Manual de Microbiologia

Manual de microbiologa UPIBI_IPN
INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL
INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BSICAS

ACADEMIA DE BIOLOGA
MANUAL DE MICROBIOLOGA
ELABORADO POR:
Martha Morales Martnez
Refugia Prez Snchez
Miriam Jurez Jurez
Mara de Lourdes Moreno Rivera
Segunda edicin
Refugia Prez Snchez
ENERO 2012
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PRLOGO
El presente manual de laboratorio de Microbiologa tiene la finalidad de dar apoyo a la asignatura con el
mismo nombre, en este manual tenemos las prcticas que se realizarn a lo largo del curso, la cual
contiene los fundamentos mnimos, los materiales, el procedimiento y la bibliografa para ampliar los
fundamentos.
Se presentan algunas tcnicas bsicas de microbiologa, algunas de ellas basadas en la normatividad
de la Secretaria de Salud para que el alumno poco a poco se vaya adentrando a la legislacin sanitaria
mexicana.
Uno de los principales objetivos es poner en prctica el mtodo cientfico para despertar el inters y
seguir estimulando en algunos casos al estudiante por esta rama de la ciencia.
Como una aportacin a las estructuras didcticas de este manual, colocamos una serie de imgenes de
lo que esperamos en el experimento y de lo que no esperamos para poderlos comparar.
NOMBRE DEL ALUMNO: ________________________________________________________
PROFESOR DE TEORA: ________________________________________________________
PROFESORES DE LABORATORIO: _______________________________________________
________________________________________________
________________________________________________
GRUPO: _____________________
PERIODO LECTIVO: ____________________________________________________________
CARRERA: ___________________________________________________________________
ESCUELA: ___________________________________________________________________
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NDICE
Prologo__________________________________________________________________________ 2
ndice ____________________________________________________________________________3
Instrucciones generales _____________________________________________________________ 4
Practica No. 1 Microscopia __________________________________________________________ 9
Practica No. 2 Preparaciones fijas y en fresco ____________________________________________ 16
Practica No. 3 Mtodos de esterilizacin y reduccin de la carga microbiana ___________________ 23
Practica No. 4 Nutricin y cultivo de microorganismos aerbicos ____________________________ 31
Practica No. 5 Aislamiento y recuento de microorganismos aerbicos________________________ 46
Practica No. 6 Conservacin de microorganismos_________________________________________ 52
Practica No. 7 Identificacin de microorganismos (bacterias)________________________________ 63
Practica No. 7 Identificacin de microorganismos (mohos y levaduras)________________________ 83
Practica No. 8 Crecimiento microbiano _________________________________________________ 95
Practica No. 9 efecto de los factores fisicoqumicos sobre el crecimiento microbiano _____________104
Practica No. 10 Mtodos rpidos para la identificacin de microorganismos____________________113
Agares __________________________________________________________________________122
Caldos __________________________________________________________________________125
Medios semislidos________________________________________________________________ 128
Soluciones y reactivos _____________________________________________________________ 130
Colorantes, decolorantes y mordente_________________________________________________ 133
Nefelmetro de McFarland________________________________________________________ 135
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INSTRUCCIONES GENERALES
I.- EVALUACIN
1.- El laboratorio se evala como sigue:
a) Trabajo laboratorio 3.4
b) Diagrama de la practica 0.5
c) Examen 1.0
d) Discusin 2.5
e) Reporte de la prctica 2.5
Nota. Solo se promedia el laboratorio si se aprueba la teora.
2.- El reporte se evala:
a) Objetivo y bibliografa 0.5
b) Resultados y cuestionario 1.0
c) Discusin y anlisis 0.5
d) Conclusiones 0.5
3.- Para aprobar el curso de laboratorio se requiere haber asistido al 80% de las sesiones prcticas,
aprobar el 80% de las prcticas efectuadas y obtener un promedio mnimo de seis.
4.- La calificacin del trabajo prctico se obtendr promediando las sesiones de las que conste la
prctica. Si el alumno no cumple en alguna de las tres etapas, se le calificar con cero en la parte
correspondiente.
5.- La calificacin de laboratorio se obtendr por cada departamental
6.- Si un alumno no asiste a una sesin tendr cero en trabajo prctico, si la justifica se mantiene la
calificacin, pero no se cuenta la falta para el computo final de asistencias.
7.- Se elige un reporte al azar de cada equipo, revisando que todos los alumnos miembros del
equipo lo hayan elaborado. Si no es as el alumno que no lo presento tendr cero y para acreditar
el laboratorio deber entregar el 80 % de prcticas
8.- Cuando a un equipo le toque preparar los materiales para utilizarse en la prctica o bien la
esterilizacin de material limpio y /o sucio y no lo realice tendr cero en la prctica.
9.- Cada grupo de 6 equipos deber traer un candado para su gaveta y cada equipo tendr una
llave, donde podr guardar solo material de Microbiologa.
II.- ORGANIZACIN CON LOS ALUMNOS
10.- Para asistir al laboratorio el alumno deber traer:
Una bata limpia y con botones Una fotografa tamao infantil

Manual de laboratorio Colores
Dos asas bacteriolgicas Un marcador indeleble de punto mediano
11.- El cuaderno de reporte de prcticas debe ser de tamao profesional forrado de color blanco
(2LM1), Verde claro (2LM2) Verde obscuro y Morado el grupo (2LV1), en la portada se colocar una
etiqueta con el ttulo de la asignatura, el nombre de los tres alumnos que conforman el equipo,
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colocando en primer trmino el del dueo del cuaderno, de manera remarcada o con letra ms grande
y en la parte superior derecha se pondr una etiqueta de 5 cm con el nmero de equipo.
Por equipo deber traer:
Un rollo de Masking tape Una regla graduada

Papel peridico 5 cm de altura Un metro de franela
Una tijera de punta recta Un jabn para las manos
Una pinza de punta roma Dos frascos de boca ancha de vidrio
Tres botes de lmina Dos frascos de vidrio de aprox. 13x4cm
Una llave del candado Una caja de ligas del nmero 18
Una esponja Encendedor
Una jeringa de 5 ml 250 ml de alcohol
Una caja de portaobjetos Una brocha de cerdas suaves
Fibra suave para trastes Rollo de papel aluminio de hoja gruesa
Una cuchara sopera y una cafetera de acero
inoxidable
Por seccin
Por seccin se deber traer un candado Una caja de cubreobjetos

Dos frascos de 1/2 L de Jabn lquido para trastes Un barniz de uas transparentes
1 kg de algodn Dos frascos de jabn lquido para manos
Paquete de papel higinico de 4 rollos suave 1 kg de bolsas de plstico de polipapel con
capacidad de 1kg
Una canastilla
Por grupo
Bolsa de cofias
III.- DEL HORARIO Y COMPORTAMIENTO DE LOS ALUMNOS.

12.- Se impartirn dos sesiones por semana de 3.0 horas cada una.
13.- Cada sesin principiar y terminar a la hora indicada.
14.- Se pasar lista cada da al empezar la prctica.
15.- Se anotarn las faltas y asistencias con todo rigor y por ningn motivo se pondrn retardos.
16.- Cuando el alumno abandone el laboratorio antes de terminar la prctica y sin el consentimiento
del profesor, se considerar que no asisti a la prctica.
17.- Las faltas al laboratorio se calificarn con cero.
18.- La asistencia al laboratorio es obligatoria, ya que uno de los objetivos del trabajo prctico es que
el alumno adquiera habilidades y destrezas. La lista de asistencia se efectuar a la hora indicada
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con una tolerancia de 10 minutos y con la bata debidamente abrochada. En caso de llegar ya no
se le permitir la entrada a menos que sea discusin con su correspondiente falta.
19.- El reporte se entregar una semana despus de realizada la discusin, excepto la prctica que
este cercana al periodo de evaluacin y no se permitir que el reporte se entregue escrito todo o
alguna fraccin con lpiz, se sugiere el uso solo de colores negro, azul, rojo y en caso de
esquemas lpices de colores.
20.- El alumno utilizar el Manual de Prcticas de Laboratorio, obligatoriamente en cada sesin,
apegndose a la metodologa a seguir, as como a las instrucciones del profesor y corregir lo
que se vaya cambiando.
21.- El material y equipo roto, deteriorado o extraviado, deber ser repuesto por el equipo
responsable, para ello tiene como mnimos una semana, de lo contrario el vale se ir al
expediente del alumno.
22.- El alumno revisar el material que reciba y reportar cualquier anomala antes de iniciar el trabajo
prctico para evitar que se le responsabilice del material deteriorado que se le entregue.
23.- Despus de terminada la prctica, el material debe ser entregado limpio por el equipo
responsable a la persona encargada del almacn.
24.- Evitar su permanencia en el laboratorio despus de terminada la prctica.
25.- Se debe guardar el comportamiento adecuado para evitar accidentes, ya que el laboratorio es un
lugar de trabajo donde se manejan cultivos y aparatos delicados.
26.- La entrada de los alumnos al laboratorio en horas que no correspondan a la sesin, estar
condicionada a la autorizacin del profesor responsable de la prctica, y en caso de retirar su
material de la incubadora deber traer bata, adems traer su material que va a necesitar.
27.- Una vez esterilizado el material que contenga agar se dejar enfriar y posteriormente se
depositar en una bolsa de plstico para su desecho.
28.- Equipo que no traiga el material biolgico solicitado en la prctica no se le permitir la entrada.
IV BREVES REGLAS DE SEGURIDAD PARA UN LABORATORIO DE MICROBIOLOGA
1.- Las reglas de seguridad son para TODAS las personas que estn en el laboratorio.
2.- Uso de bata de laboratorio. Las batas protegen de contaminaciones qumicas o biolgicas, por
ello se recomienda su cambio al salir de laboratorio.
3.- Lavarse las manos al inicio y al final cada prctica: Recordar que se manejan microorganismos
patgenos.
4.- El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Cualquier material que no se
utilice en la realizacin de la prctica debe estar apartada del rea de trabajo. Antes de comenzar
desinfectar la superficie de trabajo.
5.- Prohibido comer, beber, fumar y mascar chicle. Cuando se manipulan microorganismos hay
que evitar llevarse las manos a la boca, nariz ojos u odos.
6.- No se debe pipetear nunca con la boca. Utilizar siempre pipeteadores o pipetas automticas.
7.- Evitar generar aerosoles que contengan microorganismos, ya que son fcilmente
inhalados. Todas las operaciones bruscas como el manejo rpido de las asas pueden generar
microparticulas que pueden ser inhaladas por el analista. Los microorganismos deben manejarse
siempre alrededor de la flama del mechero en un rea de 15 cm o en una campana de seguridad.
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8.- Evitar desplazarse en el laboratorio.

9.- Las ventanas deben estar cerradas, ya que las corrientes de aire originan contaminaciones en
los cultivos.
10.- El transporte y almacenamiento de placas y recipientes que contengan cultivos. Se debe
realizar con una canastilla y si se saca de la incubadora o refrigerador, sacar dicho material de una sola
vez y siempre colocar el material de forma segura para evitar que se caigan.
11.- Bajo ningn concepto se deben sacar muestras contaminadas del laboratorio.
12.- El material contaminado debe esterilizarse antes de procesarlos como residuos. El
material de vidrio debe esterilizarse para luego lavarse, secarse y volverse a emplear.
13.- El material de vidrio roto depositarlo en los contenedores especficos y designados en el
laboratorio
14.- El botiqun de primeros auxilios est en el interlaboratorio
15.- La mesa de trabajo se debe limpiar con una esponja que contenga benzal como desinfectante,
este proceso se hace antes y despus de terminar la sesin de laboratorio.
16.- En caso de accidente. Avisar inmediatamente al profesor, en caso de derrame del cultivo se
deber cubrir con un desinfectante y dejar actuar por cinco minutos, para luego limpiar con la esponja.
17.- Tomar las precauciones necesarias en el suministro de gas, evitar la presencia de sustancias
inflamables, revisar peridicamente las instalaciones y la flama del mechero beber estar en azul, para
ello el mechero cuenta con una entrada de la cantidad de aire con el que se obtiene una mezcla de aire-
gas, de forma que la llama tenga oxigeno suficiente.
18.- Incendio de disolventes. En el caso de que se produzca un accidente al incendiarse un
solvente, nunca soplar, se deber emplear una franela mojada para cubrir el recipiente. Si el fuego se
extiende, usar el extintor dirigindolo a la base de las llamas.
19.- Durante el desarrollo de la prctica, queda prohibida la entrada de personas ajenas al grupo que
visiten a los alumnos y a profesores.
20.- Los alumnos con el pelo largo se lo recogern, no se permite el uso de flecos.
21.- Queda prohibido el uso de celulares y aparatos electrnicos durante el desarrollo de la prctica.
22.- Al entrar al laboratorio evitar, traer chamarra, bufanda, guantes y la bata deber estar
abrochada.
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Actividades:
I.- Lectura de Normas Oficiales Mexicanas (NOM)
A. Norma oficial mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Proteccin ambiental - Salud ambiental -
Residuos peligrosos biolgico-infecciosos - Clasificacin y especificaciones de manejo.
B. Norma oficial mexicana NOM-026-STPS-2008, Colores y seales de seguridad e higiene, e
identificacin de riesgos por fluidos conducidos en tuberas
a. Desinfeccin del rea de trabajo
b. Cdigo de colores (instalaciones de gas)
c. Uso del contenedor para punzocortantes
d. Botiqun
e. Extinguidores
C. Norma oficial mexicana NOM-120-SSA1-1994, bienes y servicios. Prcticas de higiene y sanidad
para el proceso de alimentos, bebidas no alcohlicas y alcohlicas.
II.- Conocimiento del material bsico de laboratorio
a. Material de cristalera
b. Uso del mechero
III.- Equipo de laboratorio
a. Cuarto de incubacin
b. Cuarto de refrigeracin
c. Incubadoras
d. Balanza de dos platillos, granataria, digital y analtica
e. Campana de flujo laminar
f. Campana de extraccin
IV.- Material para la gaveta
a. Frasco con benzal
b. Frasco con alcohol
c. Frasco con torundas
d. Frasco con benzal para pipetas
e. Varilla acodada y base de caja de Petri
f. Frasco con benzal para material de desecho
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PRCTICA No. 1
MICROSCOPA
UNIDAD: II Microscopia y tinciones
1. OBJETIVOS:
1.1 Objetivo general
1.1.1. El alumno aprender a enfocar correctamente una preparacin para ser observada en el
microscopio compuesto, as como la forma correcta de utilizarlo.
1.2 Objetivos especficos
1.2.1 El alumno manejar correctamente el microscopio compuesto.
1.2.2 El alumno realizar correctamente la tcnica de iluminacin de Khler
2.- INTRODUCCIN
El microscopio es un instrumento ptico que amplifica la imagen de un objeto pequeo. Es el

