Gua de Trabajos Prcticos

BIOLOGIA II

2009

1
 Biologa II
Segundo Cuatrimestre-ao 2009

Coordinador de la materia
Dra. Prof. Deborah R. Tasat

Docentes Responsables de TP
Dra. Andrea Gioffr
Dra. Paola D`Atri
Dr. Martin Radrizzani

Ayudantes de Primera
Lic. Mnica Palmieri
Lic. Leonardo Storani

Ayudantes de Segunda
Marcos Bruno
Romina Chiurazzi
Sebastin Ferraro
Vernica Delfosse

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 INDICE

Cronograma de la materia Pg. 1

Programa Analtico Pg. 2
Bibliografa Recomendada Pg. 4
Caractersticas grales. de la Materia-Rgimen de aprobacin Pg. 5
Normas para el trabajo en el laboratorio Pg. 6
Pipetas de precisin de volumen variable Pg. 8
Microscopio ptico: Descripcin y Funcionamiento Pg. 10
TP#1 Microscopa Optica Pg. 13
TP#2 Tcnicas cito-histolgicas y Microscopa clulas Pg. 14
eucariotas
Microscopa ptica en el estudio de los microorganismos Pg. 19
Pared Bacteriana Pg. 21
TP#3 Morfologa bacteriana y Tcnica de Gram Pg. 23
TP#4 Desinfeccin y Esterilizacin Pg. 25
Crecimiento bacteriano Pg. 28
Cuantificacin en medio slido y recuento celular Pg. 30
TP#5 Espectrofotometra Pg. 32
Turbidimetra: evaluacin del crecimiento bacteriano. Pg. 35
Crecimiento bacteriano en medio lquido
TP#6 Cuantificacin de Protenas Pg. 37
TP#7 Centrifugacin Pg. 40
Permeabilidad de las membranas celulares Pg. 42
TP#8 Problemas: Gua de Problemas Pg. 68
Cultivo de Tejidos Pg. 44
TP#9 Fagocitosis: Resea histrica Pg. 47
Fagocitosis en cultivos primarios de macrfagos Pg. 48
Recuento Celular- Cmara de Neubauer Pg. 50

TP#10 Divisin Celular: Mitosis y Meiosis Pg. 51

TP#11 cidos Nucleicos: Resea histrica Pg. 53
Extraccin de ADN Pg. 54
Electroforesis: Geles de agarosa Pg. 57
TP#12- Anlisis de ADN Pg. 61

TP#13 Electroforesis: Geles de poliacrilamida Pg. 62

Separacin de Protenas Pg. 65
TP#14 Problemas Pg. 68
TP#15 Problemas

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Inicio de las clases: Mircoles 19 de Agosto Tericos y TPs

Finalizacin de las clases: Mircoles 25 de Noviembre

Exmenes:

Primer Parcial: Mircoles 14 de Octubre

Segundo Parcial: Mircoles 2 de Diciembre

Exmenes Recuperatorios:

Primer y Segundo Parcial: Mircoles 16 de Diciembre

Fechas de Finales:
Sern establecidas por la Escuela de Ciencia y Tecnologa

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 Programa Analtico de la materia

1: Microscopas ptica y electrnica. Microscopio ptico simple y compuesto.

Microscopios especiales de: fondo oscuro, fluorescencia, polarizacin, contraste de fase,
interferencia, confocal. Electrnicos de transmisin y de barrido.

2: Mtodos citolgicos y citoqumicos. Fijacin. Inclusin. Obtencin de cortes.

Coloracin. Tcnicas especiales: tejidos duros (descalcificacin y desgaste), frotis de
sangre, Impregnaciones metlicas. Histoqumica. Inmunohistoqumica: tcnicas directa e
indirectas. Tcnicas para microscopa electrnica de transmisin y de barrido. Mtodos
citofotomtricos. Mtodos autoradiogrficos.

3: El origen de las clulas. Evolucin de las clulas procarionte y eucarionte. Estructura

general de las clulas procarionte y eucarionte. Teora de la Endosimbiosis. Niveles de
Organizacin: Unicelulares, Multicelulares y Pluricelulares. Organizacin Celular.
Clulas Procariontes: (Arqueobacterias y Eubacterias). Clulas Eucariontes (Reino
Fungi: ascomycetes, deuteromycetes y basidiomycetes).

4: Clulas Eucariontes. Comparacin entre clula animal y vegetal. Lmites Celulares.

Tamao y forma celular. Organizacin subcelular: Membrana Plasmtica y Pared
Celular. Caractersticas de la clula animal y vegetal. Tipos de clulas: forma, tamao,
diferenciaciones.

5: Membrana Plasmtica. Breve Resea Histrica (Danelli, Singer). Composicin

Qumica: La Bicapa lipdica y Protenas de Membrana. Propiedades. Transporte de
Molculas a travs de la Membrana. Tipos de Transporte: Pasivo Simple, Facilitado y
Activo (Cotransporte: Simporte y Antiporte).

6: Endomembranas I. Continuidad de Membrana. Compartimentalizacin Celular. El

Retculo Endoplsmico Rugoso y Liso. Estructura y Funciones.

7: Endomembranas II. Sistema de Golgi. Estructura y Funcin. Sistema vacuolar:

Lisosomas. Peroxisomas. Reciclado de la Membrana Celular: Vesculas cubiertas.
Transporte de Macromolculas: Exocitosis y Endocitosis.

8: Mitocondrias y Cloroplastos. Caracterizacin Morfolgica y Estructural.

Compartimentalizacin. Funcin de las Mitocondrias: Respiracin Aerbica y
Fermentacin. (Gluclisis, Cadena Respiratoria y Fosforilacin Oxidativa). Funcin de
las Cloroplastos.

9: Citoesqueleto I. Clasificacin y funciones. Los Microfilamentos: actina y protenas

asociadas. Estructura y funciones. El Movimiento ameboide. Los Filamentos
Intermedios: Estructura y funciones. Marcadores Especficos de Estirpe Celular.
Anomalas genticas de protenas estructurales. Protenas de los filamentos intermedios
(queratinas).

10: Citoesqueleto II. Los Microtbulos: tubulina y protenas asociadas. Estructura y

funciones. Organizacin molecular y funcional del aparato mittico. Organoides
microtubulares: cilias y flagelos.

5
11: Divisin Celular en eucariontes: Mitosis: Organizacin Molecular y rol Funcional
del aparato mittico. Descripcin general de la meiosis: Etapas, Formacin del Complejo
sinaptonmico, recombinacin gnica entre cromtidas homlogas (crossing-over),
separacin de homlogos y de cromtides hermanas. Consecuencias genticas de la
meiosis. Comparacin entre meiosis y mitosis.

12: Ciclo Celular: Perodos Go, G1, S, G2. Ciclinas y Factor Promotor de la
Maduracin (MPF). Factores regulatorios del ciclo celular (p21, p53, p16, etc.), cascadas
regulatorias.

13: Ncleo I. La organizacin del ADN. Los cromosomas (nucleosomas histonas

cromatina). Replicacin. La envoltura nuclear.

14: Ncleo II. El Nuclolo. Tipos de ARN. Transcripcin y procesamiento del ARN.
Ribosomas y poli-ribosomas. Traduccin. Protenas intracelulares y de exportacin.

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 Bibliografa Recomendada
A modo orientativo se citan a continuacin algunos libros de referencia. Sin embargo, se
recomienda optar por las ediciones actualizadas, en el caso de que se encuentren
disponibles
Biologa Curtis and Barnes. Ed. Panamericana, 2001 H.

Biologa Molecular de la Clula B. Alberts y col. Ed. Garland, 1994.

Biologa Celular y Molecular De Robertis y De Robertis. Ed. El Ateneo,1994.

Fundamentos de Biologa Celular y Molecular De Robertis y De Robertis (h). Ed.

Ateneo, 1995.

Histologa Genesser. Ed. Panamericana, 1996.

La Clula 2da. Edicin G. Cooper. Ed. Marbn, 2002

.
Bioqumica Stryer. Ed. Revert, 1995

Genes VII Lewis. Ed. Marbn, 2001

Biologa Celular Smith y Wood. Ed. Adison Wesley Iberoamericana, 1997

Recombinant DNA. 2da Ed. Watson JD, Gilman M, Witowski J, Zoller M

(1992) Freeman, Scientific American Books

Molecular Cell Biology. 4th ed. Lodish, Harvey; Berk, Arnold; Zipursky, S. Lawrence;
Matsudaira, Paul; Baltimore, David; Darnell, James E.

Bsquedas Bibliogrficas
Para buscar citas de trabajos originales publicados en revistas cientficas en ingls
mediante el uso de palabras presentes en sus ttulos o resmenes (abstracts) o el apellido
de sus autores, o libros on-line (tambin en ingls), se puede consultar la base de
publicaciones ms importante en ciencias biomdicas y biotecnologa, llamada PubMed,
a la siguiente direccin de internet:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/

Publicaciones Peridicas
Scientific American o su edicin en espaol (Investigacin y Ciencia)
Mundo Cientfico
Ciencia Hoy

7
 Caractersticas generales y Rgimen de aprobacin
El curso se desarrollar en 15 semanas y comprende:
Clases Tericas de 2 horas (1 clase por semana) a dictarse los das mircoles de 15-17hs
Trabajos Prcticos de 3 horas. Los mismos se llevarn a cabo los das mircoles de
maana: 9-12hs o de noche de 18-21hs.
Exmenes parciales escritos a desarrollar. El examen final podr ser oral o escrito.

Clases Tericas
Teniendo en cuenta la imposibilidad material para desarrollar la totalidad de los temas
debido a los avances crecientes en el conocimiento en Biologa, las clases tericas estn
dedicadas bsicamente a la actualizacin de los temas fundamentales de la materia. No
obstante, la totalidad de los tpicos del Programa Analtico deben ser estudiados
utilizando la bibliografa aconsejada. Para facilitar la compresin de los contenidos
desarrollados en las clases tericas, es esencial el estudio previo de los temas a ser
dictados.
Clases Prcticas
El Trabajo Prctico es una actividad de asistencia obligatoria, por lo tanto, se exige un 80
% de asistencia. La inasistencia a los TPs implica por lo tanto la prdida de la regularidad
de la materia. Las bases conceptuales de los temas de TP son desarrolladas previamente
en las Clases Tericas o durante el desarrollo de las prcticas. El alumno deber poseer
los conocimientos tericos correspondientes al tema del da, los que sern evaluados
mediante interrogatorios orales o escritos (parcialitos).

La materia presenta distintas instancias de Evaluacin

1-Trabajos Prcticos
El alumno deber poseer los conocimientos tericos correspondientes al tema del da, los
que sern evaluados mediante interrogatorios orales o escritos (parcialitos). Los
parcialitos se aprueban con el 60 % de la nota total. Todos los parcialitos desaprobados
sern recuperados en una fecha que dispondr la ctedra, previa a cada parcial. Para
acceder al exmen recuperatorio, los alumnos debern tener aprobados no menos del 50
% de los parcialitos en cada mdulo. Los alumnos que no aprueben los TPs, no podrn
presentarse a rendir los exmenes parciales.
Informes: Todos los resultados y observaciones de los TPs debern presentarse en
informes siguiendo los lineamientos establecidos por la ctedra. Los informes debern ser
entregados a ms tardar, en la segunda clase posterior a la realizacin de la Prctica.
Luego de esa fecha se considerar desaprobada la prctica. En caso de estar desaprobado
el informe, el alumno deber rehacerlo.

2-Exmenes Parciales
Durante el curso lectivo se tomarn 2 (dos) exmenes parciales cada uno de los cuales se
aprobar con el 60% de la nota.
Recuperatorios de Parciales
Se podr recuperar, en las fechas previstas por la Ctedra, solamente uno de los
exmenes parciales.
3-Exmen Final

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Los alumnos que regularizan la materia, rendirn un examen final integratorio. El mismo
puede ser escrito u oral.

Promedio Final de la Materia

La nota final surge de promediar la nota de los exmenes parciales, final y el promedio
de los TP.

Los alumnos que al finalizar la cursada se encuentren dentro de las siguientes

situaciones:
-desaprobacin de los dos exmenes parciales

- desaprobacin del exmen recuperatorio.

Estos debern recursar la materia. En caso de recursar en el cuatrimestre siguiente, la

nota de los TPs sern consideradas, debiendo cursar solamente los tericos y rendir los
respectivos exmenes parciales.

NOTA: Todo el material necesario ser provisto por la ctedra. Sin embargo es
obligacin del alumno contar con:
- Marcador indeleble trazo fino
- Lpices de colores y hojas blancas

Normas para el trabajo en el laboratorio

En el siguiente texto, mostramos una serie de tems elementales para el trabajo en el

laboratorio.
1. Se implementar el uso de guardapolvo, de preferencia que sea de algodn, largo y con
mangas largas, asimismo es recomendable no usar faldas, shorts o zapatos abiertos. Las
personas de cabello largo debern sujetarlos mientras estn en el laboratorio.
2. No fumar, comer o beber en el laboratorio. Lavar bien las manos al salir del lugar.
3. Es importante conocer la localizacin de los accesorios de seguridad.
-Localizar los extintores de incendio y verificar a que tipo pertenecen y que tipo de fuego
pueden apagar.
-Localizar las salidas de emergencia o salidas alternativas a las habituales.
-Localizar la llave general de electricidad del laboratorio.
-Localizar la manta anti-llama.
-Localizar el lava-ojos y ducha ms cercanos
4. Todo frasco o tubo conteniendo alguna sustancia debe rotularse. Es necesario contar
con un rotulador indeleble.
5. No devolver los reactivos a los frascos originales, as no hayan sido usados. Evitar
circular con ellos por el laboratorio.
6. No usar ningn instrumento para el cual no se haya sido entrenado o autorizado a

9
utilizar.
7. Verificar el voltaje de trabajo del instrumento antes de enchufarlo. Cuando los
instrumentos no estn siendo usados deben permanecer desenchufados.
8. Nunca pipetear lquidos con la boca. En este caso usar peras de plstico o propipetas
especiales para tal fin.

* Material de Vidrio
1. Al usar material de vidrio, verificar su condicin. Cualquier material de vidrio que est
astillado debe ser rechazado.
2. Los vidrios rotos as como todo material punzante deben ser descartados en un
recipiente apropiado. NUNCA DEJARLOS SIN IDENTIFICAR NI A LA MANO DE
UN TERCERO.

* Residuos
Consultar siempre la va de descarte de cada uno de los reactivos utilizados.

* Microscopios
Verificar siempre el estado de las lentes y recordar apagar la lmpara luego de realizada
la observacin. Siempre que use aceite de inmersin, limpiar al finalizar con el solvente
adecuado.
Al retirarse, verificar que el instrumental utilizado est apagado, en su lugar, la
mesada de trabajo debe quedar libre y limpia.

Cualquier desperfecto, rotura o accidente deber ser informado a los docentes

ANTE CUALQUIER DUDA SUGERIMOS SIEMPRE CONSULTAR A LOS

DOCENTES A CARGO

10
 Pipetas de precisin de volumen variable (micropipetas)

Este tipo de instrumento permite el pipeteo de pequeos volmenes de lquidos con

precisin y reproducibilidad. Es un instrumento de precisin que, como tal, es costoso y
requiere de cierto cuidado en su manejo. Las mismas son autoclavables y utilizan un
cono, punta o tip descartable, con el que se toman las muestras.
Requerimos leer atentamente este apndice para evitar una mala manipulacin de las
mismas.
Descripcin general de una micropipeta tipo.

A- Push button, suele indicar el

mximo Vol a pipetear
B- Tambor mvil, a partir del cual se
puede ajustar el Vol a dispensar. En
un pequeo visor, se observa el Vol
a calibrar.
C- Conducto principal-vstago
D- Eyector de tips, este es activado
presionando el botn E.
F- Tip descartable

Tabla: Lmites operativos y lectura de volumen.

