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PRCTICA N10
CATLISIS ENZIMTICA:
AYACUCHO PER
2017
PRACTICA N10
UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN CRISTOBAL DE HUAMANGA
Escuela Profesional de Ingeniera Qumica
CATALISIS ENZIMTICA
ACCIN DE LA CATALAZA SOBRE EL PEROXIDO DE HIDRGENO
I. OBJETIVOS
1. Medir los volmenes de oxigeno liberados en cada tiempo para los ensayos con
diferentes concentraciones del sustrato H2o2, [S] a determinada temperatura
manteniendo la masa constante de enzima (E) presente en el tubrculo o frutas.
2. Determinar la velocidad inicial (Vo) de la reaccin de la enzima (E) con diferentes
muestras de sustrato H2o2 a temperatura constante.
3. Hallar los parmetros cinticos: velocidad mxima (Vmx) y la constante de Michaelis
Menten (KM) representando 1/Vo VS 1/[S] y representar la ecuacin de Lineweaver-
Burk o de la doble recproca.
4. Representar el significado de Vmx y KM, la ecuacin de Henry-Michaelis-Menten y
trazar la curva corregida con Vo con la ecuacin de LineweaveR-Burk (c).
5. Explicar el significado de Vmx y KM en la presente catlisis enzimtica.
6. Hallar los parmetros cinticos: velocidad mxima (Vmx)y la constante de Michaelis-
Menten (KM) representando Vo VS Vo/[S] y presentar la ecuacin de Eadie-Hofstee.
7. Comparar los resulados de 3,5 y 6
CATLISIS ENZIMTICA
k 1 k 2
E + S [E S ] (1) [E S ] E + P (2)
k -1 k -2
De acuerdo a la ecuacin (2) la velocidad inicial (Vo) de una reaccin catalizada por enzimas
estara determinada por la desaparicin del ES y, por lo tanto, es proporcional a su concentracin:
Sin embargo, k2 y [ES] son difciles de determinar directamente por lo que Michaelis y Menten
V o = k 2 [E S ] (3)
derivaron la ecuacin (3) en trminos de otras variables que pueden ser medidas
experimentalmente:
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V m ax [S ]
V o = (4 )
K m + [S ]
Vo
Vmx
-K m
1
[S]
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(A) (B)
Vo V max Vo V max
S ustrato 1 E nzima 1
ato 2
S ustr
V mx V mx
2 2 Enzima 1 : Hexoquinasa
a 2 Enzima 2 : Glucoquinasa
E nz im
Enzima: Hexoquinasa Sustrat : glucosa
Sustrato glucosa oK =m10,1 mM
1:
Sustrato K =m210 mM
2: fructosa
Km K m2 [S] Km [S]
1 1
Figura 2: Curvas de sustrato. (A)Una enzima con dos sustratos. (B)Dos enzimas con el mismo sustrato.
Vo
El conocimiento de Vmx nos da informacin sobre la cantidad
de enzima presente ya que la Vmx es directamente
proporcional a la concentracin de enzima.
A medida que aumenta la concentracin de enzima aumenta el
complejo [ES] y por lo tanto aumenta la velocidad de la
reaccin (Figura 3). Cuando se trabaja con concentraciones de
sustrato saturantes, toda la enzima est formando el complejo
[ES] y el aumento de la velocidad es proporcional al aumento
de la concentracin de enzima, es decir que estamos
[Enzima]
trabajando en condiciones de Vmx. Si la concentracin de
sustrato deja de ser saturante el aumento de la actividad deja Figura 3: Efecto de la concentracin de enzima en
reaccin una
de ser proporcional, y la velocidad deja de ser mxima (Figura enzimtica
3).
