PRUEBAS MICROBIOLGICAS: Esterilidad, recuento y ausencia de patgenos

Si existe la posibilidad de que la muestra este contaminada por microorganismos tal

como micobacterias.
tratar con una solucion de descontaminacion adecuada como acetilcisteina-Hidroxido
de Sodio o una solucion de Lauril sulfato de sodio
Inocular 0,2 ml de la mestra por triplicado en cada uno de los 2 medios solidos
adecuados.
inocular 0,5 ml en triplicado en un medio liquido adecuado.
incubar todos los medios a 37C durante 56 dias
establecer un medio fertil en presencia de una cepa de Mycobacterium sp. TAL COMO
BCG y su es necesario utilizar una sustancia neutralizate adecuada.
si se desarrollan microorganismos contaminantes durante los primeros 8 dias de
incubacion repetir prueba y llevar a cabo una prueba de esterilidad bacteriologica
si al final del tiempo de incubacin no se produce crecimiento de micobacterias en
ninguno de los medio de ensayo, la preparacin cumple con la prueba.

http://www.bd.com/resource.aspx?IDX=8796
http://www.britanialab.com/productos/576_hoja_tecnica_es.pdf
http://www.davislab.cl/pdf/industria_farmaceutica_analisis_microbiologico.pdf

Cuando se prescribe la prueba de micoplasmas para un banco de clulas maestras, para un banco de
clulas de trabajo, para un lote de semillas de virus o para clulas de control, se utilizan tanto el mtodo de
cultivo como el mtodo de cultivo de clulas indicador. Cuando se prescribe la prueba de micoplasmas
para una cosecha de virus, para una vacuna a granel o para el lote final (lote), se utiliza el mtodo de
cultivo. El mtodo de cultivo de clulas indicador tambin puede usarse, cuando sea necesario, para la
seleccin de medios. Las tcnicas de amplificacin de cidos nucleicos (NAT) pueden usarse como
alternativa a uno o ambos de los otros mtodos despus de una validacin adecuada.
MTODO DE LA CULTURA
ELECCIN DE LOS MEDIOS DE CULTURA
El ensayo se lleva a cabo utilizando un nmero suficiente de medios slidos y lquidos para asegurar el
crecimiento en las condiciones de incubacin elegidas de un nmero pequeo de micoplasmas que
pueden estar presentes en el producto a examinar. Los medios lquidos deben contener rojo de fenol. Se
demuestra que la gama de medios elegidos tiene propiedades nutritivas satisfactorias para al menos los
microorganismos mostrados a continuacin. Las propiedades nutritivas de cada nuevo lote de medio se
verifican para los microorganismos apropiados en la lista. Cuando se realizan pruebas de micoplasmas en
el producto a examinar, al menos 1 de las siguientes especies se incluir como control positivo:
- Acholeplasma laidlawii (vacunas de uso humano y veterinario en las que se ha utilizado un antibitico
durante la produccin);
- Mycoplasma gallisepticum (donde se ha utilizado material aviar durante la produccin o cuando la vacuna
est destinada a ser utilizada en aves de corral);
- Mycoplasma hyorhinis (vacunas veterinarias no aviarias);
- Mycoplasma orale (vacunas para uso humano y veterinario);
- Mycoplasma pneumoniae (vacunas para uso humano) u otras especies adecuadas de fermentador de
D-glucosa tales como Mycoplasma fermentans;
- Mycoplasma synoviae (donde se ha utilizado material aviar durante la produccin o cuando la vacuna
est destinada a ser utilizada en aves de corral).
Las cepas de ensayo son aislamientos de campo que han sufrido un nmero limitado de subcultivos (no
ms de 15) y se almacenan congeladas o liofilizadas. Despus de la clonacin, las cepas se identifican
como de las especies requeridas en comparacin con los cultivos tipo, por ejemplo:
A. laidlawii NCTC 10116 CIP 75,27 ATCC 23206
M. gallisepticum NCTC 10115 CIP 104967 ATCC 19610
M. fermentans NCTC 10117 CIP 105680 ATCC 19989
M. hyorhinis NCTC 10130 CIP 104968 ATCC 17981
M. orale NCTC 10112 CIP 104969 ATCC 23714
M. pneumoniae NCTC 10119 CIP 103766 ATCC 15531
M. synoviae NCTC 10124 CIP 104970 ATCC 25204

Acholeplasma laidlawii BRP, Mycoplasma fermentans BRP, Mycoplasma hyorhinis BRP, Mycoplasma
orale BRP y Mycoplasma synoviae BRP son adecuados para su uso como cepas de referencia de bajo
paso.
CONDICIONES DE INCUBACIN
Incubar los medios lquidos en recipientes hermticamente taponados a 35-38 C. Incubar medios slidos
en condiciones microaeroflicas (nitrgeno que contiene 5-10 por ciento de dixido de carbono y suficiente
humedad para prevenir la desecacin de la superficie del agar) a 35-38 C.