Modelo Rango de Volumen ectura del indicador de V

P20
2ul-20ul

P200
50ul-200ul

P1000
200ul-1000ul

1ul= 10-3 ml

11
 Utilizacin:

Observar que el mbolo (push button) tiene tres posiciones. T0 (B-E), T1, primer tope (A-
C), T2 (D)
Para la carga:
1. Calibracin del V, tener mucho cuidado en no sobrepasar los lmites operativos
de cada pipeta. Colocar el tip.
2. Llevar el mbolo a la posicin de carga T1 (ver A).
3. Dentro del lquido a pipetear, liberar el mbolo lentamente hasta la posicin T0
(ver B).
4. Para la descarga:
5. Bajar el mbolo suavemente, este debe pasar por primer tope, para la descarga
total, llegar hasta el final, posicin T2 (ver C y D).
6. Finalmente, fuera del lquido dispensado, liberar el mbolo hasta T0 (ver E).
7. Descartar el tip.

T0

T1
T2

12
 MICROSCOPIA

Descripcin y funcionamiento del microscopio ptico

La microscopa de luz es una forma de microscopa ptica que incluye lupas y
microscopios compuestos. Un microscopio compuesto posee dos lentes: la lente objetivo,
que se encuentra cerca del objeto que se observa y el lente ocular, colocado cerca del ojo.
El aumento primario del objeto se produce por el lente objetivo, y la imagen que as se
origina se transmite al ocular, donde ocurre el aumento final. La magnificacin total es el
producto del aumento del objetivo por el aumento del ocular.
Una propiedad importante de un microscopio es su poder de resolucin, es decir, la
capacidad para mostrar como distintos dos puntos separados que se encuentran cercanos.
Depende exclusivamente del poder del objetivo. El lmite de resolucin de un
microscopio compuesto es directamente proporcional a la longitud de onda de la luz
empleada () e inversamente proporcional a la apertura numrica (AN), una propiedad
ptica de las lentes objetivo.
AN = n x seno , donde:
n = ndice de refraccin
seno = seno del ngulo de abertura de la lente
El fsico Ernst Abbe estableci la relacin entre , AN del objetivo y distancia mnima de
separacin entre dos puntos.
Si el Lmite de resolucin (LR) es la distancia mnima que separa dos puntos que pueden
ser discriminados como tales entonces:
LR = 0.61 x / AN
donde
= longitud de onda de la luz
AN = apertura numrica del objetivo
LR del *el ojo humano = 0.1 mm
*microscopio ptico = 0.2m
*microscopio electrnico = 2-10 A
Dado que la longitud de onda de la luz empleada est acotada en el rango 400-700 nm.
En la prctica la resolucin de un objeto es funcin de su apertura numrica. A mayor
apertura numrica ms pequeo ser el objeto resuelto.
Por otra parte, el medio por el cual se transmite la luz afecta tambin a la apertura
numrica. Mientras el objetivo est separado del objeto por aire, su apertura numrica
nunca ser mayor que 1. Para alcanzar aperturas numricas mayores, el objetivo debe
estar inmerso en un medio que posea un ndice de refraccin de la luz mayor que el del
aire. Por ello se emplean aceites de varios tipos cuyos ndices de refraccin sean iguales al
del vidrio. Los lentes objetivos diseados para utilizarse con este tipo de aceites se
denominan lentes de inmersin. La apertura numrica de una lente de este tipo oscila
entre los valores 1.2 y 1.4.

13
 Principios Generales de ptica

Luz: Es una onda electromagntica que a partir de una fuente, se propaga en el vaco a
una velocidad de 300.000 km /seg.
La escala de medicin de las longitudes de onda es desde los nanmetros hasta
kilmetros. El espectro de luz visible se encuentra en el rango 380 nm (violeta) 750 nm
(rojo).

Refraccin: La refraccin es el resultado de un cambio en la velocidad de propagacin de

la luz al pasar de un medio transparente a otro de diferente densidad. Como
consecuencia se produce una desviacin en el sentido de la propagacin.

aire aire

i i

aire aceite de
r r
inmersin

Leyes de la refraccin

1ra. Ley: Los rayos incidente, refractado y la normal estn en el mismo plano.
2da. Ley: Cuando la luz atraviesa la superficie de separacin de dos sustancias
transparentes el cociente entre seno i/seno r es una constante y se denomina ndice de
refraccin

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 Diagrama de un
Microscopio compuesto

Tipos de Microscopios:
pticos Electrnicos
Campo claro Transmisin
Contraste de fase Barrido
Interferencia
Campo oscuro
Polarizacin
Fluorescencia
Confocal

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 TP#1 Microscopa
La Microscopa ptica en el estudio de las clulas eucariotas

Mtodos para obtener informacin morfo-funcional

1. Microscopios pticos y electrnicos

2. Tcnicas citolgicas y citoqumicas

3. Marcadores especficos (Anticuerpos, Radioactivos)

4. Tcnicas Inmunocitoqumicas (directas e indirectas)

5. Separacin de componentes subcelulares (centrifugacin)

6. Aislamiento y caracterizacin de macromolculas (electroforesis, cromatografa)

7. Cultivo in vitro de clulas y/o tejidos

8. Manipulacin embrionaria

16
 TP#2 Tcnicas cito-histolgicas

Son los procedimientos que abarcan desde la obtencin de una muestra de origen animal
o vegetal, hasta su transformacin en una preparacin adecuada para su estudio
microscpico.
La tcnica corriente para microscopa de campo claro es bsica y sirve como patrn para
casi todas las dems. La tcnica histolgica de rutina para estudiar las preparaciones con
el microscopio ptico consta de los siguientes pasos:

a. Obtencin de la muestra

b. Fijacin (tipos de fijadores, variacin del tiempo de fijacin)

c. Deshidratacin

d. Inclusin (distintos medios)

e. Corte (tipos de micrtomos)

f. Montaje del corte

g. Coloracin (concepto de basofilia y acidofilia)

h. Montaje final (deshidratacin, aclaracin)

Unidad de medida Valor de la unidad (m)

milmetro (mm) 1x10 -3
micrmetro (m) 1x10-6, 1x10-3 mm
nanmetro (nm) 1x10-9, 1x10-6 mm
ngstrom (A) 1x10 -10, 1x10-7 mm

17
 Tcnica Histolgica

9 OBTENCIN DE LA PIEZA
NECROPSIA: Son piezas que se obtienen de un cadver.
BIOPSIA: Son trozos de tejido que se obtienen de un sujeto con vida, con el objeto de
estudiarlos a microscopio y efectuar el diagnostico histopatolgico.

9 FIJACIN: es una operacin que tiene por objeto matar las clulas y conservarlas en
el estado en que se encontraban durante la vida.
Tipos de fijadores: formol 10-2-%, Bouin (mezcla fijadora a base de cido pcrico, formol
y cido actico).

9 DESHIDRATACIN: se realiza en grados crecientes de alcoholes (70, 96 y 100).

9 ACLARACIN: se utiliza un liquido intermediario (solvente orgnico) antes de la

inclusin. Solventes utilizados: benzol o xilol.

9 INCLUSIN: el objetivo es aumentar y homogeneizar la consistencia del tejido.

Masas de inclusin: parafina, celoidina, etc.

9 CORTE: el objetivo de la inclusin es preparar el material para realizar cortes del

espesor necesario para permitir el paso de la luz y ser examinados por el microscopio. El
corte se realiza con micrtomo.

9 DESPARAFINACION: El objetivo es extraer la parafina del corte. Se utiliza el xilol.

9 HIDRATACIN: se realiza en grados decrecientes de alcohol (100, 96, 70), luego

los cortes se pasan por agua destilada.

9 COLORACIN: Hematoxilina-eosina, tricrmicos, PAS, impregnaciones

argnticas, etc.

9 DESHIDRATACIN: se realiza con alcoholes en grados crecientes.

9 ACLARACIN: se utiliza benzol o xilol.

9 MONTAJE: con blsamo de Canad.

18
 Coloracin Con Hematoxilina-Eosina
Pasos
1. Desparafinar el corte en xilol durante 10 minutos
2. Hidratar en alcoholes 100, 96, 70 y 50.
3. Pasaje por agua destilada
4. Coloracin con hematoxilina durante 10 minutos.
5. Viraje en agua corriente
6. Coloracin con eosina durante 3 minutos
7. Lavado rpido en agua corriente
8. Deshidratar en alcoholes 50, 70, 96 y 100
9. Aclaracin en xilol
10. Montaje con blsamo de Canad.

Observar los cortes al microscopio ptico: Dibujar las

caractersticas principales y coloracin de los mismos

19
 Objetivo:

Visualizacin y Caracterizacin de distintos tipos celulares

Frotis Sanguneo
Diferenciar clulas de la serie roja y de la serie blanca.
Materiales
Rata Wistar
Jeringa
Colorante May Grunwald-Giemsa o Hematoxilina-Eosina
Porta y cubreobjetos
Microscopio compuesto
Metodologa
A partir de la muestra de sangre se obtendrn los extendidos segn mostrar el docente a
cargo del T.P.

Dejar secar, fijar con alcohol 96% y colorear la muestra durante 5-15 min.

Observar bajo microscopio de campo claro.

Se realizar la observacin del preparado tratando de
identificar los tipos celulares que se muestran a continuacin:

20
21
 La Microscopa ptica en el estudio de los microorganismos
Resea Histrica
La existencia de
microorganismos era sospechada
desde mucho antes del siglo XVII,
pero no poda demostrarse,
consecuencia de las limitaciones
tcnicas de la poca. En 1664, Robert
Hooke desarroll un microscopio
compuesto y lo utiliz para observar
pulgas, esponjas, plantas y mohos
entre otros. Su trabajo fue publicado
en Micrographia siendo muy popular.
Varios aos ms tarde, el trabajo de
Anton van Leeuwenhoek, un
cientfico amateur con gran
habilidad para combinar lentes y
obtener telescopios y microscopios,
permiti la magnificacin de muestras
ms de 200 veces, generando
imgenes de mayor claridad. Pas
meses observando a travs de su
microscopio y envi sus
observaciones a la Royal Society of
London, causando sensacin.
Sorpresivamente el trabajo de estos
investigadores fue abandonado por
casi 200 aos hasta la Revolucin
Through the microscope: A look at all things small. Timothy Paustian and Gary Roberts,
University of Wisconsin-
Madison. http://www.microbiologytext.com
industrial, cuando se dieron las
condiciones tcnicas y sociales para el
desarrollo de la ciencia de los
microorganismos. El trabajo posterior
de Ferdinand Julius Cohn en la
observacin de microorganimos
eucariotas y bacterias (procariotas)
populariz el uso de los microscopios
en la microbiologa y sent las bases
para el comienzo de la microbiologa
mdica fundada por Robert Koch. La
historia de la microbiologa, como la
historia del hombre, no es una
coleccin de eventos de progreso
lineal, sino un entramado de carreras
de individuos brillantes y sus ideas.
Cada nuevo descubrimiento, se basa
en un descubrimiento previo y en
retorno, permite otros
cuestionamientos. La tabla siguiente,
resume los avances que ayudaron al
desarrollo de la prctica
microbiolgica, entre los que se
encuentra el desarrollo de la tcnica
de Gram, que realizaremos en este
TP.
22
AO EVENTO
Robert Hooke es el primero en utilizar el microscopio para describir la esctructura
1664 reproductiva de los mohos. Tambin acu el trmino clula a partir de la observacin
de corcho vegetal.
Anton van Leeuwenhoek, un comerciante alemn y habilidoso constructor de lentes, es el
1673
primero en describir microorganismos en detalle.
Ferdinand Julius Cohn publica un trabajo decisivo en bacterias y reciclado de los
1872
materiales. Aparece un esquema de clasificacin utilizando el nombre Bacillus.
Oscar Brefeld reporta el crecimiento de colonias fngicas a partir de esporas individuales
1872 en gelatine y el botnico alemn Joseph Schroeter crece colonias bacterianas pigmentadas
en trozos de papa.
Robert Koch desarrolla mtodos de tincin de bacterias, fotografa especimenes y
1877
preparado de registro visuales permanente en cortes histolgicos.
Koch desarrolla medio de cultivo slido y mtodos para la obtencin de cultivos puros de
1881
bacterias.
Angelina Fannie and Walther Hesse en el laboratorio de Koch desarrollan el uso de agar
1882
como medio de soporte para el cultivo en medio slido.
Hans Christian Gram desarrolla un sistema de tincin para la identificacin de bacterias.
1884
[la tincin de Gram].
1887 Primer reporte de la placa de Petri por Julius R. Petri.
M. H. McCrady establece un mtodo cuantitativo para el anlisis de muestras de agua
1915
usando el nmero ms probable .

23
 La Pared Bacteriana
Las bacterias (procariotas)
son los organismos vivos ms
pequeos que contienen toda la
maquinaria requerida para el
crecimiento y la autorreplicacin a
expensas de distintos nutrientes
pudiendo ser auto o hetertrofos.
Su tamao promedio es de
aproximadamente 0,5m de
dimetro. Casi todos los
procariotas estn rodeados por
una pared celular rgida que rodea
la membrana citoplasmtica que
da a los diferentes tipos su
GramNegativa
La clasificacin de las
bacterias depende principalmente de
su tamao, forma y propiedades de
coloracin, en consecuencia, el
microscopio ptico ha sido durante
mucho tiempo el instrumento principal
del bacterilogo. Las preparaciones no
teidas pueden ser observadas
mediante un microscopio de contraste
de fases, pero en general los
bacterilogos utilizan preparaciones
fijadas al calor y por lo tanto
coloreadas. Para las bacterias la
coloracin de Gram es la ms
utilizada. Este mtodo fue
desarrollado en forma emprica por el
morfologa caracterstica. Dado
que la mayora de las bacterias son
hipertnicas en relacin con su
ambiente, se lisaran si no tuviesen
dicha pared. Las paredes celulares
de los procariotas son complejas y
contienen muchos tipos de
molculas que estn ausentes en
los eucariotas. Estn compuestas
por polmeros complejos
(peptidoglucanos), que son
primariamente responsables de la
resistencia mecnica de la pared.
Gram Positiva
bacterilogo dans Christian Gram en
1884.
En primer lugar, las clulas son fijadas
al porta mediante calor y coloreadas
con un colorante bsico, cristal violeta.
A continuacin los portas son tratados
con una mezcla de I2KI (lugol) para
fijar (mordiente) el colorante,
posteriormente son lavados en acetona
o alcohol y, finalmente se aplica una
coloracin de contraste, la safranina.
Teniendo en cuenta lo descrito, se
denomina en consecuencia organismo
grampositivo a los que retienen el
colorante violeta inicial, mientras que
los organismos gramnegativos son
24
decolorados por el disolvente orgnico
utilizado y presentan la coloracin de
contraste. Casi 75 aos despus de la
introduccin de este procedimiento tan
til se observ que las bacterias G+ y
G-, diferan fundamentalmente en la
estructura de la pared. Salton
demostr que la pared grampositiva no
se tie, sino que presenta una barrera
de permeabilidad frente a la elusin
del complejo coloranteI2 por el
alcohol. La coloracin de Gram se usa
ampliamente como base para la
clasificacin de las bacterias, dado que
refleja una diferencia fundamental en
la arquitectura de la pared celular. En
las clulas grampositivas, la pared esta
formada por una capa homognea de
peptidoglucanos y polisacridos que
miden entre 10 a 80 nanmetros de
espesor. En las clulas gramnegativas,
por el contrario, la pared est formada
por dos capas: una interior de
peptidoglucanos de solo 2 a 3
nanmetros de espesor, y una capa
exterior de lipoprotenas y
lipopolisacridos. Estas molculas
estn dispuestas en forma de una
bicapa de unos 7 a 8 nanmetros de
espesor similar en estructura a la
membrana celular. De modo que, el
lmite de una clula gramnegativa es
en realidad una membrana celular
interna, una capa de peptidoglucanos
delgada y una membrana externa.
25
 TP# 3 Morfologa Bacteriana y Tcnica de Gram
El microscopio ptico revela dos formas principales de bacterias, organismos ms o
menos esfricos conocidos como cocos (en latn, baya) y otros cilndricos denominados
bacilos (en latn bastn). Los cocos incompletamente separados pueden aparecer en cierto
nmero de formas diferentes, dependiendo de los planos en los que se dividen: cuando
aparecen predominantemente por parejas se denominan diplococos, en cadenas,
estreptococos, y en grupos reciben el nombre de estafilococos (racimo). Los cocos

que permanecen adheridos tras dividirse sucesivamente en dos o tres direcciones

perpendiculares, formando tetraedros cuadrados o formas cbicas, se conocen por
sarcinas. Los bacilos reciben el nombre de cocobacilos, cuando son excepcionalmente
cortos, el de bacilos fusiformes cuando estn afilados por ambos extremos, de formas
filamentosas cuando crecen en forma de largos filamentos y de vibriones o espirilos
cuando son curvados. Se muestra en el grfico la diversidad morfolgica. Puede
distinguir las formas de la figura?

