcionar resultados validos en presencia en presencia de pequeos cambios
respecto de las condiciones descritas en el mtodo, susceptibles de producirse durante
su utilizacin. (AEFI, 2001)
Aunque la USP define la robustez junto con los parmetros de validacin de un mtodo
analtico, no es considerado, todava, un requisito necesario para registro de
especialidades, sino que se trata de un estudio que sugiri con el fin de resolver los
problemas que se planteaban en la transferencia de mtodos analticos entre
laboratorios. Las guas ICH recomienda incluir la robustez en una fase apropiada del
desarrollo del mtodo y no en la validacin propiamente dicha , dado que si la robustez
del mtodo no se comprueba con anterioridad a iniciar la validacin, puede suceder que
se intente validar un mtodo poco robusto, con lo consiguientes malos resultados y
perdida de tiempo y dinero. Incluso despus de realizar el estudio de robustez podra
concluirse que se debe modificar algn parmetro del mtodo, obligando a la
consiguiente revalidacin de los puntos necesarios. De hecho la consecuencia directa
de los resultados del estudio de robustez ha de ser la definicin razonada del test de
idoneidad del mtodo, que en muchas ocasiones es fijado de una forma arbitraria y sin
saber la ciencia cierta si los requisitos que impone son realmente necesarios o limitan la
realizacin del mtodo a unas condiciones escasamente reproducibles.(USP, 30)
Todos los mtodos, sea cual sea la tcnica empleada, son susceptibles a ser sometidos
a un estudio de robustez. Algunos pueden tener muchos parmetros sobre los que
37
actuar y otros menos. Adems estos no tienen por que ser solo factores relacionados
con la medida final, sino que pueden ser de cualquier etapa del procedimiento analtico,
Por esto la primera etapa del estudio es precisamente analizar todo el mtodo y definir
que factores son los que se espera que influyan mas en el resultado final. (AEFI, 2001)
3.7.7 ESPECIFICIDAD
3.7.7.1 Definicin
3.7.7.2 Determinacin
38
impurezas en concentraciones adecuadas y la demostracin de que esas impurezas se
determinan con exactitud y precisin adecuadas. (USP 30)
3.8.1 Generalidades
3.8.2 Definiciones
39
Bsicamente la valoracin de antibiticos por difusin en agar se fundamenta en la
difusin del antibitico desde un cilindro vertical (o desde una perforacin circular en el
agar) a travs de una capa de agar solidificada en una placa de petri hasta inhibir
totalmente el crecimiento del microorganismo aadido, en un rea circular o zona de
inhibicin entorno al cilindro que contiene una solucin antibitico. El mtodo
turbidimetrico se basa en la inhibicin del crecimiento de un cultivo microbiano en una
solucin uniforme del antibitico en un medio lquido que promueva su rpido
crecimiento en ausencia del antibitico. (USP 30)
3.8.3 METODO
El diseo mas simple para esta prueba es un ensayo con una curva estndar. Para ello
se prepara el patrn a 5 concentraciones o dosis (A, B, C, D, E) que mantengan entre si
una relacin logartmica, y una solucin de la preparacin a ensayar a una
concentracin terica equivalente a la intermedia del patrn (C). Se considera el ensayo
como preliminar si la potencia de la muestra una vez interpolada en la curva construida
con las respuestas del patrn es inferior al 80% o superior al 120%. En tal caso se
debe preparar la muestra a una concentracin terica mas centrada a la del patrn y
repetir el ensayo. Otro diseo seria del cuadrado latino, en el que la potencia del
problema se determina por comparacin entre una recta constituida por el patrn y otra
constituida por el problema. (AEFI, 2001)
40
Los sistemas biolgicos presentan una variabilidad que obliga a tener diferentes criterios
para verificar y realizar ensayos. Realmente la verdadera potencia se puede encontrar
dentro de un rango de valores que vendr definido por los lmites de confianza de error
calculados para el ensayo, que nos dar los valores de los extremos con una
probabilidad de un 95%.( AEFI, 2001)
3.8.4 Validacin
El ensayo debe disearse de tal forma que permita examinar la validez del mtodo
matemtico en el que se basa la ecuacin de la potencia. Si se escoge el modelo de
lneas paralelas, las dos lneas de logaritmos de dosis-respuesta deben ser paralelas, y
lineales en el rango de dosis usadas en el clculo. Estas condiciones deben verificarse
por ensayos de validacin con una probabilidad P= 0.05. Pueden usarse otros modelos
matemticos si se demuestra su validez. (AEFI, 2001)
Los pasos a seguir para la validacin de una valoracin de antibiticos son segn la
USP 30
3.8.4.1 Linealidad
Demostrar que la recta de regresin construida con la muestra de producto acabado que
contiene el antibitico a las mismas dosis que la recta patrn, presenta una relacin Log.
Dosis-respuesta que cumple con los parmetros de regresin lineal y anlisis de
varianza.
41
media, coeficiente de variacin, limites de confianza de la media y la tolerancia, que
expresa la variabilidad del mtodo respecto al intervalo entre las especificaciones
superior e inferior.
3.8.4.3 Exactitud
Para determinar la exactitud se preparan tres alcuotas de un blanco con los excipientes,
se aaden a una de ellas la cantidad de antibitico correspondiente al limite inferior de
aceptacin, en la otra alcuota se aade la cantidad correspondiente al 100% y en la
tercera la cantidad correspondiente al limite superior de aceptacin. Se efectan las
valoraciones de cada una de las alcuotas y con los resultados obtenidos se comprueba
que se cumplan los parmetros estadsticos que definen la exactitud:
3.8.4.4 Selectividad
42
4. FORMULACION DEL PROBLEMA
44
5. JUSTIFICACION
45
consistentes, que se llevan a cabo por medio de tcnicas y mtodos exactos,
reproducibles y slidos. (WHO Technical Report Series, No 823, 1992)
Por otra parte se encuentran las normas ISO 9000 presentes en un manual de calidad
conciso que establece polticas bsicas fundamentadas en la descripcin de
procedimientos de procesos que reflejen en pocas palabras lo que se hace en la
industria. La norma ISO 9000 busca mejorar y certificar las industrias de manufactura en
el mbito nacional e internacional mediante la estandarizacin de cada uno de los
procesos de produccin (Teormina, 1997). Al ir realizando la validacin de cada uno de
los mtodos analticos que se desarrollan en esta industria farmacutica se estan
alcanzando las pautas para la certificacin de la empresa, alcanzando un alto nivel de
calidad que tiene como resultado el desarrollo, crecimiento y alto grado de
competitividad en la industria farmacutica a nivel nacional e internacional, ser lder en
prestacin de servicios de anlisis de laboratorio, tener reconocimiento del alto nivel de
calidad de los productos que ofrece al consumidor, logrando su misin y visin.
46
6. OBJETIVOS
6.2.3 Evaluar cada una de las caractersticas de desempeo analtico para la validacin
del mtodo.
47
7. MATERIALES Y METODOS
La primera muestra que se utilizo en el anlisis fue Bacitracina Zinc al 15% como
principio activo, de Lote 20071102-6 y potencia asignada 6006 U/g en base seca
(indicada en el certificado de Anlisis por el fabricante).
Los anlisis estadsticos para la Validacin del Mtodo Analtico se realizaron utilizando
Statgraphics Plus for Windows 2.0 (1996). Statistical Graphics Corp. Serial Number:
3862216 para la linealidad del sistema y las linealidades del mtodo y se utilizo
Microsoft Office Exel 2007 para el anlisis de datos de la precisin, exactitud,
selectividad, especificidad, limite de cuantificacin, limite de deteccin, linealidad del
sistema y linealidad del mtodo.
