D. Práctica 4 Bebidas Refrescantes - Hidratantes - Carbonatadas

PRCTICA N 4
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ANLISIS MICROBIOLGICO DE BEBIDAS REFRESCANTES,
HIDRATANTES Y CARBONATADAS
CURSO DE- MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS VERSIN
1-
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA 2
OBJETIVO.
- Desarrollar competencias en los estudiantes para realizar e interpretar los anlisis microbiolgicos requeridos por la legislacin
actual para este tipo de bebidas.
- Determinar qu tipo de productos se clasifican dentro de las bebidas refrescantes, hidratantes y carbonatadas.
- De acuerdo a los procesos llevados a cabo en estas bebidas que, el estudiante reconozca el tipo de microbiota que puede
estar presente, las consecuencias de su presencia y las formas de detectar estas poblaciones.
INTRODUCCIN.
Bebidas refrescantes.
El trmino bebida refrescante (soft drinks), est abierto a diversas interpretaciones, por lo que es necesaria una cuidadosa
definicin. En su ms amplia aceptacin, el trmino engloba a las bebidas sin alcohol (incluyendo a la cerveza, vinos sin alcohol y
agua), pero en su uso corriente se excluye normalmente al t, caf, etc., y a las bebidas basadas en leche (Tabla 1).
Histricamente, las bebidas refrescantes derivan de dos fuentes principales, de las aguas minerales con gas y aromatizadas con
frutas que estuvieron asociadas con la popularidad de los manantiales europeos y de las versiones sin alcohol de las cervezas de
hierbas elaboradas de un modo casero. La campaa antialcohlica a finales del siglo XIX, proporcion el estmulo principal para el
desarrollo de las industrias de bebidas refrescantes. Aunque la elaboracin a pequea escala todava persiste a nivel local, la
mayor parte de las industrias opera a nivel nacional e internacional y, los esfuerzos de compaas como Coca-Cola y Pepsi-
Cola, para establecer una hegemona global se discute frecuentemente en la fraseologa del poder de la poltica internacional. Se
han desarrollado nuevos productos con el nombre de marcas bien conocidas, como las variantes de Coca-Cola, pero con el paso
de los aos han desaparecido muchos productos tradicionales, especialmente aquellos derivados de brebajes de hierbas.
Tabla 1. Productos clasificados como bebidas refrescantes.
- Zumos de frutas.
- Concentrados de zumos de frutas.
BEBIDAS REFRESCANTES
- Bebidas a base de zumos de frutas.
- Bebidas a base de extractos naturales (limonadas, colas, sodas, etc.).
De todas ellas, son los zumos de frutas los ms ricos en sustancias nitrogenadas y vitaminas; el grupo de limonadas y sodas, etc.,
poseen muy escasas cantidades de las sustancias citadas. Por su composicin, es evidente que son las bebidas a base de zumos
de frutas las ms sensibles a las contaminaciones. Las bebidas elaboradas con extractos naturales (limonada, soda, etc.),
constituyen medios desfavorables para el desarrollo de microorganismos, por las siguientes caractersticas:
- Su bajo pH (3.0 4.0).

- Alta concentracin de CO2.
- Su dbil cantidad de sustancias nitrogenadas y vitaminas.
- Su falta de Oxgeno.
- Su concentracin de azcar.
FECHA DE
ELABORADO POR: Alberto Rojas Trivio M.Sc. ELABORACIN
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Los microorganismos presentes en las bebidas refrescantes, pueden proceder de diferentes fuentes, dentro de las cuales se
pueden listar: La materia prima principal, la materia prima suplementaria, el equipo que se utiliza en su elaboracin y el ambiente.
En las bebidas a base de zumos de fruta, adems de las frutas, se aaden materias primas suplementarias que pueden aumentar
la contaminacin como: El agua, azcar y otros. El azcar es con frecuencia portador de microbiota fngica y bacteriana (como
Leuconostoc spp.).
Los zumos recin extrados son ricos en microorganismos, con una tasa que depende de la calidad bacteriolgica de la fruta, de la
limpieza en la cosecha y del equipo utilizado; esta microbiota dominante est constituida por levaduras y mohos. La limpieza del
ambiente influye notablemente en la contaminacin de los productos; el entorno ambiental est a veces, cargado de esporas
fngicas que influyen negativamente sobre la calidad del producto, al hacer posible la alteracin de sus caracteres organolpticos,
sin olvidar la posibilidad de produccin de micotoxinas (como Patulina).
Adicionalmente, por malas manipulaciones se pueden incorporar diversos agentes, sobre todo Micrococcus spp., Staphylococcus
spp., y microorganismos de origen fecal.
La microbiota presente en los zumos recin extrados es muy elevada, predominando las levaduras, que son las que, en el 90% de
los casos, alteran las bebidas refrescantes, debido a:
- Que son capaces de soportar su bajo pH y replicarse en estas condiciones,

