8/8/2017 LII.

SEPARACIN DE LA ALBUMINA DE SUERO EN DOS FRACCIONES

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LII. SEPARACIN de la albmina srica

En dos fracciones
II. OBSERVACIONES SOBRE LA NATURALEZA DE
LA FRACCIN DE GLICOPROTENA

Por LESLIE FRANK HEWITT

De los Laboratorios Belmont (London County Council),
Sutton, Surrey
(Recibido el 1 de enero de 1937)
EXPERIMENTOS informaron recientemente llevado a la conclusin de que la albmina srica,
cuando
incluso se obtiene en el estado cristalino, contiene cantidades considerables de
otra protena que es extrable slo con dificultad [Hewitt, 1936]. Eso
aparecera por lo tanto que el material considerado como razonablemente puro y se usa
como el pointof de partida muchas investigaciones era una mezcla de diferentes protenas.
Una clara separacin de la fraccin de albmina de suero de caballo en dos
distintas fracciones de muy diferentes propiedades qumicas y fsicas fue
descrito en la antigua de papel. Una de las fracciones era suero cristalino
albmina en un estado ms puro que alcanza normalmente y era prcticamente libre de
polisacrido. Puesto que la fraccin de albmina total de suero contiene considerable
cantidades de polisacrido no es de extraar que la segunda fraccin aislada
contenida una glicoprotena, cuya identidad no fue establecida.
En vista de la posible importancia de estas observaciones, los experimentos
ahora descrito se llevaron a cabo con el fin de obtener furtherevidence en apoyo
de las conclusiones alcanzadas y para recoger ms informacin acerca de la glico-
protena presente en la segunda fraccin de albmina de suero.

NOMENCLATURA
La falta de una nomenclatura claramente definido conduce a dificultades en la discusin de estas
albmina derivado originalmente de clara de huevo, hasbeen aplicarse a cualquier material de protena pero su
plazo, los
protenas.
uso general, ahora se limita a protenas solublein 50%, pero insolublein 100% saturado
solucin de sulfato de amonio. Hay, sin embargo, ningn nombre disponible, excepto la albmina de aplicar
la
a protena libre de carbohidratos cristalizable presente en la fraccin de albmina de suero. El de-
cripcin cristalino albmina de suero, adems de ser engorroso no es necesariamente preciso, ya que la
protena se puede precipitar en un no cristalino conditionand que es, en efecto generalmente encontr
en solucin. Parecera, pues, que existe la necesidad de una nueva palabra para describir esta protena.
El nombre debe sugerir la capacidad de cristalizacin de la protena y su ocurrencia en la albmina
fraccin. Se sugiere que crystalbumin podra ser apropiada, y por comodidad este trmino
se utilizar a lo largo de este documento.
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cussed
En una
pero
seccin
en lasposterior
seccionesdeanteriores
la identidadsedehace
thesecond
referencia
protena presente
en trminos generales
en la como
fraccin
unade
glicoprotena.
albmina es dis-
EXPERIMENTAL
Los mtodos generales utilizados fueron similares a los previamente descrito [Hewitt,
1936]. Plasma HQrse era la fuente de las protenas empleadas. Protena deter-
minations se llevaron a cabo por el mtodo de micro-Kjeldahl y en vista de la
(360)