48
7.3 Preparacin y estandarizacin de la suspensin del microorganismo de
ensayo
49
sugerido (0.3ml / 100ml medio) para inoculo por la USP 30. Los volmenes de prueba
que se utilizaron de suspensin madre fueron: 0.3, 0.5, 1.0 y 2.0 ml por cada 100 ml de
medio antibitico No 1 (Anexo 1). Cada volumen de prueba se hizo por triplicado. Se
agrego 6ml de inoculo sobre cada una de las cajas petri con capa de agar base. Se
dejaron las cajas 45 minutos sobre una superficie plana hasta que el inoculo se
solidificara para perforarlas con el sacabocados de 6 perforaciones y se retiro el residuo
de agar de cada uno de los pozos, en cada pozo se sembr 100 microlitros del la
dilucin media del estndar de referencia en una concentracin de 1.0 UI/ml. Se
incubaron las placas de 32 a 35 oC durante 18 horas. Despus del periodo de
incubacin se determino la cantidad de suspensin madre para el inoculo que mostr
una demarcacin satisfactoria de las zonas de inhibicin obtenida por la relacin dosis-
respuesta optima a partir de la cantidad de cultivo del microorganismo en las placas.
(USP, 30)
7.4.2 Diluciones finales del patrn: la valoracin se realizo con 10 niveles (desde A
hasta J) del Estndar. Se preparo a partir de la solucin madre 10 diluciones en
concentraciones de: 0.05 UI/ml , 0.1 UI/ml , 0.15 UI /ml , 0.20 UI/ml , 0.25 UI/ml , 0.50
UI/ml , 1.0 UI/ml, 1.5 UI/ml, 2.0 UI/ml y 2.5 UI/ml utilizando solucin amortiguadora No 1,
1%, pH 6 (Anexo 1) como diluyente ( tabla.4 y 5). La dilucin media utilizada fue de 1.0
UI por ml segn lo especificado en la USP 30.
Volumen de 0.5 UI/ml (ml) Volumen de Diluyente (ml) Concentracion Final (UI/ml)
2 8 0.1
3 7 0.15
4 6 0.2
5 5 0.25
50
Tabla 5. Diluciones de la curva patrn (intervalo de concentraciones 0.5 a 2.5
UI/ml)
Volumen de Solucion Madre (ml) Volumen de Diluyente (ml) Concentracion Final (UI/ml)
1 99 0.5
1 49 1.0
3 97 1.5
2 48 2.0
2.5 47.5 2.5
Para el estudio no fue posible obtener el placebo de cada uno de los productos a
analizar de esta forma se realizo la inactivacin del principio activo para poder analizar
los excipientes presentes en la muestra. Para la desactivar el principio activo se
51
realizaron diluciones madres de cada una de las muestras y se les adiciono 5ml de HCl
1N posteriormente se sometieron 60 minutos a 90 0C en bao de termostatado. Pasado
el periodo de tiempo se adiciono 5 ml de NaOH 1N con el fin de neutralizar la muestra.
Finalmente se afora el balon de 50ml con Buffer 1 al 1% pH6. Se realizaron estudios
para la confirmacin de que no existiera actividad ni presencia de la molcula del
principio activo.
7.8 Validacin del mtodo de cuantificacin del principio activo (USP, 30)
52
se realizo con 3 replicas para cada uno. Se observo si existi o no la formacin de halo
de inhibicin.
Para observar la degradacin por accin de la luz las muestras se colocaron bajo luz
UV por un tiempo de 8 das a luz solar, transcurrido el periodo de tiempo se realizaron
diluciones para obtener una concentracin de 1.0 UI/ml. Una vez que se obtuvieron los
datos de la valoracin de cada una de las condiciones a las que se sometieron las
muestras, se realizo una segunda prueba en la que se llev acabo los mismos
procedimientos solo que el periodo de exposicin a la temperatura cambio siendo de 30
minutos a 90 oC, en las condiciones acidas y bsicas nicamente. Se realizo esta
segunda prueba ya que los resultados que se obtuvieron mostraron una degradacin
53
total de la molcula del principio activo al ser sometidas a 90oC en bao de mara
durante 1 hora en las diferentes condiciones, por esta razn se analizo en un periodo de
tiempo mas corto para determinar si la respuesta de la molcula era la misma en un
periodo de tiempo mas corto en las mismas condiciones de prueba.
7.8.3 Linealidad del sistema: Para el estudio de la linealidad del sistema se prepar
una curva de calibracin en un intervalo de concentracin desde 0.05 hasta 2.5 UI/ml,
que incluy 10 niveles de concentraciones diferentes (0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.5,
1.0, 1.5, 2.0 y 2.5 UI /ml) del Estndar de Referencia USP Bacitracina (Ver Tabla. 6). El
anlisis se realiz por triplicado en cada concentracin. Los niveles de concentracin se
encuentran dentro de los intervalos establecidos para el tipo de anlisis (80% 100%
120% 140%).
7.8.4 Linealidad del mtodo: para esta determinacin se analizo el mtodo preparando
10 muestras de diferentes niveles de concentracin de analito de muestra. Las
concentraciones verificadas previamente, son las mismas que se utilizaron en la
linealidad del sistema. El intervalo de concentraciones se utilizo desde 0.05 hasta 2.5
UI/ml que incluy 10 niveles de concentraciones diferentes (0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25,
0.5, 1.0, 1.5, 2.0 y 2.5 UI /ml) del Estndar de Bacitracina mas placebo. De cada una de
las concentraciones se realizaron 3 replicas. A cada una de las diluciones se le adiciono
1ml de placebo antes de aforar los balones con Buffer 1 al 1% pH6. El placebo se
obtuvo sometiendo una solucin madre de muestra a una hidrlisis acida con 5ml de
HCl 1N posteriormente se someti a 60 minutos a una temperatura de 90 oC en bao
termostatado transcurrido el tiempo se neutralizo con 5ml de NaOH 1.0N. De esta
forma se inactivo el principio activo y la muestra represento el placebo.
54
7.8.5 Precisin del mtodo: a una muestra de concentracin nica que represent el
100,0% de la cantidad terica declarada se le realizo dilucin hasta obtener una
concentracin de 1.0 UI/ml; se efectuaron las valoraciones por 2 analistas en 2 das
diferentes en la que cada analista realizo diluciones para obtener muestras de
concentracin de 1.0UI/ml del estndar y las muestras para ser analizadas. Para su
evaluacin se realiz un anlisis de varianza. De la muestra se realizaron 3 replicas por
analista y para cada da de anlisis.
55
Tabla. 7 Diluciones del las muestras para determinar el limite de deteccin
Una vez finalizado el anlisis se genero informe de validacin y de acuerdo con los
resultados obtenidos se concluyo y se demostr estadsticamente que el mtodo es
adecuado para el propsito determinado, es decir que posee un alto grado de
confiabilidad que puede ser aplicado a un amplio numero de muestras y matrices que
es practico con respecto al costo y el tiempo requerido en el anlisis.
56
8. RESULTADOS Y DISCUSIN
8.1 ESPECIFICIDAD
El mtodo tiene la capacidad de diferenciar precisa y especficamente el principio activo
de Bacitracina Zinc y Bacitracina Metilen Disalicilato, en presencia de los dems
componentes como lo son el diluyente utilizado y el placebo, que se espera estn
presentes en la matriz de la muestra. (WHO Technical Report Series, No 823, 1992)
A partir de los resultados obtenidos de la especificidad presentados en el Anexo 5 y 6
se muestra evidencia de que el procedimiento no resulta afectado por la presencia del
diluyente o excipientes, ya que al sembrar el placebo y el diluyente en las placas de
valoracin no se observo formacin de halo lo que demuestra que estos no intervienen
en la formacin de halo al cuantificar el principio activo. Al sembrar la concentracin
central del principio activo en las placas de valoracin se observo la formacin de halos
de inhibicin en de Bacitracina Zinc y en Bacitracina Metilen Disalicilato.
