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Informe 6 Microbiologa Ambiental (2016)

Anlisis de muestra de suelo


Hernn Crdenas

Carrera de Ingeniera Civil Ambiental, Universidad de La Frontera

1. Resumen:

El suelo es un ecosistema que contiene una gran variedad de poblaciones microbianas. La


comunidad microbiana en suelos es importante por su relacin con la fertilidad del suelo y,
adems del uso potencial de los miembros especficos para aplicaciones ambientales e
industriales (Fernndez et al., 2006). Es por esto que se hizo una planificacin con el objetivo
de conocer, enumerar y aislar los miembros principales de la comunidad microbiana en el
suelo. Para eso, se comenz con la extraccin de la muestra de suelo para la preparacin de
agar extracto de suelo (AES); se prepar Agar Plate Count (APC) y agua peptona los cuales
fueron autoclavados a 121C durante 1 hora. Se realizaron diluciones seriadas desde 104
hasta 107 en tubos con agua peptona para cuantificar la unidad formadora de colonias en
16 placas Petri (4 placas APC y AES incubadas a 24C y 4 placas de APC Y AES a 36C) y
se hizo un seguimiento y conteo durante 72 horas para todas las placas. Se realiz los cultivos
puros en APC Y AES a travs del mtodo de siembra por estras, las que se incubaron entre
24 a 48 horas a 36C. Posteriormente, se realiz la tincin de Gram para la identificacin
bacteriana de la muestra de suelo en el microscopio. Finalmente se realizaron pruebas
bioqumicas para identificar y conocer la actividad metablica de los microorganismos en
estudio, las cuales fueron las siguientes: Indol, Voges Proskauer, Rojo Metilo, SIM, Citrato
y TSI. El resultado de todas las pruebas nos arroj bacterias gramnegativas y grampositivas,
pudiendo ser en base a las pruebas bioqumicas Lactobacillus Sporogenes, Clostridium
perfringens o Pseudomonas.

2. Resultados y discusin:

Para el recuento en placa, se hizo un duplicado de diluciones en placas Petri en los medios
de Extracto de Suelo y agar Plate Count a travs de la siembra en profundidad para ser
incubados a 24 y 36C. Esto para asemejar condiciones ambientales de la muestra en estudio
e identificar la presencia de bacterias patgenas respectivamente. Se analiz y observ
adems la existencia de hongos en las placas.

El nmero de colonias mientras transcurra las horas aument considerablemente, saliendo


del rango optimo (30 a 300 colonias) en algunas placas. Para obtener las unidades formadoras
de colonias por mililitro [ufc/ml] se multiplic el factor de dilucin de la placa en cuestin.

El nmero de colonias transcurridas las 72 horas se muestran en las tablas 1, 2 y 3.


Transcurridos las 72 horas, a 24C se obtuvo un promedio de 39x106 [ufc/ml] para AES y
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66x104 [ufc/ml] para APC mientras que a 36C se obtuvo 217x106 [ufc/ml] para AES y
15x106 [ufc/ml] para APC. Se ignor para 24C las diluciones 10-7 para AES y 10-5, 10-6 y
10-7 para APC mientras que para 36C se ignor las diluciones 10-4 para AES y 10-7 para APC
debido a que no se encontraban en el rango aceptable.

A continuacin, se eligieron las colonias ms representativas para realizar los cultivos puros
en APC y AES con el mtodo de siembra por estras, las cuales se incubaron a 37C por 24
a 48 horas, arrojando resultados positivos para la placa APC y negativa para AES.

Una vez obtenido el cultivo puro de la placa APC, se identific algunas caractersticas de
est como la forma, tamao, elevacin, consistencia, superficie y olor de la colonia. Despus
de un previo anlisis, se lleg a la siguiente conclusin: colonia con forma circular, tamao
aproximado de 5 mm, elevacin convexa, consistencia viscosa, superficie lisa y olor presente.

Con el cultivo puro listo, se procedi a tomar muestras del cultivo puro para realizar la tincin
de Gram y estudiar su morfologa e identificar si pertenecen a las Gram positivas o negativas
(ver imgenes 1,2 y 3). Segn la literatura, las bacterias que predominan en el suelo son las
del genero Bacillus, Pseudomonas, Clostridium, Nitrobacter, entre otras, las que estn
relacionadas generalmente con los ciclos de los nutrientes. Esto nos dar una idea en primera
instancia para identificar e ir generando hiptesis respecto a las bacterias en estudio.

