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ACTIVIDAD BIOLGICA DE PPTIDOS ANTIMICROBIANOS DIRIGIDO A

MEMBRANAS PLASMTICAS DE E. coli

ANDREA CAMACHO FORERO

JORGE GARCIA MOMPOTES

ALEJANDRA HURTADO GALLO

UNIVERSIDAD SANTIAGO DE CALI

PROGRAMA DE QUMICA

FACULTAD CIENCIAS BSICAS

CALI

2017
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ACTIVIDAD BIOLGICA DE PPTIDOS ANTIMICROBIANOS DIRIGIDO A

MEMBRANAS PLASMTICAS DE E. coli

ANDREA CAMACHO FORERO

JORGE GARCIA MOMPOTES

ALEJANDRA HURTADO GALLO

TUTOR

AURA FALCO

BIOLOGA MOLECULAR

UNIVERSIDAD SANTIAGO DE CALI

PROGRAMA DE QUMICA

FACULTAD CIENCIAS BSICAS

CALI

2017
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Tabla de Contenido
Tabla de Contenido ....................................................................................................................................... 3
1. Introduccin .......................................................................................................................................... 4
2. Planteamiento del problema ................................................................................................................ 6
3. Justificacin ........................................................................................................................................... 7
4. Estado del arte ...................................................................................................................................... 8
5. Objetivos ............................................................................................................................................. 10
6. Marco terico ...................................................................................................................................... 11
7. Metodologa ........................................................................................................................................ 14
8. Conclusiones........................................................................................................................................ 16
9. Recomendaciones ............................................................................................................................... 17
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1. Introduccin

La resistencia a los antibiticos es la capacidad de sobrevivir de un microorganismo

frente a los efectos de un antibitico. Esta resistencia resulta en la imposibilidad del
husped para controlar y erradicar el agente patgeno, aumentando la morbilidad de los
pacientes por enfermedades infecciosas (Guillemot, 1999). A pesar de numerosos esfuerzos
por parte de la comunidad cientfica en las ltimas dcadas, se ha notado una disminucin
en la generacin de nuevos antibiticos, lo cual se ha sumado a un rpido avance de la
multirresistencia. Para combatir la lamentable asociacin que existe actualmente entre la
resistencia por parte de los microorganismos y la ausencia de antibiticos eficaces en
combatir las infecciones, surge la necesidad de estudiar nuevas molculas con potencial
accin antimicrobiana y con la capacidad de eliminar un amplio espectro de
microorganismos. Estudios recientes han demostrado que los pptidos producidos de
manera natural por diversos organismos cumplen con estas caractersticas (Martinez, 2009).

Se ha establecido que tanto plantas como animales producen molculas efectoras de la

inmunidad innata tales como pptidos antimicrobianos (PAMs), los cuales actan como un
mecanismo de defensa natural contra los patgenos (Gordon et al., 2005). Se sabe que los
PAMs interactan y alteran las membranas microbianas pero existe un conocimiento
limitado acerca del mecanismo por el cual ejercen su accin antimicrobiana (Papo and Shai,
2003). Estos pptidos son relativamente pequeos (<10 kDa), con diversas estructuras y
secuencias de aminocidos, siendo la mayora de estos, anfipticos y de naturaleza
catinica (Powers and Hancock, 2003b). Estas caractersticas estructurales modulan la
interaccin con la membrana celular aninica de los microorganismos, alterando su
estructura e integridad y en consecuencia, causando la muerte del microorganismo
(Teixeira et al., 2012).