instrumento que ms se usa en los laboratorios que estudian los microorganismos. Mediante un sistema
de lentes y fuentes de iluminacin se puede hacer visible un objeto microscpico. Los microscopios
pueden aumentar de 100 a cientos de miles de veces el tamao original. Los diversos elementos que
existen en la naturaleza, presentan tamaos, formas y composiciones distintas, la mayora de ellas
pueden verse, algunas a simple vista, y otras mediante instrumentos.
Para poder observar a la clula es necesario recurrir a equipos como el microscopio, de este existen
diversas variedades, los cuales estn diseados a lo que pretendemos observar y como ejemplo
tenemos a:
Microscopio ptico
Es un instrumento (de un lente o varios lentes), que amplifica una imagen y permite la observacin de
mayores detalles de los posibles a simple vista. El microscopio ms simple es una lente de aumento o
un par de anteojos. El poder de resolucin del ojo humano es de 0,2 mm es decir que para ver dos
objetos separados estos deben estar como mnimo a esa distancia. El microscopio aumenta la imagen
hasta el nivel de la retina, para captar la informacin. La resolucin depende de la longitud de onda de
la fuente luminosa, el espesor del espcimen, la calidad de la fijacin y la intensidad de la coloracin.
Tericamente la mxima resolucin que se puede alcanzar es de 0,2 m dada por una luz con longitud
de onda de 540 nm, la cual pasa por un filtro verde (muy sensible por el ojo humano) y con objetos
condensadores adecuados. El ocular aumenta la imagen producida por el objetivo, pero no puede
aumentar la resolucin. Existen distintos microscopios pticos generales y de investigacin que se
diferencian en factores tales como la longitud de onda de la iluminacin del espcimen, la alteracin
fsica de la luz que incide en la muestra y procesos analticos que se aplican a la imagen final.
El microscopio compuesto est formado por tres sistemas: 1. Sistema de iluminacin; 2. Sistema ptico
y 3. Sistema mecnico.
El sistema de iluminacin corresponde a la fuente de luz y sus aditamentos para iluminar eficazmente
la preparacin y est formado principalmente por la lmpara (6V), el diafragma de campo y el
condensador (lente frontal, diafragma de iris y lente auxiliar)
El sistema ptico est formado por una serie de lentes de vidrio en los objetivos y oculares que
permiten agrandar la imagen y est formado por los objetivos, tubo y el ocular.
El sistema mecnico est formado por una serie de engranes y botones que permiten realizar el
movimiento y cambio de las lentes as como el enfoque de la preparacin y est formado por la base,
estativo, tornillos macromtrico y micromtrico, platina, revolver y porta-revolver.
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Funcin bsica de cada parte del microscopio:
a.- Sistema mecnico

Base. Pieza metlica que sostiene a todo el aparato
Estativo. Lugar de donde se debe tomar para trasladar al microscopio
Platina. Es una plancha cuadrada y gruesa de metal con un orificio central en donde descansa la
preparacin, la cual es fijada por dos pequeas pinzas, se puede mover hacia arriba y hacia abajo con
los tornillos macromtrico y micromtrico por medio de un sistema de engranes. Posee escalas
numricas que permiten ubicar fcilmente la posicin de lo que se observa y, al mismo tiempo, deslizar
la preparacin en forma de cruz (ejes X y Y) para su localizacin.
Pinzas. Sirve para sujetar al portaobjetos.
Tornillo macromtrico. Permite el enfoque mayor.
Tornillo micromtrico. Permite el enfoque con precisin.
Tubo del ocular. Sostiene el lente del ocular.
Revolver: Es un dispositivo giratorio en donde se atornillan las lentes de los objetivos de distinto
aumento.
Tubo binocular. Cada uno de los tubos contiene en el interior un sistema de prismas y espejos que
dividen el haz de luz en dos haces, cada uno de los cuales se enva por separado a cada tubo, estos
tubos se deslizan hacia los lados para ajustar la distancia interpupilar ya que cada persona posee una
diferente separacin entre sus ojos. Los microscopios binoculares tienen entre los tubos una escala
grabada para poder ajustar la distancia y cada persona debe memorizar su valor de apertura
interpupilar; uno de los tubos tiene el ocular fijo y el otro tiene un sistema mecnico que sube o baja.
Para realizar el enfoque de cada ojo primero se enfoca con el tornillo micromtrico el tubo que tiene el
ocular fijo y despus se enfoca el que tiene el ocular mvil, pero en este caso sin mover el tornillo
micromtrico, girando el ocular mvil hasta encontrar el foco.
b.- Sistema de iluminacin
Lmpara. Es la encargada de proporcionar los haces de luz y tiene las siguientes caractersticas: 6V, 5-
15 W 12 V, 50-100 W
Diafragma de campo. Est situada en la base del microscopio y su funcin es la de regular el dimetro
de la emisin de la luz a fin de que se ilumine solo el rea de campo visual, es decir controla la cantidad
de luz que atraviesa la preparacin.
Condensador. Es un sistema de tres lentes convergentes que concentran los rayos luminosos sobre el
objeto a observar, el condensador utilizado es capaz de agrupar todos los rayos que provienen del foco
y permite aprovechar toda la luz posible que inciden sobre l y los dirige hacia el plano focal del objeto.
c. Sistema ptico
Oculares
El ocular es la parte ptica final externa, situados en el tubo a travs de los cuales se obtiene la imagen
final, el ocular tiene aumento propio (los aumentos son denominados con la letra X), en nuestro caso es
de 10X. El ocular consta de una lente cercana al ojo, collar, tubo del ocular y una lente cercana al
objetivo.
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Tubo
El tubo es la parte ptica mecnica, situada en la parte superior del microscopio, este puede ser
monocular o binocular, adems est adaptada para poderle colocar una cmara fotogrfica una
cmara de televisin. El tubo generalmente est diseado para trabajar a una distancia mecnica fija
entre ellos y este valor puede ser de 160 mm, el factor del tubo del microscopio a utilizar en el
laboratorio es de 1,25X, dato que nos sirve para calcular el aumento total.
Objetivos.- Son lentes que captan la imagen a observar, estn construidos de cristal o fluorita, poseen
aumento propio, apertura numrica y est diseada para trabajar con diferentes campos. Todos los
objetivos tienen anillos de colores y nmeros grabados sobre el tubo metlico, que nos permite saber a
detalle cules son sus ventajas, la disposicin de estos caracteres es la siguiente:
1.- El anillo de color superior indica los aumentos (tabla 1)
2.- El lado superior izquierdo indica el nmero de aumentos
3.- El lado superior derecho la apertura numrica.
4.- El lado inferior la distancia mecnica
5.- El lado inferior derecho el espesor del cubreobjetos
6.- El anillo de color inferior indica en qu medio se hace la inmersin del objetivo (tabla 2)
En ocasiones el objetivo puede traer en lugar de 0.17, el nmero 1, el cual indica que:
Acepta cubreobjetos desde 0,17 a 0,22 mm de espesor,
10= No requiere cubreobjetos
0,11 0,27 = Es ajustable a diferentes espesores de los cubreobjetos, desde 0,11 mm hasta 0,27 mm.
Anillo superior
Los anillos de color cerca del anillo moleteado facilitan el reconocimiento del coeficiente de aumento:
Tabla 1. Correspondencia entre los

aumentos y los anillos de colores
Tabla 2. Colores para el anillo inferior que
grabados indican en qu medio se debe hacer la
Aumentos Color anillo superior inmersin del objetivo
1.0X Negro ndice de
Carcte Sustanci Color del
2.5 X Pardo refracci
r a anillo
4.0 X Rojo n
6.3 X Anaranjado Oil Aceite 1,515 Negro
10 X Amarillo W Agua 1,333 Blanco
16 X Verde claro Glyz Glicerina 1,455 Anaranjad
25 X Verde oscuro o
40 X Azul claro Metilen Yoduro 1,740 Amarillo
63 X Azul oscuro o de
100X Blanco metileno
Aumentos totales:
El nmero total de aumentos que se puede lograr en un microscopio se obtiene multiplicando el nmero
de aumentos que tiene el ocular por el nmero de aumentos que tiene el tubo y por el nmero de
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aumentos que tiene el objetivo con el que se est observando.

Distancia mecnica:
Se llama distancia mecnica a la distancia que recorre a luz por el interior del microscopio desde que
penetra por el objetivo, pasando por los tubos y espejos, hasta llegar al ocular, la distancia mecnica se
mide desde la superficie de la rosca del objetivo hasta la base del ocular, esta distancia en el caso de
nuestro microscopio es de 160 mm.
Poder de resolucin:
El poder de resolucin de una lente se define como la capacidad que tiene para discernir entre dos
puntos muy cercanos entre s y que puedan verse separada.
El poder de resolucin del ojo humano es de 0,2 mm, el microscopio ptico de 0,2 y el microscopio
electrnico de 6 ngstrom.
Apertura numrica:
Es una medida de la amplitud del cono luminoso que se forma por las lentes del microscopio, ya sea del
condensador o del objetivo.
Microscopio de contraste de fase

Permite observar clulas sin colorear y resulta especialmente til para clulas vivas.
Este aprovecha las pequeas diferencias de los ndices de refraccin en las distintas partes de una
clula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de mayor ndice de
refraccin experimenta una deflexin y queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de
luz que pasaron la muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de
anillos pticos del objetivo y del condensador, anula la amplitud de la porcin fuera de fase inicial del
haz de luz y produce un contraste til sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a
las porciones densas del espcimen; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos
densas. Por lo tanto estos microscopios se utilizan para observar clulas vivas, tejidos vivos y cortes
semifinos no coloreados.
La resolucin de este microscopio no puede ser mejor que la del microscopio de campo oscuro porque
emplea la misma fuente de longitud de onda, sin embargo puede detectar partculas individuales ms
pequeas en las imgenes de campo oscuro, debido al contraste creado. Es til para observar
autorradiografas, cristales en la orina y para detectar espiroquetas en particular el Treponema pallidum
microorganismo causante de la sfilis.
Cada uno de los microscopios tiene una funcin determinada, en este y en este caso este tipo de
microscopio utiliza un microscopio auxiliar y un filtro verde, adems en este tipo de microscopio tambin
se realiza la tcnica de iluminacin de Khler.
3. MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS
3.1 MATERIAL POR EQUIPO
Microscopio compuesto Preparaciones fijas de bacterias

Papel seda
3.2 REACTIVOS
Aceite de inmersin Atomizador con benzal
3.3 MATERIAL QUE DEBE TRAER EL ALUMNO
Colores
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4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
a) Acudir con el profesor al cuarto donde estn los microscopios.
b) Transportar el microscopio de forma vertical tomndolo del brazo con una mano y en la otra la base.
c) Colocar el microscopio sobre la mesa de trabajo, y observar si presenta alguna irregularidad en caso
de presentarla informar al profesor (cable en mal estado, falta de un objetivo, etc.)
d) Con una perilla retirar el polvo de la parte mecnica y de la parte ptica.
e) Limpiar la parte mecnica del microscopio con una brocha de cerdas suaves.
f) Limpiar la parte ptica del microscopio con papel seda, nunca hacerlo con la bata.
g) Se dar la clasificacin del microscopio segn el sistema mecnico, ptico y el de iluminacin.
h) Conectar el microscopio a la toma de corriente
i) Bajo las instrucciones del profesor realizar la tcnica de Khler.
4.1 Cuidado y limpieza del microscopio