PROPIEDADES NUTRITIVAS
Realizar la prueba de propiedades nutritivas para cada nuevo lote de medio. Inocular el medio elegido con
los microorganismos de ensayo apropiados; utilizar no ms de 100 CFU (unidades formadoras de
colonias) por placa de 60 mm de dimetro que contenga 9 ml de medio slido y por cada recipiente de 100
ml de medio lquido; utilice una placa y un recipiente separados para cada especie de microorganismo.
Incubar los medios y hacer subcultivos de 0,2 ml de medio lquido a medio slido a los intervalos
especificados (ver ms abajo en Prueba de micoplasmas en el producto a examinar). El medio slido
cumple con el ensayo si se encuentra un crecimiento adecuado para cada microorganismo de ensayo (el
crecimiento obtenido no difiere en un factor mayor de 5 del valor calculado con respecto al inculo). El
medio lquido cumple con el ensayo si se encuentra crecimiento en placas de agar subcultivadas del caldo
para al menos 1 subcultivo para cada microorganismo de ensayo.

SUSTANCIAS INHIBIDORAS
El ensayo de sustancias inhibidoras se realiza una vez para un producto dado y se repite cada vez que se
produce un cambio en el mtodo de produccin que pueda afectar a la deteccin de micoplasmas.
Para demostrar la ausencia de sustancias inhibidoras, llevar a cabo la prueba de propiedades nutritivas en
presencia y ausencia del producto a examinar. Si el crecimiento de un microorganismo de ensayo se
produce ms de 1 subcultivo antes en ausencia del producto a examinar que en su presencia o si las
placas inoculadas directamente con el producto a examinar tienen menos de 1/5 del nmero de colonias
de los inoculados sin el producto a examinar, estn presentes sustancias inhibidoras y deben neutralizarse
o neutralizarse su efecto, por ejemplo por paso en sustratos que no contengan inhibidores o dilucin en un
volumen mayor de medio antes del ensayo. Si se usa dilucin, se pueden usar volmenes de medio ms
grandes o el volumen de inculo se puede dividir entre varios matraces de 100 ml. La eficacia de la
neutralizacin u otro proceso se comprueba repitiendo el ensayo de sustancias inhibidoras despus de la
neutralizacin.

PRUEBA DE MYCOPLASMAS EN EL PRODUCTO A EXAMINAR

Inocular 10 ml del producto a examinar por 100 ml de cada medio lquido. Si se ha comprobado que se
produce un cambio de pH significativo tras la adicin del producto a examinar, el medio lquido se restaura
a su valor de pH original mediante la adicin de una solucin de hidrxido sdico o cido clorhdrico.
Inocular 0,2 ml del producto a examinar en cada placa de cada medio slido. Incubar medios lquidos
durante 20-21 das. Incubar medios slidos durante no menos de 14 das, excepto los correspondientes a
la subcultura de 20-21 das, que se incuban durante 7 das. Al mismo tiempo, incubar una porcin no
inoculada de 100 ml de cada medio lquido y placas de agar, como un control negativo. En los das 2-4
despus de la inoculacin, subculture cada medio lquido inoculando 0,2 ml en al menos 1 placa de cada
medio slido. Repita el procedimiento entre los das 6 y 8, de nuevo entre los das 13 y 15 y de nuevo
entre los das 19 y 21 de la prueba. Observe los medios lquidos cada 2 o 3 das y si ocurre un cambio de
color, subculture. Si un medio lquido muestra contaminacin bacteriana o fngica, la prueba no es vlida.
La prueba es vlida si se puede leer al menos 1 placa por medio y por da de inoculacin. Incluir en los
controles positivos de prueba preparados por inoculacin de no ms de 100 CFU de al menos 1
microorganismo de ensayo en medio de agar o en medio de caldo. Cuando la prueba de micoplasmas se
realice con regularidad y cuando sea posible, se recomienda utilizar los microorganismos de prueba en
rotacin regular. Los microorganismos de ensayo utilizados son los que se enumeran en la seccin
Eleccin de los medios de cultivo.

INTERPRETACIN DE RESULTADOS
Al final del perodo de incubacin prescrito, examinar todos los medios slidos inoculados
microscpicamente para la presencia de colonias de mycoplasma. El producto cumple con la prueba si no
se ha producido el crecimiento de colonias tpicas de micoplasma. El producto no cumple con la prueba si
el crecimiento de colonias tpicas de micoplasma ha ocurrido en cualquiera de los medios slidos. La
prueba no es vlida si uno o ms de los controles positivos no muestran crecimiento de micoplasmas en al
menos una placa de subcultivo. La prueba no es vlida si uno o ms de los controles negativos muestran
un crecimiento de micoplasmas. Si se observan colonias sospechosas, se puede usar un mtodo validado
adecuado para determinar si se deben a micoplasmas.