Resumen Polymerase Chain Reaction

A partir de este video aprend que los pasos para hacer una PCR son:
1. Hacer los clculos de todo lo que se utilizar
2. Construir una tabla con todos los datos
3. Usar guantes para nuestra seguridad (pues uno de los reactivos es muy peligroso
para la salud)
4. Poner todos los reactivos, polimerasa, bases y muestra de DNA a enfriar en una
pequea tina con hielo
5. Preparar el ependorf en que se amplificar la muestra de DNA con todos los
reactivos en las proporciones calculadas
6. Programar el termociclador a partir de los clculos de cunta temperatura
necesitar en cada fase la muestra de DNA para amplificarse.

Preguntas
1. Enlistar los componentes de una Master Mix para hacer una PCR. En qu
prioridad deben de ir?
2. Cules son las concentraciones y volmenes de cada componente del Master
Mix?
Componente Volumen
(microlitros)
Agua destilada Hasta 50
PCR buffer 5
dNTP 1
MgCL2 3
Primer sentido 1
Primer antisentido 1
DNA variable
Polimerasa 0.5

3. Hacer el programa indicando desnaturalizacin inicial, los 3 pasos intermedios, la

extensin final (30 ciclos). Indicar tiempo de cada paso.
Temperatura (C) Tiempo (seg) Ciclos
Desnaturalizacin inicial 94-98 60 1
Desnaturalizacin 94 10-60 25-35
Alineacin 5 debajo de la Tm 30 25-35
Extensin 70 a 80 variable 25-35
Extensin final 70 a 80 300 1

4. Qu debo hacer para ver los fragmentos de DNA?

a. Preparar el recipiente de agarosa
b. Poner el gel en la cmara de electroforesis
c. Cubrir con running buffer
 d. Cargar pozos con muestra
e. Conectar terminales
f. Verificar funcionamiento de la cmara (burbujas)
g. Retirar gel tras migracin
h. Retirar gel de cmara
i. Llevar gel a cuarto oscuro
j. Exposicin a luz UV
k. Tomar fotografa del anlisis
5. Cmo debo cargar mi gel? Qu me permite ver las bandas?
Con iones de magnesio a concentraciones variables.
6. Haz un diagrama lineal de las temperaturas del termociclador.
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7. Cmo se prepara un gel de agarosa?
a. Preparar una solucin agarosa-buffer
b. Diluir calentando en el microondas (30s-mezclar-30s-mezclar)
c. En un recipiente cuadrangular depositar la solucin con un peine y dejar
que se solidifique a Tamb.
8. Cmo se prepara la cmara para correr el gel?
Agregar el loading dye a las muestras de DNA que se desea separar, preparar la carga que
queremos usar, llenar la cmara de agua destilada hasta cubrir la superficie del gel de
agarosa. Llenar los pozos de las muestras de DNA. Cerrar la caja e iniciar el procedimiento.
9. Cunto es necesario de bromuro de etilio?
0.5 microgramos por mililitro.
10. Cules son los componentes del buffer de carga?
0.25% bromofenol azul, 0.25% xileno cianol, 30% glicerol
11. Qu me indica que ya est corriendo mi gel?
La aparicin de burbujas.
12. En dnde coloco el bromuro de etilio para ver los productos de PCR?
En el gel de agarosa.
13. Con qu ver las bandas de los productos de PCR?
a. En una imagen que obtenemos en un software a partir de aplicar rayos UV
al gel.
14. Qu debo cuidar para hacer una PCR exitosa?
Revisar que los electrodos estn situados en el lugar adecuado para que corra el gel en la
direccin en que debera.