Teniendo en cuenta estas consideraciones, cuando se necesita conocer la cantidad de enzima presente
en una muestra se recurre a la velocidad de la reaccin enzimtica que cataliza, en condiciones
saturantes de sustrato (Vmx). Cabe aclarar que los kits comerciales estn diseados para medir actividad
enzimtica dentro de un rango de concentracin de enzima. Si la concentracin de enzima es demasiado
alta, puede suceder que la concentracin de sustrato deje de ser saturante y en esos casos lo correcto
es diluir la muestra problema y luego repetir la medicin.
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Asimismo, es til definir una constante de velocidad general, kcat, para describir la
velocidad limitante de cualquier reaccin enzimtica a saturacin. En una reaccin Michaelise k cat=
Vmx/[Et]. La kcat, denominada tambin nmero de recambio, es una constante de velocidad de
primer orden con unidades de tiempos inversos y es equivalente al nmero de molculas de sustrato
convertidas en producto en una unidad de tiempo, por una sola molcula de enzima, cuando la
misma est saturada de sustrato.
Vmx es proporcional a la [Et]. Entonces, Vmx = cte. x [Et]. Dicha cte. es kcat = Vmx / [Et]
1 1 K m 1
= + x (8)
V o V m ax V m ax [S ]
Al graficar 1/Vo en funcin de 1/[S] se obtiene la Figura 4B. De la interseccin de la recta con la
ordenada se obtiene 1/Vmx y de la interseccin de la recta con la abscisa se obtiene 1/Km.
Km
V max Pendiente
V max
2 =
1
V max
Km [S] 1 1
Km [S]
La ventaja del uso del mtodo de la doble recproca respecto a los otros mtodos grficos radica en
la determinacin ms precisa de Vmx y como veremos ms adelante ser de utilidad en el anlisis de
la inhibicin enzimtica.
En la actualidad se usan mtodos de regresin no lineal que estn disponibles en diversos
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programas para PC, los que por aproximaciones matemticas sucesivas (iteraciones)
encuentran los valores de los parmetros cinticos. Cabe aclarar que todas las tcnicas de clculo
por mtodos grficos son menos precisas que los mtodos de regresin no lineal.
INHIBICIN ENZIMTICA
Los inhibidores de enzimas son molculas que interfieren con la catlisis disminuyendo la velocidad
de las reacciones. Varias sustancias pueden inhibir la actividad enzimtica, tales como: anlogos de
sustratos, toxinas, drogas, complejos metlicos, anticoagulantes, etc.
Los estudios sobre inhibicin enzimtica nos dan informacin sobre las vas metablicas, una visin
acerca de los mecanismos de accin de drogas y toxinas, y una mejor comprensin de los
mecanismos de las reacciones enzimticas. La determinacin de Km y Vmx tiene gran importancia y
utilidad al trabajar con inhibidores, pues en base a los valores obtenidos se puede determinar la
presencia y tipo de inhibidor.
Los inhibidores de enzimas se dividen en dos clases: reversibles e irreversibles.
INHIBIDORES REVERSIBLES
1- INHIBICIN COMPETITIVA
Un inhibidor competitivo, compite con el sustrato por el sitio activo de la enzima e impide la unin
del sustrato.
Los inhibidores competitivos son, frecuentemente, compuestos que se parecen estructuralmente al
sustrato y que se combinan con la enzima formando el complejo [EI]. Debido a que el inhibidor se
une de manera reversible a la enzima, se puede cambiar el sentido de la competicin en favor del
sustrato simplemente aadiendo ms sustrato. Cuando hay suficiente sustrato se minimiza la
probabilidad de que se fije una molcula de inhibidor por lo que la reaccin muestra la misma V mx
que la reaccin sin inhibidor, pero Km aumenta en presencia del inhibidor (Km) (Figura 5).
