AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIN DE BACTERIAS SULFATO

REDUCTORAS.
Caro Puentes Zulma Pilar, Pachn Serna Mara Paula, Parra Botia Yurani Liceth,
Rivera Rojas Yira Xilena.
Estudiantes de Ingeniera Ambiental, rea de Microbiologa, Universidad de
Boyac, Sogamoso.

RESUMEN.
Este artculo tiene como objeto corroborar la actividad metablica de bacterias
sulfato reductoras las cuales son notablemente adaptables y pueden ser
encontradas en numerosos ambientes terrestres y acuticos en los que se ha
agotado el oxgeno debido a la descomposicin aerbica de la materia orgnica,
utilizando para ello la columna de Winogradsky como mecanismo de verificacin y
experimentacin. Adicionalmente, se logra realizar el aislamiento e identificacin de
la bacteria de utilizando el medio de lactato de sodio y la tcnica de NMP (nmero
ms probable) finalmente, se logra identificar la presencia de bacterias sulfato
reductoras como la Desulfovibrio. Para dicho estudio, se realiza la preparacin del
medio lquido de cultivo y la aplicacin de tcnicas de aislamiento o siembra de los
microorganismos con tubos sellados con parafina, identificacin de precipitaciones
color negro, incubacin, tincin de Gram y nmero ms probable. De esta manera,
se realizan investigaciones respectivas para obtener mayor informacin sobre la
presencia de la bacteria de estudio en la columna y hacer el respectivo anlisis e
identificacin de la misma.
De tal manera, este tipo de estudio experimental e investigativo tiene un gran
propsito en el contexto de ingeniera ambiental ya que permite conocer tipos de
microorganismos presentes en el entorno y su respectivo aislamiento. As mismo,
mediante el presente artculo se logra identificar bacterias sulfato reductoras
presentes en un medio sin oxgeno, en este caso en una columna de Winogradsky,
conociendo las caractersticas y funciones especficas que realiza dicha bacteria.

PALABRAS CLAVE. Bacteria, sulfato reductora, microbiologa, microorganismo,

aislamiento, crecimiento, anaerobio, winogradsky.

ABSTRACT.
This article presents the study and the process carried out for the specific analysis
of the characteristics of the bacterium Desulfovibrio, being taken as object of study
in the column Winogradsky worked during certain laboratory practices. It simulates
an ecosystem that generates the growth and development of several bacteria

1
according to the established conditions. Specifically, a sulphate-reducing bacterium
is taken as the object of study because the column had a rapid anaerobic process
of the populations present by the incident light and the environmental conditions to
which it was exposed. For this study, different techniques such as preparation of the
liquid medium, isolation or seeding of the microorganisms with sealed tubes with
paraffin, identification of black precipitation, incubation, Gram staining and most
probable number are performed. In this way, respective investigations are carried
out to obtain more information about the presence of the study bacteria in the column
and to make the respective analysis of the same ones.
KEYWORDS.
Bacterium, characterization, microbiology, microorganism, sulfate, isolation, growth,
anaerobe.
INTRODUCCIN.
Las bacterias sulfato-reductoras (BSR) son microorganismos anaerobios obligados,
metablicamente verstiles provenientes de varias familias y diferentes gneros.
utilizan sulfato u otros compuestos oxidados de azufre como aceptor final de
electrones (agente oxidante) para la produccin de H2S (). Las bacterias sulfato
reductoras son notablemente adaptables y pueden ser encontradas en numerosos
ambientes, como es en el caso de la columna de Winogradsky.
La columna de Winogradsky es el medio en el cual se logra el desarrollo y
crecimiento de una gran diversidad de microorganismos, donde cada una de las
capas agregadas con diferentes nutrientes y materiales juegan un papel importante
para simular un ecosistema que genera varias bacterias segn las condiciones
establecidas. A medida que pasa el tiempo, esta columna presenta cambios de
acuerdo a los ciclos desarrollados por los microorganismos y sus respectivas
actividades que son posibles gracias al recibimiento de la energa de la luz a la que
es expuesta.
El descubrimiento ambiental de los microorganismos cada vez avanza permitiendo
el reconocimiento de millones de especies que se encuentran en el entorno, las
cuales por su morfologa y su especial funcionamiento ofrecen un gran campo de
estudios benficos e informacin sobre la microbiologa, siendo las bacterias
organismos considerados diminutos, pero de gran importancia en procesos
qumicos, fsicos y biolgicos.
Dentro de la diversidad microbiana presente en una columna, se encuentran
bacterias reductoras de sulfato, las cuales crecen en medios anaerbicos. Estos
microorganismos cuentan con variedad de especies que se encuentran
involucradas en varios campos tiles en la cotidianidad, como es el caso de la
bacteria Desulfovibrio, reconocida por hacer parte de una especie Gram negativa,
con un alto poder reductor y de gran influencia en el ciclo o transformacin de
2
compuestos de azufre siendo esto corroborado mediante artculos cientficos e
investigaciones ya realizadas.