Pgina 2

* SEROGLYCOID 361
N variables contenidos de diferentes fracciones de un factor de conversin de 7 0, que corresponde
a un contenido de protena-N de 14-3%, se us en todo.
Determinaciones de hidratos de carbono se basan en los mtodos de Tillmans &
Filipo [1929] y Sorensen y Haugaard [1933], con modificaciones que eran
encontrado para ser mejoras. Los reactivos utilizados fueron de 60% (en volumen) H2S04 y
1-6% de orcinol en 30% de H2SO4; y una solucin de partes iguales de galactosa y
Manosa se utiliz para la comparacin. 1 ml. De solucin, correspondiente a 0-02-
0-2 mg. De carbohidrato, se calent con 2-5 ml. de 1-6% de solucin de orcinol y
15 ml. de 60% de H2 $ 04 en un punto de ebullicin de tubo 7 x 1 in. en un bao de agua a 800C durante
Al
20 final
min. de este tiempo el tubo se sumergi en agua fra. Colorimtrico
comparacin se llev a cabo mediante la medicin de los coeficientes de extincin de 20 mm.
capas en un Stufen-fotmetro utilizando el azul (470 de la mezcla) y el verde (530 m, u)
Ifiters Es necesario tomar ciertas precauciones para obtener resultados reproducibles.
Una curva debe beconstructed relacionar los coeficientes de extincin a la carbo-
contenido de hidrato, y las soluciones deben ser protegidos de la luz a fin de evitar
cambios fotoqumicos. El uso de correcciones "en blanco" mediante el calentamiento de la protena
y cido sulfrico por s sola no puede ser justificado, ya que procede de formacin humin
de manera diferente en la presencia y ausencia de orcinol. Sobre la base de la obra de
Frankel y Jellinek [1927], Levene y Mori [1929], Rimington [1929; 1931],
S0rensen y Haugaard [1933] y Bierry [1934] se supone que el poli-
sacrido presente en las protenas es la galactosa-manosa-glucosamina (GMG)
Y los clculos se basan en esta suposicin.
Dado que el trabajo ya se ha informado de cinco lotes de albmina, cada uno obtiene
de 25 litros de plasma de caballo, se han fraccionado. Los detalles se
Para ahorrar espacio, pero se puede afirmar thatthe resultados anteriores han sido
confirmado.
Por crystalbuminis recristalizacin repetidas obtenido que contiene slo
trazas de hidratos de carbono (menos de 0,1% en los doce veces recristalizaron
Especmenes). Las fracciones crystalbumin se diferencian claramente de la
glicoprotena fracciones que contienen ms de 4% de polisacrido. ahora
se mantuvo para obtener la glicoprotena tan pura como la naturaleza del material que lo hara
permiten, y se inici una serie de fraccionamientos con este objeto a la vista, la
contenido de polisacridos se toma como el ndice principal para el curso de la
Fraccionamiento. Es ms difcil, en general, para purificar el con- ms soluble
constituyente de una mezcla que la menos soluble y la tenacidad con la que el
fracciones aparecieron a adherirse hecho su separacin ms difcil de lo que es habitual
incluso con las protenas. mtodos Fratiotio

Fraccin S tena el ms alto contenido de polisacrido (9,5%) de las fracciones

se mencion anteriormente, y se puede afirmar a la vez que se encontr difcil
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Elevar
fraccinelsecontenido de polisacridos
haba mantenido dedespus
en solucin cualquier fraccin
de la muy de
eliminacin porlaencima
fraccindecristalina
esta cifra.
y Esta
se volvi a precipitar con 2 2SO4 saturado (NH4). No es necesario
muchos fraccionamientos que fallaron para producir una fraccin de apreciablemente mayor
contenido de polisacridos de S, pero se puede hacer mencin del contenido ms alto
Alcanzado en cualquier proceso de refraccin de salting-out. La protena original (B) tena
7,3% de polisacrido y la precipitacin con 2 2SO4 saturado (NH4) separados
en uno fraccin (63 mg.) que contiene 10% de polisacrido y una segunda fraccin
(107 mg.) Que contiene slo el 5,7% de GMG No hay fraccionamientos con (NH4) 2SO4
tuvieron xito en elevar el contenido de polisacridos por encima de 10% e
El fraccionamiento con disolventes orgnicos. La glicoprotena se precipit bastante
fcilmente por alcohol etlico y esto sugiri un posible mtodo para efectuar
23-2

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362 362 LF HEWITT

Fraccionamiento. Solucin de
alcohol. El precipitado se centrifug, enfriada
protena se volvi a disolverse aadi a un volumen
en agua igual
y se volvi de
a precipitar
con alcohol. De esta manera el contenido de polisacrido de la fraccin (H) era
enfriado
levantado de 8-5 9 * 6%. Los intentos de obtener una separacin ms considerable de
fracciones fueron infructuosos. La precipitacin con alcohol de metilo y acetona
fallado en proporcionar un mtodo satisfactorio de fraccionamiento.
Precipitacin Alum. La albmina es precipitable por alumbre de potasio y los
intentos para utilizar este hecho en un proceso de fraccionamiento. 1-5 ml. de 5% de
se hicieron
alumbre se aadieron a 9 ml. de solucin de 0-4% de protena (fraccin H) y el
potasio
precipitacin
mximo
protena contena 8-6%mediante
se obtuvo la adicin
de polisacrido 0-1
de 3,3precipitada
y la protena ml. de NaOH7-1%. N. El precipitado

Cuando la zona de precipitacin se abord desde el lado alcalino, mediante la

el lcali a la protena antes de la solucin de alumbre, el fraccionamiento fue UN-
de protenas precipitadas y sin
adicin
xito, las precipitar tener muy similar
contenido de polisacrido.
Tricloroactico y cidos tngstico. Una concentracin bastante alta de
cido actico es necesario para precipitar la glicoprotena a partir de soluciones
en 1tricloro-
Soluciones% de protena
consistente.deEllauso
adicin de cido tricloroactico al 2-2% no dio
diluidas,
ningn fraccionamiento
pero de cido tngstico fue igualmente
Calor-coagulacin. Se inform en la comunicacin anterior que, aunque
infructuosos.
crystalbumin coagula rpidamente al calentarla en el punto isoelctrico a aproximadamente
600,fracciones de glucoprotena, por el contrario, se coagulan slo con
las
y a temperaturas
adificultad
una temperatura
llevando abajo con l
superiores
la
80tuvieron
intermediaa no
glicoprotena.
.fenmenos
Los
Los intentos
xito, la protena
de
separar las fracciones de
paracoagulable
calor-coagulacin en la
calefaccin
fracciones de glicoprotena ahora se han estudiado en una variedad de experimental
Condiciones. Soluciones de las fracciones de glicoprotena B y H que contiene aproxi-
madamente 1%de la protena se ajustaron a pH 4-8 y se calent en un punto de
baera.aComo
ebullicin
aadi slocaliente
la solucin se observ muy leve
y se produjo una coagulacin lcali
coagulacin,considerable.
diluido y cido eran
En ninguno
caso eran el contenido de polisacridos de la precipitado y sin precipitar
de agua
protenas apreciablemente diferente. En otro experimento, el con- experimental
diciones eran los mismos, pero se emple una solucin de protena de menos de 01%.
En este caso el contenido de polisacridos de la protena no coagulada alcanz
Casi el 11,5%.
Las condiciones para obtener la coagulacin satisfactoria estaban ahora estudiados.
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Fraccin
de pH
S se diluy
protena.
aaproximadamente
un diferente ml.con solucin salina
porciones
10 mediante la se transfirieron
adicin de cido a ocho
diluido o cada uno
fisiolgica
tubos
un y hasta
lcali. No
que contena
se utilizaronsesales
debido
ajust a los efectos de
0-15% confusin de diferentes soluciones tampn [Hewitt, 1929]. los
tampn
valores de pH variaron de 4-0 frente a 8-1. Los tubos se sumergieron en una de
Bao durante 10 min. pero slo uno de los tubos mostraron ninguna coagulacin y este fue
muy leve. La muestra en la que se haba producido la coagulacin se haba ajustado a
ebullicin
pH 4-6 antes del calentamiento
de agua y fue a pH 5-0 despus del calentamiento. Los
diversos grados de opalescencia, siendo mayor en aquellos tubos adyacente a
otros
pH 4-8tubos mostraron
y menos en las personas ms eliminadas de este pH. Las muestras se
se enfri y cada uno se ajust a pH 4-7 o 4-8. No se produjo la precipitacin y
los tubos se sumergieron en un bao de agua hirviendo durante una segunda vez durante 5
Coagulacin ahora se produjo en grado variable en cada tubo, excepto el uno
min.
previamente calentada a pH 4-0, que meramente desarroll una ligera opalescencia. los
cantidad de precipitacin fue mayor en el tubo calentado inicialmente a pH 6-1
y menos en los tubos retira ms lejos de este pH. El polisacrido con-

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SEROGLYCOID 363
Se determinaron las tiendas de las protenas que permanecan no coaguladas y los resultados
del experimento se resumen en la Tabla I.

