Curso Preparatrio para Concurso da

ANVISA - EDITAL N 1/2013

11. MICROBIOLOGIA CLNICA

PARTE - 2

Dra. Cleide de Oliveira

1
ITENS A SEREM ABORDADOS

Metabolismo e crescimento microbiano (bactrias,

fungos, arqueias);

Isolamento de microrganismos: mtodos de isolamento
e colorao;

Mtodos utilizados na preservao de microrganismos;

Mtodos de esterilizao, desinfeco e assepsia;

Anlise microbiolgica de produtos;

Tcnicas de biologia molecular aplicadas microbiologia.

2
ITENS A SEREM ABORDADOS

Metabolismo e crescimento microbiano (bactrias,

fungos, arqueias);

Isolamento de microrganismos: mtodos de isolamento
e colorao;

Mtodos utilizados na preservao de microrganismos;

Mtodos de esterilizao, desinfeco e assepsia;

Anlise microbiolgica de produtos;

Tcnicas de biologia molecular aplicadas microbiologia.

3
METABOLISMO E CRESCIMENTO
MICROBIANO (BACTRIAS,
FUNGOS E ARQUEIAS)
4
SERES VIVOS

5
Carl Richard Woese (1928-2012)
Microbiologista norte-americano que definiu o
dominio Archaea (um novo domnio dentro dos
seres vivos) em 1977, pela anlise filogentica
do RNAr (16S), por PCR.
Woese, C.R., O. Kandler, & M.L. Wheelis
(1990). "Towards a natural system
of organisms: Proposal for the domains
Archaea, Bacteria, and Eucarya.
Proc.Natl. Aca. Sci. USA 87:4576-4579.

Sistema dos Trs Domnios

Domnio Eubacteria, que inclui as bactrias;

Domnio Archaea, anteriormente chamado Archaebacteria, que inclui
os procariontes que no recaem na classificao anterior;

Domnio Eukaria, que inclui todos os eucariontes, os seres vivos
com um ncleo celular organizado.

Dominio Aphanobionta, composto exclusivamente pelos vrus.

6
Sistema dos Trs Domnios
Carl Woese (1990)

7
Carl Woese (1990) 8
ARQUEAS
Membrana celular - lpidos associao de glicerol-ter
glicerol-ster (bactrias e eucariotas)
Parede celular - no formada por peptidoglicanos
bactrias que os possuem. As arqueas possuem
polissacardeos e outras apresentam apenas protenas
Flagelo na composio e desenvolvimento em relao ao
flagelo das bactrias.
Ausncia de ncelo celular = bactrias
Processos de transcrio e sntese proteica so = idnticos
aos dos eucariotas.

9
ESTRUTURAS CELULARES

10
ARQUEAS
As arqueas so pouco conhecidas devido s dificuldades de acesso aos seus
hbitats e de coleta de material, alm da grande diversidade de seus processos
bioqumicos.

Atualmente, so bem conhecidas as bactrias:

 Metanognicas - organismos que produzem metano (CH4) a partir do
Hidrognio(H2) e de dixido de carbono (CO2), so anaerbias estritos.

 Halfitas - so aerbias e vivem em ambientes com alta concentrao

de sais entre 12-23% de NaCl.

 Termfilas extremas: organismos que tem afinidade por temperaturas

elevadas, suas membranas so estveis entre 80-110C, so aerbicas,
anaerbios estritos, anaerbios facultativos.

11
ARQUEAS - HALFITAS
As halfilas exigem concentraes de sal muito altas.

Halobacterium formato de
basto.

Halobacterium salinarum
As halfilas em grandes concentraes de sal.

Halfilas - produzem energia a partir da

luz, por uma estrutura celular chamada
bacteriorrodopsina.
Mar Morto(sia) e Great Salt Lake (Utah), alm
dos reservatrios onde a gua marinha deixada
para evaporar. 12
ARQUEAS - METANOGNICAS
Locais: estaes de tratamento de
esgotos, no lodo e nas profundezas do
mar, alm de ser encontrados tambm no
tratointestinal de bovinos e outros
ruminantes.

