CONTROL Microbiológico

Laboratorios Vetipharm S. R. L.
Jr. San Fernando 279 Urb. LINEA: VETIPHARM

Santa Luisa los Olivos, Lima Per
TCNICA DE ANLISIS
USP 40 26 de Junio del 2017
ENSAYO MICROBIOLOGICO PARA GRANELES, Pgina 1

PRODUCTO TERMINADO Y MATERIA PRIMA
Preparado por Yamila Alanoca ________________________
Aprobado por Nolbert Chavez _________________________

TCNICA DE ANLISIS

PREPARACIONES NO ACUOSAS PARA USO ORAL.

Recuento Total de microorganismos aerobios Menor a 103 UFC/g mL
Recuento Total combinado de Hongos Filamentosos Menor a 102 UFC/g mL
y Levaduras.
Ausencia de microorganismos especficos/g mL.
Escherichia Coli (1g 1mL.)
PREPARACIONES ACUOSAS PARA USO ORAL.

y Levaduras.
Escherichia Coli (1g 1mL.)
USO RECTAL.
y Levaduras.
USO OROMUCOSAL, GINGIVAL, CUTNEA, AURICULAR.

y Levaduras.
Escherichia Coli (1g mL.)
Stafilococus aureus (1g mL)
USO VAGINAL.
y Levaduras.
Escherichia Coli (1g mL.)
TCNICA DE ANLISIS

Stafilococus aureus (1g mL)

Candida albicans (1g 1mL)
PARA SUSTANCIAS NO ESTERILES PARA USO FARMACUTICO

y Levaduras.
TCNICA DE ANLISIS

REALIZACIN DEL ANLISIS

I. EQUIPO, MATERIALES DE LABORATORIO Y MEDIOS DE CULTIVO.
1. Equipos
Balanza de precisin, incubadora de 30C a 35C
TCNICA DE ANLISIS

Agar Mac Conkey

Agar Manitol Salado
Agar Boird Parker
Emulsion Yema de huevo telurito
Agar Cetrimide
Glicerol
Caldo roppaport Vassiliadis para enriquecimiento de salmonella
Caldo masell para Enriquecimiento de Enterobacterias
Caldo Sabouraud Glucosado
Agar VRBD
Test de Catalasa
Test de Oxidasa
Test de Coagulasa
Batera de coloracin Gram
Escala de Mac Fariand
*Solucin Amortiguadora de Peptona Cloruro de sodio Ph 7.0

Fosfato monobsico de potasio 3.6 g
Fosfato bibsico de sodio Dihidrato 7.2 g
Cloruro de sodio dihidratado 4.3 g
Peptona (de carne o casena) 1.0g
Agua purificada 1000ml
Ajustar el pH con hidrxido de sodio 1N o acido clorhdrico 1N para que despus de esterilizacin
sea de 7.0 +0.2 a 25C, Esterilizar en un autoclave utilizado un ciclo valiendo 121C x 15 minutos.
*Agar Digerido de Casena y soja (TSA)

Digerido pancretico de casina 15.0 g
Digerido Papainico de soja 5.0g
Cloruro de Sodio 5.0g
Agar 15.0g
sea de 7.3 +-0.2 o 25 .Esterilizar en un autoclave utilizado un ciclo validado 121C por 15 minutos
TCNICA DE ANLISIS

Caldo Digerido de Casena y Soya (CST)

Digerido pancretico de Casena 17,0g
Digerido pancretico de soja 5,0g
Cloruro de sodio 5,0g
Fosfato dibsico de potsio 2,5g
Glucosa monohidrato 2,5g
Agua Purificada 1000mL
Ajustar el pH con hidrxido de sodio 1N o cido clorhdrico 1N para que despus de esterilizacin
sea de 7,3 0,2 a 25C. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado 121C por 15
minutos.
Agar Sabouraud Dextrosa

Dextrosa 40,0g
Mezcla de digerido pptico de tejido 10,0g
Animal y digerido pancretico de
Casena (1:1)
Agar 15,0g
Agua purificada
sea de 5,6 0,2 0 25C. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado 121C por 15
minutos.
Agar Papa Dextrosa

Infusin de papas
Dextrosa
Agar
Agua purificada
sea de 5,6 0,2 0 25C. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado 121C por 15
minutos.
Caldo Saborauraud Dextrosa

Dextrosa
Mezcla de Digerido Peptico de tejido
Animal y digerido pancretico de
Casena (1:1)
Agua purificada
TCNICA DE ANLISIS