- No tienen necesidad de vitamina B para su desarrollo,
- Son capaces de utilizar nitrgeno inorgnico para su desarrollo,
- Toleran tasas elevadas de CO2 y,
- Soportan altas concentraciones de azcar.
Las levaduras aisladas con ms frecuencia, pertenecen a los gneros Candida spp., y Saccharomyces spp.; los mohos, por ser
microorganismos aerobios, no se encuentran en las bebidas gaseosas, pero se pueden hallar en los zumos de frutas. Las bacterias
se adaptan peor a este tipo de bebidas, debido a que:
- La mayora no soportan un pH bajo,

- Necesitan vitamina B y otras para su desarrollo,
- Necesitan sustancias nitrogenadas para desarrollarse,
- En su mayora no toleran la presencia de CO2 y,
- En su mayora no soportan altas concentraciones de azcar.
Las bacterias encontradas en este tipo de bebidas y que, pueden desarrollarse (zumos de frutas), pertenecen a los gneros:
Achromobacter spp., Pseudomonas spp., Bacillus spp., Flavobacterium spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Micrococcus
spp., Erwinia spp., y Xanthomonas spp. La microbiota patgena, se encuentra en ambientes desfavorables y desaparecen
rpidamente, considerando las bebidas a base de frutas no peligrosas, desde el punto de vista sanitario.
La microbiota banal acidfila y osmfila, puede ser causa de cierto nmero de alteraciones y a pesar de los tratamientos de
estabilizacin de las bebidas refrescantes, estos microorganismos pueden ocasionar:
Fermentacin alcohlica por levaduras. Originada por especies del gnero Saccharomyces cerevisiae, S. carlsbergensis y S.
acidifaciens, principalmente. La alteracin consiste en la aparicin de un sabor a alcohol y sobre todo, en el desprendimiento de
gran cantidad de gas; a veces, se observa turbidez y sedimentos y, formacin de olores y gustos anormales. Tambin, se puede
observar la formacin de pelculas y la presencia de aromas afrutados. De los refrescos tambin se han aislados los gneros
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Brettanomyces spp., Dekkera spp., Zygosaccharomyces spp., Candida spp., Pichia spp., Torulaspora spp. (Torulaspora delbrueckii
en materias primas y maquinaria, en producto final es rara), Cryptococcus spp., Rhodotorula spp., y Yarrowia spp.
Fermentacin por bacterias lcticas homo y heterofermentativas. Como Lactobacillus arabinosus, L. leichmanii, L.
pastorianus, L. brevis, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus spp., y otras. Al fermentar los azcares, producen sabores y
olores anormales, as como, desprendimiento de gas. Algunas cepas de Leuconostoc, producen Diacetilo en bebidas de fruta, lo
que causa una alteracin caracterstica con aromas a mantequilla.
Formacin de gas. El desarrollo de Clostridium butyricum en el zumo de tomate, cuando el pH no es muy elevado (pH 4.2),
provoca la formacin de gran cantidad de gas con el riesgo de producir la explosin del envase y dar lugar a modificaciones en el
olor y el gusto del producto.
Enturbiamiento. Los mohos se desarrollan si las condiciones de aireacin lo permiten, dando lugar a un enturbiamiento
algodonoso, ennegrecimiento, decoloracin y sabores amargos, sobre todo en los zumos. Intervienen especies de los gneros:
Mucor spp., Aspergillus spp., Alternaria spp., Cladosporium spp., Penicillium spp., Fusarium spp., y Aureobasidium spp. Tambin,
se pueden producir modificaciones en el sabor, presentndose sabores agrios y/o picantes.
Presencia de microorganismos patgenos.
La multiplicacin de microorganismos patgenos para el hombre en los zumos de fruta es prcticamente imposible, dado su pH
bajo; las intoxicaciones o infecciones alimentarias provocadas por estos productos, son pues, excepcionales. No obstante, puede
ocurrir que, los diferentes microorganismos patgenos sobrevivan y se desarrollen si la acidez de los jugos se neutraliza al ser
mezclados con otras sustancias. Por esta razn, interesa investigar la posible presencia en estos productos, de bacterias testigo de
contaminacin fecal y cierta microbiota patgena.
Las bacterias cido Acticas (Acetobacteriaceae), de los gneros Acetobacter spp., y Gluconobacter spp., causan de vez en
cuando alteraciones en los refrescos, teniendo ms importancia el gnero Gluconobacter spp., por su afinidad por los azcares.
Los productos que contienen benzoatos y/o sorbatos que se envasan en recipientes plsticos parecen ser los ms vulnerables. La
capacidad para producir alteraciones de las especies del gnero Gluconobacter spp., vara de cepa a cepa. Algunas cepas, causan
malos aromas y sabores, mientras que otras cepas pueden estar presentes en altos recuentos sin causar ningn efecto negativo
sobre el sabor o aroma. La alteracin por Acetobacter spp., y Gluconobacter spp., pueden llevar a la aparicin de turbidez y
sedimentos.
Bebidas carbonatadas.
La carbonatacin se puede considerar como la saturacin de un lquido con CO 2 gaseoso, que es incoloro, con un ligero olor
picante y que se disuelve parcialmente en agua formando cido Carbnico. El nivel ptimo de carbonatacin vara de acuerdo con
el aroma, sabor y caractersticas de las distintas bebidas; en trminos generales, los refrescos de frutas se carbonatan a un nivel
bajo, de aproximadamente 1 volumen de CO2; las colas a nivel medio, de 2 a 3 volmenes de CO2; y las bebidas para mezclas
hasta un nivel alto, de 4 a 5 volmenes de CO2, para permitir su dilucin con el componente lquido no carbonatado. El uso de
envases grandes (de 2 a 3L), de PET (Polietilentereftalato), requieren un nivel de carbonatacin ligeramente ms elevado que en
los envases de vidrio, necesario para compensar las prdidas de CO 2 que se producen a travs de las paredes durante el
almacenamiento y en cada apertura efectuada durante el periodo de consumo (Anexo A). El papel fundamental de la
carbonatacin, es conseguir un ntimo contacto entre el CO 2 gaseoso y el lquido que debe ser carbonatado; los factores que
determinan el grado de carbonatacin son:
- La presin del sistema.
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- La temperatura del lquido.