8.2 SELECTIVIDAD
En el Anexo 8 y 7 se presentan los porcentajes de degradacin de cada una de las
muestras (M1 estndar, M2 muestra y M3 placebo) en los tratamientos con Bacitracina
Zinc y Bacitracina Metilen Disalicilato sometidas a condiciones externas de temperatura,
radiacin UV, condiciones acidas y condiciones alcalinas. .
57
A partir de los porcentajes de degradacin se observa como la molcula al ser expuesta
a condiciones acidas y bsicas presenta degradacin coincidiendo con la informacin
obtenida en cuanto a la estabilidad de la Bacitracina, determinando que esta es
rpidamente inactivada en soluciones que tienen un pH mayor a 9 y menores de 4.
(McEvoy, G.K., 1993)
Se observo una degradacin apreciable al someter las muestras durante ocho das a
radicacin solar directa, el Estndar Bacitracina (M1) presento un porcentaje de
degradacin de 18.4%, a partir de este se determina que el principio activo es afectado
por la radiacin UV. La muestra Bacitracina Zinc (M2) y muestra Bacitracina Metilen
Disalicilato (M2) mostraron una degradacin mucho mas acentuada presentando un
82.6% y 76.6% de degradacin correspondientemente siendo mas sensibles a la
exposicin de luz solar durante un periodo mayor o igual a 8 das. Al someter las
muestras a una temperatura de 90oC durante un periodo de una hora se obtuvo un
porcentaje de recuperacin de: 22.1% en el Estndar Bacitracina (M1), 75.5% en
Bacitracina Zinc (M2) y 73.0% en Bacitracina Metilen Disalicilato (M2). Se determino
que los principios activos son susceptibles o pierden su estabilidad al someterlos a altas
temperaturas, aunque el Estndar de Bacitracina presento un porcentaje de
degradacin mas bajo es afectada igualmente. Los dos tipos de Bacitracina tuvieron un
porcentaje de degradacin muy cercano lo cual nos muestra que las dos se ven aun
mas afectadas al someterlas a altas temperaturas y que las dos responden de igual
manera al someterlas a 90oC por una hora.
58
esto puede deberse a la presencia de una sustancia de degradacin en los excipientes
del producto farmacutico, que hace que la muestra genere un mayor halo de inhibicin
y por lo tanto un porcentaje mayor de degradacin.
59
La curva de calibracin realizada entre el logaritmo de la concentracin en la variable
dependiente (Y) y el dimetro del halo (mm) en la variable independiente (X) result ser
lineal en el intervalo de concentraciones comprendidas entre 0,05 y 2,55 UI/mL. Al
aplicar la regresin lineal a los datos se obtuvo la ecuacin de la recta que se expres
segn y = 0.168504x 4.19447 (LogConc= -4.19447 + 0.168504*Dimetro). El
coeficiente de correlacin fue de 0,997576. (R-squared = 99.5158 percent). (Anexo 3)
La regresin lineal obtenida es el diseo del modelo matemtico, representado como
una ecuacin, que permite establecer o simular el comportamiento de la variable
dependiente con respecto a la variable independiente. En el Anexo 3. se muestra la
curva de calibracin para Bacitracina (Estandar) teniendo una regresin lineal y un
coeficiente de correlacin de 0.997576 hasta una concentracin de 2.55 UI/ml arriba de
esta concentracin el sistema puede perder su respuesta lineal (Reyes Aguero C.,
2007). Dentro del intervalo de concentraciones 0.05 y 2.55 UI/ml se puede construir una
curva de calibracin lineal en el rango lineal.
El coeficiente de correlacin obtenido es nuestro ndice estadstico que mide la relacin
lineal entre las dos variables cuantitativas (log de concentracin y dimetro). Este mide
la correlacin entre la variable dependiente xi (Dimetro halo) y una variable
independiente yi (Log de concentracin), El coeficiente de correlacin obtenido es muy
cercano a 1 existiendo una correlacin positiva casi perfecta. El ndice indica que existe
una dependencia total entre las dos variables denominada relacin directa: cuando el
halo tiene un mayor dimetro (mm) la concentracin (UI/ml) del principio activo es
mayor, es decir cuando una de las variables aumenta, la otra tambin lo hace en
idntica proporcin. (Reyes Aguero C., 2007).
60
dependiente con respecto a la variable independiente. En el Anexo 4. se muestra la
curva de calibracin para Bacitracina (Estandar) teniendo una regresin lineal y un
coeficiente de correlacin de 0.980127 hasta una concentracin de 2.55 UI/ml arriba de
esta concentracin el sistema puede perder su respuesta lineal (Reyes Aguero C.,
2007). Dentro del intervalo de concentraciones 0.05 y 2.55 UI/ml se puede construir una
curva de calibracin lineal en el rango lineal.
El coeficiente de correlacin obtenido es nuestro ndice estadstico que mide la relacin
lineal entre las dos variables cuantitativas (log de concentracin y dimetro). Este mide
la correlacin entre la variable dependiente xi (Dimetro halo) y una variable
independiente yi (Log de concentracin), El coeficiente de correlacin obtenido es
cercano a 1 existiendo una correlacin positiva. El ndice indica que existe una
dependencia total entre las dos variables denominada relacin directa: cuando el halo
tiene un mayor dimetro (mm) la concentracin (UI/ml) del principio activo es mayor, es
decir cuando una de las variables aumenta, la otra tambin lo hace en idntica
proporcin. (Reyes Aguero C., 2007).
Se observo como la recta de la regresin constituida con el dimetro del halo y su
respuesta en la concentracin cumple con los parmetros establecidos del coeficiente
de correlacin. En los resultados obtenidos (Anexo 2, 3 y 4) del coeficiente de
correlacin ninguno fue menor o igual a 0.95, de esta forma se encuentra en los criterios
de aceptacin.
Los valores obtenidos en el P-value en los anlisis de varianza (ANOVA) (Anexo 2, 3 y
4) realizados a cada una de las Bacitracinas es menor a 0.01, lo que muestra evidencia
estadsticamente significativa de la relacin entre el logaritmo de la concentracin y el
dimetro del halo con un nivel de confianza del 99%. De esta forma cumple con los
criterios de aceptacin.
En el Anexo 2, 3 y 4 se muestra el anlisis de la varianza de cada una de las
Bacitracinas, a partir de estos resultados se puedo concluir que existen diferencias
significativas entre las concentraciones establecidas dentro de un intervalo de 0.05
hasta 2.55. Es decir que las concentraciones que se trabajaron presentaron diferencia
en sus halos y de esta forma se puede establecer diferencia entre las concentraciones
para as poder realizar una cuantificacin del principio activo.
8.6 PRECISIN
La desviacin estndar obtenida en cada uno de los Grupos nos muestra la medida del
grado de dispersin de los datos del valor promedio o media. Valores grandes de la
desviacin estndar indican que los datos (puntos) estn lejos de la media y valores de
la desviacin estndar pequeos indica que los datos estn agrupados cerca de la
media. (AEFI, 2001) En todos los grupos la desviacin estndar obtenida es
relativamente pequea indicando que existe una agrupacin de datos muy cercanos
alrededor de la media. La desviacin estndar de cada uno de los grupos de medidas
nos indican la precisin de estas, ya que se muestra que tan lejos estn estas del valor
real o media al ser realizado en diferentes condiciones (da, analista, equip) pero con
una misma muestra. Las desviaciones estndar que se obtuvieron fueron de valores
pequeos lo que indico que no se observo una diferencia significativa entre los datos de
los grupos siendo un mtodo preciso.