26
 Objetivos del Trabajo Prctico:

Observar la morfologa de las distintas cepas bacterianas al microscopio ptico.

Observar comparativamente clulas eucariotas y clulas procariotas.

Identificar el tipo de pared bacteriana a partir de la tincin de Gram.

Metodologa
Preparacin del extendido. Los portaobjetos a utilizar deben estar limpios y
desengrasados. Se coloca una gota de solucin fisiolgica por cada colonia a analizar, y
all se emulsionar una pequea cantidad de cada colonia. En caso de trabajar con
cultivo lquido se coloca una gota del cultivo directamente sobre el portaobjeto. Se
realizar tambin un hisopado de la cavidad oral-encas y se procesar el extendido como
se indica a continuacin.
Secado de la preparacin. Se realiza colocando en posicin horizontal sobre la corriente
de aire caliente de un mechero. Puede realizarse tambin en estufa.
Fijado de la preparacin. Se efecta pasando 3 veces el lado del portaobjeto que NO
TIENE la preparacin, sobre la llama del mechero para que la misma adquiera una
temperatura de aproximadamente 80 0C.
Coloracin
1. Cubrir con VIOLETA para Gram las zonas del portaobjeto que tienen la preparacin.
Dejar 20 segundos.
2. Lavar con chorro fino de agua 10 segundos.
3. Cubrir con LUGOL para mordentar. Dejar 30 segundos.
4. Decolorar durante 10 segundos con DECOLORANTE haciendo presin en el frasco
plstico, para que salga un chorro fino que arrastre el colorante.
5. Lavar con chorro fino de agua 10 segundos.
6. Cubrir con SAFRANINA. Dejar 20 segundos.
7. Secar

8.

Nota: El tiempo de cada paso puede variar de acuerdo

al kit utilizado.
Desinfeccin y Esterilizacin
Por favor, verificar antes de comenzar
el protocolo.

27
 Desinfeccin y Esterilizacin

Definiciones

Se dice que un objeto es estril cuando carece de todo germen viable, en este contexto,
viable significa capaz de reproducirse.

La esterilizacin es el proceso mediante el que se matan o eliminan todos los

microorganismos viables, para lo que se utilizan mtodos fsicos o qumicos destinados a
eliminar los mismos de un objeto o matarlos in situ. Este trmino es un absoluto que
implica la inactivacin de todas las formas de vida microbiana. Los productos de
descomposicin txicos que a veces quedan en el objeto esterilizado se denominan:
pirgenos.

El trmino desinfeccin se suele emplear para los procedimientos que eliminan o matan
a la mayora de los microorganismos viables pero no a todos. Los desinfectantes reducen
la biocarga, es decir la cantidad de microorganismos viables.
Los procesos de esterilizacin y desinfeccin son costosos y por tanto, es de suma
importancia elegir el mtodo apropiado que cause el menor dao posible al material
correspondiente. Las consideraciones siguientes influyen en la eleccin del mtodo:
Es ms fcil esterilizar un objeto limpio que otro fsicamente sucio, una biocarga baja
constituye un requisito previo para una esterilizacin con buena relacin costo /
beneficio.
La proporcin de microorganismos muertos depende de la concentracin del agente y
del tiempo de exposicin. El nmero de microorganismos supervivientes se puede
expresar por la ecuacin:
N 1/CT
Donde N es el numero de supervivientes, C la concentracin del agente y T el tiempo de
exposicin. Si una poblacin de microorganismos es expuesta a una tcnica de
esterilizacin y el logaritmo del nmero de supervivientes se representa en funcin del
tiempo, la pendiente de la curva define la tasa de muerte.
Las curvas pueden utilizarse con el fin de predecir las condiciones necesarias para
conseguir la esterilidad
El mecanismo detallado del proceso de muerte de los microorganismos quizs vare
con la tcnica de esterilizacin empleada pero el efecto neto es similar y consiste en la
inactivacin de constituyentes esenciales de la clula (cidos nucleicos y protenas).

Factores que afectan la potencia desinfectante

En contraposicin con los agentes quimioteraputicos que presentan un alto grado de
selectividad para ciertas especies de bacterias, los desinfectantes son muy txicos para
todos los tipos de clulas. La efectividad de un agente particular est determinada en gran
parte por las condiciones en las cuales acta.
Concentracin del agente:
Muchos agentes son letales para bacterias slo cuando se los utiliza en concentraciones
muy elevadas. Otros en concentraciones muy bajas pueden estimular, retardar, o hasta

28
destruir al microorganismo. Sin embargo, la concentracin necesaria vara con el
desinfectante, el microorganismo y el mtodo de ensayo.
Mediante la siguiente expresin es posible relacionar la concentracin de la droga
empleada y el tiempo necesario para destruir una determinada fraccin de la poblacin:
Cn t = K
Donde C es la concentracin de la droga, t es el tiempo necesario para destruir una
determinada fraccin de las clulas y n y K son constantes.
Tiempo de exposicin a un agente
pH
La concentracin de in hidrgeno influye sobre la accin bactericida al afectar tanto al
microorganismo como al agente qumico.
Temperatura
La destruccin de las bacterias por los agentes qumicos aumenta junto con la
temperatura.
Naturaleza del microorganismo
La eficacia de un agente determinado depende de las propiedades del microorganismo.
Las ms importantes son: especie, fase de cultivo, presencia de estructuras especiales
(esporas o cpsulas), etc.
Presencia de materiales extraos
La presencia de materia orgnica (suero, sangre, pus) influye sobre la actividad de
muchos desinfectantes alterando su actividad y los transforma en inertes.

Tcnicas de esterilizacin

Calor
El calor, como forma de transferir energa, es el mtodo preferido para la esterilizacin,
debido a su fcil empleo, costo, control y eficacia.
a) Calor Seco:
El mecanismo esterilizador del calor seco es bsicamente la oxidacin de los
componentes celulares. La incineracin y el uso del mechero Bunsen son ejemplos de
esterilizacin por calor seco. El instrumental de vidrio se puede esterilizar durante una
hora en una estufa de aire caliente a 160-180 C.
b) Calor hmedo:
El agente ms eficaz para la esterilizacin es el vapor de agua saturado a presin
(autoclave). La destruccin de las enzimas y membranas esta influida por la
disponibilidad de agua, que modifica los enlaces hidrgeno. El vapor a presin facilita la
penetracin del calor en el material que se quiere esterilizar. Existe una relacin directa
entre temperatura y presin de vapor. El vapor a presin tiene una temperatura superior a
100 C, lo que aumenta su capacidad de matar microorganismos.
La duracin del ciclo de la autoclave est determinada por el tiempo de actuacin ms un
margen de seguridad y se calcula por las curvas de letalidad trmica para patgenos
termo-resistentes como los clostridios.
El ciclo usual de 121 C durante 15 minutos es suficiente para matar esporas de
Clostridium botulinum con un margen adecuado de seguridad.

29
Filtracin
Las soluciones termo-esterilizadas contendrn pirgenos. Esos productos termoestables
de la descomposicin de los microorganismos, capaces de inducir fiebre, resultan
indeseables en preparados como los lquidos intravenosos. Los filtros modernos son de
nitrocelulosa y actan por la atraccin electrosttica y el tamao de los poros, que
retienen los microorganismos y otras partculas.

Irradiacin
El empleo de la irradiacin gamma constituye ahora el mtodo de eleccin para
esterilizar grandes lotes de dispositivos pequeo tamao como agujas, jeringas, vas
intravenosas, catteres, guantes, etc. Aunque el costo inicial del equipo es muy alto,
permite un funcionamiento continuo y proporciona una eficiencia del 100%.
La tcnica requiere instalaciones y personal especializado. El mecanismo de muerte
consiste en la produccin de radicales libres, que son eficaces para romper los enlaces del
ADN. La irradiacin, a una dosis mayor que la necesaria para las clulas vegetativas
tambin mata las esporas. Este aumento en la dosis se debe a la falta relativa de agua en
las esporas.

Agentes qumicos
La necesidad de esterilizacin mediante sustancias qumicas gaseosas y/o lquidas ha
disminuido mucho gracias al xito de la irradiacin gamma. Sin embargo, an se utilizan
el xido de etileno (gas) y el formaldehdo (liquido). Ambos son agentes alquilantes y
matan por lesin en las protenas y cidos nucleicos.

30
 Desinfectantes de uso hospitalario
Grupo Ejemplos Ventajas e Inconvenientes
Halgenos Hipoclorito Econmicos, eficaces, actan por
(agentes oxidantes) liberacin de cloro libre. Activos contra
virus, bactericida.

yodo Desinfectantes cutneos tiles,

otros metales esporicidas
pesados
(modifican los cloruro mercrico empleado como preparado cutneo
grupos funcionales tpico
de protenas y
cidos nucleicos)
Alcoholes Alcohol etlico Desinfeccin cutnea y limpieza de
(solvente orgnico Alcohol isoproplico superficies, usados a veces en
que interacta con combinacin con yodo y clorhexidina.
las membranas Alcohol 70% es mejor desinfectante que
lipdicas) 96%, mayor poder bactericida.
Aldehdos Formaldehdo demasiado irritantes para uso como
(agentes alquilantes, formalina desinfectantes generales
modifican enzimas,
accin irreversible) glutaraldehdo Destruye microorganismos vegetativos
incluyendo micobacterias, lentamente
pero de modo ms eficaz, ms activo y
menos txico que el formaldehdo,
esporicida, algo irritante. Se mantiene
estable 1-2 semanas en solucin alcalina,
de uso limitado, caros.

31
 Crecimiento bacteriano

Introduccin
En un cultivo bacteriano homogneo el crecimiento de una poblacin bacteriana se
puede predecir a travs de la siguiente relacin:
dX/dt = X (1)
siendo dX el incremento en la masa celular (biomasa), dt es el intervalo de tiempo, X es
la cantidad de biomasa, y es la velocidad de crecimiento especfica (con unidades de
tiempo inversa -1/t-).
Si es constante, integrando la ecuacin (1), queda claro que X va aumentando de
manera exponencial con el tiempo:
ln X/X0 = t (2)
donde ln es el logaritmo natural (en base e = 2.303) y X0 cuando t = 0, por lo tanto
rearreglando la ecuacin 2 se aprecia que la biomasa final ser:
X = X0 et (3)
El crecimiento bacteriano que se comporta segn esta relacin es llamado crecimiento
exponencial o crecimiento logartmico.
De estas ecuaciones puede deducirse el tiempo de duplicacin (td) cuando X = 2Xo:
td = ln 2/ = 0.693/
Estas ecuaciones predicen el comportamiento de una poblacin bacteriana slo en la
porcin de la curva de crecimiento que no es influenciada por el crecimiento de la
poblacin (es decir la fase exponencial).
En general y en este TP en particular se trabaja con cultivos bacterianos lquidos no se
agrega ni quita nada del ambiente donde se crecen las bacterias luego de inocular las
clulas a un medio de crecimiento adecuado con una composicin mas o menos
definidas. Esto significa que estos sistemas slo permitirn la multiplicacin celular por
un perodo de tiempo limitado y en el que progresivamente se producirn cambios en el
medio original y en el ambiente, producto justamente de los productos metablicos y del
consumo de los nutrientes por efecto de la masa celular en crecimiento.
En este sentido podremos definir varias etapas en una curva de crecimiento normal, cuya
validez se extiende a cultivos de clulas eucariotas.
Fase lag: durante la cual la masa celular crece pero no aumenta el nmero de clulas.

Fase de crecimiento o fase exponencial: Durante la fase log el crecimiento de

microorganismos sigue un patrn exponencial. La razn de este comportamiento es que
muchos microorganismos se reproducen formando dos clulas hijas a partir de una clula
madre.
Fase estacionaria: no hay aumento neto en el nmero de clulas debido a cambios
qumicos y fsicos en el ambiente, pero donde aun requieren una fuente de energa que
mantiene la viabilidad celular.
Fase de muerte: caracterizada por una disminucin exponencial en el nmero de las
clulas vivas.

32
La fase lag es debida a los cambios rpidos en los medios de cultivo, por ejemplo si
transferimos un inculo de una poblacin en crecimiento estacionario a un medio de
cultivo fresco el tiempo que tarde en llegar a fase exponencial depender del tamao de
dicho inculo. Un inculo de volumen pequeo que es transferido a un gran volumen de
medio fresco puede resultar en la salida difusional de vitaminas, cofactores e iones que
son necesarios para muchas actividades enzimticas intracelulares. Si esta transferencia
se realiza de un medio rico a un medio pobre, resultar en consecuencia en un aumento
de la fase lag y tambin puede resultar en un crecimiento exponencial pero de menor.

Medicin de la masa celular

Hasta aqu hemos venido hablando de masa celular que resulta proporcional al nmero
de clulas slo en la fase exponencial. La masa celular se puede medir en trminos de
peso seco, pero generalmente resulta ms prctica y til la medicin por Turbidimetra en
un espectrofotmetro o en un colormetro, ya que permite seguir el aumento de la
densidad del cultivo mientras esta creciendo.
La de eleccin es 660nm ya que se evita la absorcin de partculas coloreadas del
medio de cultivo y en consecuencia el blanco hecho con medio de cultivo sin inoculo
bacteriano es similar al blanco de agua.

Cuantificacin celular

Para tener una idea precisa del nmero de clulas viables elegimos se utiliza el mtodo
de Plaqueo en medio slido.

Se efectan diluciones que son distribuidas en el agar y luego de dejar incubando una
noche a 370C se procede a contar colonias (ver nota y figura ms abajo), cuyo nmero
resulta directamente proporcional al nmero de clulas ya que cada una de ellas proviene
de una clula individual. De este concepto deriva el trmino Unidad Formadora de
Colonia (UFC). El clculo de la concentracin de clulas viables a un tiempo dado, se
realiza como se indica:

N= nmero de colonias
UFC/ml= n x FD/Vp contabilizadas
FD=Factor de dilucin (previo al
plaqueo)
Vp= volumen plaqueado

33
 TP#4 Cuantificacin celular en medio slido

1. Realizar diluciones seriadas al 1/10 (ver figura) del cultivo a cuantificar, utilizando
medio LB (Vf=1ml). Tener la precaucin de homogenizar la suspensin celular antes de
pipetear.

VSv:
900L

2. Plaquear seleccionando un volumen de plaqueo adecuado al tamao de la placa (hta.

200 ul para placas de 10 cm; hta 50 ul para placas de 5 cm).