- El tiempo de contacto entre el lquido y el CO 2.
- El rea interfacial entre el lquido y el CO 2.
- La afinidad del lquido por el CO2 (la afinidad disminuye segn aumenta el contenido de azcar).
- La presencia de otros gases.
Los refrescos carbonatados se consumen siempre sin diluir e incluyen: Los citrus comminutes (pulverizados), lemonade y otras
bebidas de ltima categora, incluyendo las colas. Los ingredientes utilizados comnmente, se resumen en la Tabla 2.
Tabla 2. Ingredientes y algunos ejemplos para los refrescos carbonatados.
- Agua.
- Dixido de carbono.
- Jarabe:
Aromatizantes: Zumo de frutas, esencias, extractos de hierbas, etc.
Azcares: Azcar, jarabe de glucosa-de maz, sacarina, aspartame, sorbitol, manitol (dietticas).
Acidulantes: cido ascrbico, ctrico, lctico, mlico, tartrico.
Colorantes: Tartracina, amarillo quinolina y sunset yellow.
Conservantes: cido benzoico, srbico, dixido de azufre. Parabenos como 4-hidroxibenzoato de metilo, de
etilo y de propilo.
Antioxidantes: cido ascrbico, tocoferoles naturales y sintticos, palmitato de ascorbilo y sus sales.
Emulsionantes: Protenas y esteres de la sacarosa.
Estabilizantes: Goma Guar y extracto de quillay.
Espesantes: Goma Guar.
Espumantes: Extracto de quillay y extracto de yuca.
Preparados en polvo para hacer refrescos.
Los preparados en polvo para hacer refrescos, pueden ser refrescos en polvo o anlogos de los refrescos. Los productos de esta
clase, tales como la limonada en polvo, se han comercializado durante muchos aos, pero hasta hace poco eran productos de baja
calidad. Los preparados en polvo para hacer refrescos ofrecen la ventaja de ser estables y ocupar poco espacio; tambin, existe un
consumo particular limitado, especialmente situaciones concretas como en las excursiones. La formulacin de los refrescos en
polvo es similar a la de sus homlogos lquidos; bsicamente la elaboracin de los preparados en polvo, consiste en el pesado y
mezclado de los ingredientes. Debe prestarse mucha atencin a la eleccin del envase, el cual debe tener propiedades
protectoras, as como, una buena resistencia fsica; normalmente se usa el papel de triple lmina (papel-polietileno-lmina de
aluminio).
Bebidas deportivas, bebidas enriquecidas y Neutraceuticals.
En los ltimo aos ha surgido un notable mercado, aunque fragmentado, de bebidas que se consumen con fines especficos y
diferentes al de sofocar la sed o el placer. Tales bebidas apoyan las modas de vida sana o bien se afirma que, tienen propiedades
para estimular la salud e incluso medicinales. Existe un considerable solapamiento entre estos productos y los refrescos
convencionales, pero la base lgica de su formulacin es completamente diferente.
Bebidas deportivas. Recientemente ha aumentado la disponibilidad de este tipo de bebidas modernas; Las ms comunes quiz,
sean las bebidas para reponer fluidos, que facilitan la rehidratacin tras o durante una actividad fsica intensa. Tales bebidas
tambin son conocidas como isotnicas, equilibradoras de los electrolitos y reponedoras de electrolitos. Estos electrolitos, estn
presentes en la formulacin fundamental para facilitar la absorcin de agua ya que, la reposicin de electrolitos no suele ser una
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prioridad tras el ejercicio si no que, se consigue mediante la alimentacin posterior al esfuerzo. Los electrolitos principales son
Sodio y Cloruro y otros presentes como Potasio, Magnesio, Calcio, Hierro, Carbonatos y Fosfatos.
Bebidas enriquecidas y Neutraceuticals. Estas dos categoras abarcan a un amplio espectro de refrescos que se solapan entre
ellos y con las bebidas deportivas. Las bebidas enriquecidas, se consideran refrescos que se asemejan organolpticamente a sus
equivalentes convencionales pero que, contienen cantidades ms elevadas de un nutriente o grupo de nutrientes. El punto de
partida ms corriente son los refrescos de frutas que se enriquecen con una variada gama de nutrientes, incluyendo protenas,
minerales (particularmente calcio, vitaminas y fibra). Algunas se destinan a mercados especficos, como las colas infantiles que no
contienen cafena, se edulcoran con glucosa y contienen un alto nivel de calcio. Neutraceuticals, es un trmino nuevo que, en su
ms amplia acepcin, se puede aplicar a cualquier alimento o sustancia que forma parte de un alimento y que proporciona algn
beneficio a la salud o ejerce algn efecto teraputico. Los refrescos neutraceuticals, son particularmente populares en Japn, en
donde se les atribuye propiedades medicinales que, en otros pases no se admitiran.
Garanta y Control de Calidad.
El grado de la garanta y control de la calidad en la planta de elaboracin vara en funcin de la escala de la operacin tecnolgica
y de su naturaleza. El control en las plantas concesionarias y en otras operaciones que parten del jarabe preparado por una planta
central o matriz, deben descansar en el control realizado en la planta central para asegurar una correcta composicin en un grado
mucho mayor que en las operaciones que se realizan en las empresas que desarrollan sus propias formulaciones. Sin embargo, en
todos los caso se deben seguir las mismas pautas bsicas: Operaciones generales de la planta (incluyendo formacin, asignacin
de responsabilidades, criterios mdicos, etc.), control de llenado (incluyendo el nivel de llenado, el nivel de carbonatacin y el
espacio de cabeza), comprobacin de que la formulacin sea correcta e higiene de las instalaciones.
Recuerde que el control debe dirigirse a la prevencin de los problemas o como mnimo a la deteccin temprana de los problemas.
Se deben llevar controles de mediciones del tiempo real en los equipos e instrumentacin para controlar de modo continuo los
slidos totales, acidez, color, claridad y grado de carbonatacin. Empleo de mtodos microbiolgicos en planta, como la deteccin
de ATP, como posible contaminacin en etapas tempranas, adems de controles en la lnea total del proceso.
ACTIVIDAD PRCTICA.
En el caso de bebidas gaseosas, el anlisis se efectuar despus de la degasificacin, para lo cual se pueden verter 50 ml. de la
muestra en un Erlenmeyer estril con perlas de vidrio; se disuelve y elimina el gas agitando el matraz durante algunos minutos a
temperatura ambiente. En los productos muy cidos, se neutralizar la muestra con Fosfato Tripotsico al 20%. A partir de la
muestra, se prepararn diluciones decimales, utilizando como diluyente agua de Triptona (TW). (Las anteriores son indicaciones
de la Comisin Interministerial para la ordenacin Alimentaria C.I.O.A., del Ministerio de Sanidad y Consumo de Espaa).
Materiales y equipos.
Muestras: Nctares de fruta, bebidas gaseosas, refrescos de frutas, jugos de fruta pasteurizados y ultrapasteurizados, bebidas
dietticas a base de frutas, bebidas dietticas carbonatadas, etc.
- Stomacher o licuadora que permita una buena homogenizacin.