Un proceso de limpieza debe considerar los siguientes aspectos:
a) Para limpiar la parte ptica, se elimina primero las partculas de polvo, ya sea con un bulbo inyector
de aire, un pincel o soplando fuertemente sobre la lente.
b) Algunos solventes como la acetona disuelven los revestimientos de barniz, la pintura y an el
cemento de las molduras y los objetivos compuestos, por lo que no se deben usar.
c) Las partes mecnicas se deben lubricar y se limpian por fuera con una brocha de cerdas suaves.
Se enlistan algunos compuestos recomendados slo para ciertas partes del microscopio.
d) Espuma de jabn suave.- Solo para remover lo sucio de la superficie de instrumentos
e) Agua destilada con algn detergente sin aditivos alcalinos.- para un prelimpiado de la ptica.
f) Solucin para limpiar la ptica.- etanol al 40 %, ter al 20 %, para limpiar superficies de la ptica o
remover residuos de aceite de inmersin.
4.2 TCNICA DE ILUMINACIN DE KHLER
A fin de evitar toda serie de inconvenientes y poder utilizar lmparas de filamento espirilado, Khler
propone un mtodo que actualmente es utilizado. Su iluminacin se forma de dos diafragmas: un
diafragma denominado de campo, situado generalmente a nivel de la lmpara colectora y un diafragma
llamado de abertura, situado generalmente debajo del condensador.
Pasos a seguir para la iluminacin de Khler.
1.- Luz amarilla (bajo voltaje)
2.- Ajustar la distancia interpupilar
3.- Ajustar las dioptras
4.- Abrir el diafragma de campo e iris
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Pasos a seguir para la iluminacin de Khler en un microscopio
5- Subir completamente el condensador con la 6.- Enfocar la preparacin con el objetivo 4X

lente frontal introducida o 10X y utilizando los tornillos macro y
micromtrico
7.- Observar y cerrar el diafragma dispuesto en 8.- Bajar algo el condensador, hasta obtener
el pie del microscopio mxima nitidez de la imagen del diafragma
9.- Centrar el diafragma de campo luminoso en 10.- Abrir el diafragma de campo luminoso
el campo visual, recurriendo a los dos tornillos casi hasta el borde del campo visual,
el condensador centrando con exactitud y abrirlo hasta que
desaparezcas detrs del borde del campo
visual.
11.- Regular el contraste de la imagen con 12.- Insertar el filtro azul, regular la intensidad
ayuda del diafragma del condensador. de la luz con el control del voltaje.
13.- A cada cambio de objetivo: enfocar con el 14.- Al utilizar objetivos panormicos de bajo
micromtrico y contrastar con el diafragma del aumento rebatir la lente frontal del
condensador. condensador sin alterar su altura.
4.3 OBSERVACIONES DE UNA PREPARACIN FIJA.
a) Tomar una preparacin y enfocarla a 10 y 40 X.

b) Adicionarle aceite de inmersin y observarlo a 100 X
c) Observar la preparacin que contiene una bastante muestra y realizar el esquema biolgico
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d) Ahora mover la preparacin en la periferia donde hay poca cantidad de muestra y realizar un
esquema, en donde se anote el aumento real
e) Ahora colocar el filtro azul y observar nuevamente
f) Compara y analiza lo realizado y concluye lo ms conveniente.
5.- RESULTADOS Y CUESTIONARIO
Esquematiza la preparacin observada a 40 y 100X, anota el nombre de la muestra (etiqueta):

_____________________
40x 100x
5.1 Consulta la bibliografa y llena la siguiente tabla

Tipo de microscopio Poder de resolucin Aplicaciones
Compuesto
Contraste de fase
Electrnico
5.2 En la siguiente tabla resume la funcin de cada una de las siguientes partes:
Parte del microscopio Funcin Sistema al que pertenece

(mecnico, ptico de iluminacin)
Condensador
Diafragma
Objetivo
Filtro azul
Lmpara
Ocular
Platina
Revolver
Tornillo macromtrico
6.- ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS
6.1 Discutir las ventajas y desventajas de utilizar la iluminacin de Khler.
6.2 Discutir las ventajas y desventajas de un microscopio ptico, as como la cantidad de muestra que
presente una preparacin.
7.- CONCLUSIONES
Elabora tus conclusiones tomando en consideracin los objetivos de la prctica, los resultados
obtenidos y la bibliografa consultada.
8.- BIBLIOGRAFA UTILIZADA PARA LA ELABORACIN DE ESTA PRCTICA
8.1 Barrera E. Hctor El Microscopio ptico 1 edicin. 1997. Editores Plaza y Valdez, S.A. de C.V.
8.2. Freifelder, D. Tcnicas de Bioqumica y Biologa Molecular. Revert Mexicana, S.A. de C.V. 1991.
8.3 Locquin Marcel, Manual de Microscopa I 1 edicin, 1985. Ed. Labor S.A.
8.4 Rincn-Snchez A.R.y ReyesOrtiz N. Manual de Microscopa ptica 1 edicin. 1991. Editado por
la Asociacin de Qumicos del INN.
16
PRCTICA No. 2
PREPARACIONES FIJAS Y EN FRESCO
UNIDAD II: Microscopia y tinciones.
1. OBJETIVOS
1.1.1 El alumno realizar preparaciones en fresco y fijas para ser observadas en el microscopio ptico
I.2 Objetivo especficos
Al trmino de la sesin el alumno:
1.2.1 Realizar una preparacin en fresco de una muestra lquida de agua.
1.2.2 Realizar una preparacin en fresco de mohos con azul de algodn lactofenol.
1.2.3 Realizar un frotis para una preparacin fija.
1.2.4 El alumno realizar preparaciones fijas y tinciones simples y diferenciales.
2. INTRODUCCIN
La gran mayora de los microorganismos no son visibles para el ojo humano, por lo que el uso del
microscopio resulta indispensable para observar a estos seres vivos. Para lograr una buena
observacin microscpica es necesario tomar en cuenta la preparacin de la muestra, debido a que los
objetos deben tener un cierto grado de contraste con el medio circundante para poder ser percibidos a
travs del microscopio, adems de que los microorganismos carecen de una coloracin natural, hay que
teirlos previamente para hacerlos resaltar de manera artificial del fondo de la imagen. Una forma de
conseguir este contraste consiste en realizar tinciones simples con un colorante o tinciones
diferenciales.
Las bacterias no teidas muestran pocos detalles morfolgicos, el diagnstico bacteriolgico
generalmente se basa en las diferentes afinidades tintoriales de las bacterias para identificarlos ms
adecuadamente, Sin embargo, tambin resultan tiles las preparaciones no teidas en la determinacin
de la movilidad.
Las preparaciones fijadas y teidas son de uso casi universal, tanto a partir de especimenes recibidos
como de colonias cultivadas. En general una muestra del espcimen original puede ser colocada
directamente sobre el portaobjetos o bien ser recogida con un asa, recordando siempre tener una
preparacin delgada y homognea. Una colonia puede ser examinada haciendo con ella una
suspensin tenue en una gota de solucin salina, y luego extendindola con un asa sobre un
portaobjetos. Las pelculas secadas al aire son fijadas con calor suave sobre la flama de un mechero y
luego pasadas a travs de ella. Debe tenerse cuidado para evitar el calor excesivo, que puede alterar la
forma bacteriana. El calor deseable es aquel en el que el portaobjetos sea apenas caliente para ser
colocado sobre el dorso de la mano.
Aunque cuando tenemos la necesidad de observar preparaciones en fresco podemos utilizar el
microscopio de contraste de fases, en donde la caracterstica ms importante de este tipo de
microscopio es que nos permite ver a los microorganismos sin la necesidad de teirlos.
3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO
3.1 EQUIPO
Microscopio ptico
Microscopio de contraste de fases
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3.2 MATERIAL
Portaobjetos Frasco gotero con solucin de cristal violeta

Cubreobjetos Frasco gotero con solucin de lugol
Pipeta Pasteur Frasco gotero con solucin de alcohol acetona
Gradilla Frasco gotero con solucin de safranina
1 tubo de ensaye de 13 X 100 mm Frasco gotero con solucin de fucsina fenicada
Asa bacteriolgica Frasco gotero con solucin de alcohol cido
Mechero Frasco gotero con solucin de azul de metileno
Asa y porta asa Frasco gotero con solucin de verde de malaquita
Puente de coloracin Solucin salina o agua de la llave
Gradilla metlica Lmpara de alcohol
3.3 CEPAS MICROBIANAS
Staphylococcus aureus Rhizopus sp

Saccharomyces cerevisiae Aspergillus niger
Escherichia coli Lodos activados,
Bacillus subtilis Micrococcus sp
3.3 MUESTRA BIOLGICA

Muestra de agua estancada o producto en descomposicin (tortilla)
4.1 Preparacin de Frotis:
Mtodo A
4.1.1 Limpiar el portaobjetos con una torunda de algodn y que contenga alcohol.
a. Etiquetar la preparacin, solo sobre la superficie superior del portaobjetos, la etiqueta ser
preferentemente pegada a la izquierda de la preparacin, si con una etiqueta no basta colocar otra del
lado derecho, la etiqueta llevar el nombre del microorganismos, el nombre de la tincin, el equipo, el
grupo y la fecha.
b. En la gradilla se tiene un tubo de ensaye de 13 X 100 mm con 2 ml de agua, de ah tomar con el asa
una pequea gota de agua y colocarla en el centro de la superficie de un portaobjetos.
c. En el mechero, flamear el asa al rojo vivo y en un radio de 20 cm de la flama del mechero, abrir el
tubo de ensaye y flamearlo, tomar la muestra con el asa, volver a flamear la boca del tubo y taparlo.
d. Dejar el tubo sobre la gradilla y con la mano izquierda tomar el portaobjetos y con la mano derecha
en la que tenemos el asa extender el inoculo aproximadamente un cm 2 para obtener una pelcula
delgada de microorganismos. Flamear el asa para esterilizarla.
e. Dejar secar el frotis a temperatura ambiente.
f. Fijar el frotis con calor, es decir pasarlo rpidamente por la flama del mechero, luego colocarlo en el
dorso de la mano, si soportamos el calor pasarlo nuevamente, realizar esta operacin una vez ms. El
18
calor deseable es aquel en que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser colocado en
el dorso de la mano. Dejar enfriar el portaobjetos antes de teir.
Nota: Procurar no tomar una gran cantidad del inculo de lo contrario quedar un frotis grueso, la luz no
pasar y no observaremos; en caso de haber ocurrido esto entonces, observa en la periferia del frotis
Mtodo B
a. Si se proporciona un tubo con una suspensin bacteriana, entonces encender el mechero.

b. En un radio de 20 cm abrir el tubo, flamearlo y con el asa tomar un inculo de la suspensin.
c. Flamear la boca del tubo de ensaye, cerrar el tubo y colocarlo en la gradilla
d. Colocar el inculo en el centro de un portaobjetos limpio. Extender el inculo por lo menos 1 cm 2, y
flamear el asa. Dejar secar el frotis y fijarlo al calor.
4.2 Examen en fresco de una muestra de agua estancada
a. De la muestra de agua estancada que se ha trado al laboratorio, colocar una gota en un portaobjetos
limpio
b. Con la ayuda de una pipeta Pasteur colocar en el centro una gota de la muestra y cubrirla con un
cubreobjetos.
c. Al colocarle el cubreobjetos evitar dejarla caer bruscamente, ya que se formaran burbujas.
d. Observar al microscopio ptico o de contraste de fases con el objetivo de 10 X y 40 X.
4.3 Preparacin de una muestra en fresco de mohos con azul de algodn lactofenol
a. Colocar una gota del colorante azul de algodn lactofenol

b. Colocar el inoculo y hacer una pequea extensin
c. Colocarle el cubreobjetos sin realizar burbujas
d. Observar la preparacin al microscopio con el objetivo 10 X y 40 X. Si se requiere que la preparacin
dure un poco ms se sellar los bordes del cubreobjetos con barniz de uas transparentes.
4.4 Tincin simple
a. Tomar la preparacin fija de Staphylococcus aureus y colocarla el colorante que previamente les ha
tocado
b. Tomar el tiempo por 1 minuto
c. Enjuagar el portaobjetos en el recipiente que contiene el agua
d. Dejar secar la preparacin y observarla al microscopio con el objetivo de 40 y 100 X.
4.5 Tincin de Gram:
a. Colocar los frotis correspondiente de cada uno de los microorganismos Bacillus subtilis, Escherichia
coli, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus y Saccharomyces cerevisiae, en el puente de
coloracin.
b. Cubrir los frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto.
c. Lavar los frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante.
d. Cubrir los frotis con lugol (mordente) durante 1 minuto.
19
e. Lavar los frotis con agua de la llave.

f. Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (hasta eliminar el exceso de colorante).
g. Lavar inmediatamente con agua de la llave.
h. Cubrir los frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos
i. Lavar los frotis con agua de la llave.
j. Dejar secar los frotis, colocar una gota de aceite de inmersin y observarlos al microscopio con el
objetivo de 100X. (Previamente realizar la tcnica de iluminacin de Khler y enfocar a 10 y 40X)
Para demostrar cmo afecta la decoloracin con el alcohol cetona (paso f, se realizar la tcnica de
gran, pero danto un exceso al tiempo de decoloracin (90 segundos).
4.6 Tincin de Gram (con exceso de decoloracin):
a. Colocar un frotis fijado de Bacillus subtilis y de Escherichia coli en el puente de coloracin.
b. Cubrir los frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto.
c. Lavar los frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante.
d. Cubrir los frotis con lugol (mordente) durante 1 minuto.
e. Lavar los frotis con agua de la llave.
f. Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (decolorante) durante 90 segundos.
h. Cubrir los frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos
i. Lavar los frotis con agua de la llave.
j. Dejar secar los frotis, colocar una gota de aceite de inmersin y observarlos al microscopio con el
objetivo de 100 X.
4.7 Tincin de Gram de una mezcla de microorganismos:
a. Colocar un frotis fijado de una mezcla de Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
b. Cubrir el frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto.
c. Lavar el frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante.
d. Cubrir el frotis con lugol (mordente) durante 1 minuto.
e. Lavar el frotis con agua de la llave.
f. Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (hasta eliminar el exceso de colorante).
h. Cubrir el frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos
i. Lavar el frotis con agua de la llave.
j. Dejar secar el frotis, colocar una gota de aceite de inmersin y observarlos al microscopio con el
objetivo de 100 X.
4.8 Tincin de Ziehl-Neelsen.
a. Colocar el frotis correspondiente en el puente de coloracin
b. Cubrir los frotis con fucsina-fenicada y calentar con una lmpara de alcohol, hasta que emita
vapores, aplicar calor peridicamente durante cinco minutos sin que se seque la preparacin y esperar
20
a que se enfre.
c. Enjuagar con agua de la llave.
d. Cubrir los frotis con alcohol cido por un minuto.
e. Enjuagar con agua de la llave.
f. Cubrir los frotis con azul de metileno por un minuto
g. Enjuagar y dejar secar los frotis y observarlos con el microscopio utilizando lente de inmersin
4.9 Tincin de ShaefferFulton
a. Cubrir el frotis correspondiente con verde de malaquita y calentar con una lmpara de alcohol, hasta
que emita vapores, aplicar calor peridicamente durante cinco minutos, sin que se seque la preparacin.
b. Dejar que el frotis se enfre.
c. Lavar con agua de la llave.
d. Cubrir el frotis con safranina por un minuto.
e. Enjuagar, dejar secar y observar con el microscopio utilizando lente de inmersin.
5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO
5.1 Examen en fresco de una muestra de agua estancada
Realiza un esquema de lo observado en el microscopio
5.2 Preparacin de una muestra en fresco de mohos con azul de algodn lactofenol
Realiza un esquema de lo observado en el microscopio
5.3 Tincin simple

a) De la muestra que se te ha proporcionado anota el nombre de microorganismo (etiqueta) y realiza un
esquema.
Resultados de la seccin
Equipo / microorganismo Colorante a utilizar Color Agrupacin
1y7 Azul de metileno
2y8 Safranina
3y9 Cristal violeta
4 y 10 Verde de malaquita
21
5.4 Tincin de Gram:

a) Realiza un esquema de cada una de las preparaciones de Bacillus subtilis, Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus y Saccharomyces cerevisiae.
Escherichia coli Escherichia coli Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus

40x 100Xx 40X 100X
Aumento real______ ________ Aumento real_______ Aumento real_______
Forma: __________ Agrupacin_________ Forma: ____________ Agrupacin_________
Micrococcus luteus Micrococcus luteus Bacillus subtilis Bacillus subtilis

40x 100X 40X 100X
Aumento real______ ________ Aumento real_______ Aumento real________
Saccharomyces cerevisiae
40x 100X
Aumento real______ ________
Forma: __________ Agrupacin_________
Resumen de la seccin
Microorganismos Gram Color Forma Agrupacin Resultado del Gram
1.Bacillus subtilis
2. Escherichia coli
3.Staphylococcus aureus
4.Micrococus luteus
5 Saccharomyces cerevisiae
5.5 Tincin de Gram (con exceso de decoloracin)

Escherichia coli Bacillus subtilis
40x 100X 40X 100X
Aumento real______ ________ Aumento real_______ Aumento real_______
Tipo de Gram: ________________________ Tipo de Gram:
_______________________________
22
5.6 Tincin de Gram (mezcla de un Gram + y un Gram -)

Mezcla de: _______________________________________________________________________
Aumento real (40X) _______ (100X) _______

a.- Forma: ________ Agrupacin_______ Color adquirido_______ Gram ______
b.- Forma: ________ Agrupacin_______ Color adquirido_______ Gram ______
5.7 Tincin de Ziehl-Neelsen.
Agua residual
Aumento real (40X) _______ (100X) ____________
Color de una BAAR positiva ____________ Color de una BAAR negativa ____________
5.8 Tincin de Shaeffer - Fulton

Bacillus sp.
Aumento real (40X) _______ (100X)_______________
Color adquirido de la espora _________ Color adquirido de la clula vegetativa_____________
5.9 Cuales son los inconvenientes al realizar un frotis con una gran carga microbiana?
5.10 Cual es la finalidad de observar una muestra en fresco?
5.11 Por qu se coloca un cubreobjetos sobre la muestra en una preparacin en fresco?
5.12 Cul es el propsito de fijar los frotis con calor?
5.13 Cmo afecta la edad del cultivo en la tcnica de Gram?
5.14 Por qu la tincin de Gram no se emplea para teir mohos?
5.15 Cundo es recomendable utilizar una preparacin simple y que colorante utilizaras?
5.16 Cul es el fundamento de la tincin de Gram, Ziehl Neelsen y Shaeffer y Fulton.
5.17 Por medio de un esquema representa la composicin de la pared celular de bacterias Gram
positivas, Gram negativas y bacterias acido alcohol resistentes (BAAR.
5.18 Dibuja una espora y menciona su composicin qumica.
6. ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS
6.1 Discutir los cuidados que se tienen que tener al realizar una preparacin en fresco y una fija, cuales
son las ventajas de de cada una de ellas, el tiempo que dura dicha preparacin para su correcta
observacin y los resultados obtenidos en cada tincin realizada.
7. CONCLUSIONES
7.1 Elaborar las conclusiones con base al anlisis y discusin de las ventajas y desventajas en la
realizacin de preparaciones en fresco y fijas, as como a la bibliografa consultada y los objetivos de la
prctica.
8 BIBLIOGRAFA UTILIZADA PARA LA ELABORACIN DE ESTA PRCTICA
8.1 Lynch, M.J.; S.S. Raphael: L. D. Mellor; D.D. Spare, M. J., Inwood. Mtodos de Laboratorio. 2
Edicin. Interamericana. Mxico. 1140 pgs.
23
PRCTICA No. 3
MTODOS DE ESTERILIZACIN Y REDUCCIN DE LA CARGA MICROBIANA
UNIDAD I: Introduccin y tcnicas de aplicacin en microbiologa
1. OBJETIVOS
El alumno preparar material de uso comn en un laboratorio de microbiologa para su esterilizacin y
analizar los diferentes mtodos para seleccionar el ms adecuado acorde a la naturaleza del material
1.2 Objetivo especficos
1.2.1 Preparar el material de vidrio e instrumental para ser esterilizado por calor seco y calor hmedo.
1.2.2 Esterilizar el material e preparado, por calor seco y calor hmedo, haciendo uso de controles de
esterilizacin.
1.2.3 Realizar el proceso de filtracin a travs de membrana.
2. INTRODUCCIN
La esterilizacin se conoce como un proceso de destruir a todos los microorganismo de una superficie,
existen varios mtodos fsicos y qumicos de esterilizacin, para seleccionar el ms adecuado es
necesario conocer la naturaleza del material, aunque algunos pueden tener varias formas de
esterilizacin.
1 Mtodos fsicos
Calor hmedo:
La aplicacin de calor hmedo es el mtodo ms simple para esterilizar un material, a condicin de que
no sufra dao en s mismo. Una temperatura de 100 C matar a todas las formas vegetativas, pero no
las esporas, para matar a estas es necesario una temperatura de 121 C, 15 minutos y 15 libras de
presin en una autoclave. La muerte microbiana se produce por la desnaturalizacin de las protenas,
generalmente se utiliza vapor, tanto porque las bacterias se mueren ms rpidamente cuando se
encuentran hmedas como porque el vapor proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente
en todas las partes del recipiente.
Calor seco:
Para esterilizar materiales que deben permanecer secos se dispone de hornos elctricos por los que
circula aire caliente, en vista de que el calor es menos eficaz en materiales secos, se aplica una
temperatura de 160 170 C durante una h.
El calor como mtodo de esterilizacin acta desnaturalizando las protenas y los cidos nucleicos de la
clula y fragmentando las membranas celulares.
Flameo:
La llama es un agente esterilizador eficaz, y el ms simple de todos. Es frecuentemente utilizado para
esterilizar el asa bacteriolgica para sembrar o resembrar un cultivo. Al flamear el asa, debe evitarse de
ser posible, que dicha asa lleve grandes cantidades de material biolgico, pues ste podra saltar
diseminndose partculas infectantes.
24
A veces para instrumentos como tijeras, hojas de bistur o pinzas, se puede esterilizar el material
mojndolo con alcohol y encendindolo ste. Se debe repetir varias veces para lograr una esterilizacin
completa. El mtodo es rpido pero produce carbonizacin y prdida del filo.
Radiaciones ionizante y no ionizante:
La radiacin ultravioleta provoca dao en el DNA, la luz ultravioleta induce el entrecruzamiento entre
pirimidinas adyacentes en una u otra de las dos tiras de polinucletidos, formando dmeros
pirimidnicos, las radiaciones ionizantes producen roturas en las tiras sencillas y en las dobles.
Pueden emplearse tambin ondas supersnicas o ultrasnicas para romper o desintegrar a la clula.
Filtracin a travs de Membranas
Algunas sustancias no pueden ser esterilizadas por calor hmedo o seco pues son termolbiles, es
decir que se desnaturalizan o que pierden alguna propiedad deseable, en tal caso se utilizan sistemas
de filtracin de membranas para retener a los microorganismos. Aqu debemos de conocer las
dimensiones del microorganismo a eliminar para poder utilizar el filtro adecuado (dimetro).
Los filtros utilizados son fabricados con porcelana, cuarzo, tierra de diatomeas, vidrio pulverizado,
asbesto o esteres de celulosa, para el caso de los filtros de la marca Millipore se utiliza como
bioindicador a Pseudomonas diminuta para filtros con un dimetro de poro de 0,45 m
2 Mtodos qumicos Gases (oxido de etileno) y lquidos (formaldehdo y propiolactona)
Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrgeno lbiles como los que tiene grupos
carboxilos, amino, sulfhidrilos e hidroxilos. Es utilizado en la esterilizacin gaseosa, generalmente en la
industria farmacutica, sirve para esterilizar material termosensible como el plstico, equipos
electrnicos, bombas cardiorrespiratorias. Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo y
adems cancergeno, por lo que se suministra normalmente con una concentracin entre el 10 y el 20 %
de CO2. La concentracin de xido de etileno, la humedad y la temperatura influyen sobre la velocidad
de esterilizacin. Un objeto limpio puede esterilizarse si se trata de 5 a 8 h a 38 C o de 3 a 4 h a 54C,
cuando la humedad relativa se mantiene entre el 40 y el 50 % y la concentracin de oxido de etileno es
de 700 mg/L. Una vez esterilizado el material es necesario airear para eliminar el oxido de etileno
residual porque es muy txico.
La -propiolactona se emplea para esterilizar vacunas y suero, se degrada hasta una forma inactiva
despus de varias horas y, por ello, no es tan difcil de eliminar. Destruye a los microorganismos ms
rpidamente que el oxido de etileno, pero no penetra tan bien en los materiales y puede ser
cancergena.
3 Mtodos bacteriolgicos para verificar las tcnicas de esterilizacin (Pruebas de esterilidad).
En todo lugar en donde se realice esterilizacin se debe de contar con indicadores de calidad que
manifiesten que la esterilizacin se ha llevado correctamente y que dicho material se encuentra estril,
para ello existen en el mercado varios indicadores que se introducen con el material a esterilizar y
posteriormente se verifica un cambio de color o turbidez de la ampolleta.
Mtodo de la tira de papel
Existen en el mercado tiras impregnadas con esporas de Geobacillus stearothermophilus se presentan
en una envoltura con dos compartimientos. En el primero est la tira testigo, que se ha esterilizado
(testigo negativo) y en el otro compartimiento se encuentran dos tiras, una de las tiras se saca
25
(problema y testigo positivo) y se coloca en un recipiente que se va a esterilizar en la forma habitual.