Vo V (A ) (B )
m ax 1
or
Vo
id
h ib
or
id
n in
o r dor b
ib id n h ib i n hi
in h i n i
Co
n C on Si
Si
V m ax
2
1
V m ax
K m K m [S ] 1 1 1
K m K m [S ]
FFigura
i g u r a 5:
9 : E f e c to d e u n in h ib i d o r c o m p e t it iv o e n u n a r e a c c i n e n z im ti c a . ( A ) C u r v a d e s u s t r a to e n p r e s e n c ia
y e n a u s e n c ia d e l in h ib id o r. ( B ) D o b le r e c p r o c a e n p r e s e n c i a y e n a u s e n c ia d e l i n h i b id o r.
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2- INHIBICIN NO COMPETITIVA
V o V m ax (A ) 1 (B )
V
r
do
o
ib i
r
b id o r id o
in h
in h i hi
b
n
S in
Co
in
n
V m a x 1 Si
id o r
n in h ib V m a x
V m ax Co
2
1
V m a x V m ax
2
K [S ] 1 1
m
K m [S ]
FFigura
i g u r a 16:
0 : E fe c to d e u n in h ib i d o r n o c o m p e t it iv o e n u n a r e a c c i n e n z im tic a . ( A ) C u r v a d e s u s t ra to e n p re s e n c ia
y e n a u s e n c ia d e l in h ib id o r. ( B ) D o b le r e c p r o c a e n p r e s e n c i a y e n a u s e n c ia d e l in h ib id o r.
Un inhibidor no competitivo es el que se fija a un sitio distinto del que se fija el sustrato. La fijacin
del inhibidor puede o no bloquear la fijacin del sustrato, pero si este ltimo se une al sitio activo no
se puede transformar a P o lo hace a menor velocidad. El inhibidor disminuye de manera efectiva la
concentracin de enzima activa por lo que disminuye la V mx aparente (Vmx). Frecuentemente el
efecto sobre Km es nulo (Figura 6).
3- INHIBICIN ACOMPETITIVA
En este caso el inhibidor se une al complejo [ES], con lo cual el valor de K m disminuye (como si la
enzima tuviera ms afinidad por el S). Tambin disminuye la V mx ya que el complejo [SEI] es
inactivo (Figura 7).
Vo V m ax (A ) (B )
1
Vo
r
b id o r i do
in h i h ib
S in n i
n
id o
r
V m a x C o n h ib
ib id o r ni
n in h Si
V m ax
Co 1
2 V m a x
V m a x
2 1
V m ax
K [S ] 1 1 1
K m m
K m K m [S ]
FFigura
i g u r a 7:
1 1 : E f e c to d e u n in h ib id o r a c o m p e titiv o e n u n a r e a c c i n e n z im tic a . ( A ) C u r v a d e s u s tr a to e n p r e s e n c ia
y e n a u s e n c ia d e l in h ib id o r. ( B ) D o b l e r e c p r o c a e n p r e s e n c i a y e n a u s e n c ia d e l in h ib id o r.
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INHIBIDORES IRREVERSIBLES
Con el uso de inhibidores irreversibles es frecuente la formacin de un enlace covalente entre
un inhibidor y la enzima. Los inhibidores irreversibles son muy tiles para estudiar los mecanismos
de reaccin. Estos juegan un papel central en los mtodos modernos para obtener nuevos agentes
farmacuticos, proceso que se denomina diseo racional de frmacos. Debido a que el inhibidor se
ha diseado para una enzima especfica y no es reactivo hasta que se encuentre en el sitio activo
de la enzima, los frmacos basados en este mtodo son con frecuencia muy efectivos y tienen
pocos efectos secundarios.
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El cofactor tiene un espectro de absorcin NAD
+
diferente en su forma oxidada (NAD+) o en su 0
forma reducida (NADH) (ver Figura 8). La 220 260 300 340 380
concentracin de NADH se puede determinar Longitud de onda (nm)
espectrofotomtricamente siguiendo el cambio de
absorbancia a 340 nm. Figura 8. Espectro de absorcin del NAD+ y
NADH.