Ajustar el pH con hidrxido de sodio 1N O acido clorhdrico 1N para que despus de esterilizacin
sea de 5.6 0.2 a 25. Esterilizar en un autoclave utilizando un acido validado 121Cpor 15
minutos.
Caldo Mossel para enriquecimiento de Enterobacterias

Digerido pancretico de gelatina 10.0g
Glucosa monohidratada 5.0g
Bilis de buey deshidratado 8.0 g
Fosfato bibsico de sodio dihidratado 8.0 g
Verde brillante 1.5g
sea 7.20.2 a 25 .Calentar a 100C durante 30minutos y enfriar inmediatamente. Si el medio de
cultivo es preparado con medios comercial deshidratado, esterilizar en un autoclave utilizado un
ciclo validado 121C por 5 minutos.
Agar Violeta Rojo Billis Glucosa

Extracto de levadura 3.0g
Sales Biliares 1.5g
Cloruro de sodio 5.0g
Glucosa monohidratada 10.0g
Agar 15.0g
Rojo Neutro 30mg
Cristal Violeta 2mg
Ajustar el ph con hidrxido de sodio 1N o acido clorhdrico 1N para que despus de esterilizacin
sea de 7.40.2 25 Calentar hasta ebullicin; no calentar en autoclave
Caldo Mac Conkey

Lactosa Monohidratada 10.0g
Bilis de buey deshidratada 5.0g
Purpura de Bromocresol 10.0g
Ajustar el pH con hidrxido de sodio 1N o acido clorhdrico 1N Para que despus de esterilizacin
sea de 7.30.2 a 25.esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado 121C por 15 minutos
TCNICA DE ANLISIS

Agar Mac Conkey

Peptonas (de carne y casena) 3.0g
Lactosa Monohidratada 10.0g
Cloruro de Sodio 5.0g
Sales Biliares 1.5g
Agar 13.5g
Rojo Neutro 30.0g
Cristal violeta 1mg
sea de 7.1 0.2 a 25. Calentar a ebullicin durante 1 minuto, agitando constantemente, y luego
esterilizar en un autoclave utilizado un ciclo validado 121C por 15 minutos
Caldo Rappaport-Vasiliadis para Enriquecimiento de Salmonella

Peptona de soja 4.5g
Cloruro de Magnesio Hexahidratado 29.0g
Cloruro de sodio 8.0 g
Fosfato bibsico de potasio 0.6g
Fosfato monobsico de potasio 0.6g
Verde de Malaquita 0.036g
Disolver, calentado ligeramente. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado A una
temperatura que no exceda a 115C por 15 minutos. El pH debe ser 5.2 0.2 a 25C luego del
calentamiento y esterilizacin en autoclave.
Agar Xilosa Lisina Desoxicolato
Xilosa 3.5g
L-lisina 5.0g
Lactosa monohidratado 7.5g
Sacarosa 7.5g
Cloruro de sodio 5.0g
Extracto de levadura 3.0g
Rojo de fenol 80mg
Agar 13.5g
Desoxicolato de sodio 2.5g
Tiosulfato de sodio 6.8g
Citrato frrico amnico 0.8g
TCNICA DE ANLISIS

TCNICA DE ANLISIS
ENSAYO MICROBIOLOGICO PARA GRANELES, Pgina

PRODUCTO TERMINADO Y MATERIA PRIMA 10
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TCNICA DE ANLISIS

TCNICA DE ANLISIS

TCNICA DE ANLISIS

c) Deteccin de salmonella:
C.1 Ausencia en 1 gramo:
Preparar una muestra empleando la dilucin 1 en 10 y usar 10ml o la cantidad correspondiente a 1g
0 1ml para inocular en 100ml de Caldo CASO, mezclar e incubar a una temperatura 30 a 35C
durante un periodo de 18 a 24 horas. El control negativo del medio de cultivo se realiza incubando
un frasco conteniendo 100 ml de Caldo CASO a las mismas condiciones de la muestras.
TCNICA DE ANLISIS