3. Incubar a 37 oC toda la noche

4. Cuantificacin de colonias y clculos de UFC/ml. (Nota: este paso se realizar

durante el prximo TP)

NOTA: Morfologa de colonia: La multiplicacin bacteriana en medio slido, genera

una colonia macroscpica que tambin puede presentar caractersticas particulares de
acuerdo a la especie y al medio de cultivo. (http://www.bact.wisc.edu)

34
 ESPECTROFOTOMETRIA

Introduccin a la Espectroscopia de Absorcin

Transmitancia
Cuando una solucin es puesta en presencia de un haz de luz, debido a la interaccin
entre los fotones y las partculas absorbentes de la muestra, la potencia del haz se atena
de P0 a P. La transmitancia T de la solucin es por lo tanto, la fraccin de radiacin
incidente transmitida por la solucin.
T = P/P0
Absorbancia
La absorbancia de una solucin se define por la ecuacin:
A = - log10T = log P0/P
A diferencia de la transmitancia, la absorbancia de una solucin aumenta cuanto mayor
es la atenuacin del haz.
Por lo tanto T y A son conceptos que definen la cada de la potencia radiante P0, luego de
atravesar una capa de solucin de una especie absorbente de concentracin c y de b cm.
de grosor.

P0 P

Solucin absorbente de
concentracin c
Absortividad y absortividad molar
La absorbancia es directamente proporcional a la longitud b de la trayectoria a travs de
la solucin, y a la concentracin c de la especie absorbente. Estas relaciones se expresan
por
A = abc
Donde a es una constante de proporcionalidad denominada absortividad, caracterstica
para cada solucin en particular, tan invariable como el punto de fusin, de ebullicin o
los ndices de refraccin. La magnitud de a depender de las unidades utilizadas para b y
c. Frecuentemente b se expresa en centmetros y c en gramos por litro. Entonces la
absortividad tiene unidades de (g/l)-1 y cm-1. Cuando la concentracin se expresa en
moles por litro, la absortividad se denomina Absortividad molar.
A = bc

35
Ley de Lambert Beer

La expresin: A = bc o A = abc es una expresin que se conoce como ley de Beer y

permite cuantificar una muestra medida por absorcin.
La ley de Lambert y Beer establece que la absorcin de la luz es proporcional al nmero
de molculas de las sustancias en solucin por donde pasa el haz luminoso. Por lo tanto
la absorcin vara con la longitud del trayecto que recorre el haz de luz en la solucin y
con la concentracin del absorbente en una forma caracterstica para cada sustancia
absorbente y para una longitud de onda dada.
La ley de Beer tambin se aplica a soluciones que contengan ms de una clase de especie
absorbente. Suponiendo que no haya interaccin entre las distintas especies, la
absorbancia total para un sistema multicomponentes se expresa como:
Atotal = A1+A2+.........+An = 1bc1+2bc2+.........+nbcn

Limitaciones propias de la ley de Beer

La ley de Beer slo describe bien el comportamiento de la absorcin en soluciones
diluidas. A concentraciones elevadas (en general > 0.01M) la distancia promedio entre
las especies responsables de la absorcin disminuye hasta el punto en que cada una afecta
a la distribucin de carga de sus vecinas. Esta interaccin, a su vez puede alterar la
capacidad de que las especies absorban a una determinada longitud de onda de radiacin.
Dado que el grado de interaccin depende de la concentracin, el hecho de que ocurra
este fenmeno causa ciertas desviaciones de la relacin lineal entre la absorbancia y la
concentracin.

Instrumentos para mediciones de absorcin:

Espectrofotmetro
El espectrofotmetro es un instrumento que permite medir la intensidad de la luz
transmitida. Consta de:
a) Fuente de luz: lmparas que suministren una fuente continua y cuya potencia no vare
bruscamente en un intervalo considerable de longitudes de onda.
b) Selector de longitud de onda: sistema ptico que separa el haz de luz en sus longitudes
de ondas componentes, seleccionando una de ellas, la que luego atravesar la muestra
(ver figura ms abajo)
c) Recipientes para la muestra (cubetas): deben ser de un material a travs del cual pase
la radiacin de la regin espectral de inters. Para trabajar en la regin UV (por debajo de
350 nm) se necesita cuarzo. En la regin entre 350 y 2000 nm se pueden usar vidrios o
recipientes de plstico. Para los trabajos en las regiones ultravioleta y visible, la longitud
de la cubeta es 1 cm.
La calidad de los datos de absorbancia depende de manera crtica de la forma en que se
usen y mantengan las cubetas. Las huellas dactilares, la grasa u otras manchas en las
paredes, alteran de forma notable las caractersticas de transmisin de una cubeta. Por
tanto es necesaria una limpieza a fondo, antes y despus de usarlas, la superficie de las
ventanas no debe tocarse durante su manipulacin.

36
d) Detectores de radiacin: receptor que transforma la seal luminosa en corriente
elctrica.
e) Sistemas de procesamiento y dispositivos de lectura de las seales: voltmetro que
registra la corriente elctrica en una escala general. Normalmente en los
espectrofotmetros se pueden encontrar 2 escalas: 1) %T (transmitancia), 2) A
(absorbancia).

El espectrofotmetro puede emitir frecuencias luminosas que varan segn el aparato y la

fuente de luz. Normalmente suelen corresponder a la regin del espectro visible, entre
400 y 700 mm, pudiendo abarcar tambin la regin del ultravioleta (UV), entre 15 y 400
nm y del infrarrojo (IR), ms de 700 nm.

UV VISIBLE IR

300 400 500 600 700 800 nm

37
 TP# 5 Cuantificacin del Crecimiento Celular
(Turbidimetra)

OBJETIVOS

Evaluar el crecimiento bacteriano por turbidimetra

MATERIALES

-Cultivo de E. coli en fase exponencial

-erlenmeyers/botellas de cultivo
-caldo Luria Bertani (LB)
-Placas de Petri con medio LB-agar
-Bao termostatizado
-espectrofotmetro, cubetas
-pipetas, tubos tipo eppendorf y tips estriles, rastrillo de vidrio

DESARROLLO

Antes de comenzar la prctica:

Encender el espectrofotmetro y calibrar a 600 nm

-Largar un cultivo en medio LB utilizando como inculo el cultivo previamente

crecido. Realizar una dilucin 1/20 (Vf= 50 ml). Tomar una alcuota de 0.2 ml en
un tubo eppendorf estril, reservar en heladera. Pipetear un V de 0.5 ml y medir al
espectro (descartar). Este dato de absorbancia constituye el to. Colocar el cultivo en
agitacin a 37 oC.

-Realizar mediciones cada 30 min, reservando tambin un volumen de 0.2 ml como

se explico ms arriba.

De esta manera se seguir la curva de crecimiento a lo largo del TP, midiendo la DO600 a
diferentes tiempos, en diferentes condiciones (que sern indicadas por los docentes) y se
graficar los valores de absorbancia en funcin del t.

38
 Preparacin de Medios de cultivo
LB-caldo LB-agar
10g triptona (o hidrolisado de casena) Al medio LB agregar 15 g de agar
5 g extracto de levadura
10g NaCl Autoclavar. Dejar enfriar (50-60 oC)
Csp 1L antes del agregado de antibiticos si es
(ajustar si es necesario a pH 7.4 con necesario, y luego del templado volcar
NaOH 1N) en placas de Petri. Dejar solidificar y
Autoclavar a 121 oC, 20 min. colocar unas h a 37 oC para eliminar el
exceso de humedad y conservar en
heladera.

Si es necesario el agregado de antibiticos, hacerlo siempre post-autoclavado

asegurndose, que el medio se haya templado. Ampicilina: 50 g/ml

39
 TP# 6 Cuantificacin de Protenas

Introduccin
Existen dos tipos de mtodos que pueden ser empleados para estimar la concentracin de
protenas en una muestra:
- Absorcin de luz ultravioleta (UV)
- Mtodos colorimtricos

Absorcin de luz ultravioleta (UV)

Las protenas absorben activamente la luz de la regin ultravioleta con un pico mximo
correspondiente a los 280 nm y otro a los 200 nm.
El pico de 280 nm corresponde a la absorcin de fotones por parte de los electrones de un
anillo aromtico. Los aminocidos que tienen anillos aromticos en su estructura son la
fenilalanina, triptofano, histidina y tirosina.
Los enlaces peptdicos absorben fotones por debajo de los 210 nm.
Sin embargo la longitud de onda de eleccin es la de 280 nm debido a que son muy pocas
las sustancias qumicas que la absorben, disminuyendo las posibles interferencias.
Los mtodos de absorcin de luz UV presentan las siguientes ventajas:
- Se llevan a cabo directamente en la muestra sin necesidad sin agregarle ningn
reactivo.
- Se realizan rpidamente ya que no requieren incubacin
- La relacin entre la absorcin y la concentracin proteica es lineal (se cumple
la ley de Lambert Beer).
-
Mtodos colorimtricos
Se fundamenta en el agregado de diferentes reactivos qumicos que reaccionan con las
protenas dando lugar a un producto coloreado que ser medido en el espectro visible, y
cuya intensidad es lineal con respecto a la concentracin proteica en un rango
determinado (esta relacin se aleja de la linealidad tanto en las altas concentraciones
como en las muy bajas).
Existen diferentes mtodos que varan no solo en su fundamento sino tambin en su
sensibilidad. La eleccin de uno u otro ser acorde a la muestra biolgica problema.
Los ensayos colorimtricos siempre se llevan a cabo realizando al mismo tiempo una
curva con diferentes diluciones de una solucin de una protena patrn de concentracin
conocida. Por lo tanto los valores obtenidos son siempre relativos a esta curva de
referencia. La misma debe realizarse simultneamente y en la misma solucin empleada
para la muestra incgnita, a fin de considerar las posibles interacciones de los reactivos
con los componentes de la solucin reguladora usada, la descomposicin de los mismos,
y las posibles variaciones de tiempo y temperatura.

Objetivo
Determinacin de la concentracin proteica de una muestra utilizando el mtodo
colorimtrico de Bradford.

40
 Materiales
Solucin madre de Albmina bovina (BSA)
Solucin cida del reactivo de color (Coomassie Blue G)
NaOH 1 M
Agua destilada
Tubos de hemlisis
Pipetas automticas
Espectrofotmetro
Metodologa

Reactivo de color:
Se disuelve 100 mg de Serva Blue G en una mezcla de 100 ml de 85% de cido fosfrico
y 50 ml de etanol 95%, despus de la completa disolucin del colorante se lleva el
volumen a 1 litro con agua.

Fundamento del mtodo:

El pico de absorcin mxima del colorante en una solucin cida, se desplaza desde los
465 nm a los 595 luego del agregado de la protena, debido a la estabilizacin de la forma
aninica del colorante por interacciones tanto inicas como hidrofbicas. El colorante
reacciona principalmente con los residuos de arginina, y en menor proporcin con
histidina, lisina, tirosina, triptofano y fenilalanina.

Procedimiento:
Se realizarn previamente las diluciones correspondientes para la curva de calibrado y de
las muestras incgnitas.
1- Prender el espectrofotmetro 15 minutos antes de usarlo
2- Poner 20 l de la muestra en los tubos. Agregar 50 l de NaOH a la muestra
3- Agregar 1 ml del reactivo de color e incubar durante 5 minutos
4- Medir la absorbancia a la longitud de onda correspondiente en una cubeta de plstico
o de vidrio.

Importante: Tener en cuenta el Vmin a emplear para cada cubeta, de lo contrario, el

haz de luz no atravesar la muestra

5- Obtener la curva patrn (Cc vs A595) y a partir de esta, obtener la concentracin de las
muestras incgnita.

41
Autoevaluacin
Confeccin de la curva de calibrado
1- Teniendo en cuenta que el rango de deteccin para este mtodo va de 0.2 a 20 g,
calcular las diluciones que hay que preparar a partir de una solucin madre de BSA
de 1mg/ml, para construir una curva de calibrado de al menos 5 puntos.

Dilucin BSA Volumen a pipetear (l) Absorbancia (DO595)

(concentracin)

2- Cul es la longitud de onda a la deber leer las muestras luego de reaccionar con el
reactivo de color?
4-Usted cuenta con una solucin de albmina pura y quiere determinar su concentracin.
Se le ha acabado el Coomassie y por problemas presupuestarios no puede comprarlo por
ahora y no tiene nadie que le preste un poco. Sin embargo cuenta en el laboratorio con
un espectrofotmetro que lee hasta 280 nm, cubetas de plstico y de cuarzo.
Podr calcular la concentracin de la solucin? Qu precauciones debera tener? Podr
hacer lo mismo con una solucin mezcla de protenas?

Conclusiones
Confeccione un informe graficando la curva de calibracin y calcule la concentracin de
la muestra incgnita. Coinciden los resultados observados con los esperados?.

42
 Centrifugacin

La sedimentacin de una partcula por accin de la fuerza centrfuga, resulta de la

aplicacin de aceleracin radial por movimiento rotacional.
Las partculas ms densas que el medio de suspensin se movern rpidamente hacia la
periferia del recipiente que contengan la mezcla sometida a centrifugacin. Por el
contrario las partculas o el lquido ms liviano se movern rpidamente hacia el interior.
La fuerza centrifuga supera a las fuerza difusionales Brownianas que normalmente
impiden o previenen la sedimentacin de partculas finas por accin de la gravedad,
permitiendo obtener la separacin en 2 fases de (precipitado pellet y sobrenadante) en
un tiempo corto.
La velocidad de sedimentacin Vg de una partcula en un fluido menos denso bajo la
influencia de la fuerza gravitacional est dada por la Ley de Stokes
1 2
Vg = D 2 g
18
D: dimetro de la partcula
1: densidad de la partcula
2: densidad del lquido
: viscosidad del fluido
g: aceleracin de la gravedad
En una centrfuga g es reemplazada por w2r, donde r es la distancia de la partcula al
centro de rotacin y w es la velocidad angular de la centrfuga (radianes seg.1).
W = n/30 n = velocidad rotacional en revoluciones por segundo
Por lo tanto, la fuerza centrifuga aumenta la velocidad de sedimentacin de Vg a Vs, es
decir:

rw2
Vs = Vg
g
De esta ecuacin se puede deducir que la velocidad de sedimentacin de una partcula
puede aumentar por:
1- aumento del dimetro de la partcula (D)
2- aumento de la diferencia entre las densidades de la partcula y el fluido (1 - 2)
3- aumento de la velocidad de centrifugacin (w)
4- disminucin de la viscosidad del liquido de la suspensin
Adems aumentando el tiempo a que la partcula es sometida a la fuerza centrfuga,
mayor ser el desplazamiento de la misma desde el centro de rotacin, de acuerdo a:
Vs t = distancia recorrida
Esto se logra aumentando el tiempo de centrifugacin
A bajas velocidades de centrifugacin se podrn sedimentar clulas enteras pero
quedarn en suspensin los componentes celulares como ncleos, mitocondrias y restos

43
de membranas, a estos habr que aplicarles, segn su tamao, mayor velocidad de
centrifugacin para sedimentarlos.