Tabla I. Efecto de soluciones de glicoprotena de calentamiento que contiene 1-38 mg. de

De protena por 1 ml, primero a diferentes niveles de pH y luego a pH 4-8
Protena Polisacrido
Coagulado contenido de
PH de Opalescencia Despus del segundo
No coagulado
Muestra primero Despus de la primera
calefaccin protena
no. calefaccincalefaccin Mg / ml. %
1 8-1 - 003 9-3
2 7-1 - 0 * 12 10-2
3 6-6 - 0 45 11,7
4 6-1 - 0-48 10-8
5 5,9 T 0-39 11-4
6 5-6 yo 009 10.1
7 5.0 + 0 * 05 9-8
8 4.1 - 0 9-3
Se ver que el contenido de polisacrido ms altas (aproximadamente 11%) son
Alcanzado en las muestras calentadas originalmente a valores de pH entre 5-8 y 6-6, y
el contenido de polisacridos ms bajos en las muestras calentadas a valores de pH ms lejano
Eliminado de este rango. Las protenas que permanecan no coaguladas en las muestras 3, 4
y 5 estn, a juzgar por su alto contenido en polisacridos, como casi puro
especmenes de la glicoprotena como cualquier obtenidos hasta la fecha y la repeticin con otro
muestras de glicoprotena dieron resultados similares, pero hay varios puntos adicionales
de inters en el experimento.
Con el fin de obtener la mxima coagulacin en estas soluciones de glicoprotenas se
fue necesario calor a dos niveles de pH diferentes, ambos bastante definitivamente fijada.
La protena coagulable y la glicoprotena no coagulable parecen estar combinadas
en cierta medida y el primer calentamiento (a pH 6,0) es necesario para efectuar la disociacin
del complejo, mientras que el segundo calentamiento (a pH 4,8) se coagula la protena
disociado durante el primer calentamiento. En soluciones ms concentradas disociacin
del complejo no se produce y la glicoprotena se realiza en el
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cogulo, como se describe anteriormente.

Determinaciones de cistina
El contenido de cistina de las fracciones han demostrado ser de gran valor en con-
Sidering su identidad. El mtodo utilizado para determinar cystinewas basa en
[1931] modificacin til de Tompsett del mtodo de Folin y Marenzi de [1929] y
se puede aplicar a las cantidades de protena tan pequea como 50 mg. De 10 a 20 ml. de
HCI concentrado puro se colocan en un 100 ml. Matraz de Kjeldahl y se calienta a
punto de ebullicin. La solucin de protena (1-5 ml. Que contiene 40-120 mg. De protena)
se pipetean directamente en el cido hirviendo. El frasco. se calienta en una elctrica
bao de arena, thecontents se mantiene simplemente hirviendo durante 18 horas. El hidrolizado es
luego se evapor hasta sequedad a vaco, el residuo se disuelve en agua y la
volumen se completa hasta 25 ml. en un matraz graduado. Humin se separ por filtracin y una
parte alcuota del filtrado se toma para el anlisis. En los presentes experimentos
1-6 ml. de filtrado se utilizaron para cada determinacin, el volumen final de la
soluciones colorimtricos ser 25 ml., y 0-2-0-5 mg. de cistina se utiliz para
comparacin. A cada matraz 0-8 ml. de 20% se aadi Na2SO3 y despus de 2 min.
5 ml. de 8% de NaHCO3 y luego 2 ml. del reactivo de cido rico (libre de fenol
reactivo) de Folin y Marenzi [1929]. El color se desarrolla rpidamente y despus de

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10 minutos. los coeficientes de extincin de las soluciones se miden en un Stufen-
Fotmetro, 20 mm. Capas de solucin que se utilizan. Cuando el filtro rojo S 72
(aproximada de longitud de onda 720 m / u) se utiliza la extincin coeficientes tienen una
relacin casi lineal con la cantidad de cistina utilizado para el anlisis. los
Color marrn de los hidrolizados de glicoprotenas tiende a hacer colori-
La comparacin mtrica del color azul se desarroll muy difcil, como se ver
de la Tabla II que da los coeficientes de extincin de las soluciones colorimtricos
Utilizado durante el anlisis de los hidrolizados de una glicoprotena (S) y de un
Cristalina. Las cifras dadas por 0-4 mg. De cistina se incluyen para
Parisina
Tabla II. Los coeficientes de extincin (2 k.) De 20 mm. capas de soluciones utilizadas
Para determinaciones de cistina
Filtrar color 0-4 mg. Cistina Glicoprotena Cristalina
S 43 Azul 0-16 0-22 0-23
S47 Azul 0,19 0-22 0-29
S 50 Verde 0-25 0-24 0-36
S 53 Verde 0-36 0,35 0-53
S 57 Amarillo 0 * 51 0 * 44 0-72
S 61 rojo 0-66 055 093
S 72 rojo 1,08 0-83 1-40
S 75 rojo 1,10 0-84 1-45
En el caso de la glicoprotena, la comparacin de los coeficientes para el rojo
filtro S 72 da una cistina equivalente de 0-31 mg. Pero utilizando luz azul (filtro S 43)
una cifra de 0 55 mg. se obtiene debido a que el color amarillo del hidrolizado
s mismo. En el caso de la cristalina, la discrepancia con los diferentes
Color es mucho menos, las cifras son 0-52 y 0 57 mg. respectivamente. Esta
ltimo hecho ilustra la gran diferencia en el comportamiento de la glicoprotena y
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crystalbumin
de cuando
un color marrn y sesedeposita
calientauncon HCl concentrado.
precipitado La glicoprotena
negro de humin mientras quedesarrollado
la
La cristalina permaneci casi incolora.
Los resultados de las determinaciones de cistina de diversas fracciones se dan en
Tabla III, en la que estn incluidos tambin los contenidos de polisacridos para la comparacin.
Tabla III
Polisacrido Cistina
Fraccin contenido % contenido%
mi 0,05 5-8
METRO 0-09 5-4
R 4.3 4-1
norte 5,6 2-4
K 6-6 2*3
MARIDO 8-5 2-1
segundo 7-3 1.9
S 9,5 1-8
En cada caso las crystalbumins con bajos contenidos de polisacridos tienen un alto
contenido de cistina, mientras que las glicoprotenas tienen bajos contenidos de cistina. No slo es
esta de inters en demostrar una vez ms las propiedades de contraste de la
dos protenas pero le permite a ciertas conclusiones que se pueden extraer en relacin con la
Naturaleza y composicin de la fraccin glicoproteica. Se discute este ltimo punto
En la siguiente seccin.

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SEROGLYCOID 365

Discusin
Los experimentos reiterados confirman la conclusin anteriormente
Se puede obtener una recristalizacin simple de albmina srica prcticamente exenta de
polisacrido. La importancia de esto radica en el hecho de que casi cada espcimen
Que los investigadores consideran materialmente puros deben tener
Cantidad apreciable de otra protena y muchas de las propiedades
descrito son las de una mezcla de protenas.
En la literatura el contenido de polisacrido de la albmina usada no tiene en
Muchos casos han sido reportados pero donde se les da es frecuentemente considerable.
Dische y Popper [1926] describen como albmina de suero que contiene 1-08% de carbo-
Hidrato, Rimington [1929; 1931] da un contenido de carbohidratos de aproximadamente 2%,
las figuras de Lustig & Haas [1931] son entre 0-47 y 0-65%, y S0rensen
Haugaard [1933] dan 0-47% para una muestra y una cifra muy baja para otro,
Y el presente autor [1934] encontr contenidos entre 0-29 y 078% para
albminas cristalinas y hasta 4-4% para otras fracciones. Como ha sido
se muestra en los dos documentos de esta serie que el contenido de polisacrido de purificado
crystalbumin puede reducirse a valores por debajo de 041%, es evidente que apre-
Cantidades de glucoprotena deben estar presentes en muestras de albmina no
Sometidos a cuidadosos procesos de repurificacin.