Transferir 0.1ml de Caldo CASO a 10ml de Caldo Rappaport-Vassiliadis para enriquecimiento de

salmonella e incubar a una temperatura de 30 a 35 C durante un periodo de 18 a 24 horas. En
paralelo realizar el control positivo para el Caldo Rappaport -Vassiliadis inoculando una asada de la
cepa Salmonella entrica ATCC 14028.asimismo realizar el control negativo del medio de cultivo
Caldo Rappaport-Vassiliadis. Incubar los tubos a una temperatura de 30C a 35C DE UN periodo
de 18 a 24 horas.
Sembrar por estriado sobre placa de Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) e incubar a una
temperatura de 30 a 35C durante un periodo de 18 a 48 horas. Las colonias de salmonella son
colonias amarillas o rojas con centro negro. Esto se confirma mediante prueba de identificacin.
Control positivo: Sembrar por estriada en placa Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) EL
TUBO Correspondiente a la cepa de Salmonella entrica ATCC 14028 e incubar a una temperatura
de 30 a 35C durante un periodo de 18 48 horas.
Control negativo: El control negativo de medio de cultivo se realiza incubando una placa
conteniendo Agar Xilosa Lisina (XLD). A una temperatura de 30 a 35C por un periodo de 18 a 48
horas.
C.2 Ausencia en 10 gramos:

Preparar una muestra empleando una cantidad correspondiente a no menos de 10ml o 10g para
inocular en 100ml de Caldo CASO, mezclar e incubar a una temperatura de 30 a 35C durante un
periodo de 18 a 24 horas.
Transferir 0.1ml de Caldo CASO a 10ml de Caldo Rappaport-Vasisiliadis para enriquecimiento de
salmonella e incubar a una temperatura de 30 a 35C durante un periodo de 18 a 24 horas
Subcultivar por estriado sobre Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) e incubar a una temperatura
de 30 a 35C durante un periodo de 18 a 48 horas.
El crecimiento de colonias caractersticas, similares al control positivo, indica la posible presencia

de salmonella sp Las colonias amarillas o rojas con centro negro. Esto se confirma mediante
pruebas de identificacin,
Control positivo: sembrar por estriado en placa de Agar Xilosa Lisina Desoxilato(XLD) el tubo
correspondiente a la cepa de Salmonella entrica ATCC 14028 e incubar a una temperatura de 30 a
35C durante un periodo de 18 a 48 horas.
TCNICA DE ANLISIS

Control negativo: El control negativo del medio de cultivo se realiza incubando una placa
conteniendo Agar XLD (Agar Xilosa Lisina Desoxicilato). A una temperatura de 30 a 35C por un
periodo de 18 a 24 horas.
D) Deteccin de salmonella (alternativo):

o 1ml e inocular en 100ml de Caldo CASO. Mezclar e incubar a una temperatura de 30 a 35C
durante un periodo de 18 a 48 horas.
Sembrar 1ml del cultivo en 10ml de caldo TGB e incubar a 41 43C durante 18 a 24 horas. En
paralelo realizar en control positivo para el Caldo TGB inoculando una asada de la cepa Salmonella
entrica ATCC 14028. As mismo realizar el control negativo del medio de cultivo Caldo TGB.
Incubar los tubos a una temperatura de 30C a 35C durante un periodo de 18 a 24 horas.
Subcultivar por estriado sobre placa de Agar Xilosa Lisina Desoxicolato e incubar a una
temperatura de 30 a 35C durante en periodo de 18 a 48 horas.
El crecimiento de colonias caractersticas, similares al control positivo. Indicada la posible
presencia de salmonella sp las colonias de salmonella son colonias amarillas o rojas con centro
negro. Esto se confirma mediante prueba de identificacin.
Control positivo: Sembrar por estriado en placa de Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) de 30 a
35C durante un periodo de 18 a 48 horas.
Control negativo: El control negativo del medio de cultivo se realiza incubando una placa
conteniendo Agar Cetrimide, a una temperatura de 30 a 35C por un periodo de 18 a 48 horas.
TCNICA DE ANLISIS

Deteccin de Pseudomona aeruginosa

o 1ml para inocular en 100ml de Caldo CASO mezclar e incubar a una temperatura de 30 a 35C
durante unj periodo de 18 a 24 horas. El control negativo del medio de cultivo se realiza incubando
un frasco conteniendo 100ml de Caldo CASO alas mismas condiciones de la muestra.
Luego del periodo de incubacin, subcultivar por estriado sobre placa de Agar Cetrimide e incubar
a una temperatura de 30 a 35C durante un periodo de 18 a 72 horas.
El crecimiento de colonias caractersticas, similares al control positivo, indica la posible presencia

de Pseudomona spp. Las colonias caractersticas de Pseudomona spp. Son colonias amarillo
verdoso a azules. Posteriormente se confirma mediante pruebas. De identificacin.
Control positivo: Sembrar por estriado la cepa de Pseudomona aeruginosa ATCC 9027 e incubar a
una temperatura de 30 a 35C durante un periodo de 18 a 72horas.
Control negativo: el control negativo del medio de cultivo se realiza incubando una placa
conteniendo Agar Cetrimide, a una temperatura de 30 a 35C por un periodo de 18 a 72 horas
Deteccin de staphylococcus aureus

Preparar una muestra empleando la dilucin 1 en 10 y usar 10 ml o la cantidad correspondiente a 1g
o 1ml de caldo CASO mezclar e incubar a una temperatura de 30 a 35C durante un periodo de 18 a
24 horas. El control negativo del medio de cultivo se realiza incubando un frasco conteniendo
100ml de caldo CASO a las mismas condiciones de las muestra.
TCNICA DE ANLISIS

Subcultivar por estriado sobre agar Manitol salado e incubar a una temperatura de 30 a 35C
durante un periodo de 18 a 72 horas.
El crecimiento de colonias caractersticas, similares al control positivo indica la posible presencia
de staphylococcus spp. Esto se confirma mediante pruebas de identificacin
CONTROL POSITIVO: Sembrar por estriado la cepa de staphylococcus aureus ATCC 6538 e
incubar a una temperatura de 30 a 35C durante un periodo de 18 a 72 horas
CONTROL NEGATIVO: El control negativo del medio de cultivo se realiza incubando una placa
conteniendo Agar Manitol Sal, a una temperatura de 30 a 35C por un periodo de 18 a 72 horas
3
EVALUACION DE ENSAYO
Recuento por el mtodo de cultivo de vertido en placas
Despus de la incubacin se produce al recuento de las unidades formadores de colonias (ufc) por
placa. Multiplicando por el factor de dilucin 10 resultan las ufc/g o ufc/ml de muestra. Si los
valores se mantienen dentro de los lmites establecidos se puede proceder a la aprobacin
TCNICA DE ANLISIS

Deteccin de patgenos
Se confirma la presencia de microorganismos patgenos, mediante pruebas de identificacin
especficas, realizado por terceros.
IMPORTANTE: Antes de solicitar la identificacin por terceros, realizar las pruebas de
identificacin por terceros, realizar las pruebas de coloracin Gram y pruebas que permitan
determinar el gnero .Ej. Test Coagualasa,
Test de Oxidasa, test de catalasa.
Si finalmente se determina que las colonias no cumplen con todas las caractersticas tpicas se
reporta como Ausente/g o ml
TINCION GRAM
La tincin Gram se realiza de las siguientes maneras:
Colocar una gota de solucin salina estril sobre la lmina porta objetos
Colocar una asada de cultivos o crecimiento microbiano que se quiere colorear, y mezclar
con la solucin salina ,
Secar al mechero
Aadir 1 gota de cristal violeta
Dejar en contacto por 1 minuto. Lavar con chorro de agua fina el exceso del colorante
Secar al mechero
Aadir 1 gota de solucin de lugol (mordiente) y dejar en contacto por 30 segundos
Lavar con chorro de agua fina
Aadir 1 gota de decolorante y dejar en contacto por 30 seg.
Lavar con chorro de agua fina
Aadir 1 gota de sefradina y dejar en contacto por 1 minuto
Lavar el exceso de colorante
Secar mechero
Llevar al microscopio para ver la coloracin. hacer uso de aceite de inmersin si es
necesario
Resultados:
Los microorganismos gram-positivos se colorean de color violeta.
Los microorganismos gram-negativos se colorean de color rosado a rojo.
TEST DE COAGULASA
Usado para la identificacin de la enzima coagualsa desarrollada por staphylococcus aureus.
El reactivo es plasma de conejo liofilizado con EDTA.
El plasma de conejo tratado con EDTA liofilizado se disuelve por adicin de 3ml de agua destilada
o desmineralizada.
TCNICA DE ANLISIS

Se someten al ensayo de coagulasa, la (s) colonias tpicas, transfirindolas con un asa de

inoculacin estril en un tubo de cultivo con caldo cerebro-corazn o caldo CASO y se incuba por
20horas a 35C por cada 24 horas.
Se introduce 0.3ml de bactident Coagulasa rehidratada mediante una pipeta estril en el tubo de
cultivo estril.
Aadir 0.1Ml del cultivo.
El ensayo de coagulasa se considera positivo, si el contenido del tubo es mas de las partes
presenta como un grumo compacto.
El ensayo debe durar 4 horas en caso de resultado negativo del ensayo tras 4 horas el tubo debe
continuar incubndose y evaluarse tras 24 horas.
Usar como control positivo, un cultivo de staphylococccus aureus y como control negativo, un tuvo
con el caldo de cultivo estril. En este caso no se debe observar ni formacin de grumos ni
cogulos.
1+ positivo No hay coagulacin, grumos pequeos, pocos de ellos no organizados

2+ positivo Grumos pequeos no organizados
3+ positivo Grumos grandes organizados en gran medida
4+ positivo Coagulacin completa, el coagulo no se desplaza al invertir el tubo
TEST DE CATALASA
Colocar 1 gota de reactivo de catalasa sobre la superficie en un portaobjeto seco y transferir una
asada del microorganismo a ser investigado
La reaccin es catalasa positiva si se produce formacin de gas inmediata
La reaccin es catalasa negativa si no se observa desarrollo de gas
Usar como control positivo la sepa staphylococcus aureus
TEST DE OXIDASA
Transferir la colonia sospechosa sobre la varilla impregnada con el reactivo de oxidasa si la

reaccin es positiva hasta 10 segundos, se observa el cambio de color de la colonia purpura.
Usar como control positivo la cepa de staphylococcus aureus
USP 35 61 EXAMEN MICROBIOLOGICO DE PRODUCTOS NO ESTERILES: PRUEBAS

DE RECUENTOS MICROBIANO
TCNICA DE ANLISIS

USP 35 [62] EXAMEN MICROBIOLOGICO DE PRODUCTOS NO ESTERILES PRUEBAS DE

MICROORGANISMOS ESPECIFICOS
USP 35 (1111) EXAMEN MICROBIOLOGICO DE PRODUCTOS NO ESTERILES: CRITERIOS
DE ACEPTACION PARA PREPARACION FARMACEUTICAS Y SUSTANCIAS
FARMACEUTICO
5 HISTORIA DE MODIFICACIONES
Versin 01: 22 de enero de 2010 se emite TECNICA PROPIA.
Versin 02:07 de junio de 2010 se incluye controles blanco por cada siembra y controles
positivos en la deteccin de microorganismos especficos.
Versin 03: 08 de Marzo 2011 se incluye preparacin de la muestra y grficos.
Versin 04: 07 de abril de 2011 se incluye los pasos a seguir en las pruebas de
identificacin de patgenos.
Versin 05: 08 de agosto del 2012, Se cambian las especificaciones en base a la ltima USP
vigente, se incluye composicin de los medios de cultivo. Se detalla la preparacin de la
muestra, se modifican los puntos PRUEBA DE RECUENTO MICROBIANO Y PRUEBAS
DE MICROORGANISMOS ESPECIFICOS, en la cual se incluyen los controles positivos y
negativos a realizar. se incluye bacterias gram-negativas tolerantes a la bilis.

CONTROL Microbiológico

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Preparado por Yamila Alanoca ________________________

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USO OROMUCOSAL, GINGIVAL, CUTNEA, AURICULAR.

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Stafilococus aureus (1g mL)

PARA SUSTANCIAS NO ESTERILES PARA USO FARMACUTICO

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REALIZACIN DEL ANLISIS

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Agar Mac Conkey

*Solucin Amortiguadora de Peptona Cloruro de sodio Ph 7.0

*Agar Digerido de Casena y soja (TSA)

ENSAYO MICROBIOLOGICO PARA GRANELES, Pgina 6

Caldo Digerido de Casena y Soya (CST)

Agar Sabouraud Dextrosa

Agar Papa Dextrosa

Caldo Saborauraud Dextrosa

ENSAYO MICROBIOLOGICO PARA GRANELES, Pgina 7

Caldo Mossel para enriquecimiento de Enterobacterias

Agar Violeta Rojo Billis Glucosa

Caldo Mac Conkey

ENSAYO MICROBIOLOGICO PARA GRANELES, Pgina 8

Agar Mac Conkey

Caldo Rappaport-Vasiliadis para Enriquecimiento de Salmonella

ENSAYO MICROBIOLOGICO PARA GRANELES, Pgina 9

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Transferir 0.1ml de Caldo CASO a 10ml de Caldo Rappaport-Vassiliadis para enriquecimiento de

C.2 Ausencia en 10 gramos:

El crecimiento de colonias caractersticas, similares al control positivo, indica la posible presencia

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D) Deteccin de salmonella (alternativo):

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Deteccin de Pseudomona aeruginosa

El crecimiento de colonias caractersticas, similares al control positivo, indica la posible presencia

Deteccin de staphylococcus aureus

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Se someten al ensayo de coagulasa, la (s) colonias tpicas, transfirindolas con un asa de

1+ positivo No hay coagulacin, grumos pequeos, pocos de ellos no organizados

Transferir la colonia sospechosa sobre la varilla impregnada con el reactivo de oxidasa si la

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