Condiciones de centrifugacin Fracciones sedimentadas

1000 x g, 5 min. Clulas, ncleos.
4000 x g, 10 min. Cloroplastos, restos celulares.
15.000 x g, 20 min. Mitocondrias, peroxisomas.
30.000 x g, 30 min. Lisosomas
100.000x g, 3 h Ribosomas y polisomas, membranas
La velocidad de centrifugacin puede estar definida en g (aceleracin de la gravedad) y
nos indica cuantas veces la aceleracin de la gravedad debo aplicarle a una partcula para
que sedimente en determinado tiempo de centrifugacin o en rpm (revoluciones por
minuto) las cuales dependern del radio del rotor o radio de giro. Existen tablas que nos
indican a cuantas rpm debemos centrifugar una muestra en un determinado rotor para
someterla a los g necesarios para sedimentarla.
En el caso de las ultracentrfugas, por ej. la velocidad de centrifugacin alcanza a los
60000 rpm, que para una partcula localizada a 6 cm del eje rotacional corresponde a una
fuerza 250.000 veces mayor que la gravitacional (250000 g)
Diferentes tipos de centrfugas
La parte fundamental de cualquier centrfuga es el rotor (donde se insertan los tubos
conteniendo las muestras), y segn el tipo de centrifuga puede poseer adems
refrigeracin y un sistema para producir vaco. Existen diferentes tipos de centrfugas
dependiendo de las velocidades de centrifugacin:
1) Centrfuga tipo clnica. Para bajas velocidades (0 5000 rpm), normalmente se utiliza
para separar clulas, algunas poseen refrigeracin.
2) Centrfuga tipo Sorvall. Alcanza hasta 20.000 rpm y poseen refrigeracin.
3) Ultracentrfugas. Para altas velocidades de centrifugacin (hasta 80.000 rpm), poseen
refrigeracin y un sistema de vaco para disminuir la fuerza de rozamiento con el aire y
lograr altas velocidades.
Por otro lado segn la finalidad de la centrifugacin, las centrfugas pueden ser analticas
o preparativas.
a) Las centrfugas analticas son ultracentrfugas y se trabaja con muestras pequeas. En
general se emplean para determinar el peso molecular de las partculas.
b) Las centrfugas preparativas son capaces de trabajar con grandes muestras (10 2.000
ml), se utiliza para separar diferentes fracciones subcelulares. Pueden ser tipo Sorvall o
Ultracentrfuga.

44
 TP # 7 Permeabilidad de las Membranas Celulares

Introduccin
Las membranas biolgicas tienen la propiedad de ser semipermeables y selectivas. Las
sustancias pueden atravesar la membrana celular por difusin pasiva o por alguno de los
mecanismos de transporte activo El transporte de las molculas depende de su peso
molecular, su carga elctrica y del coeficiente de solubilidad en lpidos. La difusin se
produce cuando existe un gradiente de concentracin, y ocurre desde el lugar de mayor
concentracin hacia el de concentracin menor.
La membrana celular mantiene un balance entre la presin osmtica de los lquidos
intracelulares e intersticiales. Las soluciones pueden ser isotnicas, hipotnicas o
hipertnicas respecto al lquido intracelular.
Objetivos
Determinacin de la hemlisis y resistencia globulares
Materiales
Ratas
Heparina
ClNa
Sacarosa
Agua destilada
Jeringas y agujas 23 G
Alcohol 96%
Gradillas con tubos de hemlisis
Centrfuga
Espectrofotmetro
Microscopio
Portaobjetos y cubreobjetos

Metodologa
Obtener sangre de una rata mediante puncin cardiaca con jeringa heparinizada.
Preparar una batera de tubos de hemlisis con distintas soluciones de ClNa (5 mL
volumen final) , como indica la tabla adjunta. Agregar 50 l de sangre suavemente en
cada tubo. Se agitan suavemente los tubos y se colocan en la gradilla en orden creciente
de concentracin. Luego de 10 minutos se centrifugan las distintas muestras (1500 rpm, 5
minutos).

45
Tabla 1:

SOLUCION SOLUTO SOLVENTE CONCENTRACION OBSERVACIONES

(NaCl) (AGUA) ml en %
MADRE 9 100
1 9 100
2 1:2
3 1:10
4 1:2 de 3
5 1:10 de 3
6 1:100 de3
7 Agua

Nota: complete el cuadro.

Mr del NaCl = 58,5

Conclusiones
Confeccionar un informe luego de observar la turbidez, tonalidad, microscopa de los
sedimentos y lectura espectrofotomtrica correspondiente al sobrenadante cada tubo
(480nm). El mismo debe contener resultados obtenidos y conclusiones.

Autoevaluacin
1) Esquematice la estructura de la membrana plasmtica. Mencione brevemente la
funcin de cada uno de sus componentes.
2) Explique los mecanismos por los cuales son incorporados los siguientes elementos a
las clulas considerando los componentes de la membrana involucrados y el
requerimiento energtico: glucosa, Na+, agua, bacterias, hormonas esteroideas, glicerol,
Cl-, micropartculas inertes.

46
 Cultivo de Tejidos

Se entiende por cultivo celular al conjunto de tcnicas que permiten el mantenimiento de

las clulas in vitro, conservando al mximo sus propiedades fisiolgicas, bioqumicas y
genticas.
Se podra hablar de tres tipos de cultivos:
Cultivo de rganos: implica que la arquitectura caracterstica del tejido in vivo se
mantiene al menos en parte. Este tipo de cultivo permite mantener los tipos celulares
diferenciados y es por ello una buena replica del tejido de origen, aunque no permite su
propagacin.
Explantes primarios: Fragmentos de tejidos o de rganos que se adhieren a una
superficie y en el que proliferan las clulas de la periferia del explante.
Cultivo de clulas: Supone una disgregacin celular por medios enzimticos o
mecnicos. Este tipo de cultivo puede propagarse, aumentando la masa celular del
mismo. Una vez que el cultivo se ha propagado por algunas generaciones, ste pierde la
heterogeneidad celular de partida, la poblacin se hace uniforme y homognea ya que
predominan en el cultivo aquellos tipos celulares que tienen superior tasa de crecimiento.
CULTIVO PRIMARIO: cultivo de clulas provenientes de la disgregacin de un tejido
original tomado de algn rgano animal. Este tipo de cultivo se caracteriza por conservar
la morfologa celular de origen, ser diploides, poseer un crecimiento celularin vitro
limitado y por tener inhibicin por contacto (ej: hepatocitos, neuronas). Aquellos cultivos
primarios que proliferan in vitro pueden ser replaqueados o subcultivados.
Cuando esto ocurre se establece una LINEA CELULAR PRIMARIA o FINITA, con
caractersticas similares a las del cultivo primario. En una lnea primaria el cultivo se
estabiliza y presenta mayor homogeneidad, ya que el tipo celular con mayor tasa de
crecimiento desplaza a los otros tipos celulares. (Generalmente existen medios de cultivo
selectivos para el tipo celular de inters). Tanto los cultivos primarios como las lneas
primarias tienen un tiempo de vida limitado, finalmente las clulas entran en una fase de
senescencia, con acumulacin de numerosas anormalidades, perdida de funciones
especializadas, etc. que conducen a la muerte del cultivo. (ej: fibroblastos, HUVEC)
Ocasionalmente una lnea primaria puede mantenerse en cultivo por ms generaciones
de las esperadas, esto se debe a la aparicin en el cultivo de clulas inmortales. Estas
clulas forman cultivos estables o LINEAS CELULARES CONTINUAS o

47
INFINITAS. La razn de la inmortalizacin de estas clulas en muchos casos es
desconocida generalmente estn relacionadas con la perdida espontnea o inducida de
las vas de control del ciclo celular. Las lneas celulares continuas estn formadas por
clulas que se diferencian gentica y morfolgicamente de las clulas de las cuales se
originaron. Pueden provenir de clulas derivadas de tumores o de una lnea primaria que
ha sido transformada mediante la transfeccion de oncogenes o el tratamiento con
carcinognicos. Este tipo de cultivo tiene la caracterstica de ser aneuploide, de no tener
inhibicin por contacto y de crecer de manera indefinida. Entre las lneas mas conocidas
se encuentran las HeLa, K-562, Meg-01.

Condiciones de Cultivo
Recipientes de cultivo: placas de petri, multiplacas, etc.
Sustrato: Muchas lneas celulares crecen en monocapas unidas a un soporte ms o
menos slido (vidrio, superficies plsticas, superficies tratadas con colgeno, fibronectina
o gelatina). Aquellas lneas que para proliferar necesiten adherirse se conocen como
dependientes de anclaje, las lneas que crecen en suspensin son por lo tanto
independientes de anclaje.
Fase gaseosa:
a) Oxgeno: Las necesidades de oxigeno de la mayora de los cultivos esta cubierta por la
presin atmosfrica de este gas.
b) Dixido de Carbono: Este gas es fundamental porque influye en la cantidad de CO2
disuelto el pH y la cantidad de iones HCO3-
Las reacciones que tienen lugar son:
H2O + CO2 H2CO3 H+ + HCO3- (1)
NaHCO3 Na+ + HCO3- (2)
El incremento de la concentracin del ion HCO3- desplaza la ecuacin (1) hacia la
izquierda de modo que el pH se establezca en 7.4. Cada medio tiene una concentracin
recomendada de bicarbonato y presin de CO2 para alcanzar el pH correcto.
pH y capacidad buffer: El pH ptimo de crecimiento para la mayora de los tipos
celulares es 7.4. El indicador de pH que se suele usar es rojo fenol. El medio de cultivo
debe tener capacidad buffer, a fin de evitar cambios bruscos de pH. El sistema buffer mas
utilizado es el del bicarbonato
Temperatura

48
Medio de cultivo: formado por los siguientes elementos:
1. Soluciones salinas equilibradas
2. Aminocidos
3. Vitaminas
4. Otros suplementos orgnicos de bajo peso molecular
5. Hormonas y factores de crecimiento (suero)
6. Antibiticos y antifngicos.
Algunos de los medios mas utilizados son: Medio Mnimo Esencial de Eagle (MEM);
RPMI 1640, MEM modificado (DMEM); Medio 199.

Los medios no definidos son aquellos que deben ser suplementados con suero. Alguno de
los mas empleados son: suero de ternera (calf serum, CF), fetal bovino (fetal calf serum,
FCS); suero de caballo (horse serum, HS); y suero humano (Human serum, HuS). A
pesar que la composicin del suero es conocida, los componentes presentes pueden tener
concentraciones variables que podran influir en el cultivo. El tipo de medio de cultivo y
como ser suplementado depende de los requerimientos de la lnea celular a cultivar.
Los estudios que emplean cultivos celulares abarcan gran nmero de disciplinas y
aproximaciones al estudio del fenmeno celular como: actividad intracelular, ecologa e
interacciones celulares. Dentro de las reas de estudio que ms utilizan este tipo de
tecnologa se encuentran la virologa, inmunologa y aquellas disciplinas dedicadas a la
investigacin del cncer.

49
 La Fagocitosis: Resea histrica
En 1908, 20 aos despus de
su incorporacin al Intituto Pasteur,
Elie Metchnikoff (1845-1916)
comparti el premio Nobel en
Fisiologa & Medicina con Paul
Ehrlich. Este premio fue otorgado a
Metchnikoff por su descubrimiento de
la fagocitosis como base de la
inmunidad mediada por clulas y a
Ehrlich por sus estudios en
anticuerpos e inmunidad humoral.
Metchnikoff contempl el proceso de
fagocitosis dentro del amplio
concepto de Harmony and
Disharmony que describa la
compleja relacin entre los patgenos
y sus hospedadores.
Introduccin
Los macrfagos pulmonares
constituyen la primera lnea de
defensa del organismo evitando la
entrada de una gran variedad de
sustancias como: gases atmosfricos,
partculas de polvo, aerosoles y
microorganismos. A pesar del gran
nmero de partculas infecciosas que
son depositadas continuamente sobre
las paredes alveolares del pulmn, su
superficie generalmente se encuentra
estril. El poder bactericida del
pulmn se debe al potencial fagoctico
y ltico (proteasas, elastasas, etc.) de
los macrfagos alveolares. Estas
Cien aos despus, la importancia del
legado de Metchnikoff es ms que
evidente. Metchnikoff propuso que la
fagocitosis era un mecanismo antigo
que se origin en los metazoos
primitivos y que los provey de un
sistema de defensa operativo de
rpida accin contra los
microorganismos. Hoy sabemos que
los fagocitos tambin juegan un rol
crucial en la inmunidad adaptativa de
los organismos superiores,
reconciliando as la inmunidad celular
de Metchnikoff con la inmunidad
humoral de Ehrlich. (2008; 120
aniversario, Institut Pasteur).
clulas ingieren el material extrao
que llega al pulmn mediante el
proceso de fagocitosis. Muchos
patgenos infectan y replican dentro
de los macrfagos, interfiriendo con
los procesos celulares que eliminan a
la mayora de los microorganismos.
En el siguiente sitio de la revista
Nature, se muestran estos eventos en
Listeria monocytogenes, Legionella
pneumophila y M. tuberculosis:
http://www.nature.com/nrmicro/ani
mation/imp_animation/allthree_qt.m
ov
50
 TP # 9 Fagocitosis de partculas por macrfagos alveolares

Objetivos
Objetivo 1. Obtener una poblacin casi homognea de macrfagos alveolares
mediante lavado bronqueoalveolar (BAL)
Objetivo 2. Estudiar el fenmeno de fagocitosis in vitro a distintas temperaturas.
Objetivo 3. Cuantificacin Celular: empleo de cmara de Neubauer
Materiales
Ratas, ratones o hmsters
Anestsico
Cnulas nasofaringeas de polietileno
Jeringa
PBS y PBS libre de Ca+2 Mg+2
Material de ciruga
Tubos de centrfuga
Centrfuga de mesa
Medio de cultivo Dulbecco o RPMI 1640
Partculas de hierro
Cpsulas de Petri
Bao termostatizado o estufa a 37C
Alcohol 96%
Colorante vital azul de tripn o rojo neutro
Colorante hematoxilina
Microscopio ptico
Cmara de Neubauer
Metodologa
Obtencin de los macrfagos:
Anestesiar al animal, exponer la trquea e introducir una cnula adosada a una jeringa de
3ml que contenga PBS libre de Ca+ Mg+. Masajear suavemente la caja torxica y
recuperar la solucin. Descartar este primer lavado alveolar. Repetir el procedimiento y
guardar la solucin recuperada en un tubo de centrfuga. Repetir este procedimiento 10-
12 veces. Centrifugar el material recolectado 10 minutos a 800 x g. Descartar el
sobrenadante y resuspender el pellet en medio RPMI-1640 y contar el nmero de clulas.
Evaluar la viabilidad celular de los macrfagos alveolares obtenidos utilizando algn
colorante vital. Sembrar las clulas en cpsulas de Petri e incubar en cmara de cultivo
(37C, 5 % CO2).
Exponer los cultivos celulares a las a partculas previamente sonicadas. El
volumen a utilizar de la suspensin ser indicado por los docentes.
Incubar 1 h a 4C, 20C (T ambiente) y a 37C.
Descartar el medio, lavar las clulas con PBS y fijarlas con alcohol 96%. Teir
las clulas con hematoxilina
Observar bajo microscopio.

Nota 1: Partculas: Alternativamente se emplearan particulas de hierro, carbon o material

derivado de la polucin en el aire (ceniza residual de combustibles), denominado ROFA
(residual oil fly ash).

51
Anlisis de Resultados
- Graficar el nmero de clulas que incorporaron partculas de hierro vs las distintas
temperaturas.
Confeccionar un informe final analizando los resultados obtenidos.

Nota 2: Como consecuencia de los tiempos necesarios para el establecimiento del cultivo
de macrfagos, los alumnos recibirn las cajas de Petri conteniendo clulas extradas
previamente. Durante la prctica, se realizar un BAL en animales de laboratorio, tal como
indica el protocolo descripto. Las clulas obtenidas por los alumnos, sern utilizadas para
evaluar el rendimiento de dicho protocolo mediante la cuantificacin celular utilizando la
cmara de Neubauer.

Autoevaluacin

-Complete el siguiente cuadro referido a los procesos involucrados en el transporte

de sustancias hacia y desde el interior de la clula.
Caractersticas Ejemplo del elemento transportado
Difusin
Fagocitosis
Endocitosis
Cules son las caractersticas estructurales y funcionales de los filamentos intermedios?
Seale los principales grupos en que fueron clasificados.
Mencione qu tcnicas utilizara para visualizar microtbulos y microfilamentos.