MATERIAL Y MTODOS.

Para la realizacin del presente artculo se busca informacin concerniente a la

bacteria sulfato-reductora, ya que segn lo observado en laboratorios y lecturas
realizadas en bases de datos la especie es semejante segn caractersticas a la
Desulfovibrio.
Se lleva a cabo un procedimiento previo para la elaboracin de la columna
Winogradsky como medio de crecimiento y desarrollo de la bacteria sulfato
reductora a estudiar.
COLUMNA DE WINOGRADSKY:
Para la realizacin de la columna se toma una botella de gaseosa tres (3) litros
plstica preferiblemente transparente, la parte inferior de la botella se llena con lodo
rico en materia orgnica hasta completar 1/3 del volumen de la misma, por otra
parte, se introduce en la mitad de la capa de lodo una puntilla y una laminilla bien
sujetada por un nailon. A continuacin, se arma otra capa que contiene pedazos de
papel peridico y aserrn, tambin se aade una capa de hojarasca seca en la
misma. De esta manera, se coloca una laminilla bien sujetada para que quede en la
correspondiente capa.
Otra capa de la columna se realiza con la agregacin de un huevo cocido triturado
completamente mediante el uso de un mortero. As mismo, se adiciona una mezcla
de suplemento de CaCO3 y CaSO4 como fuente se sulfato y posteriormente, se
adiciona una pequea capa de barro y papel peridico con el fin de evitar mezclas
entre capas. En esta se coloca otra laminilla bien sujetada por un nailon.
Por ltimo, se agrega agua residual proveniente del ro Chicamocha y agua lluvia
para cubrir en su totalidad la columna la cual es sellada con papel vinipel. Es
necesario abrirle algunos orificios sobre la cubierta para que reciba de forma
ptima las condiciones ambientales requeridas para un buen desarrollo de la
columna de Winogradsky.

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 FIGURA 1. Columna Winogradsky.

MEDIO DE CULTIVO Y SIEMBRA:

Para la identificacin de Bacterias Sulfato-Reductores presentes en la columna de
winogradsky, se hace la elaboracin del medio de cultivo Lactato de Sodio,
informacin recopilada de un artculo de investigacin ya realizado en la Universidad
Industrial de Santander, en la sede Guatiguar de Piedecuesta siendo esta
especfica para investigacin.
El medio de cultivo fue preparado segn la norma NACE TM0194-2004, siendo
distribuido en nueve tubos de ensayo tapa rosca en alcuotas de 9 ml. Siendo estos
sometidos a una esterilizacin por medio de una autoclave. Cabe resaltar, que el
medio de cultivo trabajado es lquido.
Para el procedimiento de siembra, se realizaron cinco diluciones de la muestra
tomada de la columna de winogradsky tomando la de 10 3, 104 y 105 para inocular
1ml de dicha muestra en los respectivos tubos usando pipetas estriles, siendo cada
muestra procesada por triplicado (Figura 2). Es importante la implementacin de
parafina en cada uno de los tubos sembrados con el objetivo de inhibir la presencia
de oxgeno en el medio lquido trabajado. Posteriormente, se llev a incubacin a
32C durante 18 das para permitir el crecimiento de las bacterias reductoras de
sulfato en condiciones ptimas (NACE, 2004).

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 FIGURA 2. Tubos Sembrados.

NUMERO MS PROBABLE (NMP):

Este recuento de viables en medio lquido se basa en la siembra (1mL, por ejemplo)
de 3 o 5 tubos por cada suspensin-dilucin de la muestra en estudio, con medio
adecuado para el grupo fisiolgico analizado (celulolticos, fijadores de N2,
amonificantes, etc.). Se efectan 3 repeticiones del recuento completo.
Luego de un perodo adecuado de incubacin segn sea el caso se leen los tubos
positivos (crecimiento por: turbidez y/o aparicin o desaparicin de una sustancia,
evaluada qumicamente) en tres diluciones consecutivas. (MICROBIOLOGIA
AMBIENTAL, 2005).

FIGURA 3. NMP en Medio Lquido.

TINCIN DE GRAM:
Para anlisis microscpico se emplea la tincin de Gram, la cual permite observar
distribuciones particulares de las bacterias, su morfologa y el grupo al cual
pertenecen. La observacin se realiza en 100X.
Se toma un tubo de cada una de las diluciones sembradas las cuales formaron
precipitado, para extraer una respectiva gota mediante la utilizacin de un asa
redonda, esta es expandida en un portaobjetos y fijada mediante implementacin
de un mechero.