Finalmente, para obtener resultados ms concretos y certeros, se realiz las siguientes


pruebas bioqumicas lo que permiti determinar las caractersticas metablicas de las
bacterias. Para ello se prepararon medios de cultivos lquidos con sustancias nutritivas
especficas segn la prueba a realizar. A continuacin se detalla los resultados de las pruebas
bioqumicas:

Indol
Resultado negativo. Lo que se buscaba con esta prueba, era la formacin de anillo
rojo en la superficie gracias al reactivo Kovacs. Como se puede apreciar en la imagen
4, el resultado fue negativo debido a la formacin de un anillo amarillo, lo cual
significa que las bacterias en estudio carecen de la enzima triptofanasa.

Voges Proskauer
Para esta prueba, lo que se esperaba era el viraje de color amarillo a rojo producto de
la fermentacin de la glucosa. El resultado despus de la siembra del cultivo puro,
incubacin y adicin del reactivo Barrit fue negativo.
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Rojo Metilo
Resultado negativo debido a que no hubo ningn cambio de color en el tubo de
ensayo. Nula fermentacin de la glucosa a cidos.

SIM
Resultado negativo debido a que en el medio se observa movilidad solo en la zona de
inoculacin. No se observa crecimiento de microorganismos en todo el tubo. (Ver
imagen 5)

Citrato
Resultado negativo. Medio de cultivo se mantuvo intacto, lo que significa que las
bacterias en estudio no usan el citrato como una fuente de carbono y de energa.

TSI
Resultado positivo. Cambio de color debido a la fermentacin de hidratos de carbono
presentes en el medo. (Ver imagen 6)

Tabla y figuras:

Tabla 1: Evaluacin de Medios de Cultivo

Medio de ml gastados
Medio grs/ml N Lote Fecha cultivo Mtodo de
de expiracin pH pH NaOH HCl esterilizaci
cultivo inicial final n
AES 0,02 - - 7,5 6,94 0 2 Autoclave
ml
APC 0,0235 3169276 30/04/2018 - 7,06 0 0 Autoclave

TSI 0,065 VM6229154 17/12/2018 - 7,34 0 0 Autoclave


02
SIM 0,03 3240095 28/02/2017 - 7,4 0 0 Autoclave

CITRAT 0,0242 4093194 31/05/2017 - 6,89 0 0 Autoclave


O

INDOL 0,015 YE095 Junio 2009 - 7,41 0 0 Autoclave

RM/VP 0,017 VM5928123 24/10/2018 - 6,93 0 0 Autoclave


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Como se puede apreciar en la tabla 1, para el nico medio de cultivo al cual se le agreg un
cido o base fue para el agar Extracto de Suelo. Se agreg 2 ml de HCL para dejar al medio
de cultivo con su pH ptimo, 6.8 0.2. Para los dems medio de cultivos no fue necesario
agregar una base o cido debido a que todos presentaron el pH ptimo inmediatamente.
Destacar que para la prueba Indol, el medio se encontraba en expiracin por lo cual, pudo
haber influido en los resultados.

Tabla 2: Recuento en placa durante 24 horas de incubacin

Medio de Cultivo Dilucin 24C 36C


Bacterias Hongos Bacterias Hongos
104 18 0 108 0
AES 105 8 0 56 0
106 5 0 24 0
107 3 0 6 0
104 8 0 26 0
APC 105 7 0 12 0
106 2 0 8 0
107 0 0 3 0

Durante las 24 horas de incubacin, se pudo empezar a formular e indagar que las bacterias
crecan ms rpido a una temperatura mayor, en este caso 36 C. Incluso, las diluciones 10-
4
y 10-5 a 36C ya se encontraban en el rango ptimo de colonias. Mencionar que no se
identific ningn hongo durante las 24 horas.
Tabla 3: Recuento en placa durante 48 horas de incubacin

Medio de Cultivo Dilucin 24C 36C


Bacterias Hongos Bacterias Hongos
104 48 3 212 6
AES 105 31 1 108 3
106 26 0 75 1
107 12 0 18 0
104 28 1 51 2
APC 105 14 0 32 1
106 4 0 17 0
107 1 0 9 0

Durante las 48 horas de incubacin la cantidad de colonia aument significativamente,


especialmente a 36C, siguiendo con la hiptesis de que las bacterias crecen mejor a mayor
temperatura. Se pudo apreciar tambin, que dentro de este lapso de tiempo, el medio AES a
24C present dos diluciones con rango ptimo de colonias en estudio, 10-4 y 10-5. Por ltimo,
se pudo identificar y cuantificar hongos para los dos medios de cultivos, llegando a 6 hongos
para la dilucin 10-4 de AES y 2 hongos para la dilucin 10-4 de APC a 36C.
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Tabla 4: Recuento en placa durante 72 horas de incubacin