La potencia de los PAMs para matar patgenos es similar a la de algunos antibiticos

convencionales, sin embargo, una de sus mayores fortalezas es la habilidad que tienen para
eliminar bacterias resistentes a mltiples drogas (Marr et al., 2006). Por ejemplo, los PAMs
podran utilizarse como alternativas para superar los sucesos de resistencia en Colombia y
Estados Unidos previamente mencionados; diferentes estudios han reportado que diferentes
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PAMs presentan actividad promisoria para el tratamiento de enfermedades (Steinberg et al.,

1997; Zhang et al., 2005). Este es el caso de la polimixina E utilizada para tratar
infecciones bacterianas en pacientes con fibrosis qustica, ya que presenta actividad
antimicrobiana contra E. coli y K. pneumoniae resistentes a -lactamasas (Kumarasamy et
al., 2010).

Investigaciones enfocadas en estudiar la relacin estructura-actividad de los PAMs, han

demostrado que el aumento de carga catinica en el extremo NH-terminal de la secuencia y
una composicin de residuos hidrofbicos de alrededor del 50%, son caractersticas
estructurales asociadas con una eficiente actividad antimicrobiana (Chen et al., 2007;
Powers and Hancock, 2003a). Por lo tanto, numerosas investigaciones se basan actualmente
en la modificacin de secuencias naturales para obtener pptidos modificados.
Adicionalmente el estudio de sus mecanismos de accin asociados a las propiedades
antimicrobianas, proporcionan conocimiento clave para el diseo racional de nuevos
antibiticos de naturaleza peptdica, que tengan la capacidad de eliminar clulas bacterianas
sin afectar las clulas hospederas.

El propsito de este proyecto de investigacin es desarrollar y utilizar los PAMs

catinicos sintticos mediante el diseo computacional, con el fin de determinar si el
aumento de la carga en una secuencia, aumenta la actividad antimicrobiana y la interaccin
con las membranas, para generar pptidos antimicrobianos efectivos como alternativa de
control de infecciones causados por un agente bacteriano(Zangh L. et al., 2005).
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2. Planteamiento del problema

Los frmacos han perdido efectividad ante bacterias gram negativas, (E. coli), ya que la
exposicin prolongada de algunos medicamentos han producido mutantes resistentes.
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3. Justificacin

Actualmente algunas bacterias gram negativas, como la E. coli, han desarrollado cierta
resistencia a algunos frmacos debido a que estos sufren mutaciones que les confiere mayor
adaptabilidad. por ende, se plantea un modelo modificado del pptido antimicrobiano en el
alitezerin 1C, mediante qumica computacional.

La mejora de la actividad del frmaco sobre la membrana bacteriana, permitir incrementar

las cargas catinicas, fortaleciendo la interaccin electrosttica y as generando lisis celular
por choque osmtico. La eficacia de la modificacin de la membrana permitir
contrarrestar las infecciones adquiridas por la exposicin prolongada a fuentes altamente
contaminantes de tipo bacteriano
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4. Estado del arte

- Bacterias. Las bacterias son organismos unicelulares procariontes, esto

quiere decir que estn formados por una sola clula carente de ncleo. Su
cido desoxirribonucleico (ADN) se encuentra libre en el citoplasma y no
tienen organelos, como las mitocondrias, cloroplastos o aparato de Golgi. A
pesar de su sencilla organizacin celular, cuentan con una pared celular
(capa de polisacridos) que envuelve la clula proporcionndole rigidez y
proteccin. Son tan pequeas que es imposible verlas a simple vista,
solamente cuando llegan a agruparse formando colonias es cuando las
podemos reconocer. (Audesirk G., T. Audesirk y B.E. Byers. 2003.
Biologa: la vida en la Tierra. Prentice Hall, 889 pp.)

- Frmacos antimicrobianos. son frmacos utilizados para tratar una

infeccin microbiana, Los antimicrobianos actuales, derivados
principalmente de fuentes naturales, inhiben procesos celulares, tales como
la biosntesis de la pared celular, la replicacin del ADN, y sntesis de
protenas.