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Se recurre a realizar la tincin de Gram siendo uno de los mtodos de tincin
diferencial que permite distinguir grupos bacterianos. Esta tincin reconoce
bacterias Gram positivas (toman el primer colorante y lo retienen y se ven violetas)
y Gram negativas, que no retienen el colorante violeta luego de lavado con etanol o
acetona y se colorean con el colorante de contraste, rosado, como la safranina.
(MICROBIOLOGIA AMBIENTAL, 2005).

FIGURA 4. Tincin de Gram.

RESULTADOS.
Se obtuvo datos de tipo microscpico de la batera sulfato-reductora siendo esto
reflejado mediante precipitaciones de color negro presente en los tubos de ensayo
cultivados con diluciones de 103, 104 y 105.
PRIMERA PARTE. Nmero ms probable (NMP).
TABLA N1. Registro de precipitacin en tubos de ensayo.
DILUCION TUBOS TUBOS REGISTRO
POSITIVOS (NMP/ml)
1 3
103 2
3
1 3
104 2 460
3
1 1
105 2
3

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 FIGURA 5. Precipitacin en tubos cultivados.

Descripcin: Las bacterias sulfato reductoras llevan a cabo la reduccin del sulfato
a sulfuro presente en el medio, actuando, as como un indicador de actividad
metablica y de crecimiento (Garrity, 2005). El crecimiento bacteriano fue
evidenciado por la formacin del precipitado color negro tras un periodo de
incubacin de 18 das a una temperatura de 32C.

SEGUNDA PARTE. Tincin de Gram.

Observacin: Microscpica.
Objetivo: 100x.

FIGURA 6. Dilucin 103.

FIGURA 7. Dilucin 104.