- Recipiente de vidrio esterilizable (o bolsas de polietileno para Stomacher).
- Balanza de precisin 0.1g.
- Pipetas de 1mL estriles.
- Pipetas de 10 mL estriles.
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- Frascos con diluyente (agua peptona 0.1% estril).

- Tubos taparosca con agua de Peptona 0,1% estril.
- Cajas Petri estriles.
- Agar para conteo en placa estndar (SPC), fundido.
- Agar OGYE, PDA o Sabouraud fundido.
- Tubos taparosca y campana Durham con caldo Bilis Verde Brillante o Caldo LMX-Fluorocult.
- Tubos taparosca con Caldo Triptfano (o agua Peptona 1%).
- Agar Sulfito Polimixina Sulfadiacina Perfringens (SPS), u Oleandomicina Polimixina Sulfadiacona Perfringens (OPSP),
fundido.
- Agar Violeta Rojo Bilis (VRB), fundido.
- Tubos de ensayo con agar recto SIM (Sulfuro Indol Motilidad).
- Tubos de ensayo con caldo Rojo de Metilo Voges Proskauer (RM-VP).
- Tubos de ensayo con agar inclinado Citrato de Simmons.
- Bao de agua (45C - 50C).
- Incubadora.
- Contador de colonias.
- Gradillas.
- Alcohol antisptico.
- Algodn.
- Reactivo de kovacs.
- Lmpara de luz Ultravioleta (de acuerdo a medios utilizados).
- Papel para sellar cajas Petri.
- Marcadores vidriogrficos.
PROCEDIMIENTO.
- Realice diluciones iguales a 10-1, 10-2, 10-3 o de acuerdo a su criterio de calidad (calidad del producto), o necesidad del
producto.
- Realice los anlisis de acuerdo al producto elegido, considerando los anlisis para: Aerobios Mesfilos (en placa profunda),
Coliformes y E. coli (NMP y placa profunda), Mohos y Levaduras (placa profunda) y, E.C.S.R. (guese por el Anexo B, Criterios
microbiolgicos para algunas bebidas refrescantes, Hidratantes y Carbonatadas).
- De acuerdo a los resultados obtenidos, proceda a realizar los clculos, tabule e informe correctamente, tomando como valor de
comparacin los criterios microbiolgicos registrados en el Anexo B, de esta gua.
- De acuerdo a los resultados, concluya sobre la calidad microbiolgica del producto (Aceptacin - Rechazo).
Tcnica de Siembra en Placa Profunda para el recuento de E.C.S.R.
Esta tcnica es utilizada cuando se sospecha que el alimento a analizar puede contener una poblacin del microorganismo mayor
a 100 UFC/g mL.
- Prepare diluciones iguales a 10-1, 10-2 y 10-3 a partir de la muestra.

