You are on page 1of 28

GENES SUPRESORES DE TUMORES

INTRODUCCIN

El cncer es el resultado de una serie de alteraciones genticas que se producen al azar y


conducen a la perturbacin de los controles normales de la proliferacin celular que est
regulada por proto-oncogenes que promueven el crecimiento celular y contrabalanceado
por genes supresores de tumores. Los proto-oncogenes pueden volverse hiperactivos por
mutaciones que tienen un efecto dominante generando los oncogenes que fuerzan al
crecimiento de las clulas tumorales. Inversamente, las lesiones genticas de los genes
supresores de tumores tienen un efecto inactivador. Estos genes mutados se manifiestan
de forma recesiva de manera que, la prdida o inactivacin de ambos alelos conduce al
fenotipo neoplsico. Se han utilizado varios criterios para definir los genes supresores de
tumores: Poseen un alto grado de conservacin evolutiva; pues estn implicados en el
control del desarrollo de varias clases de tumores ya que su funcin normal es inhibir o
poner freno al crecimiento celular, previniendo el desarrollo de la neoplasia. Tienden a
ser recesivos, donde ambos alelos normales deben mutar para transformar clulas
normales en tumorales. Estn frecuentemente asociados con la prdida de un alelo
resultando en la homocigosidad del gen supresor del tumor, as como de los marcadores
que le circundan. Las mutaciones en estos genes provocan que la clula ignore uno o ms
de los componentes de la red de seales inhibitorias, eliminando las barreras del
crecimiento celular y resultando en una tasa ms elevada de crecimiento canceroso
controlado. Los productos de los genes supresores de tumores funcionan en muy diversas
localizaciones celulares.

Tradicionalmente la inactivacin de un gen supresor de tumor ha sido explicada por los


mecanismos ms sencillos que contribuyen a la perturbacin de la funcin y de la
estructura del gen que son las delecciones, mutaciones puntuales e inserciones. Pero
existen otros muchos mecanismos que no afectan a la regin codificante del gen pero s
a la expresin de la protena supresora tumoral como son las alteraciones de otras regiones
gnicas: promotor, secuencias reguladoras, regiones implicadas en la maduracin del
ARN. Por otra parte la protena puede no ser funcional debido al transporte inadecuado
de la protena supresora tumoral a la localizacin subcelular donde es funcional. Adems
oncoprotenas de origen vrico pueden inducir la degradacin de la protena supresora o
inhibir la transcripcin del propio gen.

Los genes supresores actan como frenos celulares, codifican protenas que restringen el
crecimiento celular y previenen la transformacin maligna de clulas. La existencia de
estos genes se descubri a finales de los 60s en los que se fusionaron clulas normales y
malignas de roedor. Algunas de las clulas hbridas que se formaron en esta fusin
perdieron sus caractersticas malignas, lo que sugiri que una clula normal tienen
factores que puede suprimir el crecimiento descontrolado de una clula cancerosa. (Karp)

Por otro lado, los oncogenes codifican protenas que promueven la prdida de control del
crecimiento y la conversin de una clula a su estado maligno. La mayor parte de los
oncogenes actan como aceleradores de la proliferacin celular, pero tambin tienen otras
funciones. Pueden ocasionar inestabilidad gentica, impedir que una clula se vuelva
vctima de la apoptosis o promover la metstasis. La existencia de oncogenes se descubri
mediante una serie de investigaciones con virus tumorales de ARN. Estos virus
transforman una clula normal en una clula maligna porque tienen un oncogen que
codifica una protena que interfiere con las actividades normales de la clula. Se hizo
evidente que las clulas tienen diversos genes, conocidos como protooncogenes, con la
capacidad de corromper las propias actividades celulares y conducirlas hacia el estado
maligno. Los protooncogenes pueden convertirse en oncogenes (activarse) por varios
mecanismos:

El gen puede mutar de tal manera que altere las propiedades del producto del gen
para que ya no funcione en forma normal.
El gen puede duplicarse una o ms veces, lo que produce la amplificacin y
produccin excesiva de la protena codificada.
Puede haber un nuevo ordenamiento cromosmico que mueva una secuencia de
ADN distante del genoma hasta quedar prxima al gen, lo que modifica la
expresin del gen o la naturaleza el producto gnico.
Figura 1. Activacin de un protooncogen a oncogen. La activacin puede realizarse de varias
maneras. En la va a, una mutacin del gen altera la estructura y funcin de la protena
codificada. En la va b la amplificacin del gen produce una expresin excesiva de este. En la
va c, un reordenamiento del ADN pone un segmento nuevo de ADN cerca o junto al gen, lo
que altera su expresin o la estructura de la protena codificada.

Cualquiera de estas alteraciones genticas puede hacer que una clula pierda capacidad
de respuesta al control del crecimiento normal, lo cual hace que funciones como clula
maligna. Los oncogenes actan de manera dominante, lo que significa que una solo copia
de un oncogen puede hacer que la clula exprese el fenotipo alterado, sin importar que
haya o no una copia inactivada del gen en el cromosoma homologo.

1. Genes supresores tumorales.

La existencia de genes supresores tumorales fue propuesta hace muchos aos atrs. La
fusin de clulas tumorales con clulas normales daba lugar a hbridos que haban perdido
la capacidad de formar tumores en animales de experimentacin. La clula normal con su
contenido gentico era capaz de suprimir el fenotipo tumoral. La explicacin era que un
gen; supresor de tumores; haba sido inactivado o estaba ausente en la clula tumoral y al
fusionarse con la clula normal el gen funcional estaba presente y poda controlar el
crecimiento de la clula. En apoyo a este modelo estaba el hecho de que, si el hbrido
perda algunos cromosomas de la clula normal, adquira de nuevo el fenotipo tumoral.
Otra evidencia de la existencia de genes supresores de tumores provino de los casos donde
se observ predisposicin gentica al desarrollo de cierto tipo de tumores, habindose
asociado a defectos cromosmicos. Los hijos afectados reciban de uno de los padres
cromosomas alterados estructuralmente. El caso ms estudiado y que llev al aislamiento
del primer gen supresor de tumores fue el del retinoblastoma.

La transformacin de una clula normal en una cancerosa se acompaa de la prdida de


la funcin de uno o ms genes supresores tumorales. En la actualidad, hay cerca de dos
docenas de genes referidos como supresores tumorales, entre los cuales se incluyen los
que codifican factores de transcripcin (TP53 y WT1), reguladores del ciclo celular (RB
y p16), componentes que regulan las vas de sealizacin (NF1), una fostatasa de
fosfoinostida (PTEN) y una protena que regula la elongacin de la polimerasa II de ARN
(VHL). Casi todas las protenas que codifican los genes supresores tumorales actan
como reguladores negativos de la proliferacin celular, razn por la cual su eliminacin
promueve el crecimiento celular descontrolado. Los productos de los genes supresores
tumorales tambin ayudan a mantener la estabilidad gentica, lo cual puede ser una razn
primordial por la que los tumores contienen cariotipos tan anormales. Algunos genes
supresores tumorales participan en el desarrollo de una gran variedad de canceres
distintos, mientras que otros intervienen en la formacin de uno o algunos tipos de cncer.