- Pptido - membrana. Los pptidos antimicrobianos son las molculas

efectoras del sistema inmune innato, cuyas familias se encuentran en casi
todos los organismos, desde bacterias hasta mamferos. Son una familia de
sustancias polifacticas con complejos mecanismos de accin relacionados
con la interaccin con el patgeno a travs de su membrana, o afectando
blancos internos, como la replicacin del ADN y la sntesis de protenas.

- Patrones Moleculares asociados a patgenos o PAMPs

En patgenos se pueden encontrar una serie de cadenas o secuencias las
cuales permiten ser reconocidas mediante receptores de reconocimiento de
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patron o PRRs, Bsicamente son los activadores clsicos de las respuestas

inmunes. (Vidhyasekaran P. (2014).)
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5. Objetivos

Objetivos

Objetivo general

Evaluar el potencial antimicrobiano del pptido aliteserin 1C y su interaccin molecular

con membranas fosfolipdicas

Objetivos Especficos

- Estudiar el efecto peptdico sobre las vibraciones de grupos funcionales presentes en

las membranas fosfolipdicas.
- Evaluar el efecto citotxico del pptido sobre bacterias y eritrocitos humanos
respectivamente.
- Relacionar la afinidad, la interacciones y la trayectoria en estructuras peptdicas
modificadas y no modificadas sobre membranas fosfolipdicas en E.Coli
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6. Marco terico

Jacek T. Mika & Gemma Moiset, (Jacek T. , Gemma , Anna D, & Feliu, 2011),
Realizaron de forma iterativa simulaciones de dinmica molecular atomstica y
mediciones biofsicas para Interaccin de un pptido antimicrobiano cclico y su
anlogo lineal inactivo con membranas modelo. Establecieron que, en relacin con
el pptido lineal, el cclico se une ms fuerte a las membranas cargadas
negativamente. Es su estudio crearon un modelo de caracterizacin del modo de
accin de los pptidos antimicrobianos cclicos. Los resultados proporcionan una
justificacin actividad aumentada en ciertos pptidos antimicrobianos cclicos y se
puede usar como una gua para el diseo de Pptidos antimicrobianos.

Por otro lado, Nils A. Berglund & Thomas J. Piggot, ( Berglund, Piggot, Jefferies,
& Sessions, 2015), enfatizaron su estudio en inducir la lisis de clulas bacterianas
Mediante la interaccin con sus membranas. Tomando en cuenta el papel de la
composicin qumica de la Membrana, que difiere entre las especies bacterianas y
puede ser heterognea incluso dentro Una sola clula. Adems, en su anlisis de las
bacterias Gram-negativas tales como E. coli, donde dichas bacterias contienen dos
membranas con composiciones diferentes, para disear la primera dinmica
molecular Simulacin de la interaccin del pptido antimicrobiano, la polimixina
B1 con Complejos de membranas tanto internas como externas de E. coli. En sus
resultados obtenidos de> 16 microsegundos De simulacin predice que la
polimixina B1 es probable que interacte con las membranas va mecanismos
distintos. El agregado de lipopptidos en la regin del grupo de cabeza
lipopolisacrido de la membrana externa con una tendencia limitada a la insercin
dentro de las colas del lpido A.

A diferencia de los lipopptidos se insertan fcilmente en el ncleo de la membrana

interna, y la concomitante. Concluyendo que el aumento de la hidratacin puede ser
responsable de la desestabilizacin bicapa y de la funcin antimicrobiana y
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Revelando detalles mecnicos clave que pueden ser explotados para el futuro
desarrollo racional de frmacos.

En otros estudios, Yukun Wang & Tangzheng Zhao, (Wang, Zhao, Wei, &
Strandbergc, 2014), Investigaron la confiabilidad de la utilizacin simulaciones de
la dinmica molecular (MD), para explicar los pptidos antimicrobianos. Los
requisitos y limitaciones de la ejecucin de los DM para varios PAMs, entre los
ms comunes: PGLa, melitina, maculatina y BP100. Sus hallazgos en dicho estudio
fueron: (a) los resultados de la simulacin dependen fuertemente de los parmetros
del campo de fuerza, haciendo experimentalmente la Verificacin de las
simulaciones obligatorias, y (b) la generacin fluctuaciones orientativas y
conformacionales lentas, las cuales Significan que se necesitan perodos de
muestreo mucho ms largos (multi-s). Este artculo de Yukun Wang & Tangzheng
Zhao, forma parte de un nmero especial titulado Interfacially Active Pptidos y
Protenas.