7
 FIGURA 8. Dilucin 105.
Descripcin: Son Bacilos Gram negativos ya que se tornan de color fucsia o rosado
posteriormente a ser sometidos a tincin de Gram, tienen forma de bastoncillos tipo
curvos y alargados.
DISCUSIN.
Conocida la diversidad microbiana
como un trmino que incluye la
cantidad y distribucin de informacin
gentica y especifica de las especies
de comunidades en el entorno
ecolgico, se toma como temtica
principalmente en el desarrollo del
presente artculo ya que est
relacionada con la presencia de
microorganismos. Los tipos de
bacterias varan y cuentan con
distintas caractersticas de acuerdo al
medio donde se encuentran, en este
caso trabajando una columna de
Winogradsky la cual cuenta con
diferentes capas dando lugar a
microorganismos tanto aerobios como
anaerobios. Es as, como se puede
considerar que en dicha columna con
paso del tiempo se presentan zonas
aerobias y anaerobias debido a
procesos biolgicos y condiciones
ambientales a la que est expuesta,
los cuales dan lugar a la presencia de
centenares de microorganismos. De
esta manera, se toma como objeto de
8
estudio bacterias anaerobias
reductoras de azufre, debido a que la
columna de winogradsky presenta
barro como fuente de materia
orgnica, carbonato de calcio y
sulfatos, que lleva a desarrollar ciclos
biogeoqumicos como el de Carbono,
Nitrgeno y primordialmente el de
Azufre. Las interacciones que se
evidencian en la columna tienen que
ver con el desarrollo y crecimiento de
los microorganismos presentes, que
estn asociados a las diferentes
fuentes de nutrientes como las tiras de
papel peridico y el aserrn ya que
estas son las que proporcionan
carbono al sistema y la yema de huevo
que aporta una fuente de azufre, la
cual juegan un papel importante en el
ptimo desarrollo de las bacterias de
estudio.
En cuanto a la zona anaerobia de la
columna y mediante el proceso de
fermentacin de los compuestos
orgnicos, se generan varios grupos
de bacterias, entre estas las
desulfovibrio las cuales son
visualizadas en la columna por medio
de una profunda capa negra en forma
de sedimento y un olor desagradable
que refleja su presencia y su actividad
con el azufre. De acuerdo a
investigaciones y estudios ya
realizados se logra conocer que estas
bacterias oxidan compuestos
orgnicos, tienen como aceptadores
de electrones el sulfato, son muy
verstiles ya que oxidan compuestos
orgnicos y producen corrosin
anaerbica del hierro, todo esto hace
que sean de gran importancia en las
fases anaerobias del ciclo del azufre
presente en el entorno.
Cabe resaltar, que este tipo de
bacteria y su formacin estn
relacionados de forma directa con
algunos problemas de contaminacin
y en ciertos casos con la interaccin
del ser humano en el medio, ya que
son originarias de la materia orgnica
descompuesta en ausencia de
oxgeno.
En cuanto al anlisis microscpico se
logra corroborar la presencia de la
bacteria sulfato-reductora gracias a
sus particularidades, logrando as
determinar su forma, estructura y
coloracin de gram. Por lo tanto,
segn estas caractersticas
microscpicas y artculos cientficos
se cree que estas bacterias son
desulfovibrio, las cuales contaban con
una fuente de hierro generada por una
puntilla agregada en la parte inferior de la
columna de Winogradsky.
9
Tambin se puede inferir que durante
este proceso ecosistmico se
presentan interacciones tales como la
competencia donde los
microorganismos luchan por el
sustrato en el mismo hbitat y donde
el sustrato puede ser limitado. Es por
ello, que en la zona inferior de lodos
crecen organismos que desarrollan
procesos fermentativos que producen
alcohol y cidos grasos como
subproductos de su metabolismo.
Estos productos son a su vez el
sustrato para el desarrollo de
bacterias reductoras de sulfato y como
resultado se liberan sulfuros.
Dichos microorganismos, presentan
un crecimiento de 460 NMP/ml segn
la tabla estipulada para la
correspondiente lectura, reflejando un
buen desarrollo y crecimiento de
dichos microorganismos capaces de
reducir los compuestos de azufre a
sulfuro de hidrogeno como principal
funcin dentro del ecosistema
simulado por la columna en estado
anaerobio. En cuanto a crecimiento se
reconoce una relacin inversamente
proporcional de los tubos cultivados y
las diluciones realizadas, donde se
present mayor precipitado en los
tubos de dilucin 103 y 104
corroborando que a menor dilucin
mayor actividad biolgica. Por esta
razn, los tubos de 105 no presentaron
un crecimiento representativo de la
bacteria.
CONCLUSIONES.
Las bacterias Sulfato reductoras son
microorganismos que actan como en
el estado terminal de la degradacin
de la materia orgnica, mediante componentes que se encuentran a
procesos de fermentacin en diario en el entorno con el fin de
condiciones sin presencia de oxgeno. conocer los diferentes
microorganismos que trabajan en el
Durante la elaboracin de la columna
proceso de descomposicin y
de Winogradsky se pudo identificar
que el lodo agregado estaba rico en transformacin de la materia orgnica,
nutrientes y que la luz proporcionada a as como la variedad de ambientes
esta columna fue crucial para que se que se pueden presentar en el mismo.
reflejara un buen crecimiento de
microorganismos, buena actividad
biolgica y desarrollo en la zona
anaerbica en un corto lapso de
tiempo.
La tincin de Gram es una tcnica que
ayudo a tener mucho ms clara la
identificacin del microorganismo de
estudio en cuanto a su estructura y
forma, que va a acorde a la coloracin
que toma la bacteria (Gram negativo y
Gram positivo).
Se logr identificar que la bacteria
analizada contribuye de forma positiva
y cuenta con una gran aplicabilidad en
la descontaminacin de aguas
residuales las cuales contienen
sulfatos y metales procedentes de BACTERIAS REDUCTORAS DE
procesos industriales y mineros. SULFATOS, Microbiologa en suelo,
Gariboglio M.A. Y Smith S.A., 2005.

-Han sido utilizadas como una CARACTERIZACIN FENOTPICA

alternativa a la eliminacin de sulfato y DE LA CEPA SULFATO
ciertos metales en aguas residuales REDUCTORA TERMOFLICA,
procedentes de minas e industrias con (CARVAJAL CALDERN MARA
alto contenido de metales, en las CATALINA. Y PERDOMO FRANCO
cuales aumentan el ph generando NATALIA, 2008).
sulfuros insolubles.
BIOLOGA DE LOS
-Hacen parte de los biofilms metlicos MICROORGANISMOS. Madigan, M.,
de conducciones industriales donde Martinko, J., Parker, J. 1999. Brock
producen corrosin. Octava edicin. Prentice may. Madrid.
Para la elaboracin de la columna de 505-510.
winogradsky se hace uso de algunos

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MICROBIOLOGIA BASICA
AMBIENTAL, Lillian Frioni. 2005.
Universidad de la repblica, Uruguay.
BERGEYS MANUAL OF SYSTEMATIC
BACTERIOLOGY, Garrity, G. 2005. The
Proteobacteria. Volumen 2: Parte C Alfa-,
Beta-, Delta-, y Epsilon Proteobacteria.
Brenner, D., Krieg, N., Staley, J. (Eds) Berlin:
Springer-Verlag Publishers. 925-948.

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