Formato esfrico de Arqueas produtoras de metano

ARQUEAS TERMFILAS

Arqueas, bactrias resistentes a altas temperaturas entre 80 e 110C.

13
Locais: Fontes termais (giseres), Itlia,
Nova Zelndia, Parque Nacional de
Yellowstone

14
CARACTERISTICAS
GERAIS DOS FUNGOS

No possuem movimento prprio

15
16
CANDIDASE

17
CANDIDASE

18
CANDIDASE

19
CANDIDASE

20
CANDIDASE

21
CANDIDASE

22
CANDIDASE

23
CANDIDASE

24
DOMINIO BACTRIA

25
CRESCIMENTO MICROBIANO
Aumento do nmero de microrganismos.

NUTRIENTES FONTE DE CARBONO

MO
FONTE DE ENERGIA FONTE DE ELTRONS

PRECURSSORES METABLICOS

MACROMOLCULAS

MO MO

DIVISO CELULAR

MO MO 26
CRESCIMENTO
SISTEMA FECHADO (TUBO, FRASCO OU BIORREATOR) O CRESCIMENTO EXPONENCIAL NO PODE OCORRER
INDEFINIDAMENTE.

FALTA DE NUTRIENTES
ACMULO DE SUBPRODUTOS TXICOS
EQUILBRIO MULTIPLICAO E MORTE
ATIVAO DE ENZIMAS QUE
NMERO DE BACTRIAS (LOG)

MULTIPLICAO LISAM PAREDE CEULAR

ADAPTAO FASE 4
2 Estacionria

FASE Log MORTE

(Exponencial)
1

FASE Lag

TEMPO 27
CRESCIMENTO
Bactrias, algas unicelulares e
leveduras que se multiplicam por diviso
binria, temos: 21 > 22 > 23> 24

Nmero de bactrias
Log do nmero de
bactrias
Nmero de
MO
Nmero de
geraes
Valor
exponencial

Tempo

28
Fase lag - Perodo de adaptao da cultura
 adaptao das bactrias as condies do meio.
 preparao dos complexos enzimticos
 reparao das clulas com danos.
 processo de diviso pouco ou ausente

Fase log - Fase mais saudvel das clulas onde

todas esto se dividindo
 alto processo de diviso
 crescimento exponencial, porm com velocidades variveis
 absoro de nutrientes do meio
 produo de metablitos (toxinas).
29
Fase estacionria: limitao por depleo de
nutrientes e acmulo de metablitos.
 diminuio da velocidade de diviso bacteriana
 diminuio da atividade metablica
 tiram nutrientes das clulas mortas
 acmulo de substncias txicas; esporulao.
 catabolismo
 produo de metablitos secundrios

Fase de morte celular: nmero de clulas mortas

excede o nmero de clulas vivas. A manuteno de
uma cultura no estado estacionrio por longo tempo conduz
as clulas ao processo de morte e lise celular.
30
DIVISO BINRIA
Na maioria dos procariotos ocorre a fisso binria: crescimento e diviso

Varia de minutos at dias

Depende muito das condies ambientais

31
CRESCIMENTO
INFLUNCIA DOS FATORES FSICOS
o Temperatura
o pH
o Presso osmtica
INFLUNCIA DOS FATORES QUMICOS
 Carbono
 Nitrognio, enxofre, fsforo
 Oxignio
INFLUNCIA DOS FATORES NUTRICIONAIS
 Carbono
 Nitrognio, enxofre, fsforo
 Oxignio
32
 INFLUNCIA DOS FATORES
FSICOS
TEMPERATURA
Temperatura de crescimento
 Mnima - menor temperatura onde capaz de crescer.
 tima - onde apresenta melhor crescimento.
 Mxima - mais alta temperatura para crescer.

Classificao primria:
 Psicrfilos temperaturas baixas (-10 a 20C )
 Psicotrficos - temperatura de refrigerao (0 a 30C)
 Mesfilos temperaturas moderadas (10 50C)
 Termfilos temperaturas altas (40 70C)
 Termfilos extremos ou hipertermfilos (tima em >
80C)
33
 CLASSIFICAO MICROBIANA
TEMPERATURA

Termfilos

Hipertermfilos
Mesfilos

Psicrotrficos
Psicrfilos
Taxa de crescimento

Temperatura (C) 34
INFLUNCIA DOS FATORES
FSICOS
pH

Fungos
filamentosos e
leveduras

35
INFLUNCIA DOS FATORES
FSICOS
A plasmlise a retrao do volume das clulas por perda de gua. Este
fenmeno se d quando a clula colocada em meio hipertnico, ou seja,
quando o meio exterior mais concentrado que o citoplasma e a clula
perde gua por osmose.

Soluo
isotnica
O MO vivem em altas quantidades
de sal so chamados de halfilos
Soluo
Hipotnica
O MO vivem em altas quantidades
Soluo de acar so chamados de
Hipertnica sacarfilos.

36
INFLUNCIA DOS FATORES
QUIMICOS
Corresponde base de todas as molculas orgnicas:
 Aminocidos
 cidos orgnicos
 Carboidratos
 Bases nitrogenadas, etc.).
Peso seco bacteriano
(50% Carbono, 14% Nitrognio e 4% Enxofre e Potssio)

Quimioheterotrficas: a partir de materiais orgnicos como protenas, carboidratos e lipdeos 37

INFLUNCIA DOS FATORES
QUIMICOS
NITROGNIO, FSFORO E ENXOFRE

 Sntese de aminocidos e protenas

 Sntese de DNA e RNA
 Sntese de ATP
 Composio de vitaminas tiamina e biotina

Obteno do nitrognio:
 Decomposio matria orgnica proteica
 ons amnia (NH4)
 Nitratos
 Fixao do nitrognio - alguns microrganismos so capazes de
absorver nitrognio atmosfrico
Ex.: Rhizobium e Bradyrhizobium
38
INFLUNCIA DOS FATORES
QUIMICOS
Necessrios em grande quantidade. MACRONUTRIENTES
Papel importante na estrutura e metabolismo.
 P Sntese de cidos nuclicos, ATP
 S Estabilidade de aminocidos, componente de vitaminas
 K Estabilidade dos cidos nuclicos, bomba de Na/K
 Mg Estabilidade dos ribossomos
 Ca Estabilidade da parede celular e termoestabilidade de endsporos
 Na Requerido em maior quantidade por microrganismos marinhos.
Bactrias haloflicas extremas no crescem com menos de 15 % de sal.
 Fe Papel-chave na respirao, componente dos citocromos e das
protenas envolvidas no transporte de eltrons.
MICRONUTRIENTES
Necessrios em quantidades mnimas (Zn, Cu, Mn, Co, Mo e B).
Funes enzimticas e estruturais das biomolculas
39
COMPONENTES NECESSRIOS

Principal elemento dos compostos orgnicos e de diversos

inorgnicos (gua, sais e gases).
Manuteno do pH HIDROGNIO
Formao de ligaes de H entre molculas
Fonte de energia nas reaes de oxi-reduo na respirao

Elemento comum encontrado nas molculas biolgicas

(aminocidos, nucleotdeos, glicerdeos).
obtido a partir das protenas e gorduras. OXIGNIO
Na forma de oxignio molecular (O2), requerido por muitos
para os processos de gerao de energia.

40
41
 1)Aerbicos estritos
2)Anaerbicos estritos
3)Anaerbico facultativo
4)Microaerfilo
5)Anaerbicos aerotolerantes

RESPIRAO AERBICA Cadeia de eltros (cadeia respiratria) e fora

prton motiva para gerao de ATP, oxignio como receptor final de eltrons.

RESPIRAO ANAERBICA Nitrato, Ferro, Sulfato ou Carbonato como

receptor final de eltrons.

42
METABOLISMO
Catabolismo reaes qumicas que liberam energia a partir da degradao de
substncia orgnicas.

Anabolismo reaes qumicas que consomem energia e permitem a sntese

de precursores metablicos, macromolculas e estruturas celulares.
METABOLISMO

Energia
CATABOLISMO ANABOLISMO

CRESCIMENTO
E
MULTIPLICAO 43
 FONTE DE ENERGIA

LUMINOSA
COMPOSTOS ORGNICOS
FOTOSSINTETIZANTES (GLICOSE)

COMPOSTOS INORGNICOS HETEROTRFICOS

(Fe2+, NO2-, H2) ORGANOTRFICOS

LITOTRFICOS

ATP
BIOSSNTES DE DIVISO CELULAR
MACROMOLCULAS
MONTAGEM DE ESTRUTURAS
44
 ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS:
MTODOS DE ISOLAMENTO E COLORAO

45
46
MEIOS DE CULTURA

Solues de nutrientes para promover o crescimento de microrganismos.