El coeficiente de variacin (CV) en cada una de los grupos de datos para la repetibilidad
y para la reproducibilidad no fue mayor al 5% mostrando que el mtodo cumple con los
parmetros establecidos, siendo el ensay repetitivo.
Las medias de cada uno de los analistas en dos das, de cada uno del analista en un
mismo da, los dos analistas en un mismo da, o presentaron diferencias significativas lo
cual muestra la buena repetitibilidad del mtodo y reproducibilidad. No se observaron
diferencias significativas entre las medias de ambos analistas, por tanto el mtodo
analtico fue reproducible por ambos analistas, de igual forma no se detectaron
diferencias significativas entre las medias de ambos das siendo el mtodo analtico
reproducible en diferentes das. De esta forma el mtodo analtico posee repetibilidad
en diferentes das y por diferentes analistas, al igual que diferentes das por el mismo
analista.
Con un nivel de confianza de 95% que se corresponde con valores de 0.05 informa
con un 95% de seguridad que nuestro valor estimado se encuentra en un intervalo de
confianza. Los valores obtenidos de los intervalos de confianza (Anexo 9 y 10),
muestran los valores que componen el intervalo dentro de la cual se considera que se
encuentra el verdadero valor de aquella caracterstica que se esta estimando, el
dimetro del halo en mililitros con respecto a la concentracin del principio activo.(AEFI,
2001)
El coeficiente de variacin obtenido en la precisin del sistema fue menor al 5%, de esta
forma se encuentra dentro del criterio de aceptacin establecido. La desviacin estndar
obtenida muestra la dispersin de los 10 datos obtenidos con respecto a su media.
(Anexo 11).
63
8.7 EXACTITUD
Como forma de medir la dispersin de los datos hemos determinado la homogeneidad
de variancias. La varianza es una medida de dispersin que nos permite conocer que
tanto se dispersan los datos alrededor de su promedio o media. Los valores obtenidos
de la variancia de cada uno de los tratamientos con Bacitracina se muestran en los
Anexos 12 y 13, estos valores nos permiten identificar la diferencia promedio que hay
entre cada uno de los valores respecto a su punto central (la media). En el tratamiento
con Bacitracina Zinc los datos que presentaron la menor dispersin alrededor de su
media fue la concentracin 120% con una variancia de 0.311 y en el tratamiento con
Bacitracina Metilen Disalicilato los datos que presentaron la menor dispersin alrededor
de su media fue la concentracin 120% con una variancia de 0.062.
A partir del estudio de la homogeneidad de variancias por medio del test de Cochran, se
obtuvo el Valor Gexp=0.682 en Bacitracina Zinc y Gexp=0.790 en Bacitracina Metilen
Disalicilato que son inferiores al G3-.2-.0.05 (0.8709) (Anexos 12 y 13). Se acepta la
hiptesis de homogeneidad (igualdad) de variancias de las 3 poblaciones de origen, ya
que Gexp=0.682 en Bacitracina Zinc y Gexp=0.790 en Bacitracina Metilen Disalicilato es
inferior a G3-.2-.0.05 ( 0.8709).es decir que las variancias son homogneas. La hiptesis de
igualdad de variancias no se rechaza por que el valor G obtenido no es superior al
correspondiente valor G (K,v,) dado por la tabla e la prueba de COCHRAN. Los valores
optenidos de Gexp son mayores a 0.05 lo que indica que no hay diferencias significativas
en las variancias por lo que hay homogeneidad de variancias.
Los valores obtenidos del sesgo (e%) en cada uno de los tratamientos con Bacitracina
se muestran en los Anexos 12 y 13. Los valores obtenidos del sesgo es el error
sistemtico, que se produce de igual modo en todas las mediciones que se realizan de
la magnitud. Este puede estar originado en un defecto del instrumento, en una
particularidad del operador o del proceso de medicin, entre otros. (Vaqu. J, 2007).
Ninguno de los valores que se obtuvieron del e% fue mayor al 3% lo que nos indico que
se encuentran dentro de los criterios de aceptacin. El tratamiento que presento menor
error sistemtico fue el tratamiento de Bacitracina Zinc con un e%=1.24, el tratamiento
con Bacitracina Metilen Disalicilato presento un e%= 2.2 tambin entra en los criterios
de aceptacin pero con un mayor error sistemtico que el tratamiento con Bacitracina
Zinc.
De acuerdo con la prueba t de Student se obtuvo un Valor texp 1.208 para Bacitracina
Metielen Disalicilato y un Valor texp 0.39 para Bacitracina Zinc valores son menores a lo
que indica para p= 0.05/2 y v= 8 tiene un valor de 2.306: no hay diferencia significativa
64
entre la recuperacin de la media obtenida y el 100% por lo que la exactitud es
conforme.
65
una muestra que puede cuantificarse en las condiciones experimentales indicadas. De
esta forma; se determina que el mtodo es capaz de cuantificar en forma confiable
cantidades mnimas de Bacitracina en una muestra, siempre que tengan una
concentracin igual o mayor a 0.02 UI/ml .
66
9. CONCLUSIONES
9.4 Las molculas del principio activo disminuyen su actividad al someterlas a una
temperatura de 90oC por periodos mayores o iguales a una hora y al someterlas a
radicacin solar UV durante un periodo de ocho das, por esta razn se debe mantener
el principio activo a temperatura ambiente y protegido de la luz solar.
9.5 La exactitud del mtodo analtico cumple con los parmetros y/o criterios de
aceptacin, concluyendo que los resultados de la prueba obtenidos mediante el
procedimiento establecido bajo condiciones descritas posee una proximidad al valor
verdadero.
9.7 Los resultados en la precisin mostraron que los coeficientes de variacin son
aprobados, si el valor aceptable debe ser menor o igual que 5%, los coeficientes de
variacin resultaron ser menores que 5%, lo cual demuestra la buena repetibilidad del
mtodo de cuantificacin..
67
9.9 A partir del anlisis cuantitativo se determino el limite de cuantificacin en la
concentracin de 0.02 UI/ml de Bacitracina, esta concentracin corresponde a la mas
baja cantidad de Bacitracina que puede determinarse cuantitativamente con precisin y
exactitud aceptables observando claramente la formacin de halo.
9.10 Los resultados permiten concluir que el mtodo analtico para la cuantificacin de
Bacitracina presenta resultados de linealidad, especificidad, precisin y exactitud
satisfactorios que permiten obtener resultados seguros y confiables en la deteccin y
cuantificacin de Bacitracina en las muestras al 15% y 11%.
68
10. RECOMENDACIONES
Para la correcta cuantificacin del analito de inters se requiere que la seal producida se
deba inequvocamente a su presencia y que no existan interferencias de sustancias y/o
compuestos de degradacin cidos o bsicos que puedan estar presentes en la muestra, su
preparacin, condiciones instrumentales y/o material de trabajo. Es importante verificar que
estas sustancias interferentes y compuestos de degradacin estn ausentes para no generar
interferencia significativa en el resultado.
El estudio de muestras de principio activo a condiciones de estrs, tales como exposicin a
altas temperaturas y radiacin UV, permiti identificar la presencia de compuestos de
degradacin potencialmente interferentes, razn por la cual es importante que durante los
procesos de fabricacin, empaque, almacenamiento y en los anlisis de control de calidad
no se exponga el producto a ambientes con temperaturas superiores a 90C y a radiaciones
UV.
Si se desarrolla el mtodo analtico dentro del rango de concentraciones 0.05 UI/ml hasta
2.55UI/ml se obtendr una respuesta de tipo lineal, obteniendo resultados que son
directamente proporcionales a la concentracin del analito dentro de la muestra.