Naturaleza de la glicoprotena

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La identidad
protena de suerodealesta
queglicoprotena
se parece esahora debe suero
mucoide ser considerado. nica
Laalto
que tiene un conocidade carbohidratos
contenido
contenido y no se coagula por calentamiento [Zanetti, 1897; Bywaters, 1909;
Rimington, 1931]. El parecido es, sin embargo, slo superficial y el hecho
que la glicoprotena es diferente de la mucosa se hace evidente en la in- ms cerca
Spection
Aunque, cuando casi puro de la glicoprotena ahora puede ser investigada
se calienta en solucin diluida sin ser coagulada cuando se calienta en el
presencia de cantidades apreciables de protenas coagulables se lleva hacia abajo con
El cogulo. Mucoide suero, por el contrario, permanece en solucin cuando
suero se calienta y que es, de hecho, preparado por thismeans.
Mucoide El suero contiene 25% de polisacrido [Rimington, 1931], pero,
a pesar del uso de una amplia variedad de mtodos de fraccionamiento que tiene no beenpossible
para obtener el presente glicoprotena con un contenido de ms de 10 o 11% de
polisacrido. Consideracin del contenido de cistina de la glicoprotena demuestra
que no puede ser mucoide suero. Como ejemplo podemos considerar fraccin S
que tena un contenido de carbohidratos de 9-5%. Si el carbohidrato presente eran
debido a suero mucoide (que contiene 25% de carbohidratos), entonces no est presente 38%
de suero mucoide y 62% de crystalbumin. El contenido de cistina de crystalbumin
se encontr que era un 5-8%. El contenido de cistina de la glucoprotena debe ser la suma
del contenido de cistina de sus constituyentes. Por lo tanto, incluso suponiendo que el
mucoide suero no contribuye en absoluto cistina, los presentnecessitates crystalbumin
un contenido de cistina de al menos 62 x 5-8 = 36% en la fraccin de S. En realidad, sin embargo,,
esta fraccin contiene menos de 1-8% de cistina, de modo que SIIT imposible para el
glicoprotena a ser mucoide suero. De hecho ninguna protena descrita hasta ahora tiene la
propiedades de esta glicoprotena, y uno se ve obligado a la conclusin, con el apoyo de
todas las pruebas disponibles, que thisis una nueva protena de suero, al que tal vez el
nombre seroglycoid se puede aplicar provisionalmente.

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366 L. F. HEWITT
Las propiedades de la seroglicide son diferentes en casi todos los
de crystalbumin, ya que tiene un alto contenido de polisacrido (por lo menos 10%
Calculado como gmg), un menor contenido de N, una menor Van Slyke amino-N figura,
diferentes curvas de valoracin, un menor consumo de energa rotatoria, difcil de calor-
mayor contenido de triptfano y un menor contenido de cistina. En su aminocido dis-
coagulabilidad,
seroglycoid tribucin se asemeja a la globulina en lugar de albmina pero no lo es, de
Por supuesto, precipitable por 50% saturado (NH4) 2SO4. En cuanto a la cantidad de
Protenas en suero, las siguientes cifras aproximadas pueden tomarse como
indicacin de la composicin de suero de caballo: 3-6% globulina, 2-8% crystalbumin,
0 3% seroglycoid, 0 05% mucoide suero.

RESUMEN
1. La observacin se confirm que la albmina de suero cristalino (cristalizacin
Bumin) cuando pura est libre de polisacrido sino como prepara usualmente contiene
Cantidades variables de una glicoprotena.
2. La identidad de esta glicoprotena se discute y se aduce que la evidencia
se trata de una nueva protena de suero para el cual el nombre seroglycoid es provisionalmente
Gested
suge-
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REFERENCIAS
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