Cuadro 1. Genes supresores tumorales

Gen Tumor primario Funcin propuesta Sndrome heredado


Acta como factor de
APC Colorrectal Poliposis adenomatosa familiar
transcripcin
Factor de transcripcin,
BRCA1 Mamario Cncer mamario familiar
reparacin de ADN
MSH2, MLH1 Colorrectal Reparacin de discrepancia CHCSP
E-Cadherin Mamario, colon Molcula de adhesin celular Cncer gstrico familiar
Inhibidor de p16:Cdk,
INK4a Melanoma, pancretico Melanoma familiar
estabiliza a p53,
NF1 Neurofibromas Activa la GTP-asa de Ras Neurofibromatosis tipo I
Vincula membrana con
NF2 Meningiomas Neurofibromatosis tipo II
citoesqueleto
P16 Melanoma Inhibidor de Cdk Melanoma familiar
Factor de transcripcin (ciclo
TP53 Sarcomas, linfomas Sndrome de Li-Fraumeni
celular y apoptosis)
PTEN Mamario, tiroideo Fosfatasa de PIP3 Enfermedad de Cowden
RB Retiniano Se une a E2F Retinoblastoma
Elongacin de polimerasa II
VHL Renal Sndrome de von Hippel-Lindau
de ARN, degradacin proteica
WT1 Tumor de Wilms renal Factor de transcripcin Tumor de Wilms
2. Papel del Rb y la regulacin del ciclo celular

La protena que codifica el gen RB, pRb, ayuda a regular el paso de las clulas de la etapa
G1 del ciclo celular a la fase S, durante la cual se produce la sntesis de ADN. La
transicin de G1 a S se acompaa de la activacin de muchos genes diferentes que
codifican protenas. Entre los factores de transcripcin que participan figuran miembros
de la familia E2F de los factores de transcripcin, blancos claves de pRb. Durante G1, las
protenas E2F se mantienen unidas con pRb, lo cual impide que se activen varios genes
que codifican las protenas necesarias para la activacin de la fase S. Los estudios indican
que el complejo E2F-pRb se relaciona con el ADN actuando como represor gnico y no
como activador. Al aproximarse al final de la fase G1, la subunidad pRb se fosforila por
accin de las cinasas dependientes de ciclina y libera el E2F unido, lo cual permite que el
factor de transcripcin active la expresin gnica marcando el compromiso irreversible
de la clula para ingresar a la fase S. (Figura 2)

Figura 2. Papel del pRb en el


control de la transcripcin de
genes para la progresin del
ciclo celular. La protena no
fosforilada pRb est unida a la
protena E2F, formando un
complejo que acta como represor
transcripcional bloqueando la
expresin gnica. La activacin de
la cinasa dependiente de ciclina
(Cdk) produce la fosforilacin de
pRb, la cual ya no puede unirse a
la protena E2F. La prdida de la
pRb convierte a la E2F unida a
ADN en un activador de la
transcripcin, que conduce a la
expresin de genes que se regulan.
El ARNm se traduce en protenas
necesarias para el paso de las
clulas de la fase G1 a la fase S.
Se puede esperar que una clula que pierde la actividad pRb como resultado en una
mutacin de RB perdiera su capacidad para desactivar E2F, lo que eliminara ciertas
restricciones para la entrada a la fase S. El retinoblastoma se puede presentar de dos
formas: hereditaria y espordica. Knudson (1971) propuso que el retinoblastoma era el
resultado de dos mutaciones. En el caso hereditario, la primera mutacin (obtenida del
padre o madre afectada) estaba presente en todas las clulas del cuerpo. Una segunda
mutacin somtica llevara a la formacin del tumor. En cambio en el caso espordico las
dos mutaciones ocurran somticamente. Numerosos estudios localizaron al gen que
confera la susceptibilidad al retinoblastoma en el cromosoma 13, ligado al gen de la
esterasa D, en la regin 13q14. En muchos casos las mutaciones llevaban a la prdida de
un gen. El cromosoma del padre o madre afectado estaba alterado mientras que en la
segunda mutacin la copia normal era eliminada. Este gen se encuentra mutado no solo
en retinoblastomas sino tambin en muchos otros tipos de tumores. Las mutaciones llevan
en muchos casos a la ausencia de la protena codificada por el gen del retinoblastoma pRb
o a la expresin de una forma aberrante que no es funcional.

Figura 3. El retinoblastoma puede presentarse en dos modalidades: Hereditario o espordico.


En el caso hereditario el cromosoma con el RB mutado es heredado de cualquiera de los padres. En
el caso espordico se observa dos mutaciones somticas y deben darse en la misma clula para que
ocurra el tumor
2.1.Aplicacin de nuevas herramientas para el diagnstico y pronstico del
retinoblastoma

En la ltima dcada ha habido un gran avance en la tecnologa del DNA, lo cual est
permitiendo su aplicacin en el diagnstico y pronstico de algunas enfermedades. Se
sabe que ciertas alteraciones citogenticas pueden ser el sello caracterstico de tumores
malignos especficos, por ejemplo, la translocacin t(9;22) en leucemias, y t(8;14) en
linfomas y probablemente en el caso del retinoblastoma la prdida de 13q14.2. Para
identificar la prdida de esta regin citogentica se ha utilizado la tcnica de hibridacin
in situ fluorescente (FISH, o fluorescence in situ hybridization). Esta metodologa de
citogentica molecular es muy til, pero tiene algunas desventajas: es cara y laboriosa.
Afortunadamente, gracias al continuo avance tecnolgico se ha propuesto una alternativa
al FISH en donde el marcaje es in situ (PRINS primed in situ), lo cual permite evaluar
eliminaciones gnicas en metafases usando la reaccin en cadena de la polimerasa. As,
usando PRINS, se ha evaluado la deteccin de eliminaciones pequeas del gen RB1 en
pacientes con alteraciones hematolgicas con resultados satisfactorios.
Desafortunadamente, a la fecha no existe ningn reporte de esta tecnologa aplicada a los
retinoblastomas. Se sabe que en todos los tumores existen diferentes tipos de alteraciones
genticas. El anlisis citogentico convencional de tumores slidos es tcnicamente
difcil e involucra un alto costo. Para evitar estas dificultades, se desarroll la tcnica de
hibridacin genmica comparativa (HGC), til para identificar desbalances
cromosmicos utilizando 3 fluorocromos diferentes a la vez. Es decir, con esta tcnica
global es posible detectar todos los desbalances cromosmicos en todos los cromosomas
en un experimento. Adems, no hay necesidad de utilizar cultivos celulares, por lo que
los tejidos incluidos en parafina pueden usarse en esta metodologa. Debido a su
aplicacin en diversas neoplasias, actualmente se estn obteniendo las firmas
cromosmicas de todos los tumores que afectan al ser humano. La aplicacin de HGC en
retinoblastomas, tanto espordico como familiar, ha mostrado dos regiones que se ganan
ms frecuentemente; 1q31 (ms de 50% de los casos) y 6p22 (ms del 65% de los casos)
y una regin que ms frecuentemente se pierde es 16q22 (aproximadamente en 25% de
los casos). De manera interesante, no se encontr desbalance en la regin 13q14.2.41-43
Esto sugiere que algunos grupos de genes localizados en las regiones 6p22 (por ejemplo;
serina proteinasa 16, factores de transcripcin E2F 3y E2F1), 16q22 (por ejemplo,
protena serina cinasa H1 y factor de transcripcin E2F4) y 1q31 (por ejemplo, catepsina
E, protenas reguladoras G, interleucina 10, oncogn TRK, BAX, etc., entre otros),
podran tener la importancia biolgica clave que permitiera entender las bases
moleculares del desarrollo de esta neoplasia. De esta manera, se cuenta con una probable
firma cromosmica del retinoblastoma disponible en bases de datos pblicas.
Recientemente, se han investigado los mecanismos moleculares del desarrollo del
retinoblastoma para identificar potenciales blancos moleculares para posibles futuras
intervenciones teraputicas. En dicha investigacin, se ha utilizado la tecnologa del
chip de Affymetrix-ADNc el Affychip para determinar el perfil de expresin de los
retinoblastomas primarios. Mediante el anlisis del agrupamiento de tipo no
supervisado de las clases de datos de expresin de este tipo de tumores, se logr detectar
un par de grupos que nos permite clasificar como retinoblastomas benignos (retinomas)
y otro como retinoblastomas malignos. Estos datos de expresin tambin son
interpretados sobre el fondo gentico de alteraciones de la dosis gnica identificado por
HGC. La regin q31-32 del cromosoma 1, present una gran dosis gnica en la mayora
de los retinoblastomas. Actualmente se est precisando por HGC en matriz, la definicin
de los genes conocidos que presentan dichos desbalances cromosmicos. De esta manera,
el papel de las alteraciones moleculares en el gen RB1 en el retinoblastoma podra ser
menor a lo que se pensaba. Gracias al desarrollo de proyectos como el del Genoma
Humano, han surgido nuevas tecnologas tiles en la identificacin de regiones
citogenticas y de expresin de genes. Una de ellas son las microhileras o biochips. De
tal manera que, actualmente se cuenta con el desarrollo de la HGC en microhileras
haciendo el estudio ms fino. A la fecha, no ha sido explorado en retinoblastomas, la
definicin de los genes marcadores alterados; esto podra resolverse aplicando cualquier
variante de microhileras, siendo ste un campo virgen para ser explotado. En otros tipos
de cnceres como en el cncer colorrectal, cncer mamario, se estn construyendo
microhileras dirigidas para estas patologas, seleccionando genes que son expresados de
manera especfica. En este contexto, se incluyeron los principales genes sospechosos
involucrados en la carcinognesis colorrectal de acuerdo con la literatura. As, usando
este colonchip se han identificado 59 genes, posibles candidatos para el diagnstico y
la terapia de esta neoplasia. Para el caso del cncer mamario, la utilizacin de 70 clonas
de secuencias conocidas, pueden dar la firma para el buen o pobre pronstico a desarrollar
metstasis. Existen en el mercado otros chips diseados exprofeso para otras patologas:
por ejemplo los hepatochips, oncochips, cardiochips, etc.
En el caso del retinoblastoma se ha sugerido dos diseos de retinochips, uno genmico
que incluya entre otros a las regiones cromosmicas 6p22, 16q22 y 1q31, til para
determinar los genes marcadores en el pronstico de la neoplasia. El otro, un retinochip
de expresin que incluya los genes RB1, p53, E2F y todos aquellos genes relacionados
con la expresin y regulacin del gen RB1. Este tipo de diseo depender de los datos
que se obtengan a partir de experimentos con microhileras y la posterior aplicacin de
herramientas bioinformticas tales como GenMAPP, Gene Ontology, BodyMAP, etc.

3. El papel del p53

El gen p53 es considerado como "el guardin del genoma". La protena codificada por el
gen supresor de tumor p53, es una fosfoprotena que se localiza en el ncleo celular. Es
un factor de transcripcin que activa la expresin de una gran cantidad de genes referidos
en la regulacin del ciclo celular y la apoptosis.

El gen p53 est localizado en el brazo corto del cromosoma 17, banda 13 (17p13.1), y
tiene aproximadamente 20 kb. Consta de 11 exones, siendo el primero no codificante y
colocado a 8-10 kb de los exones 2-11, produce un transcrito de ARNm de 2,8 kb cuyo
resultado es una protena de 53 kD que tiene 393 aminocidos. El anlisis de los niveles
del ARNm de p53 sugiere que el gen se expresa en todos los tejidos corporales durante el
desarrollo. La protena normalmente reside en el ncleo celular y tiene una vida media
muy corta en los tejidos normales. Esta protena est siendo producida constantemente
pero es muy rpidamente degradada. En tejidos normales est presente en cantidades muy
pequeas que no pueden ser detectadas por inmunohistoqumica. Los agentes que daan
el ADN inducen p53 que se hace muy estable por un mecanismo post-transcripcional que
induce un elevado aumento de la cantidad de protena p53 en el ncleo.

3.1. Funciones de la p53.


La protena p53 es un factor de transcripcin capaz de activar y/o inhibir la
transcripcin de una amplia variedad de genes. Cuando el ADN est daado p53 se
activa para mantener la integridad de la secuencia del ADN bien por medio de la
parada de la proliferacin celular mientras el dao es reparado, o alternativamente,
dirigiendo la clula hacia la apoptosis. Algunas de las principales funciones de la
protena p53 muestran que acta como factor de transcripcin, control del ciclo
celular, induccin de la muerte celular programada y otras funciones relacionadas
con la diferenciacin neuronal, la supresin de la teratognesis y el mantenimiento
de la integridad genmica. La protena mutante pierde su funcin supresora de tumor,
etapa clave que resulta en la cascada neoplsica. Adems p53 es capaz de activar la
va apopttica, por tanto su inactivacin podra incrementar el grupo de clulas
proliferentes as como su probabilidad de transformacin neoplsica al inhibir la
muerte celular programada Por tanto, p53 es un factor de transcripcin multifactorial,
implicado en el control de la progresin del ciclo celular, integridad del ADN y
supervivencia de las clulas expuestas a agentes que daan al ADN.

Figura 4. Funcin de p53. A) La divisin celular normal no requiere la participacin de p53. B) Si


el ADN de una clula se daa, el nivel de p53 se eleva y acta para detener la progresin de la clula
por G1 o dirigirla hacia la apoptosis. C) Ante la ausencia de p53, la clula pierde la capacidad de
detener el ciclo celular o derivar hacia la apoptosis despus del dao del ADN, por lo cual la clula
muere por falla de la mitosis o contina proliferando con anormalidades genticas

Uno de los genes mejor estudiados que activa p53 codifica una protena llamada p21
que inhibe la cinasa dependiente de ciclina que impulsa a la clula por el punto de
revisin de G1. Cuando se eleva el nivel de p53 en la clula G1 daada, se activa la
expresin de p21 y se detiene el avance del ciclo celular, proporcionado a la clula
el tiempo necesario para reparar el dao gentico antes de iniciar la replicacin del
ADN. Si la lesin no es grave, la p53 detiene la divisin celular y activa los genes
reparadores del ADN. Si la p53 estima que el dao es irreparable entonces ordena
que se pongan en marcha los mecanismos genticos para que la clula entre en
apoptosis o muerte celular programada. La falta de reparacin del dao en el ADN
da lugar a la produccin de clulas anormales que tienen la capacidad de volverse
malignas. La deteccin del ciclo celular no es la nica manera que p53 protege a un
organismo. Una va alternativa puede dirigir a una clula con dao gentico por una
va que termina en la muerte por apoptosis. El nivel de p53 en una clula sana en fase
G1 es muy bajo. Sin embargo, si una clula en G1 sufre dao gentico, la
concentracin de p53 se eleva con rapidez. El aumento de estos niveles no se debe a
una mayor expresin del gen, sino a un descenso de la degradacin proteica. La
degradacin de p53 se facilita por una protena llamada MDM2, la cual se une con
p53 y la escolta fuera del ncleo hacia el citosol. Una vez all, MDM2 agrega
molculas de ubiquitina a la molcula de p53 lo que conduce a su degradacin en un
proteosoma.
Si este gen (p53) sufre alguna mutacin, no permite que la clula sea eliminada
mediante la muerte programada, tampoco se ocupa de reparar los daos en el ADN
y da lugar al inicio del proceso tumoral. Este gen es el ms frecuentemente mutado
en los cnceres humanos, ms de un 50 % de los tumores tienen genes p53 anormales,
habitualmente inactivado por una mutacin puntual o por delecciones gnicas,
producindose una protena alterada. Pero la prdida de la funcin de esta protena
no solo puede deberse a una mutacin en el gen que la origina, sino que existen otros
mecanismos que pueden provocar que la clula carezca de un control tan importante
como ste. Ambas lesiones impiden la oligomerizacin y formacin de complejos
tetramricos capaces de enlazarse a secuencias especficas del ADN. Esto altera la
funcin fisiolgica normal de la protena. La prevalencia de mutaciones de p53 vara
entre tipos de tumores, de un 0 a un 60% en los principales tipos de cncer y ms del
80% en algunos subtipos histolgicos. El espectro de las mutaciones de p53 en los
cnceres est proporcionando claves sobre la etiologa y patognesis molecular de
las neoplasias. Los cnceres con mutaciones en p53 son ms agresivos, con mayor
capacidad metasttica y a menudo fatales. Por tanto, la deteccin de las anomalas de
p53 puede revelar aspectos del origen y evolucin del cncer humano. En la mayora
de los tumores humanos estn inactivadas ambas copias de p53. El mecanismo ms
comn de prdida de funcionalidad de p53 es la mutacin puntual de uno de los alelos
y la deleccin del otro. La mutacin de solamente uno de los alelos podra afectar a
la respuesta de la clula mutante y podra quiz predisponer a la subsecuente
inactivacin del alelo restante. En este sentido cabe destacar que algunas mutaciones
de p53 son dominantes, lo cual constituye una excepcin a la norma que establece
que los genes supresores manifiestan su accin cancergena slo si se produce una
alteracin de ambas copias del gen.
4. Gen supresor APC
El gen APC codifica una protena de gran tamao con numerosos dominios y
diferentes sitios de interaccin con otras protenas. Esta protena est presente en
diferentes tejidos epiteliales, normalmente en clulas que experimentan procesos
post-mitticos. Los estudios inmunohistoqumicos muestran que APC aparece de
forma difusamente distribuida en el citoplasma celular, aunque tambin se ha
encontrado en las regiones apicales y laterales de las clulas epiteliales. La protena
APC participa en procesos celulares diversos que incluyen proliferacin,
diferenciacin, apoptosis, adhesin, migracin y segregacin cromosmica. . En el
extremo amino-terminal (N) presenta la regin conservada de repeticiones
Armadillo, que interacciona con la subunidad reguladora B56 de la protena
fosfatasa-2A y con el factor intercambiador de guanina estimulado por Asef. Estas
dos protenas estn implicadas en la va de sealizacin Wingless (Wnt), de la cual
es componente la protena APC. Otro dominio importante incluye tres repeticiones
de 15 aminocidos que interactan con la protena -catenina, y siete repeticiones de
20 aminocidos que se requieren para la regulacin negativa de -catenina.
Igualmente la protena APC presenta sitios de unin con axina y conductina, dos
protenas inhibidoras de la ruta de sealizacin Wnt. La regin carboxi-terminal (C)
participa en la unin con microtbulos y con la protena de unin a microtbulos
EB1. En su papel mejor estudiado, Apc limita el crecimiento celular mediante la
interferencia con la transcripcin de genes que estimulan la proliferacin celular.
Tambin es posible que APC participe en la unin de microtbulos con los
cinetocoros de los cromosomas mitticos. La prdida de la funcin de APC podra
dirigir de manera directa a la separacin anormal de los cromosomas y la aneuploidia.
La poliposis adenomatosa colnica familiar (PAF) es un trastorno hereditario en el
que los individuos desarrollan cientos, incluso miles, de plipos malignos
(adenomas) a partir de las clulas epiteliales que recubren la pared del colon. Se
descubri que las clulas de los pacientes que sufren de este trastorno tienen una
deleccin de una pequea parte del cromosoma 5, que se identific como el sitio del
gen supresor tumoral llamado APC. El anlisis mutacional de APC revela que la
mayora de las mutaciones germinales encontradas en pacientes con poliposis
familiar hereditaria son mutaciones sin sentido que generan codones stop y por tanto
protenas truncadas. Ms del 60% de las mutaciones encontradas en APC se
concentran en una regin central de la protena (entre los codones 1284-1580) que
recibe el nombre de mutation cluster region (MCR. La regin MCR coincide con la
regin de APC que interviene en las funciones dependientes de -catenina, lo cual
sugiere que esta funcin es muy importante en la patognesis del cncer colorrectal.
Diferentes estudios han demostrado que la protena APC y -catenina son partes
importantes de la va de sealizacin intracelular Wnt. Gracias al estudio de la
interaccin de la protena APC con la glucgeno- sintetasa quinasa-3 (GSK-3) y
con -catenina ambas partes esenciales de la va Wnt, se ha podido conocer el papel
que desempea APC en el desarrollo del cncer de colon. La GSK-3 se encuentra
formando un complejo con APC, -catenina y axina. La fosforilacin de -catenina
por la enzima GSK-3, hace que -catenina sea diana para su degradacin
proteoltica va ubiquitina- proteasoma. Las formas de protena APC truncadas
producen la alteracin del complejo, con lo cual la -catenina no es degradada y se
acumula en el citoplasma celular. La -catenina libre es translocada al ncleo celular,
donde interacciona con los factores TCFs. El factor TCF4 es el miembro
predominante de esta familia de factores de transcripcin en clulas epiteliales de
colon.

Figura 5. Plipos premalignos en el epitelio de un colon humano .


5. Gen supresor BRCA1 y BRCA2
BRCA1 y BRCA2 son genes supresores de tumores que codifican las protenas que
funcionan en el proceso de reparacin del ADN. BRCA1 y BRCA2 son genes
supresores de tumores que codifican las protenas que funcionan en el proceso de
reparacin del ADN. Los genes BRCA1 y BRCA2 se identificaron a mediados del
decenio de 1990 como los causantes de la mayora de casos hereditarios de cncer
mamario (CM). Las mutaciones en BRCA tambin predisponen a la mujer al
desarrollo de cncer ovrico, la cual tiene ndice de mortalidad muy alto. Las
protenas BRCA forman parte de un gran complejo proteico que responde al dao en
el ADN y activa su reparacin. Las clulas con protenas BRCA mutantes contienen
ADN no reparado junto con otras anomalas, como una cantidad excesiva de
centrosomas, que pueden ocasionar una separacin anormal de los cromosomas. El
descubrimiento del gen BRCA1 abri paso a un mejor entendimiento tanto del cncer
de mama hereditario como del cncer de mama espordico y llev a nuevas opciones
teraputicas y preventivas. El gen BRCA1 fue nombrado por primera vez en 1991
por Mary-Claire King. Su grupo lo asign al cromosoma 17 en 17q21 la regin dentro
de la cual se encuentra el primer gen de susceptibilidad al CM, despus de analizar
la relacin de un gran grupo de familias con casos de cncer de mama detectado a
edades tempranas; pero el paso definitivo fue la identificacin de las mutaciones
truncadas en el cdigo de secuencia del BRCA1 en familias con mltiples casos de
cncer de mama. El gen BRCA1 esta compuesto de aproximadamente 100 kb del
DNA genmico y tiene 24 exones de los que 22 son traducidos, Su estructura es
inusual, con la mayora de los exones en el rango esperado (de 100-500 pb), pero con
el exn 11 constituyendo aproximadamente el 60% (alrededor de 3500 pb) de la
regin codificante. La transcripcin del gen origina un RNAm de 7.8 kb de longitud
del cual se traducen 5592 nucletidos, produciendo una prolena de 1863
aminocidos. Las mutaciones que se reportaron primero en el BRCA1 fueron
insercin, deleccin intrnica o mutaciones de tipo terminal (mutacin nonsense).
Estas mutaciones usualmente generan una protena BRCA1 acortada y no funcional.
Las tcnicas ms comnmente utilizadas para deteccin de mutaciones son la de
anlisis de protenas truncadas (PTT), la desnaturalizacin de cromatografa lquida
de alto rendimiento (DHPLC), amplificacin mltiple de sondas ligando-
dependientes (MLPA) y la secuenciacin directa de ADN. La tcnica del PTT ha
dado buenos resultados pero, sin duda, aunque su costo es ms elevado, el
secuenciamiento completo del gen es la mejor prueba.

Figura 6. El dao en el ADN causa roturas de la cadena de doble hlice e inicia la actividad de varias
protenas codificadas por genes supresores tumorales, que se reparan por un complejo proteico que incluye
BRCA1 y BRCA2. Las mutaciones en estos genes codificantes pueden bloquear el proceso de reparacin.
Al no repararse el ADN se activa un punto de revisin que conduce al incremento de p53, el cual activa la
expresin de p21 que detiene el ciclo celular o el gen Bax cuyo producto conduce a la apoptosis.

5.1 Tcnica de rastreo de mutaciones: Test de la protena truncada (PTT).


En esta tcnica se analiza el producto artificial (polipptido) sintetizado a partir de
un fragmento de ADN y de su estudio se deduce las posibles mutaciones.vEste
mtodo tambin denominado traduccin in vitro permite localizar las mutaciones
que producen terminacin prematura de la sntesis de protenas. Para ello se lleva
cabo una amplificacin mediante PCR del fragmento de ADN o cADN que se desea
estudiar. El producto de PCR resultante sirve de molde para la transcripcin mediante
una ARN polimerasa. El trnsito as obtenido se traduce a protena en un sistema de
traduccin in vitro que presenta todos los componentes necesarios para llevar a cabo
esa sntesis proteica. De esta forma se sintetiza una protena cuyo tamao y
composicin dependen de la secuencia amplificada mediante PCR. El posterior
anlisis del producto en geles de SDS-acrilamida nos permitir determinar si en ese
fragmento de ADN estudiado existe una mutacin que interrumpa la traduccin en
algn punto y produzca una protena truncada de menor tamao que la esperada. Esta
tcnica de rastreo de mutaciones presenta algunas ventajas sobre otros mtodos
descritos, ya que permite el estudio de regiones relativamente largas en cada
experimento, lo que es importante cuando se investiga un gen grande.

6. Gen WT1
Identificado inicialmente en el estudio de pacientes con tumores de Wilms,
actualmente se sabe que mutaciones en este gen estn presentes en el 10% de los casos
de pacientes con tumor de Wilms. Es un gen que se compone de 50kB con 10 exones.
Ubicado en la regin 11p13. Codifica para una protena de unin a ADN mediante
dedos de zinc en su extremo carboxilo terminal que se compone de 449 aminocidos.
Tiene un patrn hereditario autosmico dominante. Su principal funcin es la de
activar o inhibir la transcripcin de ms de 20 genes diferentes mediante su unin a
los promotores. Al ser un gen regulador de la transcripcin, el Wt1 interacta
induciendo la expresin de diferentes genes involucrados en la nefrognesis como lo
son: el factor de crecimiento epidrmico (FCE), la quimiokina CX3CL1, el factor de
transcripcin SLUG y JUNB. En cuanto al regulador transcripcional de desarrollo del
sistema urogenital PAX- 2, el WT1 se une a la zona del promotor de este gen,
inhibiendo su transcripcin. Ratones null para el PAX-2 presentan malformaciones
renales (agenesia renal), gonadales y ureterales. De manera inversa, el PAX-2 tiene
tambin un efecto estimulante y regulador sobre la expresin del WT1
El gen Wt1 es un gen que se expresa durante la organognesis del tracto urogenital,
especialmente en el epitelio que dar origen a los podocitos, lugar en donde su
expresin se mantendr hasta la adultez. De igual forma, este se expresa en el
mesnquima renal, epitelio glomerular y gnadas fetales. Otros rganos en los que se
expresa ste gen durante la organognesis son el bazo, corazn, glndulas adrenales,
mesotelio, mdula espinal y cerebro. Mltiples isoformas del Wt1 pueden ser
generadas por dos eventos de splicing alternante principales en dos regiones
diferentes. Gracias a los cambios que sufren las protenas al ser transcritas y mediante
splicing alternante, se han descrito alrededor de 32 formas postranscripcionales de la
protena WT1.Estos diferentes polipptidos formados son los que permiten dar las
diferentes funciones en la diferenciacin y proliferacin celular durante la
organognesis del TGU En el primer splicing se incluye una cadena de 17
aminocidos codificados por el exn 5 en el extremo N-terminal. El segundo est
determinado por la inclusin de tres aminocidos terminales (Lys, Thr y Ser) entre
los dedos 3 y 4 que dan origen a la isoforma KTS. Esta isoforma KTS+ tiene una alta
afinidad por el RNA lo cual le confiere una funcin en los cambios
postranscripcionales del RNA. Por el contrario, la isoforma KTS- tiene ms afinidad
por el DNA. Ratones homocigotos para KTS-, presentan fallas en el desarrollo renal
y genital con muerte temprana en la etapa neonatal, lo que sugiere que son necesarias
las dos copias del KTSs para el desarrollo normal de gnadas y riones.

7. Oncogenes
Los oncogenes son versiones mutantes de genes normales (llamados proto-
oncogenes), que dirigen la proliferacin celular. Las diferencias entre oncogenes y
genes normales pueden ser muy tenues. La protena mutante que un oncogen codifica
puede diferir de la versin sana por un solo aminocido. Pero esta simple alteracin
puede cambiar radicalmente la funcin de la protena. La mutacin ms comn,
causante de cncer, ocurre en el gene ras. Aproximadamente 30% de los cnceres
humanos portan un gene ras anormal. La transformacin maligna de una clula surge
a travs de la acumulacin de mutaciones, principalmente en dos clases especficas
de genes: 1) proto-oncogenes que estimulan la proliferacin celular y, 2) genes
supresores que inhiben la formacin de tumores. Colectivamente estas dos clases de
genes producen la proliferacin celular incontrolada observada en los cnceres
humanos. Las mutaciones en proto-oncogenes pueden producir demasiadas protenas
estimuladoras de la proliferacin. En contraste, los genes supresores contribuyen al
cncer cuando son inactivados por mutacin. La resultante prdida de las protenas
supresoras funcionales priva a la clula de frenos cruciales que previenen la
proliferacin inapropiada. En consecuencia, para que un tumor canceroso se
desarrolle deben ocurrir mutaciones en al menos media docena de genes que controlan
la proliferacin de la clula, adems de evadir la apoptosis

7.1.Propiedades funcionales de Oncogenes


Histricamente, los eventos de transformacin en el cncer como eventos de
iniciacin (que contribuyen a las primeras etapas de la transicin neoplsica) o la
progresin de eventos (refirindose a los procesos de transformacin). Los oncogenes
codifican protenas que controlan la proliferacin celular, la apoptosis, o ambas.
Pueden ser activados por alteraciones estructurales resultantes de la mutacin o fusin
gnica, por yuxtaposicin a elementos potenciadores o por amplificacin.
Translocaciones y mutaciones pueden ocurrir como eventos iniciadores o durante la
progresin tumoral, mientras que la amplificacin usualmente ocurre durante la
progresin. Los productos de oncogenes se pueden clasificar en seis grupos amplios:
Factores de transcripcin, remodeladores de cromatina, factores de crecimiento,
receptor de factor de crecimiento, transductores de seal y reguladores de apoptosis.

a) Factores de transcripcin
Los factores de transcripcin son a menudo miembros de familias de multigenes que
comparten dominios caractersticos Para actuar, muchos factores de transcripcin
requieren interaccin con otras protenas. En algunos tumores, por ejemplo, la
protena de transcripcin de Fos dimeriza con el factor de transcripcin Jun para
forman el factor de transcripcin AP1, y este complejo aumenta la expresin de varios
genes que controlan la divisin celular. Las translocaciones cromosmicas a menudo
activan genes de factores de transcripcin en los cnceres linfoides y algunas veces lo
hacen en tumores slidos (por ejemplo, cncer de prstata). En ciertos sarcomas, las
translocaciones de cromosomas dan como resultado protenas fusionadas
consecuentemente; En el sarcoma de Ewing, por ejemplo, el gen EWS se fusiona con
uno de varios asociados, lo que resulta en una aberrante actividad transcripcional de
las protenas fusionadas La protena EWS es una molcula de unin al ARN con un
dominio que, cuando se fusiona con un dominio heterlogo de unin al ADN, puede
estimular en gran medida la transcripcin de genes. Los carcinomas de prstata llevan
translocaciones del gen TMPR552 que fusionan y activan ERG1 O ETV1. Estos
genes son miembros de la familia de reguladores de transcripcin ETS, que pueden
activar o reprimir genes implicados en la proliferacin celular, diferenciacin y
apoptosis. La fusin de TMPR552, que tiene un promotor que responde a elementos
andrgenos, con un gen relacionado con ETS crea una protena de fusin que aumenta
la proliferacin y inhibe la apoptosis de las clulas de la glndula prosttica,
facilitando as su transformacin en clulas cancerosas.

b) Remodeladores de cromatina
Modificaciones en el grado de compactacin de la cromatina juegan un papel crtico
en el control de los genes expresin, replicacin y reparacin y de la segregacin del
cromosoma. Dos tipos de enzimas remodelan la cromatina: enzimas dependientes de
ATP que mueven las posiciones de los nucleosomas, las subunidades repetidas de las
histonas en cromatina alrededor de las cuales el ADN se enrolla y enzimas que
modifican el N-terminal de las colas de histonas. El patrn de modificacin de histona
constituye un cdigo epigentico que determina la interaccin entre nucleosomas y
las protenas asociadas con la cromatina Estas interacciones, a su vez, determinar la
estructura de la cromatina y su capacidad transcripcional. En la leucemia linfoctica
aguda y la enfermedad de Leucemia mielgena aguda, el gen ALL1 (tambin llamado
MLL) puede fusionarse con 1 de ms de 50 genes. ALL1 es parte de una multiprotena
muy grande y complejo estable. La mayora de las protenas en el complejo son
componentes de los complejos de transcripcin; otros estn implicados en la
metilacin de las histonas y el procesamiento del ARN. Todo el complejo remodela,
acetila, desacetila y metila nucleosomas y las histonas libres. La fusin de ALL1 con
1 de ms de 50 protenas da lugar a la formacin de las protenas quimricas que
subyacen a las clulas de leucemia linfoblstica aguda y leucemia mielgena aguda.
Protenas de fusin ALL1 (MLL) desregulan genes homeobox (que codifican factores
transcripcionales), el gen EPHA7 (que codifica un receptor Tirosina quinasa), y genes
de microARN tales como MiR191.

c) Factores de crecimiento
La activacin constitutiva de un gen del factor de crecimiento puede contribuir a la
transformacin maligna. El factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF)
consiste en cadenas y y se libera de las plaquetas durante la coagulacin. Puede
inducir la proliferacin de diferentes tipos de clulas y estimulan a los fibroblastos a
en la cicatrizacin de heridas. El oncogn sis de sarcoma simio es estructuralmente
similar al gen para la cadena beta de PDGF. La sobreexpresin de PDGF induce la
transformacin in vitro de fibroblastos que contienen receptores de PDGF; esto no
influye en los fibroblastos que carecen de estos receptores. Este ciclo autocrino
implica la sobreexpresin de PDGF-, la expresin del receptor PDGF-, y el
crecimiento celular no regulado. Un anticuerpo contra PDGF-, un anticuerpo contra
su receptor, o pequeas molculas que bloquean el receptor inhiben el crecimiento de
los fibroblastos transformados.
La familia WNT de glicoprotenas secretadas inhibe la fosforilacin de -catenina,
que estn involucrados en la adhesin clula-clula y la activacin de varias vas de
transduccin de seal. La protena APC controla la actividad de -catenina. En la
poliposis adenomatosa familiar, las mutaciones inactivadoras de APC bloquean la
degradacin de -catenina inhibiendo su fosforilacin. Como resultado, la -catenina
libre en el citoplasma se transloca al ncleo, donde se activa los genes implicados en
la proliferacin e invasin celular.

d) Receptores del Factor de Crecimiento


Los receptores del factor de crecimiento estn alterados en muchos cnceres. En
muchos tumores, una deleccin del dominio de unin al ligando del factor de receptor
de crecimiento epidrmico (EGFR), una protena transmembrana con actividad
tirosina quinasa, causa la activacin del receptor en ausencia de ligando. Los
receptores fosforilados activado de tirosinas en el dominio intracelular del receptor,
proporcionan sitios de interaccin para protenas citoplasmticas que contienen el
dominio homlogo SRC y otros dominios de unin. Estas interacciones desregulan la
sealizacin en varias vas. Mutaciones activadas ocurren en otros tres miembros de
la familia EGFR (ERBB2, ERBB3 y ERBB4) y dentro de los dominios quinasa de la
HER2/neu y los receptores de sealizacin KIT. Tales mutaciones ocurren en cncer
de pulmn, de mama y tumores del estroma gastrointestinal. Dos clases de agentes
anti-EGFR clnicamente activos han sido desarrollados: un anticuerpo monoclonal
contra el dominio extracelular del receptor (cetuximab) e inhibidores competitivos de
la actividad tirosina quinasa del receptor (Por ejemplo, erlotinib y gefitinib). El factor
de crecimiento endotelial vascular (VEGF) regula el control dependiente de hipoxia
de la transcripcin de genes. La actividad de VEGF es mediada por tres receptoras
tirosina quinasas: VEGFR1 (FLT1), VEGFR2 (FLK1 - KDR) y VEGFR3 (FLT4).
VEGF estimula la angiognesis en una variedad de cnceres,e inhibidores de VEGF
y de los VEGFRs han sido desarrollado. Bevacizumab es un anticuerpo monoclonal
anti-VEGF, y SU5412, una pequea molcula, se une al receptor tirosina quinasas de
VEGFR1 y VEGFR2, as como las quinasas del receptor de PDGF y KIT. Adems de
inhibir la quinasa ABL, el imatinib tambin inhibe el PDGF y receptor quinasas de
KIT. Tumores del estromal gastrointestinal que llevan mutaciones activadoras de KIT
responden a imatinib u otros inhibidores de estas quinasas receptoras.

e) Transductores de seal
La unin de las tirosina quinasas receptoras a los ligando apropiados provoca la
reorganizacin de los receptores y autofosforilacin de tirosinas en la porcin
intracelular de las molcula. La autofosforilacin aumenta la actividad quinasa del
receptor o promueve la interaccin del receptor con dominios de protenas
citoplasmticas que son efectores y reguladores de la sealizacin intracelular. En los
seres humanos, hay aproximadamente 120 homologas SRC, 2 dominios en 100
diferentes protenas que median las respuestas a las seales iniciadas por tirosinas
fosforiladas. Algunas de estas protenas comparten dominios con actividad
enzimtica, mientras que otros conectan receptores activados a aguas abajo. Muchos
oncogenes codifican a miembros de las vas de transduccin de seal. Estos se dividen
en dos grupos: no receptor protena quinasas y protenas de unin de guanosina-
trifosfato. Los no receptores de protenas quinasas son de dos tipos: tirosin quinasas
y serina treonina quinasas. Protenas implicadas en la transduccin de seales se
vuelven oncognicas si tienen mutaciones activadas.