Luego las tiras se vuelven a su compartimiento correspondiente y se incuban por 7 das a 55 C en
caldo de soya y tripticasena. Las esporas sobre las tiras testigos se desarrollan, pero si la esterilizacin
no fue la correcta habr desarrollo en la tira testigo.
Mtodo de la ampolleta:
Son ampolletas que contiene una suspensin de Geobacillus stearothermophilus en medio de cultivo.
La temperatura ptima para el desarrollo de este microorganismo se encuentra entre 50 y 65C; dentro
del medio lquido se encuentra un indicador que es el prpura de bromocresol. Al utilizarla se debe
colocar la ampolleta en el interior del compartimiento que va a esterilizar el material, despus de
terminar la esterilizacin, las ampolletas (sin abrir) se incuban entre 55 y 65 C durante 24 h, el
enturbamiento y la aparicin de un color amarillo indica una esterilizacin defectuosa, en cambio si el
color permanece igual durante varios das de incubacin el equipo est funcionando bien. Debe llevarse
el control constituido por una ampolleta que no se pone en el equipo, incubada en las mismas
condiciones, debe mostrar desarrollo bacteriano y el medio se vuelve amarillo.
Mtodos fsicos para esterilizar:
A veces, para instrumentos como hojas de bistur, tijeras o pinzas, se puede esterilizar el material
mojndolo con alcohol y encendiendo ste. Se debe repetir varias veces para lograr una esterilizacin
completa. El mtodo tiene la ventaja de ser rpido peor se produce carbonizacin y perdida de filo.
Pueden emplearse ondas supersnicas o ultrasnicas de 9000 ciclos / s, para romper y desintegrar las
clulas. Se cree que las bacterias se daan y destruyen por la formacin de pequeas burbujas de gas
en la suspensin a consecuencia de las ondas sonoras.
3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO
3.1 EQUIPO
Autoclave a 121 C Incubadora a 35 C

Autoclave a 110 C Bao Mara a 55C
Horno a 170 C Termmetros de 150 y 200 C
3.2 MATERIAL (Material para demostracin del profesor por seccin)
Dos botes de lmina Una jeringa de 5 ml
Un cilindro pipetero Una pinza de diseccin
Un cilindro para cajas de Petri Una tijera de diseccin
Dos filtros estriles swinnex con empaque Un matraz con 50 ml de suspensin de
Escherichia coli (suspensin turbia)
Tres matraces de 125 ml con 50 ml de
Frasco con benzal
Caldo nutritivo (CN) estril
Contenedor para punzocortantes
Material por equipo
Tres cuadros de papel aluminio de 8X8 cm Una tira de 3 X 0,5 cm impregnada con
para tapn de tubo esporas de Geobacillus stearothermophilus
Tres cuadros de papel aluminio de 20X20 Dos tubos de 16 X 150 mm sin tapn.
26
cm para envolver pinza o tijera Cuatro cajas de Petri limpias

Tres cuadros de papel aluminio de 12X12 Tres pipetas de 10 ml limpias
cm para tapn de matraz
Un clip o aguja de diseccin
Tres cuadros de papel Kraf de 18X14 cm
Cuatro matraces de 125 ml
para gorro de matraz
Tres cuadros de papel Kraf de 15X25 cm Un matraz de 250 ml.
para gorro de matraz Algodn suficiente para tapones de matraces
Tres cuadros de papel Kraft de 20 X 20 cm Tres tubos de ensaye de 13 X 100 mm sin
para cubrir un bote de lmina. tapn
Tres cuadros de papel Kraf de 6 X 60 cm Un tubo de ensaye de 13 x 100 sin tapn
para envoltura de pipeta de 10 ml.
Dos tubos de ensaye con 3 ml de caldo
Tres cuadros de papel Kraf de 33 X 40 cm nutritivo sin esterilizar (se preparan el da de la
para caja de Petri prctica)
Tres cuadros de papel Kraf de 22x22 cm Tres tubos de ensaye con 3 ml de caldo
para envoltura de pinza o tijera. nutritivo estril
Tres cuadros de gasa doble de 12X20 cm Un frasco con alcohol
para tapn de matraz.
Tres matraces con 50 ml de caldo nutritivo
Tres cuadros de gasa doble de 15 X 25 cm estril
para tapn de matraz.
Tres cuadros de gasa doble de 7 X 15 cm para
tapn de tubo
3.3 MEDIOS DE CULTIVO

Caldo nutritivo
Reactivos comerciales (esporas indicadoras de esterilizacin). Ampolletas con un disco con esporas.
Un matraz con 50 ml de una suspensin microbiana de Escherichia coli
PREPARACIN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIN
.1 Lavado de material de vidrio e instrumental
a) Utilizando escobillones para pipetas, tubos y matraces y una fibra suave para las cajas de Petri, el
material plano y el instrumental metlico lavar el material que se va a esterilizar, utilizando de
preferencia extran.
b) Enjuagar suficientemente con agua de la llave
c) Enjuagar con agua destilada, escurrir y secar en el horno o dejarlos secar a temperatura ambiente.
4.2 PREPARACIN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIN POR CALOR HMEDO
4.2.1 TUBOS DE ENSAYO

a. Tapar 2 tubos de 16 x 150 mm con tapones de algodn siguiendo las indicaciones del profesor
27
b. Colocar los tubos en un bote de lmina, taparlos con papel Kraft y asegurarlos con una liga, anotar
fecha, equipo, grupo, medida de los tubos y cantidad preparada.
4.2.2 CAJAS DE PETRI
a) Envolver 8 cajas de Petri con papel Kraft siguiendo las indicaciones del profesor. Anotar en el papel,
la cantidad de cajas envueltas, fecha, equipo, nmero de equipo de laboratorio y grupo.
4.2.3 PIPETAS
a. Colocar en la boquilla de cada una de las pipetas un tapn de algodn cuidando que no quede muy
compactado, utilizar para ello una aguja de diseccin o un clip
b. Flamear en la flama del mechero las boquillas de las pipetas a fin de eliminar el exceso de algodn
c. Envolver de manera individual cada una de las pipetas con una tira de papel Kraft, fijar el extremo
con masking-tape y anotar sobre el papel la capacidad de la pipeta, la fecha, el grupo y el nmero de
equipo de laboratorio. Con una fecha indicar el sentido de la punta de la pipeta.
4.2.4 MATRACES
a. Colocar en la boca de cada matraz un tapn compacto de algodn, envuelto con gasa, siguiendo las
instrucciones del profesor.
b. Con papel Kraft, elaborar un gorro ligeramente ms grande que el tapn de algodn.
c. En una tira de Masking-tape anotar la fecha, grupo y equipo, adherir el Masking-tape al matraz. No
anotar los datos sobre el gorro de papel.
4.2.5 PINZAS Y TIJERAS
a. Envolver con papel Kraft una pinza o tijera y con lpiz sealar con una flecha la punta.
b. Anotar en el papel la pieza de que se trate, la fecha, grupo y equipo.
4.3 PREPARACIN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIN POR CALOR SECO
4.3.1 TUBOS DE ENSAYE
a. Colocar en 2 tubos de ensaye, una cubierta de papel aluminio y colocarlos en una canastilla metlica.
b. Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, grupo y equipo, sujetar el papel con masking-tape.
c. Los tubos o frascos con tapa de baquelita, nunca deben cerrarse completamente.
4.3.2 CAJAS DE PETRI
a. Colocar en el interior de un cilindro de acero inoxidable para cajas de Petri dos cajas en posicin
invertida perfectamente secas. (NUNCA ESTERILIZAR POR ESTE MTODO MATERIAL
CONTAMINADO)
b. Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, el nmero de cajas que contiene el cilindro, el grupo y la
fecha. Colocar la tira de papel entre la tapa del cilindro.
4.3.3 PIPETAS
a. Poner en la boquilla de cada una de las pipetas un tapn de algodn cuidando que no quede muy
compactado.
b. Flamear las boquillas en la flama a fin de eliminar el exceso de algodn.
c. Colocar en el interior de un cilindro pipetero, las pipetas preparadas.
28
d. Anotar en una tira de papel Kraft la cantidad de pipetas, su capacidad, fecha, grupo y equipo. Fijar la
tira entre la tapa del cilindro pipetero.
4.3.4 MATRACES
a) Colocar en la boca de un matraz de 125 ml una tapa de papel aluminio.
b) En una tira de papel Kraft anotar fecha, grupo y equipo. Fijar la tira al cuello del matraz sujetndolo
con masking-tape o etiquetar con un marcador indeleble.
4.3.5 PINZAS Y TIJERAS
a) Envolver en papel aluminio una pinza o una tijera.
b) En una tira de masking-tape, anotar fecha, grupo y equipo. Fijar el masking-tape a la envoltura.
4.4. REDUCCIN DE LA CARGA MICROBIANA (PROCEDIMIENTO DE ESTERILIZACIN POR
CALOR HUMEDO)
a. En un tubo de ensaye de 13 X 100 mm con 3 ml de caldo nutritivo estril etiquetarlo. (Etiqueta con la
siguiente informacin, grupo, equipo, temperatura efectuada y fecha) y colocarle una tira de esporas de
Geobacillus stearothermophilus.
b. Someterlo a una presin de 10 libras por 10 minutos.
c. Sacar el tubo e incubar el tubo a 55 oC 2C durante 5 das en bao mara y observar diariamente
durante el tiempo sealado. Anotar en la bitcora de laboratorio cualquier cambio en cuanto a la
aparicin de turbidez.
4.5 ESTERILIZACIN POR CALOR HMEDO
a) Tomar un tubo de de 13 X 100 mm con 3 ml de caldo nutritivo estril y etiquetarlo
b) En un tubo de 13 X 100 mm con 3 ml de caldo nutritivo colocar una tira de esporas de Geobacillus
sthearothermophilus, cerrar el tubo y esterilizarlo a 121 C, 15 min y 15 lb.
c) Sacar el tubo e incubarlo a 55 oC 2C por 5 das en bao mara y observar diariamente. Anotar en
la bitcora cualquier cambio en cuanto a la aparicin de turbidez.
Pasos para realizar una buena esterilizacin:
-Tener cuidado de eliminar todo el aire del autoclave.
-Colocar agua suficiente hasta el nivel de la rejilla o en la marca de la autoclave vertical
- -Observar que el manmetro registre la presin
-Si se est utilizando la autoclave vertical utilizar agua destilada.
-Al terminar de esterilizar dejar el autoclave sin agua
4.6 ESTERILIZACIN POR CALOR SECO
a. Encender el horno una hora antes y colocar el material para esterilizar por calor seco, cuando la
temperatura este a 170 oC tomar el tiempo de 1 h, verificando que la temperatura sea la indicada.
b. En un tubo de ensaye sin esterilizar y vaco, colocar una tira de papel filtro que contenga esporas de
Bacillus subtilis var. niger, cubrir el tubo con papel aluminio y colocarlo junto con el material a esterilizar.
Esterilizar a 170 oC/1 h, etiqueta el tubo de preferencia con un marcador indeleble.
29
c. Despus de transcurrido el tiempo de esterilizacin, apagar el horno y esperar a que el termmetro

indique la temperatura ambiente. Abrir, retirar el material y el tubo de ensaye con la tira de esporas.
d. Con ayuda de la pinza estril (flamear con alcohol) y bajo condiciones de esterilidad, colocar la tira
de papel filtro conteniendo las esporas de Bacillus subtilis a un tubo de ensaye que contenga 3 ml de
caldo nutritivo estril y etiquetado. Incubar a 55 2oC durante 5 das. Observar diario y anotar cualquier
cambio en cuanto a la aparicin de turbidez.
4.7 CONTROL POSITIVO Y CONTROL NEGATIVO
a) Colocar un tubo con 3 ml de caldo nutritivo estril con una tira de esporas de Geobacillus
stearothermophilus como testigo positivo del procedimiento.
b) Colocar un tubo con 3 ml de caldo nutritivo estril sin tira de esporas, es el testigo (-).
4.8 PROCESO DE FILTRACIN A TRAVS DE MEMBRANA
Sistema de filtracin Swinnex marca Millipore

a. Colocar 10 ml de la sustancia a filtrar en una jeringa desechable, remover el swinnex estril del
empaque de papel al que previamente se le ha colocado la membrana y ensamblar la jeringa.
b. Filtrar gota a gota y recibir el filtrado en un matraz con caldo nutritivo estril, la jeringa y el filtro
colocarlo en un bote de lmina para su esterilizacin. Incubar el filtrado a 35 2 oC de 48 a 72 h.
c. Observar diariamente y anotar en la bitcora del laboratorio cualquier cambio en cuanto a la
aparicin de turbidez durante 3 das.
d. El bioindicador utilizado en la filtracin a travs de membrana es Pseudomonas diminuta, para
membranas con un dimetro de poro de 0,2 m
Esterilizacin de material de desecho
-El material (pipetas o cajas de Petri) utilizado con suspensiones microbianas o con medio de cultivo,
nunca se esterilizan por calor seco
-5. CUESTIONARIO
5.1 Cul es la finalidad de utilizar agua destilada en el enjuagado del material?
5.2. Por qu utilizamos el papel Kraft para envolver el material?
5.3 Completa el siguiente cuadro, anotando la presencia o ausencia de turbidez en los tubos
Mtodo Tratamiento Calor hmedo Calor seco Filtracin a travs Control Control
110C/1010 lb de membrana negativo
121C/15/15lb 170C/2 h positivo
Resultado
(turbidez)
5.4 Explicar por qu utilizamos un tapn de algodn en las pipetas, en matraces y tubos de ensaye
5.5 Qu explicacin daras si despus de la esterilizacin, el tubo que contiene la tira de esporas hay
crecimiento despus de la incubacin.
5.6 Cmo afecta a la bacteria el proceso de esterilizacin por calor seco, calor hmedo y filtracin?
30
5.7 Anota 10 productos que se puedan esterilizar por calor seco, calor hmedo y filtracin.

6.1 Discutir cuales son los inconvenientes o riesgos de preparar el material con papel aluminio y papel
Kraf para su esterilizacin por calor seco y hmedo.
7. CONCLUSIONES
7.1 Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al anlisis y discusin de estos, as
como a la bibliografa consultada y los objetivos de la prctica.
8. BIBLIOGRAFA
8.1 Enlistar la bibliografa consultada
31
PRCTICA No. 4
NUTRICIN Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS AERBICOS
No. DE UNIDAD: III Nutricin y Cultivo Microbiano
1.- OBJETIVOS
1.1 Objetivo General.
El alumno preparar diferentes medios de cultivo en base a sus componentes, uso y consistencia,
utilizando la NOM-065 SSA1-1993 Que establece las especificaciones sanitarias de los medios de
cultivo y los utilizar para cultivar microorganismos.
2.1 El alumno preparar medios de cultivos complejos, diferenciales, enriquecidos, indicadores y
sintticos de acuerdo a la NOM065-SSA-1993, a las necesidades nutricionales de un microorganismo,
los esterilizar y vaciar para su uso.
2.2 Utilizar los medios de cultivo de acuerdo a su presentacin final para cultivar microorganismos y
comparar el crecimiento de acuerdo a la clasificacin.
2.- INTRODUCCIN
Las clulas estn formadas por grandes cantidades de pequeas molculas como agua, iones
inorgnicos, carbohidratos y aminocidos y contienen un nmero todava ms pequeo de molculas
grandes, los polmeros de las clulas, siendo los ms importantes las protenas y los cidos nucleicos.
La clula puede obtener la mayora de las molculas pequeas de su medio ambiente de manera
preformada, mientras que las grandes molculas son sintetizadas dentro de ellas. Existen complejas
interrelaciones entre los compuestos incorporados por la clula y los que son sintetizados.
Nutricin.
A las sustancias en el medio ambiente utilizadas por los organismos para el catabolismo y el
anabolismo se les llama nutrientes, y pueden dividirse en dos clases:
a.- Nutrientes necesarios, sin los cuales la clula no podra crecer.
b.- Nutrientes tiles pero no indispensables, que se emplean si estn presentes pero no son esenciales.
Algunos nutrientes son monmeros a partir de los cuales las clulas forman las macromolculas y otras
estructuras, mientras que otros nutrientes sirven solo para la obtencin de energa sin ser incorporados
directamente en las sustancias celulares, aunque en ocasiones un nutriente puede desempear ambas
funciones. Las sustancias pueden dividirse en dos grupos: macronutrientes y micronutrientes,
dependiendo de si son necesarios en cantidades grandes o pequeas respectivamente y factores de
crecimiento como compuestos orgnicos, vitaminas, cidos orgnicos etc. Es fcil detectar cuando se
requiere un macronutriente, simplemente porque se necesita en gran proporcin. Frecuentemente los
micronutrientes son necesarios en cantidades tan pequeas que es imposible determinar cunto se
requiere; muchas veces ni siquiera se sospecha que un micronutriente est presente en el medio en
que un microorganismo est creciendo, debido a que los componentes del medio pueden contener tales
micronutrientes en pequea cantidad como contaminantes.
Los microorganismos se desarrollan a partir de sustancias nutritivas que obtienen del medio que las
rodea. Los microorganismos se desarrollan en medios de cultivo que contienen los nutrimentos
adecuados para cada uno y requeridos para la sntesis de sus constituyentes celulares, adems estos
medios proporcionan las condiciones de pH, osmolaridad y humedad que le permiten crecer.
32
Existe una gran diversidad de sustancias que pueden utilizarse en la preparacin de medios de cultivo,
formulado con un fin especfico, y el cual deber contener:
a) Fuente de carbono
b) Fuente de nitrgeno
c) Fuente de azufre
d) Factores de crecimiento (que actan como cofactores, oligoelementos como aminocidos o
vitaminas que no pueden sintetizar)
e) Fuente de enriquecimiento para microorganismos exigentes (huevo, sangre, suero etc).
f) Inhibidores de crecimiento microbiano como los colorantes, sales biliares, detergentes, antibiticos
o metales pesados.
g) Indicadores de potencial oxido-reduccin.
h) Agar como el agente gelificante o soporte.
Medios de cultivo: Segn la NOM-065-SSA-1993. Que establece las especificaciones sanitarias
de los medios de cultivo. Generalidades.
Medios selectivos.
Son medios que contienen sustancias que impiden el desarrollo de algunos microorganismos, pero en
una flora mixta permiten el aislamiento y recuperacin del germen o grupo de grmenes de inters.
Medios selectivos de enriquecimiento.
Son medios lquidos que estimulan la multiplicacin de algn germen determinado e impiden o inhiben
la reproduccin de otros.
Medios diferenciales.
Son aquellos que contienen indicadores de cido base, redox o sustancias que detectan cambios en el
medio o en las caractersticas tpicas de las colonias.
Medios para cultivar grmenes anaerbicos.
Son medios de cultivo para aquellos grmenes que requieran condiciones de anaerobiosis o de
microaerofilia.
Medios de transporte.
Sirven para transportar los especmenes que contienen a los microorganismos, del sitio de la toma del
producto hasta el laboratorio donde va a efectuarse el estudio.
Estos medios impiden que se altere la proporcin original de la flora microbiana en los especmenes.
Medios para filtracin a travs de membrana.
Pueden ser lquidos o slidos. En el primer caso, se preparan a la concentracin usual y permiten el
crecimiento de microorganismos presentes en la membrana.
Los medios slidos tienen un contenido mnimo de agar para favorecer la difusin de nutrientes del
medio de la membrana.
Medios especiales para cultivo de hongos y levaduras.
En el caso de los hongos, el medio de cultivo que ms se utiliza es el agar de papa y dextrosa, ya que
tiene un pH de 3,5 lo que inhibe el crecimiento de la mayora de las bacterias. Este medio puede ser
ms selectivo al adicionarle ciertos antibiticos tales como: cloranfenicol, eritromicina o gentamicina;
para eliminar los hongos filamentosos de rpido crecimiento se adiciona cicloheximida (este medio se
llama mycosel o micobitico). Se emplea tambin el medio de agar extracto de malta y el agar rosa de
bengala se emplea para inhibir el crecimiento radial de hongos con micelio cenoctico.
33
En la formulacin de un medio de cultivo deben considerarse, no slo el tipo de microorganismo, y el

objetivo final que se persiga: aislamiento, recuento, identificacin u obtencin de masa celular.
Por otro lado, es de suma importancia los cuidados que deben observarse en la preparacin de los
medios de cultivo como son:
a. La calidad del agua utilizada (que se prefiere libre de sales)
b. Los materiales que deben encontrase en condiciones de limpieza
c. Si se debe aplicar calor y cunto para no incurrir en problemas de homogeneidad,
desnaturalizacin, caramelizacin o prdida de actividad nutricional.
d. pH final del medio que deber ajustarse segn indicaciones del fabricante
e. Esterilidad del medio de cultivo de acuerdo a indicaciones del fabricante si es una formulacin
comercial, o en otras condiciones si los componentes lo requieren.
Cultivo microbiano.
Los microorganismos obtenidos a partir de suelo, aire, alimentos se encuentran en consorcio y en raras
ocasiones se encontrar un solo tipo de microorganismo. A partir del cultivo inicial de una muestra, se
encontrar una variedad de tipos de colonias y posteriormente se pretender lograr un cultivo puro. Un
cultivo puro es aquel que est constituido por microorganismos de la misma especie. El cultivo de
microorganismos se puede realizar en medio slido, semislido o lquido.
Se conoce como cultivo en medio slido al que se hace en una caja Petri con el medio de cultivo
gelificado (agar). Las variantes del cultivo en caja son diversas pero todas se centran en la formacin de
estras sobre la superficie del medio de cultivo con el asa en el caso de bacterias y por picadura
(introduciendo el asa en el agar) si se trata de hongos filamentosos.
Las siembras en tubos con medio slido, por lo general se emplean para la conservacin de un cultivo
proveniente de una placa.
Existen dos variedades de cultivo en tubo:
a) Por estras: se utilizan los medios de cultivo inclinados, se toma una muestra de alguna colonia
inclinada y en forma recta, se toma la colonia y se arrastra el asa en forma zigzagueante en el medio
por la superficie inclinada del agar.
b) Por picadura: se utilizan los medios de cultivo en un tubo solidificado semislido en forma
inclinada y en forma recta, se toma la colonia y se introduce en el medio picndolo longitudinalmente.
La siembra en tubos de cultivo en medio lquido se realiza tomado el inculo con el asa y se introduce
en el medio lquido agitando suavemente el asa.
a) Desarrollo en medio slido inclinado. Se siembran los microorganismos por estra en tubos con
agar inclinado
b) Desarrollo en medio lquido. Las caractersticas que se observan en el cultivo son: turbidez, un
sedimento, una pelcula superficial, o combinados.
c) Desarrollo en medio semislido por picadura hasta partes del tubo
Mediante la evaluacin de las caractersticas de las colonias descritas y la accin en el medio, se puede
hacer una identificacin preliminar de los diferentes microorganismos aislados en un cultivo primario.
Estas caractersticas son tiles para seleccionar otros medios y pruebas diferenciales apropiadas para
completar la identificacin de los microorganismos, aunque cabe sealar que la identificacin de
microorganismos por el estudio de sus caractersticas de cultivo es solo parcial ya que se requiere otras
pruebas bioqumicas, fisiolgicas e inmunolgicas.
34
Agar bacteriolgico
El agar utilizado en bacteriologa es un medio que est libre de metales, compuestos nitrogenados,
sales insolubles, azcares libres, microorganismos muertos, bacterias termfilas y pigmentos.
El agar es una sustancia coloidal desecada que se extrae de algunas especies marinas de algas rojas,
particularmente de los gneros Gelidium, Gracilaria, Pteroclaida y Acanthopeltis, qumicamente el agar
es una mezcla de dos polisacridos: agarosa y la agaropectina, cuyas estructuras se revelan como
polmeros de la galactosa en sus distintas formas. La proporcin de agarosa y agaropectina es variable,
con valores extremos de 75 % de agarosa y 25 % de agaropectina, segn la clase de algas utilizadas.
El agar con agua destilada fra tiene un poder de hinchamiento superior a veces al 3000%, en agua
hirviendo el agar se disuelve totalmente en pocos minutos. La tendencia a la unin de sus partculas,
que en fro se mantienen independientes producen un gel limpio y transparente que al enfriarse, ya no
cede el exceso de agua absorbida. La viscosidad del gel aumenta paulatinamente a medida que la
solucin disminuye en su temperatura, gelificando a los 35 40 C.
Los cidos diluidos en fro, no alteran sensiblemente el agar, desde que se introdujo el agar a los
medios de cultivo como agente gelificante ha resultado muy bueno debido a que:
a) Su estructura le confiere gran estabilidad frente a las enzimas microbianas, muy pocas bacterias
marinas son capaces de hidrolizar como Pseudomonas carragenomora.
b) Su estabilidad qumica, le permite mantener el medio en estado slido.
c) Su punto de fusin, superior a 80 C, permite cultivar en medio slido bacterias termfilas que se
incuban hasta temperaturas de 65 C.
d) Su temperatura de gelificacin, inferior a los 39 C, permite mezclarlos en forma lquida.
e) Su elevado poder gelificante permite su utilizacin a muy bajas concentraciones, generalmente al
1,5 % (m/v) permitiendo obtener geles muy firmes, lo que permite sembrar microorganismos.
f) Su empleo en concentraciones muy bajas permiten la obtencin de medios semislidos en los
cuales se pueden realizar pruebas de movilidad.
Clasificacin de medios de cultivo
I Los medios de cultivo por su estado de agregacin pueden ser: lquidos, semislidos y slidos
a) Medios lquidos. Este medio no contiene agar y se emplea para obtener grandes cantidades de
microorganismos o bien para la produccin de algn metabolito.
b) Medios semislidos. Se utiliza para determinar si un microorganismo tiene movilidad.
c) Medios slidos. Se utiliza para obtener colonias aisladas de microorganismos.
II.- Por su uso se clasifican en:
a) Medios selectivos.- Son medios que contienen sustancias que inhiben el crecimiento de algunos
microorganismos, pero en una flora mixta permiten el aislamiento y recuperacin del microorganismos o
grupo de microorganismos de inters.
b) Medios de enriquecimiento. Son medios que estimulan la multiplicacin de algn microorganismo.
c) Medios selectivos de enriquecimiento.- Son medios que estimulan la multiplicacin de algn
germen determinado e impiden la reproduccin de otros.
d) Medios diferenciales.- Son aquellos que contienen indicadores cido base y de redox para detectar
cambios en el medio o en las caractersticas tpicas de la colonia.
35
e) Medios para cultivar grmenes anaerbicos.- Son medios de cultivo para aquellos grmenes que
requieran condiciones anaerbicas o de microaerofilia. Incluyendo medios reductores como el caldo
tioglicolato y el uso de jarras de anaerobiosis.
III. Por su composicin

a) Si a un medio se le conoce completamente su formulacin qumica se denomina medio sinttico
como el caldo glucosa sales.
b) Si un medio de cultivo no conocemos su composicin qumica se le denomina un medio complejo
como el agar base sangre.
Acorde a la presentacin de un medio, podemos tener cultivos lquidos en matraz, en tubo medios
semislidos y en placa medios slidos.
IV.- Medios de cultivo para medir la actividad antimicrobiana (antibiograma).
Los medios para realizar antibiogramas o para medir los halos de inhibicin de sustancias
desinfectantes o antispticas generalmente son medios que no contienen inhibidores como el agar
Mueller Hinton, agar cuenta estndar y agar de soya y tripticasena.
Para cada medio de cultivo se deben de introducir controles, por ejemplo para el Agar de papa y
dextrosa se siembran las siguientes cepas de referencia.
Microorganismo Cepa Resultado
Candida albicans ATCC 10231 Bueno
Saccharomyces cerevisiae ATCC9763 Bueno
Trichophyton mentagrophytes ACTT9533 Bueno
Para el agar con eosina y azul de metileno los controles de actividad son:
Microorganismos Cepa Resultado