En los estudios con respecto al mtodo de dinmica molecular fue introducido por
primera vez por Alder y Wainwright a finales de 1950 (Alder y Wainwright, 1957,
1959) para estudiar las interacciones de esferas duras. Muchos estudios importantes
sobre el comportamiento de los lquidos simples surgieron de sus estudios. El
siguiente gran avance fue en 1964, cuando Rahman llev a cabo la primera
simulacin utilizando un potencial realista para el argn lquido (Rahman, 1964). La
primera simulacin de dinmica molecular de un sistema realista fue realizada por
Rahman y Stillinger en su simulacin de agua lquida en 1974 (Stillinger y Rahman,
1974). Las primeras simulaciones de protenas aparecieron en 1977 con la
simulacin del inhibidor de la tripsina pancretica bovina (BPTI) (McCammon, et al
, 1977). Hoy en da en la literatura, uno rutinariamente encuentra simulaciones de
dinmica molecular de protenas solvatadas, complejos de protena-ADN, as como
sistemas de lpidos que abordan una variedad de cuestiones incluyendo la
termodinmica de la unin de ligando y el plegamiento de protenas pequeas. El
nmero de tcnicas de simulacin ha aumentado considerablemente; Existen ahora
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muchas tcnicas especializadas para problemas particulares, incluyendo

simulaciones mixtas mecnicas cunticas, que se estn empleando para estudiar
reacciones enzimticas en el contexto de la protena completa. (Alder, BJ y
Wainwright, TE J. Chem. Phys. 27 , 1208 (1957); Alder, BJ y Wainwright, TE J.
Chem. Phys. 31 , 459 (1959); Rahman, A. Phys. Rev. A136 , 405 (1964); Stillinger,
FH y Rahman, A. J. Chem. Phys. 60 , 1545 (1974); McCammon, JA, Gelin, BR y
Karplus, M. Nature (Lond.) 267 , 585 (1977)) (http://www.ch.embnet.org/)
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7. Metodologa

Mtodo de dinmica molecular (DM): Se utilizara el programa VMD

membrana, para realizar estructura 3D de la membrana de la bacteria y pptido. Por
otro lado, se usara el modulo, Leap de Amber 9 y software GROMACS, para
realizar la interaccin de la membrana de la bacteria con la pptido-membrana
alyteserin 1C modificando su carga.

Mtodo para la sntesis de pptidos: se utilizara un sintetizador automtico de

pptidos ABI 433A Peptide Synthesizer, marca Thermo Fisher Scientific, utilizando
cloruro de fluorometiloxicarbonilo (Fmoc) por sntesis en fase slida (Merrifield,
1986). La desproteccin se realizar utilizando DMF (dimetilformamida)
continuando con piperidina en DMF y el desacople se har con el uso de una mezcla
de cido trifloro actico (TFA)/agua (8,5/1,5; v/v) a temperatura ambiente.