Objetivo 3

Evaluar el rendimiento del protocolo de BAL mediante la cuantificacin celular

utilizando la cmara de Neubauer.

Materiales
-Cmara de recuento/ cmara de Neubauer/ hemocitmetro
-Microscopio
-Suspensin celular
Procedimiento:
-Realizar una dilucin de la muestra utilizando en colorante azul de trypan.
-Cargar la cmara con una micropipeta como se indica en la figura.

- .

52
 Recuento Celular

Cada cuadrado del hemocitmetro (16 cuadrados menores) representa un volumen total
de 0.1 mm3 o 10-4cm3. Como 1 cm3 es aproximadamente equivalente a 1 ml, la
concentracin celular por ml (y el nmero total de clulas) se determina realizando los
siguientes clculos:

Clulas por ml:

El promedio de clulas por cuadrado x el factor de dilucin x 104

Clulas totales:
Clulas por ml x el volumen original de la muestra

Responda: Si el promedio de clulas por cuadrado es de 25 y para poder contar realiz

una dilucin 1/20: Cuntas clulas por ml recuper de un BAL en rata?. Si recuper un
volumen de lavado de 5 mL: cuntas clulas totales obtuvo?

53
 TP # 10 Divisin Celular: Mitosis

Divisin Celular

El crecimiento, reparacin y renovacin de todos los organismos multicelulares

depende de la formacin de nuevas clulas a travs de la divisin de las clulas
preexistentes. Existen dos mecanismos para la divisin celular: la mitosis en las
clulas somticas y la meiosis en las clulas germinales. Ambas formas de divisin
presentan muchas caractersticas comunes, aunque difieren en el comportamiento
de los cromosomas durante las fases iniciales de la divisin.

Mitosis: La divisin mittica da lugar a dos clulas hijas que poseen copias
idnticas del genoma de la clula original. El ADN se replica antes del inicio de la
divisin celular (periodo S). El periodo entre los episodios sucesivos de divisin
celular se denomina interfase. La secuencia de acontecimientos que ocurren
durante la mitosis se ha dividido en cinco fases: profase, prometafase, metafase,
anafase y telofase.

Objetivo

Observar las distintas fases de la mitosis en meristema apical de raz de cebolla

(Allium cepa)

54
 Divisin Celular: Meiosis

Como hemos visto en el TP anterior la mitosis da como resultado la formacin de

dos ncleos hijos, cada uno de los cuales recibe una copia exacta de los
cromosomas de las clulas progenitoras. Durante la meiosis cada ncleo diploide
se divide dos veces produciendo un total de cuatro ncleos, cada uno de los ncleos
contiene la mitad del nmero de cromosomas presentes en el ncleo original. Los
ncleos haploides obtenidos durante la meiosis contienen nuevas combinaciones de
cromosomas.
Los cromosomas homlogos derivados originalmente de los padres del organismo
estn distribuidos al azar entre los cuatros nuevos grupos haploides.

La meiosis consiste en dos divisiones nucleares sucesivas: Meiosis I y Meiosis II

En la Meiosis I los cromosomas homlogos se aparean y luego se separan (etapa
reduccional). Las etapas de la Meiosis I son: profase I, prometafase I, metafase I,
anafase I y telofase I.
En la Meiosis II se separan las cromtides de cada homlogo. Las etapas se
denominan: profase II, prometafase II, metafase II, anafase II y telofase II.
La profase II no est precedida por la duplicacin del material gentico.

Objetivo
Esquematizar las diferentes fases de la meiosis en cortes histolgicos de testculo
de rata y/o vizcacha.

55
 El ADN: Resea histrica

El cido desoxiribonucleico casi idntica a la cantidad de timina,

(ADN) fue aislado por primera vez en
1869 por el cientfico suizo Friedrich
Miescher. Para finales de los 1940s,
los cientficos conocan la
composicin del ADN: fosfato,
azcar y cuatro bases que contenan
nitrgeno (adenina, timina, guanina y
citosina). Gracias a los experimentos
de Frederick Griffith y Oswald Avery,
se saba que el ADN era la molcula
de la herencia de los caracteres,
planteada por Gregor Mendel en el
siglo anterior. Los experimentos de
Erwin Chargaff, mostraron que la
cantidad de adenina en una clula era
asimismo, la cantidad de guanina era
comparable a la cantidad de citosina
(A=T, y G=C). Sin embargo, nadie
imaginaba la estructura de la
molcula. En 1953, Linus Pauling
sostuvo que haba descubierto la
estructura del ADN, sin embargo
cuando Watson vio el trabajo de
Pauling, que an no se haba
publicado, supo que no era correcto.
Unos das despus, lleg a las manos
de Watson una fotografa de
difraccin de rayos X tomada a partir
de cristales de ADN por Rosalind
Franklin. Ms tarde Watson escriba:

"The instant I saw the picture, my mouth fell open and my pulse began to race"
Watson, The Double Helix (1968).

El descubrimiento de la doble
hlice fue publicado en Nature el 25 de
Abril de 1953 'A Structure for
Deoxyribonucleic Acid' by Watson, J.F.,
and Crick, F.H.C. Los autores
comprendieron que del modelo de
apareamiento de bases especfico que
proponan, se desprenda directamente
un posible mecanismo de copiado del
material gentico.
En 1962, Watson and Crick
recibieron el premio Nobel de Fisiologa
y Medicina, junto a Maurice Wilkins,
quien haba publicado junto a R. Franklin
el importante trabajo de cristalografa, en
el mismo nmero de Nature. Rosalind
Franklin, cuya fotografa di un indicio
importante a Watson, muri en 1958.
Los cientficos se preguntan si hubiese
sido distinguida con el premio si hubiera
estado viva.

La primer ADN polimerasa, la ADN polimerasa I de E. coli, fue descubierta en el ao

1955 en el laboratorio de Arthur Kornberg.
Discovery of DNA polymerase. Lehman, 2003 disponible en http:// www.jbc.org

56
 Extraccin de ADN

Introduccin

Mediante la utilizacin de distintos protocolos se puede obtener ADN de al menos tres

clases diferentes.
1. ADN cromosmico celular Este ADN celular puede ser obtenido a partir de
un cultivo de bacterias, de plantas, de clulas animales o de cualquier otro tipo de
organismo que este siendo estudiado.
2. ADN plasmdico. La preparacin de ADN plasmdico a partir de un cultivo
de bacterias sigue los mismos pasos bsicos de purificacin de ADN cromosmico
celular, con la crucial diferencia que en algunos pasos, el ADN plasmdico debe ser
separado del ADN cromosmico, que tambin est presente en la clula bacteriana.
3. ADN de bacterifagos o fagos (virus que infectan bacterias), ampliamente
usado como vehculo de clonado.

Fundamentos de la extraccin de ADN celular

Los procedimientos para la preparacin de ADN cromosmico a partir de un cultivo

celular bacteriano pueden ser divididos en 4 etapas:

1) Cultivo y recoleccin.
2) Lisis celular.
3) Eliminacin de los restos celulares.
4) Concentracin de ADN puro.

Luego se centrfuga para eliminar el sobrenadante que contiene el medio de cultivo, y se

continua con el pellet, que contiene las bacterias.

2-Lisis celular: Todos las clulas bacterianas estn rodeadas por una rgida pared celular.
Para liberar los componentes celulares de estas barreras, se utiliza la lisis qumica. Esta
lisis qumica, suele involucrar un agente que ataca a la pared y otro que rompe la
membrana.

3-Eliminacin del debris celular: Este proceso puede llevarse a acabo por centrifugacin,
dejando el extracto celular como un sobrenadante claro que contiene ADN; ARN; y
algunas protenas y el pellet con restos de membrana celular.

Los procedimientos estndar para eliminar los contaminantes del ADN son los
siguientes:

1. Para eliminar las protenas se adiciona una mezcla de fenol: cloroformo

(1:1) que producen la precipitacin de las protenas, pero dejan a los cidos nucleicos
(ADN y ARN) en solucin acuosa.
2. Para eliminar ARN, se trata la muestra con la enzima RIBONUCLEASA
(RNAsa). sta degrada rpida y completamente todas las molculas de RNA hasta
dejarlo reducido a sus subunidades ribonucleotdicas.

57
En este punto hay que hacer una importante distincin entre la purificacin de ADN
cromosmico y la purificacin de ADN plasmdico: en una preparacin de plsmido, siempre
es necesario separar el ADN plasmdico de la gran cantidad de ADN cromosmico bacteriano que
est tambin presente en las clulas. Actualmente existen varios mtodos para la
separacin de ambos tipos de ADN, basados en diferencias fsicas entre el ADN
plasmdico y al ADN cromosmico. De estas diferencias, la ms utilizada es el tamao.
Los plsmidos ms grandes son solamente el 8% del tamao del

cromosoma de E. coli, y la mayora de los plsmidos son mucho ms pequeos.

Generalmente se utilizan tcnicas como la lisis alcalina, esta condicin desnaturaliza los
cidos nucleicos, luego por tratamiento renaturalizante el ADNp se renaturalizar mas
rpida y eficientemente que el ADNc debido a la diferencia de tamao entre ellos,
permitiendo su separacin, pudindose obtener de modo efectivo ADN plasmdico.

4-Concentracin de ADN puro: generalmente la concentracin de ADN obtenida luego de

los pasos arriba mencionados es baja. Para concentrarlo se utiliza ms frecuentemente la
precipitacin con etanol o isopropanol. En presencia de sal y a una temperatura de 20C
o menos, el etanol absoluto precipita eficientemente los polmeros de cidos nucleicos. El
precipitado puede ser recolectado por centrifugacin, eliminacin del sobrenadante y
resuspensin del pellet en un volumen adecuado de agua o buffer.

Qu son los Plsmidos?

Adems de un cromosoma, las clulas bacterianas, habitualmente contienen plsmidos.

Estos son molculas de ADN que estn presentes en prcticamente todo tipo de bacterias
y juegan un rol crtico en la capacidad de adaptacin y en la evolucin de las mismas. Su
replicacin es autnoma y aunque no este sincronizada con la del cromosoma, depende
de factores del hospedador para llevarse a cabo. El nmero de copias de plsmidos por
clula es variable y depende de las caractersticas del mismo (plsmidos de alto o bajo
nmero de copias) y a su vez, una misma clula puede contener ms de un tipo de
plsmido. Al igual que los cromosomas, los plsmidos codifican para ARN y protenas,
pero, sin embargo, no codifican para funciones esenciales del crecimiento bacteriano. En
cambio, proveen productos que pueden beneficiar a la bacteria bajo circunstancias
especiales; por ejemplo, sobrevivir en condiciones adversas del medio o competir con
otros microorganismos que ocupan el mismo nicho ecolgico.

TP # 11: Protocolo de Extraccin de ADN genmico

A-Soluciones:
1- Buffer TE 10 X: EDTA Tris-HCl 100mM pH 8,0
2- Dodecil sulfato de sodio (SDS) 10%
3- Proteinasa K, 10 mg/mL
4- Cloroformo/alcohol isoamlico 24:1
5- NaCl 5M
6- Isopropanol

B- Materiales
1- Cultivo en fase exponencial E. coli DH5

58
2- Tubos eppendorf de 2 mL: 3 por grupo
3- Bao termostatizado regulado a 65 C
4- recipientes con hielo granizado
5- guantes
6- pipetas automticas
7- capilares o varillas de vidrio

Previo al inicio del protocolo: Preparar el bao a 65C, dispensar 2mL del cultivo en
los tubos eppendorf. Sellar uno de los extremos de los capilares (se usar 1 por
grupo). Poner en hielo o congelador el isopropanol. Tener preparado por cada grupo
un tubo con 200 uL de buffer TE 1X.

Procedimiento
1) Centrifugar por 2 min los tubos con clulas. Descartar el SN y eliminar las
trazas de medio en papel absorbente.
2) Resuspender el pellet en 400 uL de buffer TE, asegurndose de que no
queden grumos.
3) Agregar 50 uL de SDS 10 % y 10 uL de PK, mezclar el tubo por inversin e
incubar 20 min a 65C (la suspensin se torna transparente).
4) Agregar 100 uL de NaCl, mezclar.
5) Agregar 600 uL de Cloroformo/alcohol isoamlico. Mezclar repetidas veces por
inversin hasta tener una solucin homognea (1 fase) y blanquecina.
6) Centrifugar a 12.000xg por 10 min (se forman dos fases).
7) Transferir la fase acuosa (superior) a un nuevo tubo. Hacerlo cuidadosamente
con pipeta, evitando levantar la capa blanquecina que se encuentra en la
interfase.
8) Agregar suavemente con pipeta 400 uL de isopropanol fro (evitando que se
mezclen las fases).
9) Introducir suavemente un capilar en el tubo hasta la interfase y realizar muy
suavemente movimientos circulares en la interfase, y comenzarn a
visualizarse las hebras de ADN de color blanquecino.
10) Pese a que la idea es que por los movimientos circulares y la carga de la
varilla, el ADN se enrolle a esta; esto es difcil de lograrlo en microtubos. Por
lo tanto, luego de haber realizado esta observacin, retirar la varilla, cerrar el
tubo e invertir cabeza-cola unas 15-20 veces. De esta manera el ADN formar
una masa algo ms compacta y visible. Abrir el tubo, y con la misma varilla,
retirar el ADN, colocndolo suavemente, agitando la varilla en un tubo
conteniendo EDTA 1X.
11) Conservar a 4 C para permitir su completa resuspensin.

59
 ELECTROFORESIS: Geles de Agarosa

INTRODUCCIN

En una separacin electrofortica, las partculas cargadas, migran en un medio

determinado con direccin al electrodo de signo opuesto. Esto ocurre, bajo la influencia
de un campo elctrico externo, aplicado en una corrida electrofortica. Los movimientos
de las partculas son retardados por la interaccin con una matriz slida, porosa e inerte
en la que estn inmersas, la cual, acta como un tamiz. Todo este fenmeno, se lleva a
cabo a su vez, en un medio acuoso (buffer) con iones que transmiten la corriente
elctrica. La oposicin de la interaccin elctrica y del tamiz molecular resulta en una
velocidad de migracin diferencial que permite separar los componentes de una mezcla
de macromolculas (tanto cidos nucleicos como protenas), basndose en el tamao,
forma y carga neta de las macromolculas.

Una electroforesis puede realizarse en geles de agarosa o en geles de poliacrilamida

dependiendo del material a resolver. La agarosa es un polmero lineal de hidratos de
carbono, extrado de un alga marina, los geles se preparan fundiendo la agarosa en el
buffer elegido. Los geles de poliacrilamida se generan por la polimerizacin de la
acrilamida y la bis-acrilamida mediada por un catalizador.

Ambos mtodos son utilizados para la separacin, identificacin y purificacin de

fragmentos de ADN. En el caso de los geles de poliacrilamida tambin se utilizan para
separar protenas a partir de un extracto celular. La tcnica es simple y rpida de realizar,
es capaz de resolver fragmentos de ADN que no pueden separarse por otros mtodos.
Adems, la localizacin del ADN dentro del gel puede determinarse directamente
mediante tinciones con bajas concentraciones de un colorante fluorescente intercalar,
llamado: Bromuro de Etidio (BrEt). As, las bandas que contengan tan solo de 1 a 10 ng
de ADN podrn ser visualizadas por examen directo del gel bajo luz ultravioleta. Si
resulta necesario las bandas pueden recuperarse del gel para ser utilizadas posteriormente
con otros propsitos.