Por medio de este mtodo analtico bajo las condiciones experimentarles descritas, la
mnima cantidad de analito presente en una muestra que se puede cuantificar con razonable
certeza, precisin y exactitud es de 0.02 UI/ml. Y la mnima cantidad de analito en una
muestra que se puede detectar pero no cuantificar es de 0.005 UI/ml, razn por la cual se
sugiere realizar la cuantificacin del analito en muestras que contienen concentraciones
iguales o mayores a 0.02 UI/ml evitando as falsos positivos.
69
11. REFERENCIAS
http://www.farquimica.com/catalogo/espanol/catalog/default.php?cPath=139&PHPSESSI
D=30b5e6992df73dfe99ef90f595cc5169. Consulta: 10 Marzo 2008
<http://www.uch.ceu.es/principal/eponimos_cientificos/inicio.asp?menusuperior=>.
Consulta: 10 Octubre 2007.
Bacitracin Methylene Disalicylate (BMD) 10% 11%, Powder Granular, Premix. Tianjin
XinXing, 2007). Tianjin XinXing Veterinary Pharmaceutical Factory, The South of
Huozhuang Bridge, Beichen District Tianjin Tianjin 300402 China.
http://buy.ecplaza.net/search/1s1nf20sell/bacitracin_methylene_disalicylate.html.
Consulta: 10 Marzo 2008
70
40 Hastings Road, Hawthorn East, 3123, Victoria, Australia.
/www.microbionet.com.au/mluteus.htm. Consulta: 10 Marzo 2008
BRUNNER, R., UND MACHEK, G...1962: Die antibioka, Band I, 1. Teil. Verlag Hans
Carl, Nurnberg.
ICH- Techical Coordination- R. Bass, (1998); ICH Topic Q1A Stabilitu testing Guidelines:
Stabilitesting of new drug substances and product.
Errores y Sesgos. (Vaqu Josep, 2007). Hospital Universitari Vall dHebron. Facultad
de Medicina UAB. Consulta: 10 Mayo 2008
www.vhebron.net/preventiva/docencia/mastphoenix/t12_validez_sesgos_diapos_fx.pdf -
MCEVOY, G.K. ed. 1993.. American Hospital Formulary Service - Drug Information 93.
Bethesda, MD: American Society of Hospital Pharmacists, Inc., 1993 (Plus Supplements,
1993)., p. 325
71
NEGWER, M. 1971. Organisch-chemische Arzneimittel und ihre Synonyma. Akademie-
Verlag, Berlin.
http://www.uacj.mx/transparencia/Acervo/Documentos/Ensayos%20en%20el%20laborat
orio%20ambiental%20-IIT/PR-IIT-143.pdf. Consulta: 1 Mayo 2008
Statgraphics Plus for Windows 2.0 (1996). Statistical Graphics Corp. Serial Number:
3862216
72
THRUM, H., UND BOCKER, H.1971.:Antibioka Woher, wofur?, Urania-Verlag, Leipzig-
Jena-Berln
73
11. ANEXOS
Peptona de casena
Cloruro sdio
Agar-agar
Dextrosa1.0 g/L
Ajustar pH com acido fosfrico 18N o hidrxido de potasio 10N a 6.0 +/-0.05
74
ANEXO 2. LINEALIDAD DEL SISTEMA
-----------------------------------------------------------------------------
-----------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------
Standard T
-----------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------------------
75
Analysis of Variance
----------------------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------------------
The StatAdvisor
---------------
fitted model is
Since the P-value in the ANOVA table is less than 0.01, there is a
the variables. The standard error of the estimate shows the standard
76
-----------------------------------------------------------------------------Plot of the residuals
0,09
0,06
Log concentracin
0,03
-0,03
-0,06
-0,09
0 2 4 6 8 10
Dimetro
-----------------------------------------------------------------------------
F table 113.49
77
BACTRAN
LINEALIDAD DEL SISTEMA BACITRACINA
78
Anlisis de la Varianza de la Linealidad del Sistema
si p<0.05 rechazo la Ho
si p>0.05 acepto la Ho
Si p >0.05 acepto la Ho
Si p<0.05 rechazo la Ho
Si p<0.05 rechazo la Ho
Si p>0.05 acepto la Ho
------------------------------------------------------------------------------------------
data: resultado$residuals
-----------------------------------------------------------------------------
-----------------------------------------------------------------------------
Standard T
-----------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------
80
Analysis of Variance
----------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------
-----------------------------------------------------------------------------
The StatAdvisor
---------------
fitted model is
Since the P-value in the ANOVA table is less than 0.01, there is a
the variables. The standard error of the estimate shows the standard
81
---------------------------------------------------------------------------Plot of the residuals
0,11
0,08
Log concentracin
0,05
0,02
-0,01
-0,04
-0,07
0 2 4 6 8 10
Dimetro (mm)
-----------------------------------------------------------------------------
F table 1644.21
Confidence level 95
82
BACTRAN 15%
LINEALIDAD METODO BACITRACINA
Curva Estndar
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Total Promedio Promedio corr.
S 7-G 24,86 24,61 24,39 24,12 24,74 24,81 24,22 25,07 24,47 221,29 24,59
S 1-A 16,01 16,49 16,48 15,70 17,41 6.38 16,77 17,02 16,90 132,78 16,60 16,91
S 7-G 24,80 24,91 24,85 24,56 25,30 24,16 14,72 25,06 24,75 213,11 23,68
S 2-B 19,10 18,94 18,59 17,81 17,06 18,22 18,29 16,83 18,04 162,88 18,10 19,32
S 7-G 24,53 24,63 24,77 24,74 24,41 24,34 24,65 24,33 24,69 221,09 24,57
S 3-C 19,98 19,28 20,27 18,45 18,61 19,37 19,70 20,40 19,79 175,85 19,54 19,87
S 7-G 24,89 24,85 24,89 25,65 25,81 24,98 25,00 25,10 24,90 226,07 25,12
S 4-D 21,26 21,47 20,27 20,59 21,28 20,66 21,39 20,78 20,49 188,19 20,91 20,69
S 7-G 24,77 24,95 24,92 25,30 24,63 25,05 25,02 24,81 24,49 223,94 24,88
S 5-E 21,50 21,35 21,01 21,03 21,66 21,15 21,69 21,42 21,73 192,54 21,39 21,41
S 7-G 24,70 25,19 25,23 24,49 24,31 24,27 24,59 25,02 25,30 223,10 24,79