Mtodo para la actividad antimicrobiana del pptido: se realizar ensayos de

segn la metodologa desarrollada por Wiegand, I., Hilpert, K., y Hancock, R.E.
(2008). Mtodos de dilucin de agar y caldo para determinar la concentracin
inhibitoria mnima (MIC) de las sustancias antimicrobianas. Esta metodologa se
aplicara con algunas modificaciones con el fin de incrementar la seal de respuesta.
Cada bacteria se inocula en caldo nutritivo y se incuba a 37C durante toda la
noche. Luego, el cultivo se llevar a una concentracin Aprox. 5 x 105 UFC/mL.
Posteriormente, 90L de cultivo bacteriano se incubarn por entre 18 a 20 h a 37C
con 10 L de pptido a diferentes diluciones. Posterior a la incubacin, se
determinar la turbidez de cada muestra en un plato de 96 pozos con una 625nm
usando un espectrofotmetro Multiskan Go (Thermo Fisher Scientific), con el fin de
obtener la concentracin mnima inhibitoria (CMI) y as obtener la concentracin de
antibitico en la inhibicin del crecimiento bacteriano.

Mtodo para la medicion de interacion pptido- lpido por IR: las vesculas
multilaminares (MLVs), en presencia y ausencia de pptidos sern colocadas sobre
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un cristal de reflexin total atenuada (ATR) de selenuro de Zinc (ZnSe) y despus el

agua se evaporar bajo corriente de nitrgeno (N2(g)). Se identificara las Bandas
vibracionales de la regin interfacial (1700-1750 cm-1), amida I (1600-1700 cm-1)
y grupos cabeza polares (1000-1300 cm-1) y sern analizadas para estudiar las
interacciones pptido-membrana a nivel molecular. El equipo utilizado en el analisis
de las muestras ser en un espectrofotmetro de infrarrojo Bruker Tensor 27 bajo
temperatura ambiente. En cada medicin se recolectarn 256 interferogramas con
una resolucin nominal de 2 cm-1. Los datos sern procesados usando el software
OPUS (Bruker Optics, Germany).

Materiales:
Espectrofotmetro de infrarrojo Bruker Tensor 27
Espectrofotmetro Multiskan Go (Thermo Fisher Scientific
Sintetizador automtico de pptidos ABI 433A Peptide Synthesizer, marca
Thermo Fisher Scientific
Selenuro de Zinc
cloruro de fluorometiloxicarbonilo
dimetilformamida
piperidina
cido trifloro actico
Agua
Nitrgeno (gas)
Autoclave
otros[A2]
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8. Conclusiones

Manejo de texto Manejo de texto Manejo de texto Manejo de texto Manejo de

texto Manejo de texto Manejo de texto Manejo de texto Manejo de texto Manejo de
texto Manejo de texto Manejo de texto Manejo de texto Manejo de texto Manejo de
texto Manejo Manejo de texto Manejo de texto Manejo de texto Manejo de texto
Manejo de texto Manejo de texto Manejo de texto Manejo de texto Manejo de texto.
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9. Recomendaciones

Manejo de texto Manejo de texto Manejo de texto Manejo de texto Manejo de

texto Manejo de texto Manejo de texto Manejo de texto Manejo de texto Manejo de
texto Manejo de texto Manejo de texto Manejo de texto Manejo de texto Manejo de
texto Manejo de texto Manejo de texto Manejo de texto Manejo de texto Manejo de
texto Manejo de texto Manejo de texto Manejo de texto Manejo de texto Manejo de
texto Manejo de texto Manejo de texto Manejo de texto Manejo de texto Manejo de
texto.
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10. BILIOGRAFA

1-3Gordon, Y.J., Romanowski, E.G., and McDermott, A.M. (2005). A review of

antimicrobial peptides and their therapeutic potential as anti-infective drugs. Curr Eye Res
30, 505-515.

Guillemot, D. (1999). Antibiotic use in humans and bacterial resistance. Curr Opin
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2- Martinez, J.L. (2009). Environmental pollution by antibiotics and by antibiotic resistance

determinants. Environ Pollut 157, 2893-2902.

Martinez, J.L., Fajardo, A., Garmendia, L., Hernandez, A., Linares, J.F., MartnezSolano,
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4- Papo, N., and Shai, Y. (2003). Can we predict biological activity of antimicrobial
peptides from their interactions with model phospholipid membranes? Peptides 24, 1693-
1703.