- Siembre por duplicado 1 mL de las diluciones 10-1 y 10-2 en el fondo de una placa de Petri.
- Adicione 15 mL de agar fundido SPS, OPSP, agar selectivo para C. perfringens (o el agar seleccionado para el anlisis; ver
Anexo C), y homogenice el inculo en el agar fundido, realizando movimientos circulares a la placa Petri.
- Cuando las placas hayan solidificado, dispngalas en una jarra de anaerobiosis, prepare el sistema de anaerobiosis e
introdzcalo en la jarra simultneamente con el indicador de la anaerobiosis; cierre correcta e inmediatamente la jarra.
- Incube las placas a 43 2C / 24-48 2 h.
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- Pasado el tiempo de incubacin, retire las cajas de la incubadora y de la jarra; seleccione las cajas que presenten entre 15 y
300 colonias aisladas de color negro y de 1 a 3 mm de dimetro; pueden presentarse planas, algo rizoides y elevadas en el
centro. Proceda a realizar la prueba confirmativa.
Prueba de confirmacin de las colonias para Clostridium perfringens.
- Tome como mnimo tres colonias tpicas para ensayar; inocule en caldo Tioglicolato por 4 horas a 46C en bao de agua o
toda la noche a 35-37C (Anexo C).
- Realice extensiones y talas con los colorantes de Gram y de Schaeffer Fulton. Posterior a las tinciones, se deben observar
clulas Gram-positivas, con forma bacilar, grandes y de extremos redondeados, con presencias de esporas subterminales no
deformantes. La observacin de esporas es difcil de lograr, para ello se recomienda sembrar en agar inclinado Carne Cocida
e incubarlo a 30C / 5-7d en condiciones de anaerobiosis.
- Una vez comprobada la morfologa, se procede a sembrar las pruebas bioqumicas: Caldo Nitrato, agar Gelatina, agar SIM,
agar Sangre (en general de las pruebas tpicas de las cuales se disponga). Incubar las pruebas a 43 2C / 18-24 horas en
condiciones de anaerobiosis.
- Realizar la prueba de Catalasa, adicionando a una colonia emulsionada en portaobjetos una solucin de Perxido de
Hidrgeno al 3%.
- Compare los resultados obtenidos con las reacciones bioqumicas registradas en la literatura cientfica y concluya.
Tcnica del Nmero Ms Probable.
Este mtodo es empleado para el anlisis de los alimentos de los cuales se sospecha puedan presentar un nmero menor a 100
UFC/g mL, de este microorganismo. Para esta tcnica se utilizan los medios DRCM, SPS, OPSP y las bateras bioqumicas para
su identificacin.
Prueba Presuntiva.
- A partir de las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3, siembre 1mL de cada una sobre tres tubos conteniendo 10 mL de caldo DRCM
(Caldo Diferencial Reforzado para Clostridium).
- Cubra cada tubo con parafina estril (vaselina o aceite mineral estril), y deje solidificar, con el fin de lograr condiciones de
anaerobiosis. En este medio se detecta el cambio de atmsfera, por el cambio del color rosado del caldo a amarillo, durante
las primeras horas de incubacin.
- Incube todos los tubos como mnimo a 30C (46C), por 24-48h. El ennegrecimiento del medio, pone de manifiesto la posible
presencia de C. perfringens, al producirse cido Sulfhdrico que se combina con el hierro presente en el caldo, originando
Sulfuro de Hierro que es de color negro. Realice la lectura de los tubos que se observan ennegrecidos y confronte los
resultados con la Tabla del NMP.
Prueba Confirmativa.
- De los tubos que a las 48 horas presenten ennegrecimiento, remueva la capa de parafina (vaselina o aceite mineral), y con
una pipeta estril, proceda a sembrar 1mL de cada tubo en una placa de Petri, a la cual posteriormente adicionar agar SPS,
OPSP u otro medio para Clostridios, fundido. Incube en condiciones de anaerobiosis a 43 2C / 24-48h, realizando una
primera lectura a las 24 horas.
Prueba Final.
Contine al igual que el procedimiento de siembra en placa profunda.