Para obter sucesso no cultivo de MO necessrio o conhecimento de suas

exigncias nutricionais, para que os nutrientes sejam fornecidos de forma e
proporo adequada.

No existe um meio de cultura universal, entretanto existem vrios tipos meios para
diversas finalidades.

Quimicamente definidos (sais, compostos orgnicos purificados, gua)

Complexos (utilizam hidrolisados carne e soja, extratos de levedura, sangue, soro, leite,
solo e rmem de bovino)
47
QUANTO AO ESTADO FISICO OU
CONSITENCIA DOS MEIOS DE CULTURA

Liquidos - BHI, TSB, MHB, Caldo Sabouraud, caldo lactosado, etc

Semi-slidos - MIO, MILi, Cary-Blair, etc

Slidos - Meios para isolamento (> 2.000)

48
QUANTO A COMPOSIO
Composio dos meios simples
 Fonte de CHO carboidratos
 Fonte de CHO e N peptonas
 Fonte de N e S - nitratos e sulfatos;
 Agar-agar;
 Sais Minerais e gua.
Composio dos meios ricos
Composio do simples + adio de
suplementos:
 AS- sangue de carneiro;
 ACHOCO: sangue, suplementos V e
X, vitaminas, ferro...;
 EYA gema de ovo.
49
COMPOSIO DOS MEIOS
DIFERENCIAIS

Composio do simples + adio de substratos:

 Lactose: MAC, EMB, CLED, SS

 Lactose, sacarose, xilose: XLD,

 Lactose, sacarose, salicina; Hektoen

 Manitol: gar manitol salgado

 Sangue de carneiro: Agar Sangue

 Derivados do Enxofre: SS, XLD, HE

50
Composio dos meios seletivos

Composio do simples + adio de inibidores:

 Antibiticos: Thayer-Martin, Campy, AS-Ampicilina.

 Sais biliares: MAC, EMB, XLD,

 Corantes: fucsina, cristal violeta.

 Cloreto de sdio: manitol salgado

51
MEIO PARA FUNGOS
Todos os fungos so heterotrficos
Geralmente so utilizados meios ricos contendo grande variedade de compostos
orgnicos providos pela peptona e extratos de carne ou soja.

Tambm so utilizadas maiores concentraes de acares (4%) e pH menor (3,8

a 5,6) do que os meios para bactrias.

Essa combinao permite inibir o crescimento de bactrias.

52
CLASSIFICAO DOS MEIOS DE
CULTURA
De acordo com a finalidade bacteriolgica ou micolgica os meios especiais podem
ser classificados em:

Meios de pr-enriquecimento - so aqueles que permitem a

dessensibilizao dos MO semeados ou para amostras que sofreram
algum tipo de tratamento (trmico ou qumico).
 gua peptonada
 Caldo lactosado (isolamento de salmonelas de leite em p).

Meios Enriquecidos - quando proporcionam nutrientes adequados ao

crescimento de MO presentes usualmente em baixos nmeros ou de crescimento
lento, bem como MO exigentes e fastidiosos. Esses meios tm a propriedade de
estimular o crescimento de determinados MO, mas existem alguns que tambm
podem inibir o crescimento de outros.
 Caldo Tetrationato e Selenito-Cistina para cultivo de Salmonelas
(lquidos)
 Caldo Tioglicolato Clostridium perfringens.
53
Diferenciais - quando contm substncias que permitem estabelecer
diferenas entre os MO muito parecidos.
Exemplo:
 Meio de Teague ou Eosina Azul de Metileno (diferencial para coliformes)
 gar MacConkey para a diferenciao de enterobactrias
 gar sangue
 gar Baird-Parker para isolamento e diferenciao de cocos Gram
positivos (slidos).