Powers, J.-P.S., and Hancock, R.E. (2003a). The relationship between peptide structure and
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5-Teixeira, V., Feio, M.J., and Bastos, M. (2012). Role of lipids in the interaction of
antimicrobial peptides with membranes. Prog Lipid Res 51, 149-177.

6-Marr, A.K., Gooderham, W.J., and Hancock, R.E. (2006). Antibacterial peptides for
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Merrifield, B. (1986). Solid phase synthesis. Science 232, 341-347.

7-Steinberg, D.A., Hurst, M.A., Fujii, C.A., Kung, A.H., Ho, J.F., Cheng, F.C., Loury, D.J.,
and Fiddes, J.C. (1997). Protegrin-1: a broad-spectrum, rapidly microbicidal peptide with in
vivo activity. Antimicrob Agents Chemother 41, 1738-1742.
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8-Kumarasamy, K.K., Toleman, M.A., Walsh, T.R., Bagaria, J., Butt, F., Balakrishnan, R.,
Chaudhary, U., Doumith, M., Giske, C.G., Irfan, S., et al. (2010). Emergence of a new
antibiotic resistance mechanism in India, Pakistan, and the UK: a molecular, biological, and
epidemiological study. Lancet Infect Dis 10, 597-602.

9-Chen, Y., Guarnieri, M.T., Vasil, A.I., Vasil, M.L., Mant, C.T., and Hodges, R.S. (2007).
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10-Zhang, L., Parente, J., Harris, S.M., Woods, D.E., Hancock, R.E., and Falla, T.J. (2005).
Antimicrobial peptide therapeutics for cystic fibrosis. Antimicrob Agents Chemother 49,
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11- Audesirk G., T. Audesirk y B.E. Byers. (2003). Biologa: la vida en la Tierra. Prentice
Hall, 889 pp.

12- https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4824775/

13-http://www.scielo.org.co/pdf/inf/v14n1/v14n1a07.pdf
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0005273606000733

14- (Vidhyasekaran P. (2014). Springer. PAMP Signals in plant innate inmunity. Signal
perception and traduction) pag 23

14-http://www.ch.embnet.org/MD_tutorial/pages/MD.Part1.html

15-Jacek T. , M., Gemma , M., Anna D, C., & Feliu, L. (2011). Structural basis for the
enhanced activity of cyclic antimicrobial peptides: the case of BPC194. ELSEVIER, 2197-
2205.

16-Berglund, N., Piggot, T., Jefferies, D., & Sessions, R. (2015). Interaction of the
Antimicrobial Peptide Polymyxin B1 with Both Membranes of E. coli:A Molecular
Dynamics Study. PLOS Computational biology.

17-Wang, Y., Zhao, T., Wei, D., & Strandbergc, E. (2014). How reliable are molecular
dynamics simulations of membrane active antimicrobial peptides? ELSERVIE, 2280-2288.
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18-Alder, BJ y Wainwright, TE J. Chem. Phys. 27 , 1208 (1957); Alder, BJ y Wainwright,

TE J. Chem. Phys. 31 , 459 (1959); Rahman, A. Phys. Rev. A136 , 405 (1964); Stillinger,
FH y Rahman, A. J. Chem. Phys. 60 , 1545 (1974); McCammon, JA, Gelin, BR y Karplus,
M. Nature (Lond.) 267 , 585 (1977). http://www.ch.embnet.org/

Van Der Spoel, D., Lindahl, E., Hess, B., Groenhof, G., Mark, A.E., and Berendsen, H.J.
(2005). GROMACS: fast, flexible, and free. J Comput Chem 26, 1701-1718.

Wiegand, I., Hilpert, K., and Hancock, R.E. (2008). Agar and broth dilution methods to
determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat
Protoc 3, 163-175.

Yeaman, M.R., and Yount, N.Y. (2003). Mechanisms of antimicrobial peptide action and
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