f) Reguladores de Apoptosis
La generacin de oncogenes o inactivacin de genes supresores tumorales dentro de
una clula puede inducir apoptosis. La destruccin de una clula daada es mala para
ella misma, pero tiene sentido para el organismo completo de un individuo. Las
clulas cancerosas que emergen en nuestro tejido parecen evadir exitosamente la
apoptosis, a pesar de sus disturbios genticos. La protena p53, entre sus mltiples
funciones, contribuye a disparar el suicidio celular; su inactivacin en muchas clulas
tumorales reduce la probabilidad de que clulas genticamente alteradas sean
eliminadas. Las clulas tumorales pueden entonces elaborar cantidades excesivas de
la protena Bcl-2, la cual previene eficientemente la apoptosis. El gen BCL2, que
participa en la iniciacin de casi todos los linfomas foliculares y algunos linfomas
difusos de clulas B, codifica una protena citoplasmtica que se localiza en la
mitocondria y aumenta la supervivencia celular mediante la inhibicin de la apoptosis.
BCL2 tambin es importante en pacientes con leucemia linfoctica crnica y cncer
de pulmn. Miembros de la familia BCL2 (BCL-XL y BCL2) inhiben la apoptosis y
estn regulados en muchos tipos de cncer. Dos vas principales conducen a la
apoptosis: la va del estrs y la va del receptor de la muerte. La primera es
desencadenada por protenas que contienen el BCL2 homlogo de dominio 3. Este
dominio inactiva BCL2 y BCL-XL (que normalmente inhiben la apoptosis) y por lo
tanto activa las caspasas que inducen la apoptosis. Drogas que imitan el dominio
BCL2 homologo 3 y pueden unirse a BCL-XL o BCL2 (pptidos o pequeas
molculas orgnicas que se unen en una ranura de estas protenas) estn en desarrollo.
Este enfoque ha atrado considerable atencin porque muchos tumores sobre expresan
BCL2 o protenas relacionadas. La va de receptor muerte- est activada por la unin
del ligando Fas, TRAIL y el factor de necrosis tumoral , a su correspondiente
receptores en la superficie celular. Receptores de activacin de la muerte activan
caspasas que causan muerte celular

7.2.Los oncogenes como objetivos teraputicos


Protenas oncognicas en las clulas cancerosas pueden ser marcadas por pequeas
molculas, cuando la protena oncognica se expresa en la superficie celular mediante
anticuerpos. El imatinib marca el paso inicial de las multietapa en la leucemia
mielgena crnica. El mismo frmaco puede afectar receptor quinasas de KIT y
PDGFR. De inters particular son los inhibidores de la familia BCL2, que pueden
inducir la muerte apopttica de las clulas cancerosas. En la leucemia promieloctica
agudo, que es iniciada por una translocacin cromosmica t(15; 17) que fusiona el
gen PML a RAR (un receptor nuclear para cido retinoico; El cido retinoico puede
inducir diferenciacin terminal y muerte de clulas APL. Esta modalidad se llama
terapia de diferenciacin.

a) Genes MicroRNA
Genes microRNA, a diferencia de otros genes implicados en cncer, no codifican
protenas. En cambio, los productos de estos genes consisten en una nica cadena de
ARN de aproximadamente 21 a 23 nucletidos; Su funcin es regular la expresin
gnica. Una molcula de microARN pueden unirse a un ARN mensajero (mRNA)
que contiene una secuencia de nucletidos que complementa la secuencia del
microRNA. . De esta manera, el microRNA bloquea la traduccin o causa la
degradacin del mRNA. Ejemplos del papel del microRNA en la fisiopatologa del
cncer implican miR-15a y miR-16-1, que se eliminan o son regulados en la mayora
de los casos indolentes de leucemia linfoctica, lo que sugiere un evento temprano en
la patognesis de esta enfermedad. La cartografa de numerosos genes microRNA ha
demostrado que muchos ocurren en regiones cromosmicas que se someten a
reordenamientos, delecciones y amplificaciones en las clulas cancerosas. Las
regiones del genoma que estn constantemente involucrados en reordenamientos en
las clulas cancerosas, carecen de oncogenes o genes supresores de tumores para
albergar genes de microARN. El perfil de expresin de genes microRNA ha revelado
firmas asociadas con la clasificacin de tumores, diagnstico, estadificacin y
progresin, as como el pronstico y la respuesta al tratamiento. Por ejemplo, el perfil
de expresin de microARN puede distinguir entre formas indolentes y agresivas de
leucemia linfoctica crnica, y la expresin de un pequeo grupo de genes de
microARN se correlaciona con el pronstico en el cncer de pulmn en estadio 1.
Algunos genes de microARN que se desregulan en la leucemia linfoctica crnica
tienen lneas germinales o mutaciones somticas en un precursor de microARN que
afectan al procesamiento de las molculas microRNA. Genes MicroRNA puede ser
regulada hacia arriba o abajo en las clulas cancerosas. Los genes regulados hacia
arriba funcionan como oncogenes reguladores de los genes supresores de tumores,
mientras que los genes regulados hacia abajo funcionan como genes supresores de
tumores por la regulacin de los oncogenes. La funcin de los genes microRNA
depende de sus dianas en un tejido especfico. Un gen microARN puede ser un
supresor de tumores si en una clula dada su marcador crtico es un oncogn, y puede
ser un oncogn si en un tipo de clula diferente su marcador es un gen supresor de
tumores.

8. Diagnstico molecular en gentica mdica


En los ltimos aos los avances en el estudio del genoma humano y el desarrollo de
las tcnicas moleculares han posibilitado un mayor conocimiento de la relacin entre
genes y enfermedad, de forma que los anlisis moleculares se han incorporado, como
una herramienta fundamental, en el diagnstico y tratamiento de muchas
enfermedades. El conjunto de tcnicas moleculares permite abordar los estudios desde
diferentes puntos de vista dependiendo del estado de conocimiento del gen o genes
implicados y de las propias tcnicas empleadas.
8.1. PCR (Reaccin en cadena de la polimerasa)
La tcnica, descrita por Mullis en 1983, se ha convertido en el punto de partida de
la mayora de los estudios genticos por ser un procedimiento asequible y rpido.
Se trata de un mtodo de sntesis enzimtica in vitro de secuencias especficas de
ADN. A partir de ADN genmico, mitocondrial o incluso ARN, se genera un
nmero de copias de un fragmento de ADN concreto, suficiente para su estudio,
que se analizan rutinariamente en geles de poliacrilamida o agarosa. La carga
negativa de las molculas de ADN hace que stas migren hacia el polo positivo, a
una distancia que depende de su tamao y estructura, cuando son sometidas a un
campo elctrico. La forma de afrontar un estudio gentico depende de si se conoce
el gen implicado y si existen mutaciones concretas responsables
8.1.1. Anlisis indirecto
Cuando no se conoce el gen implicado en una determinada enfermedad, se
estudian marcadores ligados a ella, generalmente mini y microsatlites, que son
polimorfismos (variaciones no patolgicas) que existen en el ADN y que se
heredan segn las leyes de Mendel. Si el polimorfismo se encuentra en el mismo
cromosoma que el gen en cuestin, se dice que estn ligados y la distancia entre
ellos se mide por la frecuencia con la que ocurre un sobrecruzamiento
(recombinacin) entre ambos durante la meiosis. Cuanto menor sea esta distancia,
mayor es la probabilidad de que ambos rasgos (enfermedad y polimorfismo) se
transmitan unidos en la descendencia. As, estos estudios moleculares nos
ayudarn en el consejo gentico, aunque no conozcamos el gen causante de la
enfermedad.
8.1.2. Anlisis directo
Cuando se conoce el gen implicado en la enfermedad, se estudia ste directamente,
con diferentes aproximaciones dependiendo de que el ADN se estudie para
detectar una mutacin concreta o bien que tengamos que rastrear el gen completo
para intentar localizar cualquier variacin en su secuencia.

Tcnicas de rastreo de mutaciones


Son en general tcnicas que ponen de manifiesto variaciones (mutaciones o
polimorfismos) en la secuencia de uno o de los 2 alelos del gen, pero no permite
especificar en qu consiste ese cambio, ni en qu posicin se encuentra. Se
estudian genes enteros, amplificndolos mediante PCR, en pequeos fragmentos
de 100-900 pares de bases. Los productos de PCR se someten posteriormente a un
anlisis electrofortico en diferentes condiciones. Las tcnicas ms utilizadas en
el rastreo de mutaciones son: anlisis de heterodplex, polimorfismos de cadena
sencilla (SSCP), electroforesis en geles de gradiente desnaturalizante (DGGE).
Todas ellas se utilizan en la actualidad en el estudio de genes como APC (poliposis
colnica familiar), BRCA-1 (cncer de mama), etc. Recientemente se han
desarrollado mtodos de secuenciacin no radiactivos de productos de PCR, que
permiten su uso tanto en la confirmacin y caracterizacin de las mutaciones
detectadas previamente por mtodos de rastreo como en el estudio directo de
mutaciones.
Tcnicas de deteccin de mutaciones
Estas tcnicas son ms sencillas ya que persiguen la demostracin de la presencia
o ausencia de una mutacin especfica previamente descrita y no un rastreo de
mutaciones en todo un gen. Se emplean en enfermedades donde la mayora de la
poblacin afectada tiene una o varias mutaciones concretas: hemocromatosis (2
mutaciones), distrofia muscular de Duchenne (delecciones), linfomas
(reordenamiento gen bcl-2), etc. Tambin se emplean para el diagnstico clnico
y presintomtico en familias en las que el previo rastreo de mutaciones ha dado
lugar a la caracterizacin de una mutacin especfica. Se parte generalmente de
un fragmento de ADN amplificado por PCR. Entre las ms utilizadas se
encuentran: presencia/ausencia de producto de PCR, tamao del producto de
amplificacin, digestin con enzimas de restriccin, amplificacin especfica de
alelos.