Los geles pueden confeccionarse de varias formas, tamaos y porosidad, y pueden correr
horizontales los agarosa y verticales los de poliacrilamida, en un campo elctrico de
fuerza y direccin constante. La eleccin dentro de estos parmetros depende
principalmente del tamao de los fragmentos que se desean separar. Los geles de
poliacrilamida son ms efectivos para separar fragmentos pequeos de ADN (5 a 500
pb), y su poder de resolucin es extremadamente grande, pudiendo separar fragmentos
que difieren en 1 pb.
Los geles de agarosa, poseen un poder resolutivo menor respecto de los geles de
poliacrilamida, pero poseen un rango mayor de separacin. Mediante concentraciones
variables de agarosa, se pueden separar fragmentos de ADN desde 200 pb hasta
aproximadamente 50 kb de longitud.

60
 Factores que afectan la tasa de migracin del ADN en geles de
agarosa

1) Tamao molecular del ADN

Las molculas de ADN de doble cadena, migran a travs de la matriz del gel, a tasas que
son inversamente proporcionales al nmero de pares de bases que ellas contienen. En
consecuencia, las molculas ms grandes, migran mucho ms lentamente debido a que
sufren una gran friccin y resistencia.

2) Concentracin de Agarosa

Un fragmento lineal de ADN, de un tamao determinado, migra a diferentes tasas a

travs de geles que contienen diferentes concentraciones de agarosa. A medida que se
aumenta la concentracin de agarosa, los poros formados en la matriz del gel de agarosa
disminuyen en tamao. As, mediante la utilizacin de geles con diferentes
concentraciones de agarosa, es posible resolver un amplio rango de tamaos de
molculas de ADN.

3) Conformacin del ADN

La molcula de ADN puede presentarse en varias conformaciones.

En primer lugar, puede estar en su forma lineal como existen en los eucariotas.
En segundo lugar, tambin existen molculas de ADN circulares, las cuales pueden
presentar varias formas dependiendo del superenrrollamiento que posean o debido a la
presencia de algn nick en la doble hlice. De este modo, si tenemos las diferentes
formas de ADN, pero del mismo tamao molecular, las tasas de migracin de las
diferentes formas a travs del mismo gel sern distintas.

4) Voltaje aplicado

A bajo voltaje, la tasa de migracin de fragmentos lineales de ADN, es proporcional al

voltaje aplicado. Sin embargo, a medida que la fuerza del campo elctrico se incrementa,
la movilidad de los fragmentos de ADN de alto PM incrementa diferencialmente; por lo
tanto, el rango efectivo de separacin en geles de agarosa decrece cuando el voltaje se
incrementa.

4) Direccin del campo elctrico, composicin de bases y temperatura

El comportamiento del ADN en geles de agarosa, a diferencia de lo que ocurre con los
geles de poliacrilamida, no esta afectado significativamente por su composicin de bases
ni por la temperatura a la cual se corre el gel.
Por lo tanto, en geles de agarosa en un campo elctrico de direccin constante, la
movilidad electrofortica de fragmentos de ADN de diferentes tamaos no cambia entre
4 C y 30 C.

61
6) Presencia de colorante intercalares:

El BrEt, es el colorante fluorescente utilizado para detectar ADN en geles de agarosa y

poliacrilamida. Afecta la tasa de migracin reduciendo la movilidad electrofortica del
ADN lineal en un 15%. El colorante se intercala entre las bases apiladas de las molculas
de ADN hacindolas mas rgidas, lo cual, produce la disminucin de la movilidad.

El bromuro de etidio es un agente altamente mutagnico y debe manipularse con mucho

cuidado, utilizando guantes. Todas las soluciones conteniendo BrEt deben decontaminarse (con
carbn activado) antes de ser descartadas.

7) Composicin del buffer de corrida:

La movilidad electrofortica del ADN, est afectada por la composicin y la fuerza

inica del buffer de electroforesis. En ausencia de iones (por ejemplo si se omitiera el
buffer de corrida por error) la conductividad elctrica seria mnima y el ADN no migrara
o lo hara muy lentamente. Por otro lado, en buffers con elevada fuerza inica (por
ejemplo, si se utiliza un buffer de corrida al 10X) la conductividad elctrica es muy
eficiente, generndose calor, pudindose alterar la matriz y desnaturalizarse el ADN.
Existen diferentes buffers de corrida electrofortica de ADN de doble cadena, entre otros
el TAE (Tris Acetato + EDTA), TBE (Tris Borato + EDTA) y TPE (Tris
Fosfato+EDTA).

Generalmente en las corridas es necesario utilizar marcadores de peso molecular. Estos,

son fragmentos de ADN de tamao conocido, obtenidos comercialmente, y que deben
sembrarse en el gel en un pocillo vecino al de la muestra y deben correrse conjuntamente.
Esto facilita la determinacin del tamao de los fragmentos de ADN contenidos en la
muestra, por comparacin de las bandas de la muestra con los marcadores de peso
molecular.

Geles de agarosa : corrida

Una vez efectuada la siembra de todas las muestras, se procede a tapar la cuba de
electroforesis y a conectar los cables correspondientes para aplicar el voltaje deseado. As
el ADN migrar hacia el nodo (rojo). El voltaje aplicado ser de 1-5V/cm (medido
como la distancia entre los electrodos). Si los electrodos se colocaron correctamente, se
formarn burbujas en el nodo y el ctodo y en unos pocos minutos el azul de
bromofenol comenzar a migrar desde el lugar de siembra.
El gel se corre, generalmente, hasta que el frente de corrida (formado por los colorantes
del loading buffer) haya migrado una distancia apropiada a travs del mismo.
La presencia de BrEt permite que el gel pueda ser examinado bajo luz U.V. en cualquier
momento durante la corrida.
En principio, la corrida puede efectuarse en presencia o en ausencia del BrEt tanto en gel
como en buffer. Si se efecta en ausencia del colorante, es necesario teir el gel una vez
finalizada la electroforesis (sumergiendo el gel en una solucin de BrEt (0.5g/ml en
buffer de corrida al 1X)

62
Geles de Agarosa: Visualizacin del ADN

La visualizacin del ADN en geles de agarosa teido con el colorante fluorescente

bromuro de etidio, es debido, a que el grupo planar de esta molcula se intercala entre las
bases apiladas del ADN. La posicin fija de este grupo y su cercana a las bases causa la
unin del colorante al ADN que muestra una fluorescencia comparablemente mayor a
aquella que posee el colorante libre en solucin.
La radiacin U.V. a 254nm es absorbida por el ADN y transmitida al colorante, por otro
lado la radiacin a 302nm y 366nm es absorbida por el colorante unido al ADN. En
ambos casos, la energa es re-emitida a 590nm en la regin del rojo-naranja del espectro
visible. En consecuencia, dado que la fluorescencia impartida por el complejo ADN:
BrEt es mayor a aquella emitida por el colorante libre, es posible detectar pequeas
cantidades de ADN en presencia de BrEt libre en el gel. As, como la unin del BrEt al
ADN es directamente proporcional, la intensidad de la banda nos puede dar una
estimacin de la cantidad de ADN presente en la muestra. Esto implica, que a mayor
concentracin de ADN, la banda observada tendr una luminosidad mas intensa.

NOTA: El BrEt se utiliza para la visualizacin tanto de ADN como de ARN simple o
doble cadena. No obstante, la afinidad del colorante por los cidos nucleicos de simple
cadena es menor y por lo tanto la fluorescencia impartida es ms pobre.

63
 TP #12 Anlisis del ADN

Objetivo

Evaluar el rendimiento de la extraccin de ADN

Evaluar la integridad del producto obtenido
Evaluar la copurificacin de otros cidos nucleicos

PREPARACION DE GEL DE AGAROSA AL 1%

1. Pesar 0.5 gr. de agarosa

2. Diluir en 50 ml de TAE 1X
3. Calentar en microondas hasta disolver. Luego, enfriar a 60 C aprox.
4. Volcar en el molde o cama, previamente obstruidos sus bordes y colocado el peine.
Evitar la presencia de burbujas. Dejar solidificar unos minutos a temperatura ambiente.
5. Llenar la cuba con buffer TAE 1X
6. Una vez solidificado el gel, (quitar la obstruccin y el peine del gel) y sumergirlos
en la cuba. Dejar equilibrar unos minutos.
7. Mezclar en un parafilm 5 ul muestra + 5ul loading buffer. Sembrar con micropipeta
P20 en el gel.
8. Conectar la cuba a la fuente de energa y correr 5minutos a 90 V, luego 15 minutos
a 65 V.
9. Visualizar exponiendo el gel a la luz U.V.

Solucin Stock Buffer TAE 25X

121 gr. Tris-base
28.55ml. cido actico glacial
50 ml 0.5 M EDTA (pH: 8)

Nota 1: El BrEt, en esta prctica se encuentra mezclado en el loading buffer para mayor
seguridad. Es de suma importancia usar guantes durante la prctica.

Nota 2: Los loading buffers son utilizados para:

1. Incrementar la densidad de la muestra, con lo cual evita que el ADN difunda en el
buffer en el momento de la siembra, adems facilita la carga de la muestra en cada
pocillo.
2. Otorgar color a la muestra. Poseen colorantes que en un campo elctrico migran
hacia el nodo a tasas predecibles independientemente de la concentracin de agarosa.

64
 Electroforesis: Geles de Poliacrilamida
PAGE (PoliacrylAmide Gel Electrophoresis)
Introduccin
La separacin electrofortica
de protenas ha sido introducida en
los aos 1960s por Samuel Raymond.
Modificaciones posteriores como la
utilizacin de SDS y un agente
reductor como el -mercaptoetanol
han optimizado esta tcnica,
convirtiendo al SDS-PAGE en una de
tcnicas ms utilizadas en la
actualidad para estudios bioqumicos
y de biologa molecular.
Bsicamente, la tcnica consiste en
someter a una muestra compleja a un
campo elctrico que se establece entre
un par de electrodos de platino a
travs de una solucin acuosa. La
muestra migrar en una matriz
(poliacrilamida) de acuerdo a distintas
propiedades, tal como se explica a
continuacin.
Las protenas son molculas
anfotricas, su carga neta est
determinada por el pH del medio. De
esta manera, en una solucin con un
pH por encima de su punto
isoelctrico, la protena tiene carga
neta negativa y migra hacia el nodo
(+). Contrariamente, debajo su punto
isoelctrico, est positivamente
cargada y migra hacia el ctodo (-).
La carga por unidad de masa difiere
de protena en protena.
A un pH determinado y bajo
condiciones nativas, la separacin
electrofortica de protenas est
determinada por el tamao y la carga
de las molculas.
Casi la totalidad de las electroforesis
de protenas analticas se realizan bajo
condiciones que aseguran la
disociacin de de las protenas en sus
subunidades polipeptdicas
individuales y que minimizan su
agregacin (condiciones
desnaturalizantes).
Comnmente se emplea el detergente
aninico SDS en combinacin con un
agente reductor y calor para disociar
las protenas antes de su siembra en el
gel. El polipptido desnaturalizado
une al SDS y queda homogneamente
cargado. Como la cantidad de SDS
unido es proporcional al peso
molecular del polipptido e
independiente de su secuencia, el
complejo SDS-polipptido migra a
travs del gel de poliacrilamida de
acuerdo al tamao (ver figura). Como
la distancia de migracin est
relacionada con la masa molecular del
polipptido, entonces el SDS-PAGE
no solo separa una mezcla compleja
de protenas en bandas individuales,
sino que tambin permite estimar la
masa molecular de cada banda que
representa un polipptido.
65
Los geles son preparados utilizando armadores especiales donde se monta el
dispositivo de la figura de ms abajo. Se vuelcan las soluciones de gel separador (A)
y posterior a la polimerizacin se vuelca sobre ste, el gel concentrador (B) y se
coloca el peine que formar los lugares de siembra (wells). Una vez polimerizado el
gel, el peine se retira. Se muestra tambin una cuba donde se coloca el gel, se
siembra la muestra, se cubre con el buffer de corrida y se conecta a la fuente de
poder. Los modelos varan de acuerdo al fabricante.

Ctodo
Peine

Well/calle Compartimento
A Vidrio para buffer
posterior
Spacer
(entre los 2
vidrios)
B Vidrio
nodo
anterior

Para realizar la calibracin de cada gel, se utilizan estandares de peso molecular

(marcadores de peso molecular), que son mezcla de protenas de masa molecular
conocida. Esto ayuda a estimar la masa de las bandas incgnita. La unidad de masa
se denomina Dalton (Da).
La figura siguiente, muestra la resolucin de una muestra de protenas en geles con
distinta concentracin de poliacrilamida. La densidad del gel establece un rango de
masas moleculares que sern resueltas de manera ptima en una corrida. Para la
visualizacin se realiz una tincin con azul de Coomassie.

MPM 7% 10% 12 %

60 kDa >
 TP # 13 Separacin de Protenas

Objetivo:

Evaluar distintas muestras de protenas mediante SDS-PAGE

Analizar semicuantitativamente la concentracin de una muestra
conteniendo una protena purificada

1. Obtencin del extracto celular de de protenas bacterianas.

Se obtendrn las protenas totales mediante la lisis trmica de bacterias. Los
docentes entregarn dos cultivos crecidos de dos especies bacterianas distintas. Con
el fin de obtener las protenas a partir de un mismo nmero de clulas, se proceder
como se indica:
-Medir la DO600 de los cultivos y ajustar la concentracin celular a 10 % de
transmitancia.
-Tomar 1 mL de estas suspensiones bacterianas y peletear las clulas por
centrifugacin (5 min, 10.000xg). Resuspender en 100 L de PBS
-Agregar 100 L de buffer de siembra 2X (cracking buffer) y someter a 100 C las
muestras por 5 min utilizando un bao de agua. Reservar en hielo hasta la siembra
de los geles.
2. Semicuantificacin de la concentracin de protenas de una muestra
Se sembrar en un gel una curva patrn (de concentracin conocida) y la muestra
incgnita. Las muestras sern preparadas con el mismo V del buffer de siembra, y
se sembrar el mismo V de todas las muestras.

Nota:
-No es necesario trabajar en esterilidad
-Preparar con anterioridad el bao de agua y asegurarse de contar con flotadores
para tubos eppendorf.

2. Preparacin de geles de poliacrilamida

Gel Separador al Gel Stacking al 4%

12% (1ml)
(5ml)
Sn. Acrilamida-Bisacrilamida 2 ml 0.17ml
Buffer 1.3 ml (pH8.8) 0.13 ml (pH6.5)
Agua bidestilada 1.7ml 0.68 ml
10 % SDS 50 ul 10ul
TEMED 2 ul 1 ul
10% Persulfato de Amonio 50 ul 10 ul

Nota: Preparar las soluciones de cada tipo de gel sin Persulfato de Amonio,
este se agrega en el momento de utilizarlo.

Precaucin: La acrilamida y la bisacrilamida son neurotioxinas potentes y

se absorben a travs de la piel. Su efecto es acumulativo. Utilizar guantes
en la preparacin de las mezclas.

65
 Primero colocar el gel separador. Cubrir la superficie con etanol 96%, n-
butanol o agua.
Dejar polimerizar a temperatura ambiente (el tiempo depende de la T
ambiental).
Remover el etanol.
Agregar el gel stacking y colocar el peine.
Dejar polimerizar a temperatura ambiente unos minutos.
Colocar el gel en la cuba de corrida. Remover el peine. Agregar el buffer
de corrida hasta cubrir las calles.
Sembrar las muestras (Vmax=15ul)

NOTA: asegurarse que los vidrios se encuentren totalmente limpios, de lo

contrario, realizar una limpieza con etanol.

3. Condiciones de corrida:
Setear la fuente de poder 50mA/150 Volt. Cortar la corrida cuando el colorante
llegue al final del gel.

4. Tincin con Coomassie blue

Finalizada la corrida electrofortica, se proceder al desarmado del cassette

trabajando con sumo cuidado para evitar la rotura de los vidrios.