54
Seletivos - os que contm substncias que inibem o desenvolvimento
de determinados grupos de MO permitindo o crescimento de outros.
 Meios com telurito de potssio (para isolamento de Corynebacterium
diphtheriae)
 gar Salmonella-Shigella (SS)
 gar MacConkey
 Meios com sais biliares e verde brilhante para isolamento seletivo de
Salmonella
 Meios com 7,5% de cloreto de sdio
 Meio Baird-Parker, para isolamento de Staphylococcus aureus
 Meios com antibiticos para isolamento de diversos MO (TSC, SFP,
meio de Blaser, meio de Skirrow, etc.).

A maioria destes meios tambm so diferencial, permitindo diferenciar as

colnias (slidos) dos microrganismos.

55
Meios de triagem - meios que avaliam determinadas atividades
metablicas permitindo caracterizao e identificao presuntiva de muitos
microrganismos.
 gar trplice acar e ferro
 Meio Instituto Adolfo Lutz
 Meio de uria, etc.);

Meios de Identificao - prestam-se para a realizao de provas

bioqumicas e verificao de funes fisiolgicas de organismos submetidos
a identificao.
 Meios Oxidao/Fermentao
 gar Citrato
 Caldo nitrato
 Meio semi-slido
 Caldo triptofano
 Meio de Sulfito Indol Motilidade, etc.;
56
Meios de dosagem - empregados nas determinaes de vitaminas,
antibiticos e aminocidos.

Meios de contagem - empregados para a determinao quantitativa da

populao microbiana.
 Agar de Contagem em Placas
 TSC
 Agar Batata Dextrose
 gar Baird-Parker, etc.);

Meio de estocagem ou manuteno - utilizados para conservao

de MO em laboratrio, i.e. garantem a viabilidade dos MO.
 gar Sabouraud
 Meios com leite
 gar suco de tomate
 gar sangue
 gar Simples, meio semi-slido, etc.) 57
58
MEIOS DE CULTURA MAIS
COMUNS
 gar sangue: meio no seletivo, crescimento de bactrias
gram negativas e positivas.

 gar chocolate: meio nutritivo maioria bactrias.

 gar Thayer-Martin: meio seletivo utilizado para isolamento

Neisseria, inibe a maioria das outras bactrias.

 gar MacConkey: Seletivo gram negativa e inibe

crescimento bactrias gram positivas.

 CLED - gar cistina-lactose deficiente de eletrlitos:

um meio especfico que permite o crescimento de gram
positivas e negativas.
59
 gar eosina metileno blue (EMB): seletivo gram
negativo e inibe bactrias gram positivas.

 gar Salmonella-Shigella (SS): seletivo e diferencial

isolamento fezes

 gar Colistin nalidix (CNA): seletivo para Streptococcus e

Enterococos. Inibe bactrias gram negativas.

 Caldo de tioglicolato: meio enriquecido maioria das

bactrias.

 gar tetrationato: meio enriquecido para Salmonella sp.

 gar karmali: meio seletivo para o isolamento de

Campylobacter sp
60
MATERIAIS BIOLGICOS E OS MEIOS
MAIS COMUNS

 Secrees purulentas: gar sangue, gar MacConkey e Caldo de

tioglicolato.

 Orofaringe, Nasal, Ocular: gar sangue.

 LCR: gar sangue, CHO, Caldo de tioglicolato.

 Fungos: gar Saboraund

 Vaginal, Uretral, Endocervical: CHO, gar sangue.

 Extremidade de cateter: gar sangue e Caldo de tioglicolato.

 Urina: CLED e gar MacConkey

 Fezes: SS e gar MacConkey

61
1. GAR
SANGUE

62
 2. GAR
CHOCOLATE

63
3. GAR THAYER-MARTIN

64
 4. GAR
MacConkey

65
5. CLED

66
 6. GAR EOSINA
METILENO BLUE (EMB)

67
 6. GAR EOSINA
METILENO BLUE (EMB)

68
7. gar Salmonella-Shigella (SS)

69
 um meio no seletivo
onde crescem diversas
bactrias.1 O meio
rico em triptona e
peptona, fonte de

Meio TSA carboidratos, protenas

e lipdios para o
(trypticase soy agar) desenvolvimento dos
microorganismos
verificados.2

70
71
 GAR
MYCOSEL

72
GAR
SABOURAUD Meio para cultivo,
isolamento e identificao
de fungos patognicos e
leveduras. O timo
crescimento dos fungos se
deve s altas
concentraes de
carboidratos.