Medio de Cultivo Dilucin 24C 36C


Bacterias Hongos Bacterias Hongos
104 155 4 421 12
AES 105 127 2 294 7
106 103 0 212 3
107 27 0 41 0
104 66 3 86 2
APC 105 25 1 69 2
106 12 0 38 0
107 4 0 18 0

Finalmente, transcurridas las 72 horas se hizo el conteo final para el clculo de las unidades
formadoras de colonias. Para esto se tom solo las que se encontraban en el rango ptimo.
Los valores fueron mencionados anteriormente. Por ltimo, mencionar que la cantidad de
hongos fue significativa, por lo que pudo haber influido en el crecimiento de las bacterias.
Tabla 5: Reacciones tpicas de especies bacterianas

Pruebas Escherichia Klebsiella Proteus Shigella Pseudomonas Clostridium


bioqumicas Coli sp.
Indol + - - -
Voges - + - - - -
Proskauer
Citrato - + - - -
SIM - + - + +
Rojo metilo + - + + - -
TSI - + - + +

Como se puede apreciar en la tabla 5 y en base a los resultados obtenidos de las pruebas
bioqumicas se puede concluir lo siguiente:
1. Ausencia de la bacteria Escherichia Coli debido a la reaccin negativa de la prueba
Indol. La bacteria Klebsiella pneumoniae comnmente se identifica con este
resultado, pero como se puede apreciar para las pruebas bioqumicas de citrato y
Voges Proskauer debera dar positiva, lo cual no se dio en este estudio.

2. Respecto a las bacterias Proteus y Shigella no se encontraron debido a la reaccin


negativa de la prueba Rojo Metilo. Como se observa en la tabla 5, la reaccin para
Proteus y Shigella debiese ser positiva.

3. Con respecto a las bacterias Pseudomonas sp. y Clostridium, los resultados obtenidos
concuerdan con la tabla 5, por lo cual nos hace pensar que podramos estar frente a
este tipo de bacterias como se mencion anteriormente.
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Imagen 1: Bacterias Gram- Imagen 2: Bacterias Gram


negativas vistas al microscopio positivas vistas al microscopio
tras ser teidas con la tincin de tras ser teidas con la tincin de
Gram Gram

Imagen 3: Bacterias Gram


positivas y negativas vistas al
microscopio tras ser teidas con
la tincin de Gram

Imagen 4: Prueba Indol. Imagen 5: prueba SIM.


Resultado negativo debido a la Resultado negativo debido al
formacin de un anillo amarillo nulo crecimiento en el tubo.
por ausencia de la enzima
triptofanasa en las bacterias
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Imagen 6: Prueba TSI. Resultado


positivo. Cambio de color
debido a la fermentacin de
hidratos de carbono presentes
en el medo.

En las imgenes 1-2-3, se puede apreciar gramnegativos y grampositivos. Segn a la forma


de agrupamiento de las bacterias y similitud con otros estudios realizados, las bacterias en
funcin de las pruebas realizadas podran ser las siguientes:

Imagen 7: Lactobacillus Imagen 8: Clostridium


Sporogenes perfringens

Imagen 9: Pseudomonas,
Bacilos Gram negativo
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3. Conclusin:

El estudio demostr que las bacterias crecen ms rpido a una temperatura mayor. Tambin,
que el medio AES mostr mayor potencial en cuanto al crecimiento bacteriano. Esto
posiblemente a que el AES presentaba los nutrientes necesarios y similares a las del suelo en
estudio. Debido a esto, el nmero de colonias se vio reflejado llegando despus de 72 horas
a 39x106 [ufc/ml] para AES y a 66x104 [ufc/ml] para APC a 24C mientras que se obtuvo
217x106 [ufc/ml] para AES y 15x106 [ufc/ml] para APC a 36C. A su vez se concluy que
las bacterias en su mayora eran gramnegativos del tipo bacillus y que las grampositivas eran
formadoras de esporas como posiblemente Clostridium perfringens.

4. Referencias
Fernndez. L. Rojas. G. Roldn. T. Ramrez. M. Zegarra. H. Uribe. R. Reyes. R.
Flores. D. & Arce. J. (2006). Manual de tcnicas de anlisis de suelos aplicadas.

Daz. G. Espinosa., C. Ilizaliturri. (2012). Mtodos ecotoxicolgicos para la


evaluacin de suelos contaminados con hidrocarburos

tems Nota:
Resumen (20%)
Resultados y discusin (50%)
Conclusin (25%)
Referencias (5%)
Nota Final: