1. Introduccin.

Los pptidos bioactivos (BPs) son una categora especial de pptidos que, al ser introducidos en un sistema de
cuerpo vivo, son capaces de desencadenar ciertas respuestas fisiolgicas deseables y, de este modo, promueven la
salud y el bienestar en general (Agore et al., 2015, Korhonen y Marnila, , Korhonen y Pihlanto 2006).
Las actividades biolgicas desencadenadas por BP incluyen propiedades antioxidantes, propiedades
antimicrobianas, propiedades anticancergenas, propiedades anorexicas (control de peso), propiedades ansiolticas
(ansiolticas), propiedades antihipertensivas, propiedades anticariognicas, actividades opioides y actividades
inmunomoduladoras (Agyei y Danquah 2011; Danquah 2012b, Aluko 2008, Clare y Swaisgood 2000, Korhonen y
Pihlanto 2003.

Aunque la mayora de las BP se derivan como productos de la hidrlisis de protenas, difieren de las protenas
nativas en que BP son generalmente inactivos cuando dentro de la estructura de la protena. La bioactividad se
expresa slo cuando los pptidos han sido liberados por la accin de enzimas. Las propiedades biolgicas de BP se
han atribuido a las propiedades nicas de los individuos y las combinaciones de aminocidos que componen la
secuencia. Por ejemplo, los pptidos que contienen grupos hidrfobos y sulfhidrilos presentan usualmente
propiedades antioxidantes (Park et al., 2010, Ren et al., 2014), mientras que son cortos
Y los pptidos catinicos generalmente muestran comportamientos antimicrobianos (Hancock y Sahl 2006).

Aunque la mayora de las BP se derivan como productos de la hidrlisis de protenas, difieren de las protenas
nativas en que BP son generalmente inactivos cuando dentro de la estructura de la protena. La bioactividad se
expresa slo cuando los pptidos han sido liberados por la accin de enzimas. Las propiedades biolgicas de BP se
han atribuido a las propiedades nicas de los individuos y las combinaciones de aminocidos que componen la
secuencia. Por ejemplo, los pptidos que contienen grupos hidrfobos y sulfhidrilos presentan usualmente
propiedades antioxidantes (Park et al., 2010, Ren et al., 2014), mientras que son cortos
Y los pptidos catinicos generalmente muestran comportamientos antimicrobianos (Hancock y Sahl 2006).

Sin embargo, a pesar de estas propiedades tiles, existen algunos desafos que
obstaculizan la explotacin total de las propiedades bioactivas de BP en productos
alimenticios y farmacuticos. El principal reto se refiere a la produccin a escala industrial
de pptidos bioactivos. Hasta donde sabemos, no ha habido ningn informe que se ocupe
de la produccin de pptidos bioactivos purificados desde una perspectiva de ingeniera y
economa de bioprocesos.

Aunque existe en el mercado una serie de productos que incorporan BP, la mayora de estos
productos usan los BPs en forma de hidrolizados de protenas no purificados o mezclas de
pptidos sin purificacin previa (Korhonen 2009; Korhonen y Pihlanto 2006). El desarrollo de
procesos comercialmente viables capaces de aumentar la produccin y purificacin de BPs es
crucial para promover el uso de estos pptidos como ingredientes activos de alto valor que se
pueden usar en productos de nutricin y salud.

Presentamos aqu un bioproceso para la produccin de pptidos bioactivos a partir de protenas alimentarias
mediante la explotacin de la actividad de proteinasas de bacterias de cido lctico. Hemos informado de un proceso
optimizado y escalable que limita la cantidad de materia prima utilizada en todas las etapas de la cadena de
produccin y tambin ha llevado a cabo una evaluacin econmica en profundidad del proceso para determinar la
viabilidad comercial.
2 Mtodos y alcance
Nuestro objetivo es disear un bioproceso completo, como se muestra en la Fig. 1, que puede utilizarse para
producir pptidos antihipertensivos a escala comercial empleando un enfoque de sistemas completo que contempla
todo el bioproceso desde el acondicionamiento de la materia prima hasta el procesamiento hasta la formulacin del
producto final. Adems, se utilizaron materias primas y procesos muy abundantes y adecuados, respectivamente,
as como las condiciones y parmetros ptimos que se han descrito en la literatura. Los anlisis econmicos se han
llevado a cabo utilizando datos mdicos, farmacolgicos y estadsticos
Datos sobre pacientes con hipertensin en Malasia. A continuacin se detallan los detalles del desarrollo del proceso
y del anlisis de viabilidad econmica.

El procedimiento paso a paso empleado en el desarrollo del modelo para producir BP fue
el siguiente:
A) comparacin y seleccin de la tcnica de produccin;
(B) seleccin de fuente de protena y biocatalizador; Y (c) produccin, separacin y
purificacin del pptido.

A) Comparacin y seleccin de la tcnica de produccin.

Como pptidos, las BP pueden producirse por procedimientos tales como (a) sntesis
qumica, (b) expresin transgnica en huspedes adecuados, (c) fermentacin microbiana
de protenas y / o hidrlisis in vitro de protenas por enzimas proteolticas de plantas,
animales o microbios Origen (Korhonen y Pihlanto 2006). La produccin de BPs
El empleo de la accin hidroltica de las enzimas proteolticas en las protenas
alimentarias ha sido el mtodo ms utilizado, ya que es seguro, de calidad alimentaria y
rentable. Este enfoque fue elegido para este estudio.

b)Seleccin de fuente de protena y biocatalizador.

Putativamente, las dos materias primas clave utilizadas (protenas alimentarias y enzimas
proteolticas) son ampliamente abundantes. De hecho, los desechos proteicos de las
casas lecheras y los aserraderos pueden ser valorizados y convertidos con seguridad en
pptidos bioactivos. Para este estudio, se eligi la leche como fuente de protena, siendo
un alimento muy barato y abundante
material. Desde el punto de vista geogrfico, Miri en Malasia es el hogar de varias granjas
de cabras, lo que facilita la obtencin de leche con el propsito de producir BP. Los
biocatalizadores, por otra parte, pueden obtenerse de clulas enteras y / o enzimas
proteolticas de bacterias de cido lctico (LAB). LAB son generalmente considerados
como seguros, tienen una larga historia de uso en los alimentos y tienen una alta
capacidad para descomponer la leche en
Hidrolizados y pptidos (Espeche Turbay et al., 2009, Gupta et al., 2002, Kaushik et al.,
2009). Debido a que la mayora de LAB son auxotrficas para varios aminocidos y como
tales slo son capaces de crecer en leche utilizando un complejo sistema proteoltico que
comprende proteinasas de envolvente celular (CEPs), transportadores de membrana y
peptidasas intracelulares (Axelsson 2004, Khalid y Marth 1990). Durante el crecimiento
Leche, LAB utilizan los CEPs para degradar las protenas en pptidos y esto constituye la
base para el uso de estas bacterias para la produccin de pptidos bioactivos. Entre los
LAB, Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactis 313 (LDL 313 o Lactobacillus leichmanii,
ATCC 7830) fue elegida para este estudio debido a su alta tasa de produccin de CEP
(Zaks y Klibanov 1985), as como la opcin de poder mejorar el rendimiento de CEP
optimizando el crecimiento celular y Parmetros de fermentacin (Agyei y Danquah
2012a, Agyei et al., 2013b, c). Las condiciones y parmetros requeridos para asegurar el
crecimiento ptimo y la produccin de CEP por LDL 313 se obtuvieron de la bibliografa
(Agyei y Danquah 2012a, Agyei et al., 2012, 2013a).

Seleccin de fuente de protena y biocatalizador.

Putativamente, las dos materias primas clave utilizadas (protenas alimentarias y enzimas proteolticas) son
ampliamente abundantes. De hecho, los desechos proteicos de las casas lecheras y los aserraderos pueden ser
valorizados y convertidos con seguridad en pptidos bioactivos. Para este estudio, se eligi la leche como fuente de
protena, siendo un alimento muy barato y abundante
material. Desde el punto de vista geogrfico, Miri en Malasia es el hogar de varias granjas de cabras, lo que facilita
la obtencin de leche con el propsito de producir BP. Los biocatalizadores, por otra parte, pueden obtenerse de
clulas enteras y / o enzimas proteolticas de bacterias de cido lctico (LAB). LAB son generalmente considerados
como seguros, tienen una larga historia de uso en los alimentos y tienen una alta capacidad para descomponer la
leche en
Hidrolizados y pptidos (Espeche Turbay et al., 2009, Gupta et al., 2002, Kaushik et al., 2009). Debido a que la
mayora de LAB son auxotrficas para varios aminocidos y como tales slo son capaces de crecer en leche
utilizando un complejo sistema proteoltico que comprende proteinasas de envolvente celular (CEPs),
transportadores de membrana y peptidasas intracelulares (Axelsson 2004, Khalid y Marth 1990). Durante el
crecimiento

Para este estudio, empleamos dos procesos en esta etapa para la separacin de los pptidos. El primer mtodo
implicaba el empleo de una serie de procesos de filtracin en membrana para eliminar el producto peptdico deseado
tal como se captura en la Fig. 2a, mientras que el segundo mtodo implicaba el uso de una unidad de filtracin de
membrana nica (aislamiento de las clulas bacterianas por centrifugacin, seguido por filtracin adicional para el
pptido bruto) como se muestra en la Fig. 2b.

Para este estudio, empleamos dos procesos en esta etapa para la separacin de los pptidos. El primer mtodo
implicaba el empleo de una serie de procesos de filtracin en membrana para eliminar el producto peptdico deseado
tal como se captura en la Fig. 2a, mientras que el segundo mtodo implicaba el uso de una unidad de filtracin de
membrana nica (aislamiento de las clulas bacterianas por centrifugacin, seguido por filtracin adicional para el
pptido bruto) como se muestra en la Fig. 2b.
2.2 Metodologa de anlisis econmico
Para llevar a cabo la evaluacin econmica, era necesario fijar una tasa de produccin a un conjunto objetivo de
consumidores. Como se destac anteriormente, el proyecto se llev a cabo para satisfacer las necesidades mdicas
de los pacientes de hipertensin de Malasia. Se utiliz un mtodo de clculo retroactivo para calcular la cantidad de
materia prima requerida y la evaluacin econmica de todo el proceso para determinar el beneficio neto anual.
Adems, para calcular la cantidad de enzima requerida para descomponer la cantidad especificada de protena, era
necesario reconocer la relacin enzima-sustrato (E: S). El conocimiento de la relacin E: S, la cantidad de sustrato
(protena) y el valor de conversin nos permiti estimar el requerimiento enzimtico para lograr la tasa de produccin
objetivo de BPs. Esto a su vez nos ayud a estimar la tasa de crecimiento microbiano que puede dar la cantidad
requerida de enzima, as como el nmero de biorreactores necesarios para el crecimiento celular y la produccin de
pptidos. Un esquema del anlisis econmico cuantitativo realizado se da en la Fig. 3.

3 Resultados
Como se mencion en la seccin anterior, se utilizaron dos mtodos diferentes para la produccin por lotes de
pptidos bioactivos. El primer mtodo se ha demostrado en la Fig. 2a En el primer recipiente (E-1), se
introdujeron clulas de Lactobacilos maduras, frescas, como alimento. El pH se ajust a 5,7 introduciendo una
cantidad especificada de tampn. La temperatura se ajust a 45 C (desde 44 C) mediante la adicin de
una corriente de vapor.
A continuacin se aadieron nutrientes para ayudar al crecimiento de clulas de Lactobacilli. Una vez que el
perfil de crecimiento celular y la produccin de CEP fueron ptimos (usualmente en la fase exponencial
tarda), las clulas se cosecharon y se transfirieron al recipiente E-2, que es un biorreactor donde se produjo
la produccin real de pptidos.

Los CEPs sobre la superficie celular de Lactobacillus interactan con protenas de la leche para producir
pptidos en condiciones ptimas de proceso (pH = 6,2 y T = 40 C). Los dos procedimientos, es decir, el
cultivo de enzimas y la descomposicin de protenas, podran ser operados simultneamente debido a la
diferencia marginal en sus condiciones operativas de proceso. La agitacin se proporcion a travs del
mezclador para promover el proceso mejorando el contacto celular con el medio de la leche. En la tercera
etapa (E-3), el producto del biorreactor E-2 se aisl usando ultrafiltracin (el mtodo de separacin ms
adecuado), donde la leche, los pptidos y las clulas de Lactobacilli se alimentaron a la superficie de la
membrana en una filtracin de alimentacin tangencial.

La fuerza tangencial llev finalmente a las clulas y pptidos de Lactobacilos a ser raspados fuera de la
superficie de la membrana. La leche gastada (con la mayor parte de las protenas totalmente utilizadas) fluy
a travs de la membrana y no pudo ser reciclada. Las clulas de Lactobacilli y pptidos de E-3 se separaron
en E-4 en una etapa de filtracin sin fin. La diferencia de tamao entre las clulas bacterianas (en micras) y
los pptidos (nanoescala) fue el principal motivo detrs de una separacin fsica en lugar de un enfoque
qumico. El retentado (es decir, las clulas de Lactobacilos) se reciclara entonces a la corriente de
alimentacin para el siguiente lote de produccin de pptidos. El pptido filtrado (o crudo) se someti a una
serie de procedimientos cromatogrficos y otros procedimientos de purificacin para dar un producto final
purificado como se ilustra en la Fig. 4.
El segundo mtodo se muestra en la Fig. 2b. Aqu, E-1 y E-2 son biorreactores que funcionan exactamente de
la misma manera que en el diseo anterior. Sin embargo, E-3 se reemplaz con un separador de clulas
centrfugas para extraer las clulas Lactobacilos, ya que poseen las densidades ms importantes en ese
punto. En E-4, se us membrana de ultrafiltracin para filtrar el pptido de los residuos no deseados. Adems,
puesto que los pptidos en bruto se consideraron ms puros de las etapas anteriores, slo se utiliz
purificacin por intercambio inico para la etapa final de purificacin. Por ltimo, E-6, un secador por
pulverizacin, se utiliz para eliminar el agua, dejando los pptidos en forma de polvo

3.2 Requisito de protenas, leche y biorreactores.

La leche es predominantemente el 80-90% de agua (reasegurada por el hecho de que tanto la leche como el
agua tienen densidades similares), y el 10% restante consiste en los principales nutrientes (grasas,
carbohidratos, protenas, minerales y vitaminas). La composicin proteica de la leche vara dependiendo de la
fuente: vaca-3.5%, bfalo-3.75% o cabra-4% (Agyei y Danquah 2011). Cabe sealar que para el presente
estudio se pretende un biorreactor de escala industrial, con un tamao tpico de 10.000 L (Reboredo-
Rodrguez et al., 2014).

Teniendo en cuenta que por lo general el 75% del biorreactor se llena (Cicerale et al., 2011), esto nos da un
total de 7500 L de leche y mezcla de clulas que se pueden procesar en un lote. Suponiendo que el 3,5% de
la leche se compone de protena, slo (0,035? 7500 L =) 262,5 L (o 0,262 m3) de protena tiene que ser
desglosado en pptidos en un solo lote. Si consideramos que la densidad de protena es de 1350 kg / m3
(Agyei y Danquah 2011), entonces la masa de protena presente en un reactor discontinuo en cualquier
momento especfico es de 354,375 kg

Se ha hecho una estimacin aproximada del nmero total de biorreactores requeridos a partir de
la tasa de produccin peptdica diaria esperada (segn se ha estimado en la seccin anterior), en
base al tipo de leche (vaca / cabra / bfalo) y se muestra en la Tabla 1. Los resultados sugieren que
el nmero de biorreactores se puede reducir de 6 a 5 si se usa leche de cabra o bfala en lugar de
la leche de vaca, debido a la diferencia en sus composiciones proteicas.

Tasa de produccin.

Uno de los objetivos del presente estudio ha sido satisfacer las necesidades mdicas de
los pacientes hipertensos en Malasia. Segn las estadsticas, alrededor de 1 de cada 7
ciudadanos de Malasia sufre de presin arterial alta. Considerando que la poblacin total
de Malasia es de 30.257.000, que nos da un total de 4.322.429 pacientes hipertensos.
Ahora, un solo paciente que sufre presin arterial alta necesita 300 mg de pptidos por
da [siempre que un paciente debe ser administrado con 2 cpsulas antihipertensivas al
da con un contenido de pptido de 150 mg / cpsula] (Vertuani et al., 2011). Esto da un
objetivo diario de produccin de pptidos de (4.322.429 \ sim 300 mg) = 1296.729 kg / da
para satisfacer las necesidades en Malasia.
Requisito de Protena, Leche y Bioreactor.

La leche es predominantemente el 80-90% de agua (reasegurada por el hecho de que

tanto la leche como el agua tienen densidades similares), y el 10% restante consiste en
los principales nutrientes (grasas, carbohidratos, protenas, minerales y vitaminas). La
composicin proteica de la leche vara dependiendo de la fuente: vaca-3.5%, bfalo-
3.75% o cabra-4% (Agyei y Danquah 2011). Cabe sealar que para el presente estudio se
pretende un biorreactor de escala industrial, con un tamao tpico de 10.000 L (Reboredo-
Rodrguez et al., 2014). Teniendo en cuenta que por lo general el 75% del biorreactor se
llena (Cicerale et al., 2011), esto nos da un total de 7500 L de leche y mezcla de clulas
que se pueden procesar en un lote.