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Modificaciones a la metodologa. Una modificacin a la tcnica consiste en tratar trmicamente todos los tubos sembrados,
antes de incubarlos, a una temperatura de 60C por 30 minutos e incubarlos a 30C por mnimo 7 das. Aqu la mayora de los
cultivos positivos se pueden observar al cabo de 3 o 4 das. Las observaciones posteriores debern prolongarse hasta cuatro
semanas, porque la germinacin de las esporas puede tardar mucho tiempo. La identificacin se debe continuar con otros
exmenes.
Con el fin de asegurar un poco ms los resultados en el recuento en placa, se pueden someter las diluciones a un choque trmico
a 60C/15 min., para destruir formas vegetativas y pre-activar formas esporuladas. A continuacin, se siembra en profundidad y se
incuba en las condiciones anteriormente mencionadas. Las colonias formadas posteriores a este proceso, son originadas por las
formas esporuladas anaerobias; se realizan confirmaciones morfolgicas, reaccin de Gram y pruebas bioqumicas, para descartar
otras especies de Clostridium o de bacterias termorresistentes facultativas.
Resultados.
Recuento en Placa Profunda. Para informar tenga en cuenta los resultados de las pruebas bioqumicas y tenga en cuenta para el
informe, aplicar el factor de correccin utilizado para S. aureus.
a donde,
N = ________________________
V (n1 + (0.1*n2)) d
N: Nmero total de UFC de Clostridium perfringens por gramo o mililitro de la muestra.

a: Sumatoria del nmero de colonias tpicas en cada caja examinada.
V: Volumen de muestra inoculada
n1: Nmero de cajas retenidas en la primera dilucin.
n2: Nmero de cajas retenidas en la segunda dilucin.
d: Factor de dilucin de la primera dilucin empleada en el recuento.
b
a= * C, donde:
A
b: Nmero de colonias identificadas como positivas de acuerdo al criterio microbiolgico.

A: Nmero de colonias examinadas.
C: Nmero de colonias contadas en cada una de las cajas retenidas.
Nmero Ms Probable. Para el NMP tenga en cuenta los tubos positivos (presuntivo), colonias tpicas en medios slidos
(confirmativo), y el resultado de las pruebas bioqumicas (final). Reporte los resultados remitindose a la Tabla del NMP y exprese
como: Grmenes Clostridium perfringens/g.
NOTA: No olvide que para el anlisis de esporas de Clostridium sulfito reductores (E.C.S.R.), debe contar con jarras de
anaerobiosis, sistemas de anaerobiosis e indicadores de atmsfera (indicadores de anaerobiosis); as como, los reactivos
reveladores de las pruebas que se presenten en los medios de cultivo utilizados.
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CONSULTA.
Zymomonas spp., solo se encuentra implicada ocasionalmente en la alteracin de los refrescos, pero puede ser difcil la
eliminacin de la planta contaminada por este microorganismo. Si Usted es el responsable de la planta de proceso de la empresa
de jugos Jugos S.A, que protocolo implantara en el laboratorio, mediante el cual pueda detectar este microorganismo. Describa
paso a paso su aislamiento, los medios utilizados, la composicin de los mismos y las reacciones tpicas que se observaran en
estos medios cuando el microorganismo est presente. Posterior a la presuntividad del microorganismo, mencione sus reacciones
bioqumicas tpicas y la posible identificacin serolgica.
BIBLIOGRAFA.
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ANEXO A. Fases en la produccin de bebidas gaseosas.
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CURSO DE MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS VERSIN
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Anexo B. Criterios microbiolgicos para algunas bebidas refrescantes, Hidratantes y Carbonatadas.
Anlisis de rutina Anlisis especiales y/o espordicos