73
MEIO LwensteinJensen

74
Microplacas com diferentes meios de
cultura para identificao de
enterobactrias.

75
76
 Meio de Rugai & Arajo modificado por Pessoa & Silva ou
meio IAL (Meio Instituto Adolfo Lutz)

Prova de Identificao bioqumica de Enterobactria

O meio IAL / Rugai foi elaborado para triagem de

enterobactrias e consiste de nove provas em apenas
um tubo de ensaio: indol (tampa), fermentao da
sacarose, fermentao da glicose, produo de gs,
fenilalanina, uria, H2S, lisina e motilidade. Baseado
nestas provas possvel identificar as seguintes
bactrias:
- E. coli
- Shigella
- Enterobacter
- Klebsiella
- Providencia spp.
- Morganella morganii
- Proteus
- Salmonella
- Citrobacter
- Serratia
- Vibrio
- No fermentadoras
77
78
INCULO E SEMEADURA

79
TIPOS DE COLORAES

80
 MTODO DE GRAM DIFERENCIAO ENTRE
GRAM POSITIVO E NEGATIVO

TCNICA DE GRAM
 Confeccionar o esfregao;
 Corar com violeta de cristal por 60seg FIXAO
 Lavar com esguicho de gua
destilada;
CRISTAL VIOLETA
 Cobrir com Iodo ou Lugol por 60seg
 Lavar com esguicho de gua
destilada; IODO OU LUGOL
 Descorar com lcool a 95%, ou
acetona, 10-20 seg; DESCOLORAO
 Lavar com esguicho de gua
destilada;
 Corar com safranina por 60 seg COLORAO
DIFERENCIAL COM
 Lavar com gua destilada, secar e
SAFRANINA
observar ao microscpio. 81
GRAM NEGATIVA

82
 MTODO DE ZIEHL- NEELSEN COLORAO
PARA BAAR

COLORAO ZIELHL-NEELSEN
 Confeccionar o esfregao
 Cobrir a lmina com fucsina fenicada
 Aquecer a lmina at emisso de vapores
 Aguardar 5 a 8 min
 Lavar com gua corrente;

BAAR - vermelho.  Cobrir a lmina com lcool-cido 3% at

NO BAAR - azul. descorar totalmente o esfregao;
 Lavar com gua corrente;
 Cobrir a lmina com azul de metileno por 1 min
 Lavar com gua corrente;
 Secar;
 Observar.
83
BCTERIAS ALCOOL
CIDO RESISTENTE

84
Mycobacterium tuberculosis corado com a tcnica de Ziehl-Neelsen

85
FONTANA-TRIBONDEAU PARA
COLORAO DE ESPIROQUETAS
Esfregao fino,
seco ao ar.
Reagentes:
Soluo A Fixador
Soluo B Mordente
Soluyo C Impregnadora

Tcnica:
1 Cobrir o esfregao com o fixador (soluo A) durante 1 minuto.
2 Lavar cuidadosamente com gua corrente.
3 Cobrir o esfregao com o mordente (soluo B) e aquecer a lmina at a
emisso de vapores. Esfriar.
4 Lavar com gua corrente, e aps, com gua destilada.
5 Cobrir o esfregao com a soluo impregnadora (soluo C) e aquecer at a
emisso de vapores.Deixar 30 segundos.
6 Lavar com gua corrente e secar ao ar.

As espiroquetas aparecem impregnados de azul-preto em fundo pardo.

86
IDENTIFICAO DE MICRORGANISMOS

Caractersticas Culturais Microscopia ptica

Morfologia Colonial Caractersticas Metablicas

Caractersticas Morfolgicas Caractersticas Fisiolgicas

Colorao simples Caractersticas Antignicas

Colorao diferencial Caractersticas patognicas

Colorao de Gram Caractersticas genticas

87
GOOD LUCK!

88