S 6-F 24,69 24,16 24,18 23,10 22,49 22,29 22,84 22,94 23,78 210,47 23,39 23,50
S 7-G 25,19 24,72 24,78 24,97 24,87 24,46 24,42 24,36 24,98 222,75 24,75
S 8-H 25,60 25,89 25,54 26,30 26,55 26,33 26,24 26,45 25,86 234,76 26,08 26,23
S 7-G 25,08 24,49 24,83 24,80 24,88 24,75 24,83 25,20 24,59 223,45 24,83
S 9-I 26,52 26,33 26,19 26,54 25,72 26,95 26,63 26,52 26,62 238,02 26,45 26,52
S 7-G 25,00 25,20 25,04 24,20 24,66 24,40 25,26 24,32 24,88 222,96 24,77
S 10-J 28,41 27,57 27,60 26,90 26,79 26,43 26,50 27,24 26,30 243,74 27,08 27,21
24.9024.9
CURVA ESTANDAR DATOS ESTANDAR 24
Puntos Dimetro Concentracin Log (Conc.) Peso (mg) 17,0
(mm) (mg/ml) Potencia (P) UI/mg 75,1
S1 16,91 0,05 -1,3010 Fecha de Vencim iento N.A
S2 19,32 0,10 -1,0000 Lote N1E200
S3 19,87 0,15 -0,8239 DATOS
S4 20,69 0,20 -0,6990 Pendiente 0,1278
S5 21,41 0,25 -0,6021 Intercepto -3,1322
S6 23,50 0,51 -0,2924 Factor de Dilucion (D) 1250
S7 24,66 1,02 0,0086 Promedio General
S8 26,23 1,53 0,1847 Concentracion Central 24,90
S9 26,52 2,04 0,3096
S10 27,21 2,55 0,4065 Pr T (X S 3 )es mayor que Pr R= Suma
Pr T (X S 3 )es menor que Pr R= Resta
83
Anlisis de la Varianza de la Linealidad Bacitracina Zinc
si p<0.05 rechazo la Ho
si p>0.05 acepto la Ho
Si p >0.05 acepto la Ho
Si p<0.05 rechazo la Ho
Si p<0.05 rechazo la Ho
Si p>0.05 acepto la Ho
--------------------------------------------------------------------------------------------
data: resultado$residuals
Si hay diferencias significativas entre los tratamientos con zinc (Kruskal-Wallis p< 0.05)
84
ANEXO 4. LINEALIDAD DEL MTODO BACITRACINA METILEN DISALICILATO
-----------------------------------------------------------------------------
-----------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------
Standard T
-----------------------------------------------------------------------------
85
Analysis of Variance
----------------------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------------------
-----------------------------------------------------------------------------
The StatAdvisor
---------------
fitted model is
Since the P-value in the ANOVA table is less than 0.01, there is a
the variables. The standard error of the estimate shows the standard
86
0,6
Log concentracin
0,2
-0,2
-0,6
-1,4
18 20 22 24 26 28
Dimetro (mm)
---------------------------------------------------------------------------Plot of the residuals
0,15
0,1
Log concentracin
0,05
-0,05
-0,1
-0,15
0 2 4 6 8 10
Dimetro
-----------------------------------------------------------------------------
F table 195.30
Confidence level 95
87
BACT R AN 11%
LINEA LID AD M ETOD O B A CITR A CINA
Curva Estndar
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Total Prom edio Prom edio corr
S 7-G 23,58 23,66 23,76 22,98 23,80 23,66 24,18 23,50 23,57 212,69 23,63
S 1-A 17,09 17,91 17,37 17,70 16,91 17,40 17,14 17,80 17,09 156,41 17,38 18,65
S 7-G 22,80 23,54 23,23 24,03 24,33 24,29 23,63 24,50 23,80 214,15 23,79
S 2-B 16,99 17,30 17,37 18,42 18,10 18,66 16,61 17,68 16,52 141,04 17,63 18,74
S 7-G 24,04 23,41 23,35 23,19 23,70 23,58 23,60 23,12 23,22 211,21 23,47
S 3-C 16,98 18,20 18,42 17,50 17,06 17,94 17,87 18,23 17,58 159,78 17,75 19,19
S 7-G 23,02 23,51 22,82 23,99 23,64 23,46 23,57 22,66 22,40 209,07 23,23
S 4-D 18,36 18,82 18,22 19,38 18,37 18,26 17,16 17,90 18,81 165,28 18,36 20,03
S 7-G 23,10 23,18 24,15 23,41 23,82 24,02 23,44 23,20 23,67 211,99 23,55
S 5-E 18,73 18,87 19,14 18,77 19,41 19,42 18,73 19,70 19,63 172,40 19,16 20,50
S 7-G 23,20 20,09 23,01 23,77 23,25 24,43 23,26 23,18 23,33 207,52 23,06
S 6-F 20,84 20,54 21,90 20,11 20,86 21,04 20,54 20,45 21,07 187,35 20,82 22,66
S 7-G 23,90 23,32 23,68 22,94 23,24 23,20 23,92 23,75 23,54 211,49 23,50
S 8-H 24,57 23,53 23,03 23,93 23,95 23,58 23,17 23,72 23,72 213,20 23,69 25,09
S 7-G 24,80 23,62 23,38 23,31 23,60 23,22 23,58 23,06 23,22 211,79 23,53
S 9-I 24,13 25,01 25,60 24,21 24,18 24,19 24,68 25,50 24,93 222,43 24,71 26,08
S 7-G 23,29 23,03 22,86 23,21 23,03 23,05 23,13 23,00 22,60 207,20 23,02
S 10-J 24,79 25,22 24,80 24,60 25,11 24,04 24,90 24,83 24,52 222,81 24,76 26,63
S 7-G 23,42 24.9024.9
CUR VA ES TAN D AR DAT O S EST AND AR 24
Puntos Dim etro Concentracin Log (Conc.) P eso (m g) 17,0
(m m ) (m g/m l) Potencia (P) U I/m g 75,1
S1 18,65 0,05 -1,3010 F echa de V encim iento
S2 18,74 0,10 -1,0000 Lote N 1E 200
S3 19,19 0,15 -0,8239 DAT O S
S4 20,03 0,20 -0,6990 P endiente 0,1278 Pr T (X S 3 )es m ayor que Pr R= Sum a
S5 20,50 0,25 -0,6021 Intercepto -3,1322 Pr T (X S 3 )es m enor que Pr R= Resta
S6 22,66 0,51 -0,2924 F actor de Dilucion (D ) 1250
S7 23,42 1,02 0,0086 P rom edio G eneral
S8 25,09 1,53 0,1847 C oncentracion Central 24,90
S9 26,08 2,04 0,3096
S10 26,63 2,55 0,4065
88
Anlisis de la Varianza de la Linealidad Bacitracina Metilen Disalicilato
si p<0.05 rechazo la Ho
si p>0.05 acepto la Ho
Si p >0.05 acepto la Ho
Si p<0.05 rechazo la Ho
Si p<0.05 rechazo la Ho
Si p>0.05 acepto la Ho
data: resultado$residuals
ANOVA
Signif. codes: 0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1 1 observation deleted due to missingness
Si hay diferencias significativas entre los tratamientos con metilen (ANOVA de una via p<
0.05)
89
ANEXO 5 ESPECIFICIDAD BACITRACINA ZINC
EST ANDAR 1250 25 HC l 0,01N 1.0 U I / mL M UEST R A 217.2 mg 25 HC l 0,01N 1.0 U I/mL
1 50 BPH 6 1 50 BPH 6
M U ES TR A S DATO S ESTANDAR
M UESTR A P LAC EB O D ILUENTE Peso (m g) 17,0
Dim etro 25,08 0,00 0,00 Potencia (P) UI/m g 75,1
Concentracin (U I/m l) 1,183 Fecha de vencim iento N.A.
Log (Concentracin) 0,073 Lote N1E200
Cantidad Muestra (m g) 217,1 217,1 DATO S
g Bacitracina /100 g 6,8 --- --- Pendiente 0,1278
Intercepto -3,1322
Factor de Dilucin (D) 1250
Prom edio General Concentracion Central 24,90
RESULTADO
M1 M UEST R A 6,8 g / 100g
M2 PLAC EBO N O PRO DU C E H ALO
M3 DILUEN T E NO PR O D UC E H ALO Pr T (X S 3 )es m ayor que Pr R= Sum a
Pr T (X S 3 )es m enor que Pr R= Resta
90
ANEXO 6 ESPECIFICIDAD BACITRACINA METILEN DISALICILATO
EST ANDAR 1250 25 H C l 0,01N 1.0 U I / m L M UEST R A 292 mg 25 H C l 0,01N 1.0 U I/mL
1 50 BPH 6 1 50 BPH 6
RESULTADO
M1 MU EST R A 5,0 g / 100g
M2 PLAC EBO N O PR O D U C E H ALO
M3 D ILU EN T E N O PR O D U C E H ALO Pr T (X S 3 )es m ayor que Pr R= Sum a
Pr T (X S 3 )es m enor que Pr R= Resta
91
ANEXO 7. SELECTIVIDAD BACITRACINA ZINC
BACTRAN 15%
SELECTIVID A D COND ICION ACID A
M uestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 22,23 21,94 22,01 23,39 22,91 21,52 22,24 23,84 23,80 22,65
ESTANDAR --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---
92
BACTRAN 15%
SELECTIVIDAD CONDICION BASICA
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL M UESTRA 217.2 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 22,42 22,62 22,90 22,60 21,83 22,72 21,87 22,86 21,92 22,42
ESTANDAR --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---
M UESTRA DEGRADACION
M1 ESTNDAR 99,9 Pr T (X S3)es mayor que Pr R= Suma
M2 MUESTRA 100,0 Pr T (X S3)es menor que Pr R= Resta
M3 PLACEBO ----
93
BACTRAN 15%
SELECTIVIDAD CONDICION TERMICA
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 217.2 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 24,11 23,53 23,97 23,50 23,52 23,77 23,67 23,27 23,20 23,62
ESTANDAR 22,09 22,96 22,47 22,80 22,49 22,36 22,34 22,30 22,21 22,45 23,73
94
BACTRAN 15%
SELECTIVIDAD CONDICION ULTRAVIOLETA
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL M UESTRA 217.2 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 23,01 24,38 23,91 24,06 23,76 23,18 24,25 23,40 23,03 23,66
ESTANDAR 23,14 22,92 23,40 23,10 22,83 22,24 22,33 22,27 22,36 22,73 23,97
95
ANEXO 8. SELECTIVIDAD BACITRACINA METILEN DISALICILATO
EST ANDAR 1250 25 HC l 0,01N 1.0 U I / mL M UEST RA 292 mg 25 HC l 0,01N 1.0 U I/mL
1 50 BPH 6 1 50 BPH 6
M uestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Prom edio Prom edio corr
S3 22,23 21,94 22,01 23,39 22,91 21,52 22,24 23,84 23,80 22,65
ESTANDAR --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---
96
BACTRAN 11%
SELECTIVIDAD CONDICION BASICA
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 292 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 22,42 22,62 22,90 22,60 21,83 22,72 21,87 22,86 21,92 22,42
ESTANDAR --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---
MUESTRA DEGRADACION
M1 ESTNDAR 99,9 Pr T (X S3)es mayor que Pr R= Suma
M2 MUESTRA 100,0 Pr T (X S3)es menor que Pr R= Resta
M3 PLACEBO ----
97
BACTRAN 11%
SELECTIVIDAD CONDICION TERMICA
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL M UESTRA 292 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 24,11 23,53 23,97 23,50 23,52 23,77 23,67 23,27 23,20 23,62
ESTANDAR 22,09 22,96 22,47 22,80 22,49 22,36 22,34 22,30 22,21 22,45 23,73
98
BACTRAN 11%
SELECTIVIDAD CONDICION ULTRAVIOLETA
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL M UESTRA 292 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
M uestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 23,01 24,38 23,91 24,06 23,76 23,18 24,25 23,40 23,03 23,66
ESTANDAR 23,14 22,92 23,40 23,10 22,83 22,24 22,33 22,27 22,36 22,73 23,97
99
ANEXO 9. PRECISIN DEL METODO BACITRACINA ZINC
IC = 24.8864.303* 0.032/3
Nmeros de datos 3
100
DATOS DEL GRUPO 2 - PRECISION DIA 1 ANALISTA 2
%
Muestra Concentracin (UI/ml) Dimetro (mm) Recuperacin
1 1,0 24,82 105.12
IC = 24.8874.303* 0.060/3
Nmeros de datos 3
101
DATOS DEL GRUPO 3 - PRECISION DIA 2 ANALISTA 1
% Recuperacin
Muestra Concentracin (UI/ml) Dimetro (mm)
101.79
1 1,0 24.71
2 1,0 24.65 99.84
(0.243%) (1.767%)
IC = 24.7114.303* 0.06/3
IC = 101.64.303 *1.797/3
Nmeros de datos 3
102
DATOS DEL GRUPO 4 - PRECISION DIA 2 ANALISTA 2
IC = 24.9254.303* 1.410/3
Nmeros de datos 3
103
DATOS DEL GRUPO 5 - PRECISIONES ANALISTAS
% Recuperacin
Muestra Concentracin (UI/ml) Dimetro (mm)
1 1,0 24.90 107.64
2 1,0 24.85 106.00
3 1,0 24.91 107.73
4 1,0 24,82 105.12
5 1,0 24.94 108.83
6 1,0 24.90 107.18
7 1,0 24.71 101.79
8 1,0 24.65 99.84
9 1,0 24.77 103.43
10 1,0 24.96 103.32
11 1,0 24.91 106.56
12 1,0 24.91 107.44
IC = 24.852.201* 0.097/12
104
Nmeros de datos 12
X= X t S/n X= X t S/n
Grados de libertad 11
105
BACTRAN 15%
PRECISION DIA 1 ANALISTA 1
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 217.2 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 22,81 22,49 22,82 22,29 23,21 23,05 23,11 23,09 23,06 23,02
M1 23,05 23,36 22,89 22,86 23,10 23,21 22,98 23,01 23,09 23,02 24,90
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 217.2 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 23,03 24,01 23,27 23,49 23,31 24,76 23,19 23,59 23,83 23,61
M1 23,26 23,20 23,09 23,52 23,80 24,45 23,87 23,08 23,52 23,53 24,82
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 217.2 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 25,34 23,98 24,57 25,58 24,65 25,20 24,95 25,30 25,41 24,93
M1 24,65 23,83 24,51 24,86 23,63 24,13 25,68 25,24 25,00 24,74 24,71
108
BACTRAN 15%
PRECISION DIA 2 ANALISTA 2
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 217.2 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 25,43 24,54 24,54 25,57 25,38 24,89 24,80 25,62 24,89 25,07
M1 25,18 24,20 25,42 25,73 25,11 25,63 25,01 25,58 24,35 25,13 24,96
109
ANEXO 10. PRECISIN DE METODO BACITRACINA METILEN DISALICILATO
IC = 24.864.303* 0.024/3
Nmeros de datos 3
110
DATOS DEL GRUPO 2 - PRECISION DIA 1 ANALISTA 2
% Recuperacin
Muestra Concentracin (UI/ml) Dimetro (mm)
1 1,0 24,91 106.90
IC = 24.964.303* 0.049/3
IC = 108.75 4.303*1.638/3
Nmeros de datos 3
111
DATOS DEL GRUPO 3 - PRECISION DIA 2 ANALISTA 1
% Recuperacin
Muestra Concentracin (UI/ml) Dimetro (mm)
107.64
1 1,0 24.92
2 1,0 24.93 108.0
IC = 24.9354.303* 0.014/3
Nmeros de datos 3
112
DATOS DEL GRUPO 4 - PRECISION DIA 2 ANALISTA 2
IC = 24.784.303* 0.115/3
IC = 103.51 4.303*3.542/3