Producto Norma
Aerobios Mohos y S. aureus
Coliformes E. coli E.C.S.R Salmonella sp. Otros
Mesfilos Levaduras coag (+)
Bebida diettica a base de jugo de frutas MS. Res. 11488/84 5000 - 7000 <3 <3 100 - 200 -- < 10 -- --
Bebida diettica carbonatada MS. Res. 11488/84 50 - 100 <3 <3 <10 -- <10 -- --
Bebida hidratante energtica MS. Res. 02229/94 100 <3 <3 <10 -- <10 -- --
Bebida hidratante energtica en polvo MS. Res. 02229/94 <10 <3 <3 <10 -- <10 -- --
Nctares y refrescos de >30 das de
MS Res. 07992/91 100 - 300 <3 <3 10 - 100 -- <10 -- --
duracin
Nctares y refrescos de 30 das mx. de
MS Res. 07992/91 1000 - 3000 9 - 29 <3 100 - 200 -- <10 -- --
duracin
Refrescos INS <30000 11 <3 <300 -- <10 -- --
Gaseosas INS 100 <3 <3 <10 -- <10 -- --
Jugo de tomate MS. Res. 15789/84 100 - 300 3 3 20 - 50 -- <10 -- --
Jugos y pulpas pasterizados MS Res. 07992/91 1000 - 3000 <3 <3 100 - 200 -- <10 -- --
Jugos y pulpas Ultrapasterizados MS Res. 07992/91 100 - 300 <3 <3 <10 -- <10 -- --
Jugos-pulpas concentrados congelados no
MS Res. 07992/91 20000/50000 9 - 29 <3 1000 - 3000 -- <10 -- --
pasterizados
FECHA DE
Enero de 2011
PRCTICA N 2
PGINA 12
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE
Clostridium perfringens
VERSIN
CURSO DE MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS 2
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
Anexo C. Composicin de algunos medios de cultivo y reactivos utilizados para el anlisis de E.C.S.R.
Agar Triptona Sulfito Neomicina (TSN). Agar Triptosa Cicloserina con Yema de huevo
(TSCY).
SUSTANCIA CANTIDAD SUSTANCIA CANTIDAD

Peptona de Casena 15 g Triptosa 15 g
Extracto de Levadura 10 g Soja 5g
Sulfito Sdico 1g Extracto de levadura 5g
Citrato de Hierro 0.50 g Metabisulfito Sdico 1g
Sulfato de Polimixina B 0.02 g Citrato Frrico Amnico 1g
Sulfato de Neomicina 0.05 g Agar 20 g
Agar 14 g Agua destilada 1000 mL
Agua destilada 1000 mL
Disolver por calentamiento y agitacin, ajustar pH hasta 7.6
0.1, esterilizar en autoclave 10 min. a 121C. Atemperar a
Disolver por calentamiento y agitacin, ajustar pH hasta 7.2 50C y aadir por cada 90 ml., de medio 4 ml., de solucin
0.2, esterilizar en autoclave 10 min. a 121C. Servir las acuosa de D-Cicloserina al 1% y 6 ml., de emulsin de yema
placas de Petri y utilizarlas el mismo da de su preparacin. de huevo, homogenizar y servir las placas de petri.
Agar Sulfito Polimixina Sulfadiazina (SPS).

Agar Reforzado para Clostridium con Neomicina (RCM).
SUSTANCIA CANTIDAD
Peptona de Casena 15 g
SUSTANCIA CANTIDAD Extracto de levadura 10 g
Extracto de levadura 3g Citrato de Hierro III 0.5 g
Extracto de carne 10 g Sulfito Sdico 0.5 g
Peptona 10 g Polimixina B Sulfato 0.01 g
Dextrosa 5g Sulfadiazina Sdica 0.12 g
Almidn Soluble 1g Agar 13.9 g
NaCl 5g Agua destilada 1000 mL
Acetato Sdico 3g
Clorhidrato de Cistena 0.50 g Disolver y esterilizar 15 min. a 121C. El medio de cultivo
Agar 15 g se mezcla con el material de ensayo y posterior a esto se
Agua destilada 1000 mL vierte en las placas de Petri.
Medio de Cultivo Tioglicolato.