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CONSTANTE DE MICHAELIS-MENTEN
Aunque es imposible medir exactamente la concentracin de sustrato que da Vmax, las
enzimas pueden caracterizarse mediante la concentracin de sustrato a la cual la
velocidad de reaccin es la mitad de la velocidad mxima. Esta concentracin de
sustrato se conoce como constante de Michaelis-Menten (KM).
Para enzimas que exhiben una cintica de Michaelis-Menten simple esta constante
representa la constante de disociacin del complejo enzima-sustrato (ES) (o la inversa
de la afinidad entre enzima y sustrato). Valores bajos indican que el complejo ES est
unido muy fuertemente y raramente se disocia sin que el sustrato reaccione para dar
producto.
En estos casos se obtendr una KM diferente segn el sustrato especfico sobre el que
acte la enzima (como sucede en el caso de enzimas que actan sobre sustratos
anlogos) y segn las condiciones de reaccin en que se realicen las mediciones.
Nota: KM solo se puede usar para determinar la afinidad de una enzima por un
sustrato k2 es limitante de la velocidad, por ejemplo, k2 << k1 y KMse convierte en k-
1/k1. Generalmente, k2 >> k1 o bien k2 y k1 son comparables.
ECUACIN
La derivacin de Michaelis y Menten est descrita por Briggs y Haldane. Se obtiene de
la siguiente manera:
Se supone que la reaccin enzimtica es irreversible, y que el producto no se liga con la
enzima despus de la reaccin.
Siguiendo la aproximacin del estado estacionario, que seala que la concentracin del
complejo enzima-sustrato (ES) es pequea y se mantiene casi constante a lo largo de la
reaccin enzimtica:
Se define:
Entonces:
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Reordenando:
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grficamente V0 frente a [S] se puede fcilmente determinar Vmx y Km. Esto requiere
una serie de experimentos a E0constante y diferentes concentraciones de sustrato [S].
k1 k3 1
H 202 ( ac ) +catalasa ( ac ) H 2O 2 ( ac ) catalasa ( ac ) + H 2O ( l ) + O2( g)
k2 2
2 lupas
2 Erlenmeyer de 150 ml
2 pisetas
2 pinzas
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Equipos
2 equipos gasomtricos y accesorios
1 balanza analtica digital (*/-0.1mg)
2 termocuplas
2 cronmetros
1 molde circular de 1-2cm
1 almetro barmetro
1 psicrmetro
1 cuchilla
Reactivos
50 ml de H202 al 30 % w/v
100g de papa
1 L de agua destilada
4. Termostatizar los Erlenmeyer por 7-12 minutos, dos en cada cuba del termostato.
5. Pesar cuatro muestras con una masa constante de la fuente de catalasa (papa),
de forma circular con una altura de 1-2mm y cuya masa constante debe estar
entre 1.2 y 1.50 g. (emplear una masa constante: +/- 0.001 g). guardarla en la
respectiva cpsula de Petri. Registrar las masas en la tabla T.1 LA FORMA Y
TAMAO DEL ENZIMA DEBE SER UNIDFORME.
6. Asegurarse de la hermeticidad de ambos equipos. Nivelar el volumen de agua en
cero. Ensayar sucesivamente la dinmica de medicin del Vo2 cada 30 y 60 s.
7. Colocar en el Erlenmeyer el trozo de papa e instantneamente cerrar la llave y la
tapa, estando el nivel de agua en la bureta en cero.
9. Repetir los pasos anteriores (6-8) con los otros tres Erlenmeyer.
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Construir la Figuras NI.1, I.2, I.3 y I.4 para cada concentracin de sustrato los
volmenes de oxigeno desprendido en cada tiempo transcurrido.