Escherichia coli ATCC 25922 Colonias moradas con brillo metlico azul verdoso
Enterobacter aerogenes ATCC 13048 Colonias mucoides con centro oscuro por lo general sin brillo metlico
Salmonella typhimurium ATCC 14028 Colonias incoloras y transparentes
Shigella flexneri ATCC 12022 Colonias incoloras y transparentes
Staphylococcus aureus ATCC 25923 Crecimiento parcialmente inhibido o colonias puntiformes
Candida albicans ATCC 10231 Colonias plumosas de color rosa plido.
Esto se realiza para garantizar que el medio de cultivo funciona adecuadamente y puede ser utilizado,
adems es parte del control de calidad de los medios de cultivo.
3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS

3.1 MATERIAL POR GRUPO Sesin I
Balanza granataria Potencimetro

Autoclave Algodn
Horno 170 C Gasa
Papel Kraf Refrigerador
36
Incubadora a 28 C Incubadora a 37 C
3.2 MATERIAL POR EQUIPO (Sesin I)
Un mechero Fisher Una pipeta de 10 ml
Un esptula Cinco tubos de ensaye de 13 x 100 mm
Seis matraces de 250 ml Una probeta de 100 ml
Siete tubos de ensaye de 16 x 150 mm Un termmetro
Dos matraces de 125 ml Seis cajas Petri
Sesin II
Tres tubos con 3 ml de medio SIM Un matraz con 50 ml de caldo glucosa sales
Tres cajas con agar EMB Un matraz con 50 ml de caldo nutritivo
Tres tubos con agar PDA Tres tubos con agar nutritivo
Tres cajas con agar nutritivo Tres cajas con un medio enriquecido
3 tubos con 3 ml de caldo glucosa sales 3 tubos de caldo nutritivo
3.3 REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO
Agar nutritivo (AN) (NH4) 2SO4
Agar eosina azul de metileno (EMB) K2HPO4
Agar de papa y dextrosa (PDA) MgSO4 7H2O
Medio SIM MnSO4 4H2O
Glucosa Agar bacteriolgico
Agar base sangre Agar rosa de bengala
Escherichia coli Penicillum sp.
Bacillus sp. Aspergillus sp.
4.- DESARROLLO EXPERIMENTAL
Recomendaciones generales para la preparacin de los medios de cultivo.
a) Preparar el volumen de medio que se vaya a utilizar en el perodo recomendado para su
empleo.
b) Utilizar agua destilada y material de vidrio libre de detergentes.
c) Pesar la cantidad del medio que marca el fabricante (en la etiqueta)
d) El medio de cultivo en polvo debe de guardarse en su frasco y en un lugar fresco.
e) Emplear recipientes con el doble de capacidad al volumen que se va a preparar para evitar la
proyeccin en el momento de la ebullicin.
f) Aadir una pequea cantidad de agua para permitir la disolucin y despus completar el volumen.
37
g) En general los medios se mezclan hasta disolucin completa para aclararse, pero debe evitarse que
se derramen. Nunca deben calentarse a la flama directa del mechero para evitar que se proyecten.
h) El pH de los medios debe ajustarse antes de la esterilizacin y a una temperatura de 25 C.
i) Es conveniente evitar el sobrecalentamiento durante la esterilizacin por calor para evitar la prdida
de materiales nutritivos y agua que puedan cambiar la consistencia del medio.
j) Los medios de cultivo ya preparados y esterilizados deben mantenerse en refrigeracin (4 C) y
protegidos de la luz. Antes de emplearlos verificar que no exista contaminacin, precipitacin, cambio
de color o de consistencia etc.
k) Un medio contenido en un matraz y que ya contenga sustancias de enriquecimiento cido tartrico
no puede ser esterilizado una segunda ocasin.
PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO
4.2 MEDIO SINTTICO (glucosa-sales caldo y agar)
a) Preparar 100 ml de caldo o la cantidad que indique el profesor.
b) Pesar cuidadosamente los componentes del medio de acuerdo a la siguiente formulacin:
Reactivo Cantidad
Glucosa 5.0
(NH4) 2SO4 2.0
KH2PO4 0.05
K2HPO4 0.05
MgSO4 7H2O 0.25
MnSO4 4H2O 0.001
Agua destilada 100 ml
c) Disolver los componentes por separados y colocarlos en un matraz de 250 ml, adicionar en primer
lugar los metales, luego los fosfatos, el amonio y finalmente la glucosa. Ajustar el pH a 7.0 - 0.2 si
fuera necesario, para ello utilizar el potencimetro.
d) Una vez disueltos los componentes transferir 30 ml a un matraz Erlenmeyer de 125 ml,
colocarle el tapn de algodn su gorro de papel Kraf y colocarlo en el autoclave.
e) Tomar 3 tubos y colocarles 3 ml de caldo glucosa sales, taparlos y colocarlo en un bote de
lmina
f) Medir el volumen que sobra del caldo y realizar la operacin matemtica, de tal forma que la
concentracin de agar a adicionarle sea 1.5 g de agar bacteriolgico/ 100ml de medio.
g) Calentar a ebullicin hasta que se haya fundido completamente.
h) Tomar 3 tubos de ensaye y colocarle aproximadamente 3 ml, taparlos y colocarlos en el bote de
lmina para su esterilizacin.
i) El medio que ha sobrado colocarle el tapn y su gorro e introducirlo a la autoclave.
j) Esterilizar todo el material anterior en autoclave a 110 C durante 15 minutos. Una vez que se ha
llevado a cabo la esterilizacin, inclinar los tubos que tienen agar.
k) Enfriar el matraz hasta 45 C y en condiciones aspticas transferir del matraz de 15 a 20 ml de
medio en cajas de Petri estriles y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.
38
l) Etiquetar con los datos correspondientes cada caja (en la base de la caja) colocar el masking tape o
con marcador indeleble Finalmente guardar en bolsas de plstico nuevas en posicin invertida.
m) Dejar una muestra para control de esterilidad por 5 das y el resto de material conservarlo en
refrigeracin para su uso.
4.3.1 MEDIO COMPLEJO (agar nutritivo para placas de Petri)
a) Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad de
medio indicada por el profesor.
b) Colocar el medio en un matraz del doble de volumen y adicionar el agua necesaria.
c) Calentar suavemente hasta disolverlo completamente.
d) Tapar el matraz que contiene el medio con un tapn y gorro de papel Kraft.
e) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase.
f) Enfriar el matraz hasta 45 C y en condiciones estriles transferir del matraz de 15 a 20 ml de medio
en cajas de Petri estriles y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.
g) Etiquetar con los datos correspondientes cada caja (en la base de la caja) colocar el masking tape o
4.3.2 MEDIO COMPLEJO (agar nutritivo para preparar tubos de ensaye)
d) En un tubo colocar 3 ml de agua para ser utilizado como tubo de comparacin y no usar una pipeta.
e) Vaciar aproximadamente 3 ml de medio en cada uno de los tubos de ensaye de 13 x 100 mm limpios
y etiquetados, taparlos con un tapn de algodn-gasa y colocarlos en un bote
f) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase, al trmino de
esta y calientes inclinar los tubos con el agar y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.
g) Finalmente guardar en bolsas de plstico nuevas.
4.3.3 MEDIO COMPLEJO (caldo nutritivo en matraz y tubo de ensaye)
a) Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar 60 ml de medio.
c) Calentar solo si es necesario hasta disolverlo completamente.
d) Medir con una probeta 50 ml y colocarlo en un matraz de 125 ml, colocarle su tapn y gorro
e) Vaciar 3 ml de medio en cada uno de los tubos de ensaye de 13 x 100 mm limpios y etiquetados,
taparlos con un tapn de algodn-gasa y colocarlos en un bote de lmina.
f) Esterilizar a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase y guardar en refrigeracin.
4.4 MEDIO DIFERENCIAL Agar Eosina Azul de Metileno (EMB)
a) Pesar cuidadosamente la cantidad que dice el envase para preparar la cantidad que se indique.
39
b) Colocar el medio en un matraz con el doble del volumen y adicionarle el agua necesaria.
c) Calentar suavemente hasta disolucin completa.
d) Tapar el matraz con un tapn de algodn-gasa y gorro de papel Kraft.
e) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del frasco
f) Enfriar el matraz hasta 45 C y en condiciones aspticas transferir del matraz de 15 a 20 ml de
medio en cajas de Petri estriles y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.
4.5.1 MEDIO SELECTIVO (Agar Papa y Dextrosa para preparar cajas de Petri)
d) Tapar el matraz que contiene el medio con un tapn y gorro de papel Kraft.
e) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase.
f) Enfriar el matraz hasta 45 C y en condiciones estriles transferir del matraz de 15 a 20 ml de medio
en cajas de Petri estriles y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.
4.5.2 MEDIO COMPLEJO (Agar Papa y Dextrosa para preparar tubos de ensaye)
d) En un tubo colocar 3 ml de agua para ser utilizado como tubo de comparacin y no usar una pipeta.
e) Vaciar aproximadamente 3 ml de medio en cada uno de los tubos de ensaye de 13 x 100 mm limpios
y etiquetados, taparlos con un tapn de algodn-gasa y colocarlos en un bote
f) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase, al trmino de
esta y calientes inclinar los tubos con el agar y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.
g) Finalmente guardar en bolsas de plstico nuevas.
4.5.3 MEDIO SELECTIVO (Agar Papa y Dextrosa para preparar matraces con 80 ml)
h) Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar 80 ml del medio.
i) Colocar el medio en un matraz de 125 ml y adicionar el agua necesaria.
j) Calentar suavemente hasta disolverlo completamente.
k) Tapar el matraz previamente etiquetado que contiene el medio con un tapn y gorro de papel Kraft.
l) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase.
40
m)Este medio se utilizar para la realizacin de la tcnica de vaciado en placa y para ello ser
necesario fundir el medio y cuando este a 45 C se le adicionar 1.4 ml de cido tartrico al 10%
estril por cada 100 ml de medio preparado y homogeneizar.
4.6 MEDIO INDICADOR medio SIM (Sulfur Indol Motility).
a) Pesar con cuidado la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad que
indique el profesor.
b) Colocar el medio en un matraz del doble de capacidad y adicionarle agua necesaria.
c) Calentar suavemente hasta disolucin completa y colocar 3 ml en tubos de 13 x 100 mm.
d) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase
e) Dejar los tubos en el bote y dejar que estos solidifiquen en posicin vertical.
4.7a.-MEDIO ENRIQUECIDO AGAR SANGRE

a) Pesar la cantidad indicada para preparar cuatro placas segn la etiqueta del frasco.
b) Fundir el medio con agua destilada, hasta que el medio este claro y sin grumos.
c) Colocar el tapn de algodn y el gorro y esterilizar, segn indica el frasco.
d) Una vez esterilizado el medio, enfriarlo hasta que este a 45C.
e) Cuando este a esa temperatura, adicionar 5 % de sangre estril desfibrinada.
f) Mezclar bien la sangre y vaciar rpidamente en las placas previamente esterilizadas y etiquetadas.
g) Dejar solidificar el medio y colocarlas en una bolsa de plstico nueva en posicin invertida y
guardarlas en el refrigerador.
4.7.b.- MEDIO COMPLEJO Y ENRIQUECIDO (Agar Baird-Parker, medio que se utilizar en

aislamiento)
Este medio de cultivo contiene cloruro de litio y telurio para la inhibicin de la flora acompaante, en
tanto que el piruvato y la glicocola actan favoreciendo selectivamente el crecimiento de
Estafilococos.Sobre el medio de cultivo, opaco por su contenido en yema de huevo, las colonias de
Estafilococos muestran dos caractersticas diagnosticas por la liplisis y proteolisis, se producen halos y
caractersticas y, debido a la reduccin del telurio a teluro, se desarrolla una colonia negra. La reaccin
con al yema de huevo y la reduccin del telurio se presentan con notable paralelismo con la coagulasa-
positividad, y por tanto, pueden utilizarse como ndice de esta ltima.
Formula
Ingredientes Cantidad
Medio base 95,0 ml
Solucin de telurito de potasio 1,0 ml
Emulsin de yema de huevo 5,0 ml
Preparacin
a.- Cuando el medio base est a 45C, agregar los dems ingredientes y mezclar.
b.- Colocar de 15 a 20 ml del medio completo, enfriar y dejar solidificar.
c.- Las placas pueden almacenarse por 48 h a temperatura de 0 a 5C.
41
Preparacin del medio base de Baird-Parker