Nmeros de datos 3
113
DATOS DEL GRUPO 5 - PRECISIONES ANALISTAS
IC = 24.882.201* 0.089/12
IC= 106.482.201*2.728/12
Nmeros de datos 12
114
%
# Dimetro Recuperacin Sesgo (b)
1 24,86 105,704 5,704
2 24,96 108,775 8,775
3 24,94 107,947 7,947
4 24,786 103,512 3,512
Varianza 0,006 5,610
Media 24,886 106,485 6,485
Desviacin estndar 0,078 2,369 2,369
Coeficiente de variacin 0,003 0,022 0,365
% Coeficiente de
variacin 0,315 2,224 36,526
t de Student
X= X t S/n X= X t S/n
Grados de libertad 11
115
BACTRAN 11%
PRECISION DIA 1 ANALISTA 1
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 292 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 24,13 24,99 24,78 24,63 24,69 25,09 25,20 24,53 24,59 24,81
M1 24,66 24,80 24,84 25,50 24,92 24,52 25,62 24,37 24,74 24,79 24,88
116
BACTRAN 11%
PRECISION DIA 1 ANALISTA 2
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 292 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 25,72 25,75 25,33 25,19 25,03 25,11 25,10 25,51 25,51 25,36
M1 25,82 25,60 25,27 25,04 25,46 24,54 25,41 25,69 25,49 25,37 24,91
117
BACTRAN 11%
PRECISION DIA 2 ANALISTA 1
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 292 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 22,14 21,99 21,76 23,05 22,09 22,41 21,54 22,49 23,05 22,28
M1 22,67 22,17 21,84 21,93 22,07 23,20 22,76 22,20 21,89 22,30 24,92
118
BACTRAN 11%
PRECISION DIA 2 ANALISTA 2
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 292 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 21,25 23,45 23,20 23,51 23,70 23,30 23,21 23,60 22,48 23,08
M1 21,85 22,70 22,17 23,76 23,12 22,20 23,83 23,03 23,52 22,91 24,73
119
ANEXO11. PRECISION DEL SISTEMA
%
Muestra Concentracin (UI/ml) Dimetro (mm) Recuperacin
1 1.0 24.84 107.79
2 1.0 24.89 109.58
3 1.0 24.76 105.50
4 1.0 24.82 107.44
5 1.0 24.66 102.30
6 1.0 24.77 105.80
7 1.0 24.81 107.10
8 1.0 24.77 105.85
9 1.0 24.83 107.46
10 1.0 24.83 107.55
Media 24.798 106.641 Tendencia central
(0.251%) (1.817%)
IC = 24.7982.262* 0.062/10
Nmeros de datos 10
120
ANEXO 12. EXACTITUD METODO BACITRACINA ZINC
2 2 2 2
Gexp = S max / S li +S t +S is
%
# recuperacion Sesgo (b)
1 100,230 -0,230
2 103,710 -3,710
3 85,690 14,310
4 111,790 -11,790
5 111,660 -11,660
6 100,450 -0,450
7 92,410 7,590
8 91,430 8,570
9 91,460 8,540
Promedio 98,759 1,241
Desvest 9,246
Media 98,759
CV 0,094
CV% 9,362
Variancia 85.485
e% 1,24
Valor de referencia 100,00
121
t de Student
# halos
1 23,766
2 23,878
3 23,231
4 24,893
5 24,888
6 24,530
7 24,862
8 24,830
9 24,830
Varianza 0,390
Media 24,412
IC 0,408
Desvest 0,625
n 9
CV 0,026
CV% 2,559
122
Area
Variance 0.390
Mean 24.41
Recovery
Variance 85.485
Degrees of freedom 8
123
BACTRAN 15%
EXACTITUD AL 80%
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 173.8 mg 25 HCl 0,01N 0,8 UI / mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 23,36 24,41 23,29 23,34 23,03 23,23 23,30 23,10 23,24 23,37
M1 22,64 23,01 22,53 22,17 22,01 22,26 21,68 21,75 22,04 22,23 23,77
124
BACTRAN 15%
EXACTITUD AL 100%
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 217.27 mg 25 HCl 0,01N 1,0 UI / mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 23,51 22,20 23,73 23,83 23,73 23,37 23,87 23,27 23,34 23,43
M1 22,12 23,36 24,10 23,56 23,82 23,34 23,76 23,45 23,28 23,42 24,89
125
BACTRAN 15%
EXACTITUD AL 120%
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 260.73 mg 25 HCl 0,01N 1,2 UI / mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 23,44 23,60 23,67 23,46 23,53 23,01 23,96 23,88 23,95 23,61
M1 23,57 23,63 23,52 23,20 23,23 23,95 23,78 23,67 23,61 23,57 24,86
126
ANEXO 13. EXACTITUD DEL METODO BACITRACINA METILEN DISALICILATO
127
t de Student
# halos
1 23,540
2 23,430
3 23,488
4 24,526
5 24,526
6 24,369
7 25,011
8 25,024
9 25,024
Variancia 0,456
Media 24,327
Desvest 0,675
n 9,000
CV 0,028
CV% 2,776
128
Area
Variance 0.479
Mean 24.32
Recovery
Variance 11.49
Degrees of freedom 8
129
BACTRAN 11%
EXACTITUD AL 80%
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 222.7 mg 25 HCl 0,01N 0,8 UI / mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 22,91 23,21 23,62 22,90 23,47 23,11 23,09 23,63 22,80 23,09
M1 21,04 22,17 20,92 21,86 21,56 20,29 21,98 21,76 20,63 21,73 23,54
130
BACTRAN 11%
EXACTITUD AL 100%
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 278.3 mg 25 HCl 0,01N 1,0 UI / mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 22,62 22,84 23,30 22,84 23,04 23,00 23,75 23,30 23,99 23,40
M1 23,06 23,10 23,42 23,19 23,11 22,90 23,39 22,80 23,00 23,02 24,53
131
BACTRAN 11%
EXACTITUD AL 120%
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 334.07 mg 25 HCl 0,01N 1,2 UI / mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 23,63 24,53 23,51 22,65 23,53 23,63 24,04 24,64 24,04 23,80
M1 24,05 24,55 23,75 23,88 23,87 24,56 23,62 23,19 23,73 23,91 25,01
132
ANEXO 14. LIMITE DE CUANTIFICACION
Concentracin % recuperacin
# (UI/ml) Dimetro (mm)
1 0,02 17,82 669.00
2 0,02 17,55 616.90
3 0,02 17,57 620.60
4 0,02 17,55 617.30
5 0,02 17,15 548.20
6 0,02 17,40 591.30
Varianza 0.050 1572.275
Expresa la
variabilidad del
Desviacin Estndar 0.223 39.65 mtodo
Expresa la
variabilidad del
Desviacin estndar de la media 0.100 ---------- mtodo
Nmeros de datos 6
Grados de libertad 5
133
BACITRACINA
LIMITE DE CUANTIFICACION
LOTE N1E200
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 17 mg 25 HCl 0,01N 0,02 UI/mL
1 50 BPH6 1 100 BPH6
2 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 23,27 23,15 24,00 23,41 23,52 23,24 23,42 23,38 24,07 23,50
M1 16,63 17,67 16,61 16,34 16,66 16,31 15,66 16,60 15,30 16,42 17,82
134
BACITRACINA
LIMITE DE CUANTIFICACION
LOTE N1E200
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 17 mg 25 HCl 0,01N 0,02 UI/mL
1 50 BPH6 1 100 BPH6
2 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 23,36 22,69 23,36 24,12 23,73 23,77 23,60 23,27 23,52 23,49
M1 16,33 15,74 15,80 15,65 15,90 16,00 16,16 16,89 16,81 16,14 17,55
135
ANEXO 15. LIMITE DE DETECCIN
ACTIVO Bacitracina Zinc BACITRACINA
Lote M1E200
50 50 50 50 BPH6
0,005 0,01 0,015 0,025 UI/ml
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 23,65 24,46 23,70 24,16 23,59 25,17 24,43 23,94 23,30 24,04
0,005 UI/ml --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---
136