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KM Vmx[ S ]
1
1 Vmx 1 Vo=
= + KM +[ S]
Vo [ S] Vmx
Vmx= Vmx=
KM= kM=
10 %v 3 H 2O 2 w /v
100 ml 10 v
3 g de H 2 O 2
Preparacin de las soluciones de perxido
Moles iniciales
w w
15 ml H 2O 2 3 2.4 X
v v
12 ml H 2 O 2X 9 ml H 2O 2 2.4 %w /v
x 1.8 w /v
14
w
6 ml H 2O 2 2.4 x 1.2 w /v
v
Hallar la velocidad inicial, Vo, para cada concentracin de sustrato, [S]. anotar
RECOMENDACIN: LA DETERMINACIN DE CADA VELOVIDAD INICAL DE CADA
EXPERIMENTO DEBE UTILIZAR LAS MISMAS ESCALAS.
[H2o2]=[S]=3.0%w/v
6
5
f(x) = 0.75x + 0.44
4
VO2, mg
0
0 1 2 3 4 5 6
t, min
[H2o2]=[S]=2.4%w/v
8
f(x) = 1.13x + 0.92
7
5
VO2, mg
0
0 1 2 3 4 5 6
t ,min
16
[H2o2]=[S]=1.8%w/v
14
10
8
VO2, mg
0
0 1 2 3 4 5 6
t,min
[H2o2]=[S]=1.2%w/v
4
3.5
f(x) = 0.56x + 0.13
2.5
VO2, mg
1.5
0.5
0
0 1 2 3 4 5 6
t,min
16
12 3.0[H2o2]=[S]=%w/v Pol ynomi a l (3.0[H2o2]=[S]=%w/v)
2.4[H2o2]=[S]=%w/v Pol ynomi a l (2.4[H2o2]=[S]=%w/v)
1.8[H2o2]=[S]=%w/v Pol ynomi a l (1.8[H2o2]=[S]=%w/v)
10
1.2[H2o2]=[S]=%w/v Pol ynomi a l (1.2[H2o2]=[S]=%w/v)
8
vO2, mg
0
0 1 2 3 4 5 6
t, min
1/Vo 1/[S]
1.326963907 0.333333333
0.881600987 0.416666667
0.536394357 0.555555556
1.78348493 0.833333333
16
Grfico de Linmeweaver-Burk
2
1.8
1.6
1.4 f(x) = 1.2x + 0.49
1.2 R = 0.23
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
1/[S]
Ubicar dos puntos corregidos(o) y trazar la recta corregida con lnea entrecortada.
Extrapolar hasta interceptar el eje X.
1/Vo 1/[S]
1.326963907 0.333333333
0.881600987 0.416666667
0.536394357 0.555555556
1.78348493 0.833333333
Grfico de Linmeweaver-Burk
2
1.8
1.6
1.4 f(x) = 1.2x + 0.49
1.2 R = 0.23
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
1/[S]
16
1
1/ Vo=1.1966 ( )+0.4923 R =0.2345
[ S]
Entonces cuando x = 0,
y=0.5
b=0.4923
1 m
=0.4923 V mx=2.0313
V mx s
Vo2 [H2o2]
0.7536 3.0
1.134300001 2.4
1.8643 1.8
0.5607 1.2
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Determinamos la velocidad inicial de la reaccin de la enzima catalasa con
diferentes muestras de sustrato a temperatura constante. (KM) representando
1/Vo VS 1/[S] y representar la ecuacin de Lineweaver-Burk o de la doble
recproca.
Representamos el significado de Vmx y KM, la ecuacin de Henry-Michaelis-
Menten y trazar la curva corregida con Vo con la ecuacin de LineweaveR-Burk
(c).
Explicamos el significado de Vmx y KM en la presente catlisis enzimtica.
Hallar los parmetros cinticos: velocidad mxima (Vmx)y la constante de
Michaelis-Menten (KM) representando Vo VS Vo/[S] y presentar la ecuacin de
Eadie-Hofstee.
Comparramos los resultados de 3,5 y 6
VII. BIBLIOGRAFA
CHANG, R.(2000) Fisicoqumica. Edit. McGraw-Hill interamericana. Mxico, D. F.
Mxico.
BALL, R (2005) Fisicoqumica. Edit. Thomson. Buenos Aires. Argentina.
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