- Incubar el gel en la solucin de azul de Coomassie 30 con agitacin. Descartar la

solucin, lavar rpidamente con agua para eliminar el exceso de colorante.
- Incubar con la solucin de desteido. Decolorear hasta que sean visibles las
bandas y que el background sea el adecuado.
-Transferir el gel a un recipiente con agua para la hidratacin del mismo. Guardar
en heladera.

NOTA: Los geles pueden secarse en secadores de geles especiales para su

conservacin.

Anlisis de resultados

1. Se realizar el anlisis comparativo entre los perfiles proteicos obtenidos a

partir de las bacterias. Incluya en el informe fotos de los geles junto a sus
observaciones y comentarios.
2. Se informar la concentracin proteica de la muestra incgnita

66
 Soluciones

-10X Buffer de corrida (Tris glicina) -2X Buffer de siembra (cracking buffer)
32 g Tris base Tris-Cl pH 6.8 125 mM
144 g Glycine glycerol 20%
AguaCsp/1L bromophenol blue 0.2 %
Preparar para la corrida el buffer 1X- SDS 4%
SDS 10 % B-mercaptoetanol 200 mM

-Azul de Coomassie -Solucin de desteido

0.1% coomassie R-250 (Sigma) 7.5% cido actico
40% etanol 20% etanol (o metanol)
10% cido actico

-Acrilamida-Bisacrilamida -1.5 M Tris HCl pH 8.8

30 g Acrilamida
0.8 g Bisacrilamida -1M Tris-HCl HCl pH 6.8
Agua csp 1L

67
 PROBLEMAS

http://www.sciam.com/article.cfm?id=what-are-we-thinking-when

68
 PRIMERA PARTE

SOLUCIONES

1) Cmo preparara:
a) 1000 ml de una solucin NaCl 0,32 M
b) 500 ml de NaCl al 0,9 %
c) Una solucin de NaCl que sea isoosmolar con una solucin de CaCl2 al 0,9
%

2) Cuntos ml de una solucin de NaCl al 5 % se precisan para preparar:

a) 1500 ml de NaCl al 0,9 %
b) 1500 ml de NaCl 0,15 M

3) Ud. desea preparar 1000 ml de una solucin de NaCl al 0,9 % que contenga
PMSF 1 mM. El PMSF (P.M. = 174,2) es poco soluble en agua y muy soluble en etanol.
Cmo resuelve el problema?

4) Cul es la concentracin mnima que debe tener una solucin de PMSF en

etanol para preparar una solucin acuosa que contenga una concentracin final de 2 mM
de PMSF y la concentracin de etanol no exceda el 0,1 %?

5) A partir de una solucin madre de NaCl al 25 % se desea preparar las siguientes

soluciones:
Concentracin final Cantidad Volumen de
deseada En ml NaCl necesario
0,05 M 200
0,075 M 200
0,1 M 200
0,15 M 200
0,2 M 200
0,25 M 200
0,30 M 200
0,35 M 500
a) Complete el cuadro indicando la cantidad en ml de NaCl al 25 % necesaria para
preparar cada solucin.
b) Calcule la osmolaridad de cada solucin.

6) Cuntos ml de una solucin madre necesito preparar para obtener 10 ml de

cada una de las siguientes diluciones: 1:2, 1:5, 1:25, 1:50?
7) De una solucin madre (A) 1 M se realiz primero una dilucin 1:2 (B), luego
se diluy 1:50 obtenindose de este modo la solucin C y por ltimo se diluy la solucin
C 10 veces obtenindose D.
a) Cules son las concentraciones finales de las soluciones A, B, C y D?
b) Cuntas veces respecto de la solucin A se diluy B, C y D?

69
 c) Cuntas veces respecto de la solucin B se diluy C y D?

8) Se desea preparar 500 ml de una solucin de NaCl (PM: 58) 10-1 M:

a) Cuanta droga slida debo pesar?
b) Cuntas veces debo diluir la solucin madre para obtener una solucin 10-4 M?

9) Necesito para mi experimento 10 ml de una solucin de K (OH) 50 mM y poseo

una solucin madre 2 M. Para realizar las diluciones dispongo de pipetas de 10, 5 y 1 ml.
Cmo preparara esta solucin teniendo en cuenta que el volumen mnimo a pipetear es
de 1 ml?

Molaridad = Nmero de moles/litro de solucin

Normalidad = Nmero de equivalentes/litro de solucin
Osmolaridad = Nmero de osmoles/litro de solucin

Problema 1.

a) Cuales son los dos procesos celulares esquematizados?

b) Requieren de energa?
c) Como se une las vesculas a la membrana plasmtica? Explique brevemente

70
 SEGUNDA PARTE

Problema1- Laboratorio: Controles experimentales

Un experimento es llevado a cabo generalmente, para poner a prueba una
hiptesis acerca del rol de una variable (variable independiente) sobre otra (variable
dependiente). La experimentacin cientfica requiere, de un diseo experimental y de
ciertas condiciones para que los ensayos tengan validez, como ser la realizacin de
rplicas de las muestras, y la implementacin de controles positivos y negativos. Un
control positivo es un procedimiento, que tiene condiciones similares al experimento
principal, pero que se conoce por la experiencia previa, que el resultado del ensayo es
positivo. Un control negativo, es el ensayo del que se espera el resultado negativo. El
control positivo confirma que las condiciones del experimento son capaces de generar
un resultado positivo. El control negativo muestra la lnea de base (background o
ruido) que se obtiene cuando la prueba no produce un resultado positivo. Muchas
veces este valor, se sustrae al resultado experimental de las muestras. Cualquier
resultado distinto al esperado de los controles, invalida el experimento, cualquiera
haya sido el resultado de este.
Lea atentamente las siguientes situaciones experimentales e indique en cada caso
cual es la variable estudiada y qu ensayos CONTROL necesita.
1) Anlisis de la presencia de bacterias en la orina de un paciente mediante la
tcnica de Gram.
2) Evaluacin de la presencia de protenas en una muestra diluda en PBS,
utilizando el mtodo de Bradford
3) Evaluacin del efecto de una mutacin en el crecimiento de una bacteria.
4) Anlisis de la capacidad de inhibir la fagocitosis de un compuesto aislado de un
extracto vegetal
5) Se quiere demostrar que una dieta hipocalrica incrementa la supervivencia en
ratones
6) Se quiere evaluar la hiptesis de que un incremento de T de 37 C a 39 C,
trae aparejado un incremento en la produccin de cido lctico en
Lactococcus lactis.
7) Evaluacin de la fagocitosis de una bacteria a pH 4.
8) Evaluacin de la induccin de la sntesis de una protena recombinante en un
cultivo de E.coli cuando se utiliza 10 veces menos del inductor IPTG.
9) Evaluacin del efecto de una droga en pacientes

71
Problema 2.

Durante los aos 50 exista un gran debate con respecto a cul de las
macromolculas era la encargada de portar la informacin gentica. Dos
macromolculas se disputaban la funcin, las protenas y los cidos nucleicos.
Con el objetivo de dilucidar ese debate, los investigadores Martha Chase y
Alfred D. Hershey realizaron el siguiente experimento.
Utilizaron unos virus capaces de infectar clulas baterianas, denominados
bacterifagos, que consisten en una cpisde proteica que engloba a una nica
molcula de ADN.

La cpside proteica de una poblacin viral fue marcada radiactivamente con

S35. El ADN de otra poblacin viral fue marcado con P32. Luego cada
preparacin de bacterifagos se utiliz para infectar bacterias. Una vez
procedida la infeccin se lav para eliminar la marca que no fue incorporada al
interior celular, y se cuantific la marca que qued retenida dentro de la clula,
observndose los siguientes resultados:

Nivel de radiactividad
Fraccin marcada Cultivo 1 Cultivo 2 Cultivo 3 Cultivo 4
Protena marcada con S35 5 2 10 4
ADN marcado con P32 87 89 95 90

1) Cules son las hiptesis del momento?

2) Qu resultados obtuvo el grupo de investigacin?
3) Cul es la conclusin ms importante?
4) Grafique los resultados si el paso de lavado se hubiese obviado.

72
Problema 3.

El Vibrio cholerae es la bacteria responsable de la diarrea aguda caracterstica

del clera. El proceso infeccioso implica supervivencia de V. cholerae al pH
cido del estmago, su motilidad a travs del intestino y la secrecin por parte
del vibrin de una toxina proteica (CT) de 87 kilodaltons (KDa) compuesta por
los productos de 2 genes (cistrones) llamados ctxA (ro arriba) y ctxB (ro
abajo), que forman parte de un mismo opern bicistrnico. El producto de ctxA
es un polipptido de 27 KDa y el de ctxB, uno de los 12KDa. El polipptido A
sufre una modificacin post-traduccional.

Se realizaron los siguientes geles de poliacrilamida con la toxina purificada:

Sin SDS Con SDS Con SDS y -Me

Sin -Me

Toxina MPM CT MPM CT

pH 7

Polo -
40KDa 40KDa

22KDa 22KDa

10KDa 10KDa

5KDa 5KDa
Polo +

a. Dibuje la molcula de toxina que muestre el n de subunidades de cada

clase, el tipo de unin entre las mismas y la caracterstica saliente del
producto del gen ctxA.
b. Cul es la carga elctrica neta de la protena a ph=7?
c. Qu modificacin post-traduccional sufre in vivo el producto de ctxA para
explicar el resultado del gel con SDS y mercaptoetanol?
d. Se le ocurre alguna manera para identificar especficamente cada tipo de
subunidad???

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Problema 4.

La toxina colrica (CT) es el principal factor de virulencia producido por V.

cholerae. Es una protena oligomrica constituda por una unica subunidad A y
5 subunidades B que forman un anillo pentamrico con la subunidad A unida al
core pentamrico B.
La accin biolgica de CT es iniciada por la unin de las subunidades B al
receptor en la membrana de las clulas epiteliales intestinales. Esta unin
induce un cambio conformacional en la molcula, que permite la internalizacin
de la subunidad A (CTA) a la clula. Esta subunidad tiene actividad ADP-ribosil
transferasa, adiciona un residuo de ADP-ribosa a la subunidad de la protena
G (G) -ver material suplementario al final de la gua-. Esto provoca la
activacin constitutiva de la adenilato ciclasa. Como consecuencia, se acumula
excesiva sal y agua en el lumen intestinal que finaliza en las diarreas
caractersticas de la enfermedad. Las formulaciones Kampo, son medicinas
tradicionales utilizadas en Oriente hace ms de 2000 aos. Las formulaciones
son de origen natural, incluyendo hojas de plantas, races y hongos. El tipo de
prescripcin vara de acuerdo al diagnstico. Estas formulaciones han sido
empleadas para el tratamiento de la diarrea de origen bacteriano, por ese
motivo se examin su efecto en la actividad de CT estudiando loops ligados de
leon de ratn o conejo y actividad ADP-ribosil-transferasa.

A continuacin se muestran algunos de los resultados obtenidos, evaluando las

distintas formulaciones sobre cultivos celulares (actividad ADP-ribosil
transferasa) y en asas ligadas de ratn (fludo acumulado):

74
:

75
1-Qu tipo de modificacin representa la ADP-ribosilacin?. Proponga un
mecanismo que explique el efecto observado (activacin constitutiva de la
adenilato ciclasa)Qu efecto espera en la clula?.
2-Cul de los preparados es el ms efectivo?

3- Cul es el objetivo del segundo experimento en asas ligadas, mostrado en la

figura 2? Por qu se utiliza conejo en lugar de ratn?

4- La ADP-ribosilacin se realiza a partir del precursor NAD+ (ver material

suplementario del problema). Para analizar la ADP-ribosilacin producida por la
CTA y el posible efecto de los taninos de RG, se realiza un ensayo incubando
las protenas totales (membrana) de clulas intestinales Caco-2 en presencia
de NAD+ marcado radiactivamente y CTA.
A partir de los resultados de la fig. 3.
-Explique la tcnica de anlisis.
-Podra decir sobre qu evento acta el compuesto estudiado (RG-tannin)?

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-Para este experimento podra haber utilizado otra lnea celular? Justifique.

En base a los resultados obtenidos, se pudo conocer el fundamento de la

medicina tradicional china en la utilizacin de Kampo para el tratamiento del
clera?

Problema 5.

Para que los espermatozoides sean funcionales (y ser capaces de fecundar los
oocitos) luego de la liberacin del tracto reproductivo de los mamferos, se
requieren desde unas pocas a varias horas, dependiendo de la especie. A
travs del tiempo, el espermatozoide sufre una serie de eventos de maduracin
post-liberacin colectivamente conocidos como capacitacin. El pptido
promotor de la fertilizacin (FPF), la adenosina y calcitonina, presentes en el

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plasma seminal, son molculas que promueven y regulan la capacitacin. La
evidencia actual seala a estas molculas como primeros mensajeros que
regulan la produccin de un segundo mensajero, cAMP por la adenilato ciclasa
(AC).

- Dnde se encuentran los Receptores para estas molculas y cul es su

estructura?. Dibuje.
- Cul es la molcula que transduce la seal?

La Calcitonina es una hormona peptdica de 32 aa involucrada en la

homeostasis sea. Sin embargo, se encuentra en cantidades muy superiores
en el lquido seminal respecto del plasma sanguneo. El siguiente experimento
muestra el efecto de la Calcitonina (Cal) y FPP sobre suspensiones de
espermatozoides:

Qu puede decir del grfico??

Cmo explica la disminucin del cAMP en los espermatozoides capacitados?

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El calcio es un in que acta como segundo mensajero. Puede decr quin es

el transductor de la seal en este tipo de mecanismo?. Sin embargo, este

catin bivalente puede actuar tambin a partir de otros mecanismos. En el

siguiente experimento se analiz la produccin de AMPc en espermatozoides

no capacitados, as como tambin la capacidad de fecundar oocitos.

-Cul es el objetivo del experimento?

- Qu estrategia experimental podra utilizar para verificar el resultado??

Dibuje el resultado esperado.

-Qu se puede concluir a partir de la figura? Puede hipotetizar algn

mecanismo con estos elementos?.

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Material suplementario Problema 4:

1) ADP-ribosilacin

2) Leyendas de figuras

Fig1. Efectos inhibitorios de R. rhizoma sobre la ADP-ribosilacin catalizada por CT. Se agreg
1 ug de CT con las cantidades indicadas de R. rhizoma (), Taninos de RG (), gallato
epigallocatecin (), emodina () y seredina(). Los valores representan duplicados de un
experimento representativo de tres. B) Efectos de R. rhizoma en la acumulacin de fluidos en
loops del leon. Cada ratn fue inyectado con 0,1 ml de una solucin conteniendo 100 ng de CT
y las cantidades indicadas de R. rhizoma (), Taninos de RG (), gallato epigallocatecin (),
emodina ()y seredina(). El ratn fue sacrificado a las 6 horas y se determin la proporcin de
la acumulacin de fludos (mg/cm).

Fig 2. Efectos inhibitorios de los taninos de RG en la acumulacin de fluidos inducidos por CT

en los loops de leon (ratn). Los loops contenan: 1) sin aditivos; del 2 al 7: 250 ng de CT; 3 y
8: 10 ug de taninos de RG; 4: 3 ug de taninos RG; 5: 1 ug de tanino RG; 6: 300 ng de tanino
RG y 7: 100 ng de tanino RG. Los experimentos fueron repetidos por quintuplicado.

Fig 3. Efecto de los taninos de RG sobre la ADP-ribosilacin catalizada por CTA en

membranas de clulas Caco-2. Lnea 1: sin aditivos, lneas 2-5, 2,5 ug de CTA; lneas 3 y 6, 15
ug de taninos de RG, lneas 4 y 7, 10 ug de taninos RG, y lneas 5 y 8, 5ug de taninos RG.

3) La lnea celular Caco-2 es una lnea celular inmortalizada generada a partir de clulas
epiteliales humanas de adenocarcinoma colorectal.

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