Disolver por calentamiento hasta ebullicin, ajustar pH hasta
7.0 0.1, esterilizar en autoclave 15 min. a 121C. Enfriar a SUSTANCIA CANTIDAD
50C y aadir por cada 10 ml., de medio 0.25 ml., de Peptona de Casena 15 g
solucin acuosa de Sulfato de Neomicina (5.7 gr. de Extracto de levadura 5g
Neomicina por litro, que equivalen a 100 g de Sulfato de D(+)-Glucosa 5.5 g
Neomicina activa por mililitro). Tambin se puede preparar L(+)-Cistena 0.5 g
el medio DRCM que es un Caldo Diferencial reforzado para NaCl 2.5 g
Clostridios. Tioglicolato Sdico 0.5 g
Resazurina Sdica 0.001 g
Agar 0.75 g
FECHA DE
Enero de 2011
PRCTICA N 2
PGINA 13
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE
Clostridium perfringens
VERSIN
CURSO DE MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS 2
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
Disolver el medio de cultivo y esterilizar en autoclave por 15

min a 121C. El medio se utiliza cuando no presenta color
rosa, debido a la presencia de oxgeno en el, para lo cual se
somete a una sola ebullicin.
Solucin de Tioglicolato Sdico.
SUSTANCIA CANTIDAD
Tioglicolato Sdico 12 g
Esterilizar por filtracin.
Caldo Fermentacin Lactosa (FL).
SUSTANCIA CANTIDAD
Triptona 15 g
Extracto de levadura 10 g
Lactosa 10 g
Fosfato Disdico 5g
Solucin acuosa Rojo de Fenol 0.51 g
Agar 3g
Disolver todos los ingredientes, excepto la lactosa y el rojo

de fenol; ajustar el pH a 7.5 0.1. Aadir la lactosa y el
indicador, distribuir en tubos con campana Durham y
esterilizar 15 min a 121C.
FECHA DE
Enero de 2011

D. Práctica 4 Bebidas Refrescantes - Hidratantes - Carbonatadas

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D. Práctica 4 Bebidas Refrescantes - Hidratantes - Carbonatadas

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PRCTICA N 4

Tabla 1. Productos clasificados como bebidas refrescantes.

- Su bajo pH (3.0 4.0).

- Que son capaces de soportar su bajo pH y replicarse en estas condiciones,

- La mayora no soportan un pH bajo,

Presencia de microorganismos patgenos.

- La presin del sistema.

- La temperatura del lquido.

Tabla 2. Ingredientes y algunos ejemplos para los refrescos carbonatados.

Preparados en polvo para hacer refrescos.

Bebidas deportivas, bebidas enriquecidas y Neutraceuticals.

Garanta y Control de Calidad.

- Stomacher o licuadora que permita una buena homogenizacin.

- Frascos con diluyente (agua peptona 0.1% estril).

Tcnica de Siembra en Placa Profunda para el recuento de E.C.S.R.

- Prepare diluciones iguales a 10-1, 10-2 y 10-3 a partir de la muestra.

Prueba de confirmacin de las colonias para Clostridium perfringens.

Tcnica del Nmero Ms Probable.

Contine al igual que el procedimiento de siembra en placa profunda.

N: Nmero total de UFC de Clostridium perfringens por gramo o mililitro de la muestra.

b: Nmero de colonias identificadas como positivas de acuerdo al criterio microbiolgico.

INSTITUTO COLOMBIANO DE NORMAS TCNICAS Y CERTIFICACIN. Bebidas no alcohlicas. Bebidas Gaseosas o

INSTITUTO COLOMBIANO DE NORMAS TCNICAS Y CERTIFICACIN. Microbiologa de Alimentos y productos para

Manual de Medios de Cultivo Merck. Editorial Merck Alemana. 1994.

ANEXO A. Fases en la produccin de bebidas gaseosas.

Anexo B. Criterios microbiolgicos para algunas bebidas refrescantes, Hidratantes y Carbonatadas.

Anlisis de rutina Anlisis especiales y/o espordicos

SUSTANCIA CANTIDAD SUSTANCIA CANTIDAD

Agar Sulfito Polimixina Sulfadiazina (SPS).

Medio de Cultivo Tioglicolato.

Disolver el medio de cultivo y esterilizar en autoclave por 15

Solucin de Tioglicolato Sdico.

Esterilizar por filtracin.

Caldo Fermentacin Lactosa (FL).

Disolver todos los ingredientes, excepto la lactosa y el rojo

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