8.2. Hibridacin in situ

Es una tcnica que combina la citogentica clsica con mtodos moleculares. Su


gran sensibilidad permite detectar y localizar secuencias especficas de cidos
nucleicos en cromosomas, clulas y tejidos preservados morfolgicamente. La
tcnica utiliza fragmentos de ADN o ARN marcados (sondas), que hibridan
especficamente con sus secuencias complementarias de ADN presentes en
cromosomas, clulas interfsicas y mitocondrias o ARN citoplsmico, formando
hbridos estables que luego pueden ser detectados. Existen diferentes sondas
diseadas para multitud de aplicaciones en medicina. Se utilizan para detectar
aneuploidas, alteraciones del nmero cromosmico que son responsables de
numerosos sndromes: Down (trisoma 21), Patau (trisoma 13), Turner (X0), etc.
y pueden ser diagnosticados o confirmados por hibridacin in situ. Las
aneuploidas pueden detectarse en lquido amnitico sin cultivar, pudindose
descartar las ms frecuentes en pocas horas. Dado que las aneuploidas suponen
las aberraciones cromosmicas ms frecuentes en los nacidos vivos con algn
defecto, la hibridacin in situ puede proporcionar informacin rpida en el
diagnstico prenatal. Las alteraciones en el nmero de cromosomas son tambin
muy frecuentes en procesos malignos y se manifiestan en tumores slidos y
leucemia. Muchas de estas alteraciones estn asociadas a tumores concretos
(trisoma 12 en leucemia linfoctica crnica) que varan con la evolucin de la
enfermedad. La utilizacin de sondas que permiten contar cromosomas es, por
tanto, de gran utilidad en el diagnstico y seguimiento de numerosos tipos de
cncer diferentes. Tambin hay sondas que hibridan especficamente a lo largo de
todo el cromosoma. Slo se utilizan en clulas en metafase y permiten la
identificacin del par cromosmico que deseemos. Son de gran utilidad en el
estudio de translocaciones e inserciones y se utilizan principalmente en la
caracterizacin de cromosomas marcadores, tanto en gentica del cncer como en
el diagnstico prenatal. Existen otras sondas especficas de locus que, aunque
se pueden utilizar para contar cromosomas, estn diseadas para la localizacin
de secuencias gnicas. Se usan en el estudio de microdelecciones que no pueden
detectarse por citogentica y que son responsables de diferentes sndromes como
el del maullido de gato, el sndrome de Williams, etc. Tambin son de gran utilidad
en el diagnstico, pronstico y seguimiento de enfermos de cncer que presentan
clulas con microdelecciones (5q en sndromes mielodisplsicos),
reordenamientos (bcr/abl en la leucemia mieloide crnica) o amplificaciones
gnicas (N-Myc en el neuroblastoma). En la actualidad se ha puesto a punto la
tecnologa necesaria para el anlisis automtico de imgenes, que permite la
utilizacin simultnea de multitud de sondas marcadas con mezclas de
fluorocromos que son percibidas como colores diferentes por el analizados,
aunque no son distinguibles por el ojo humano. Esta tecnologa permite hibridar
todos los cromosomas simultneamente, obtenindose un cariotipo de 24 colores,
o incluso obtener un patrn de bandas de colores asignando diferentes
combinaciones de fluorocromos a sondas de regiones cromosmicas diferentes.
La hibridacin in situ es una tcnica de gran sensibilidad y especificidad, que
mejora la capacidad de la citogentica clsica en la deteccin de alteraciones.
Generalmente se utilizan conjuntamente, pero la hibridacin in situ es insustituible
en el estudio de alteraciones muy pequeas, cuando los cultivos no crecen bien y
no pueden obtenerse metafases para su estudio, o cuando el tiempo es el factor
limitante del anlisis.
8.3.Microarrays (microchips de ADN)
El chip de ADN es hasta ahora la ltima de las tcnicas que utilizan una de las
caractersticas bsicas de los cidos nucleicos: la complementariedad de secuencia
de las 2 cadenas. Los polinucletidos a ensayar (sondas) se unen covalentemente
a un soporte rgido (cristal) que posteriormente se hibridar con las muestras de
ADN y se analizarn automticamente. Los microchips de ADN estn empezando
a utilizarse en mltiples aplicaciones:
Anlisis de expresin gnica
La mayora de los estudios basados en esta tecnologa son de monitorizacin de
niveles de expresin de ARN. Estos estudios se pueden realizar con chips de
polinucletidos derivados del extremo 3 del transcrito de ARN. Esta matriz se
hibrida entonces con el ADNc fluorescente (procedente del transcrito celular) que
se desea estudiar, determinndose as la cantidad de transcrito presente en la clula
por la seal fluorescente generada.
Genotipicacin
Permite el anlisis de cientos de miles de loci en un elevado nmero de muestras
de ADN al mismo tiempo, posibilitando los estudios de asociacin gnica y el
esclarecimiento de la contribucin gentica en enfermedades polignicas
complejas.
Anlisis de mutaciones
Esta tecnologa permite el estudio de todas las posibles variaciones en la secuencia
de un fragmento de ADN.
BIBLIOGRAFA
ngel M. Oncogenes. VERTIENTES Revista especializada en Ciencias de la
Salud. 1 (2): 41-45. 1998.
Carlo C. Oncogenes and cancer. New England Journal of Medicine. 2008;
358:502-11.
C. M. Cabrera y M. A. Lpez-Nevot. APC e inestabilidad cromosmica en el cncer
de colon Rev. Esp. Enferm.Dig.2005; 97(10): 738-743-
Karp G. Biologa celular y molecular. Conceptos y experimentos 4ta. Edicin
McGraw-Hill Interamericana. 2006.
Mara R., Mait H. Los genes supresores de tumores y el cncer. Rev. Cubana de
Oncologa 2001; 18 (1): 65-71.
Mara S. Genes supresores de tumores. Acta cancerolgica N 3, 1993.

M. Lpez, M. Anzola, N. Cuevas-Salazar, J.M. Aguirre, M. Martnez de Pancorbo.


p53, un gen supresor tumoral. Gaceta Mdica de Bilbao VOL. 98 N. 1 Ene.-
Mar. 2001.
Maricela R., Martha P., Mauricio S. Perspectivas en la genmica del retinoblastoma:
Implicaciones del gen supresor de tumor RB1. Revista de investigacin clnica. -
Vol. 57- N 4 Julio-Agosto 2005: 572-581.
Nicols F., Vctor F., Jaime P. Gen WT-1. Expresin en la nefrognesis Revista
Urologa Colombiana - Vol. XVIII, No. 3: pp 113-120, 2009.
Steven N., Adriana R., Predisposicin gentica para el cncer de mama: genes
BRCA1 y BRCA2 Salud Pblica de Mxico - vol. 53, no. 5 - Septiembre-octubre de
2011.
Vallcorba G. Diagnstico molecular en gentica mdica