a.- Disolver los ingredientes o el agar base en agua y calentar con agitacin constante y hervir durante 1
min. Esterilizar a 121C 1 durante 15 min, enfriar y mantener el medio a 45C.
Preparacin de la solucin de telurito
a.- Disolver el telurito de potasio en agua y esterilizar. La solucin puede ser almacenada por varios
meses a temperatura de 0 a 5C.
Preparacin Emulsin de yema de huevo
a.- Lavar con agua y jabn los huevos frescos que sean necesarios y limpiarlos con una solucin de
tintura de yodo (solucin alcohlica al 2%) o sumergirlos en solucin de cloruro mercrico (1:1000).
Enjuagar con agua estril y secar con gasa estril.
b.- En campana de flujo laminar o en condiciones aspticas, abrir los huevos y vaciarlos en un
separador de claras estril. Transferir las yemas a una probeta hasta un volumen de 60 ml y completar
a 90 ml con solucin salina isotnica.
c.- Verter la emulsin a un matraz Erlenmeyer con perlas de vidrio estril y agitar fuertemente para
formar la emulsin y filtrar a travs de gasa.
d.- En tanto que el medio de cultivo basal puede aguardarse de 1 a 2 meses a 4 C, el medio de cultivo
completo, vertido en placas, ha de ser utilizado dentro de las 24 horas siguientes a su preparacin.
4.8 AGAR ROSA DE BENGALA

a) Pesar la cantidad indicada para preparar cuatro placas segn la etiqueta del frasco.
b) Fundir el medio con agua destilada, hasta que el medio este claro y sin grumos.
c) Colocar el tapn de algodn y el gorro y esterilizar, segn indica el frasco.
d) Una vez esterilizado el medio, enfriarlo hasta que este a 45C y vaciar en placas estriles
e) Dejar solidificar el medio y colocarlas en una bolsa de plstico nueva en posicin invertida y
guardarlas en el refrigerador.
4.9 CONTROL DE ESTERILIDAD

a) Tomar una muestra de cada uno de los medios preparados para el control de la esterilizacin e
incubarlos a 35 C durante 3 a 5 das.
b) Verificar que no presente crecimiento, cambio de color o precipitacin.
NOTA: ESTOS MEDIOS SE UTILIZARAN PARA LA SIGUIENTE SESIN QUE ES CULTIVO DE MICROORGANISMOS.
SESIN II
4.1 Revisar los medios de cultivo que se prepararon
4.2 CULTIVO EN MEDIO SLIDO EN PLACA (ESTRA CRUZADA, SIMPLE, POR PUNTO Y
MASIVA)
Se utilizarn cajas con agar EMB o Agar sangre para la realizacin de la estra cruzada.
a) Tomar el asa y esterilizarla al rojo vivo en la flama del mechero.
b) Destapar el tubo que contenga el microorganismo, pasar la boca del tubo por la flama del mechero.
c) Enfriar el asa en el interior del tubo y tomar con ella el inculo.
42
d) Pasar la boca del tubo nuevamente por la flama del mechero y colocarle el tapn .
e) Destapar la caja de EMB y sembrar al microorganismo por estra cruzada como se indica en el
esquema y esterilizar el asa cada vez que se realiza una estra.
f) Una vez sembrado el microorganismo incubar la caja sembrada a 37 C, durante 24 horas.
g) Observar el crecimiento a las 24 h y anotar las caractersticas del crecimiento en el medio cultivo.
4.3. CULTIVO DE MICROORGANISMOS POR ESTRA SIMPLE EN PLACA

a) Tomar el asa y esterilizarla en la flama.
b) Destapar el tubo que contenga el microorganismo, pasar la boca del tubo por la flama.
c) Enfriar el asa en el interior del tubo y tomar con ella el
inculo.
d) Pasar la boca del tubo nuevamente por la flama del
mechero y colocarle el tapn.
e) Destapar la caja de Agar nutritivo y sembrar como se
indica en el esquema
f) Esterilizar el asa al terminar de efectuar la estra e
incubar la caja sembrada a 37 C, durante 24 h.
g) Observar el crecimiento a las 24 h y anotar las caractersticas del crecimiento en el medio cultivo.
4.4. CULTIVO DE MICROORGANISMOS POR PUNTO (generalmente para mohos)
a) Tomar la placa y dividirla en cuatro fracciones que

corresponden una para cada alumno y testigo
b) Tomar el asa y esterilizarla al rojo vivo en la flama.
c) Destapar el tubo que contenga el microorganismo, pasar la
boca del tubo por la flama del mechero.
d) Enfriar el asa en el interior del tubo y tomar el inculo.
e) Pasar la boca del tubo nuevamente por la flama del mechero y colocarle el tapn.
f) Destapar la caja de agar de papa y dextrosa y sembrar como se indica en el esquema.
g) Esterilizar el asa al terminar de efectuar la estra e incubar la caja sembrada a 28 C, de 3 a 5 das.
h) Observar el crecimiento a las 24h, 48h, 72h y 5 das, anotar las caractersticas del crecimiento.
4.5. CULTIVO DE MICROORGANISMOS POR ESTRA MASIVA
43
a) Tomar un hisopo estril.

b) Destapar el tubo que contenga la suspensin del microorganismo y
pasar la boca del tubo por la flama del mechero.
c) Tomar un hisopo estril y humedecerlo en la suspensin.
d) Pasar la boca del tubo por la flama y colocarle el tapn.
e) Destapar la caja de agar de soya y tripticasena y sembrar como se
indica en el esquema
f) Colocar el hisopo en el benzal para su desinfeccin e incubar la caja sembrada a 37 C/24 h, y
observar el crecimiento.
4.6 CULTIVO EN TUBO EN MEDIO SLIDO INCLINADO
a) Se utilizarn tubos con agar nutritivo y agar papa dextrosa inclinada y AGS
b) Tomar una asada de la bacteria proporcionada y sembrar por estra en S la
superficie del medio inclinado de agar nutritivo.
c) Tomar una asada del (micelio y esporas) proporcionada y sembrar por estra en
S la superficie del medio inclinado de agar de papa y dextrosa.
d) Esterilizar el asa una vez realizada la siembra e Incubar los tubos sembrados a 37 C para bacterias
y a 28 C para hongos, durante 24 y 48 h respectivamente
e) Observar los cultivos a las 24 y 48 horas y anotar las caractersticas del cultivo.
4.7 CULTIVO EN MEDIO LQUIDO (Se emplearn tubos y matraz con caldo nutritivo y glucosa sales)
a) Tomar el inculo de bacterias con el asa y disgregar ste

agitndolo en las paredes del tubo o matraz, evitar la
formacin de grumos.
b) Tomar el inculo de hongos con el asa en forma de L y
sembrarlo en el matraz o en tubo, procurando tomar esporas
y micelio para disgregarlo en el medio.
c) Esterilizar el asa una vez realizada la siembra.
d) Incubar los tubos y matraz con bacterias a 35 C/24 h, y
el matraz con hongos a 28 C/ 5 das en agitacin a 120 rpm
e) Observar los cultivos a las 24 y 48 h y anotar las caractersticas observadas.
f) Los equipos designados por el profesor dejarn su matraz con moho o bacterias sin agitacin.
4.8 CULTIVO EN MEDIO SEMISLIDO (Se emplearn tubos con medio SIM)
a) Tomar un inculo de bacterias con el asa recta.

b) Sembrar por picadura, sumergiendo el asa hasta partes del medio SIM sin tocar el
fondo y sacar el asa verticalmente. (El crecimiento debe de darse en la lnea de trazo en el
caso de que la bacteria sea no mvil, cuando es mvil el crecimiento se difunde a travs
del medio). Esterilizar el asa una vez realizada la siembra.
c) Incubar los tubos a 37 C/ 24 h.
d) Observar los cultivos a las 24 h y anotar las caractersticas del cultivo.
44
4.9 MORFOLOGA COLONIAL
Morfologa colonial en placa para bacterias y levaduras

Una vez sembrada la placa la descripcin de cada una de las colonias SEPARADAS debe incluir:
a. Tamao: Dimetro en mm, La mayora de los microorganismos forman colonias de tamao limitado
al tiempo de incubacin.
b. Forma: Es la apreciacin general de su figura la cual puede ser:
c.- Elevacin: Que puede ser:
d. Borde: Se refiere al contorno de las colonias y puede ser: Entero, ondulado, Lobulado, crenado,
filamentoso o rizado.
e. Color: Blanco, amarillo, negro, marrn, anaranjado, etc.

f. Aspecto: Hmedo o seco
g. Consistencia: Suave (butirosa), viscosa, membranosa o dura. Esta prueba se realizar con el asa.
Morfologa colonial en placa para mohos:
Tiempo de crecimiento: Los mohos filamentosos, tienen colonias de 2-3 cm de dimetro y va de 3 a 5 das.
Aspecto: puede ser: aterciopelado, pulverulento, velloso y algodonoso.
Pigmentacin: Al reverso de la colonia se observa el pigmento del micelio y puede ser de color olivo,
verde claro, grises, blancas, rojas, amarillas.
45
5.- RESULTADOS Y CUESTIONARIO

5.1 En un cuadro anota los medios de cultivo que se prepararon, sus condiciones de esterilizacin, el
aspecto final del medio y cul es su clasificacin en base a su consistencia y composicin.
Medio de cultivo Condiciones de Clasificacin por su Clasificacin por su Presentacin del

esterilizacin consistencia composicin medio
Caldo Glucosa sales 110C /10 Lquido Simple /sinttico Tubo y matraz
Ejemplo
Agar Glucosa sales
Agar Nutritivo
EMB
PDA
SIM
Agar sangre
Agar rosa de bengala
5.2 Qu cuidados deben tenerse al preparar un medio de cultivo slido en caja de Petri?
5.3- De los siguientes medios, mencionar en qu consiste su capacidad diferencial o selectiva y qu
tipos de microorganismos crecen en ellos? Agar Rosa de Bengala y Agar Papa Dextrosa.
5.4 Cul es la funcin de los colorantes e indicadores en los medios de cultivo?
5.5 De los medios usados indica cules son especficos para mohos y cules para bacterias y por
qu?
5.6 Cuando se siembran hongos en medio lquido, describe cmo es el crecimiento con y sin agitacin.
5.7 En qu casos se siembra en medio semislido y cules son las precauciones que se deben tomar?
5.8 Anota la morfologa colonial de un moho y de una bacteria, indicando de que medio lo obtuviste.
6.- ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS
Discutir con base a la Norma Oficial Mexicana la clasificacin de los medios y a las caractersticas de la
morfologa colonial (macroscpica) para cada especie microbiana.
7.- CONCLUSIONES
Elabora tus conclusiones utilizando los resultados obtenidos, al anlisis y discusin de stos, la
bibliografa consultada y al objetivo de la prctica.
8. BIBLIOGRAFA UTILIZADA PARA LA ELABORACIN DE ESTA PRCTICA
Edicin. Interamericana. Mxico. 140 p.
8.2 Manual de medios de cultivo Bioxon parte 1 y 2
8.3 NOM-065-SSA1-1993, Bienes y servicios. Que establece las especificaciones sanitarias de los
medios de cultivo. Generalidades.
8.4 Schiegel, G. Microbiologa General. Edicin. Omega. 1997. Espaa. 654 p.
46
PRACTICA No 5
AISLAMIENTO Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS
UNIDAD IV: Cultivo y crecimiento microbiano
1. OBJETIVOS:
El alumno practicar las tcnicas de aislamiento y cuantificacin de microorganismos de muestras
biolgicas siguiendo las recomendaciones de las Normas Oficiales Mexicanas.
1.2 OBJETIVOS ESPECFICOS:
1.2.1 El alumno practicar las diferentes tcnicas de aislamiento y recuento de microorganismos.
1.2.2 Aplicar la tcnica de las diluciones para disminuir la carga microbiana de las muestras con base
en las normas oficiales, NOM-109-SSA1-1994 Procedimientos para la Toma, Manejo y Transporte de
Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico y NOM-110-SSA1-1994 Preparacin y Dilucin
de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico, 092 NOM-092-SSA-1994, Mtodo para la
cuenta de bacterias aerobias en placa y NOM-111-SSA11994, Bienes y servicios. Mtodo para la
cuenta de mohos y levaduras en alimentos
2. INTRODUCCIN
Se entiende por aislamiento, al proceso que permite separar uno o ms microorganismos presentes en
una muestra, forzndolos a crecer en medios de cultivos. No todos los microorganismos pueden
cultivarse en medios de cultivo como el caso de los organismos biotrficos y consorcios microbianos
difciles de separar (parsitos obligados), los cuales se desarrollan sobre tejido vivo de su hospedante
(virus, rickettsias, hongos).
En el estudio microbiolgico, el primer paso es la separacin de la poblacin mixta a un cultivo puro y
luego su posterior identificacin (familia, gnero y especie).
-Cultivo puro: es aquel que contiene una sola especie o tipo de microorganismo y que presumiblemente
se ha obtenido a partir de una sola clula. En un cultivo puro, no necesariamente todas las clulas que
lo componen tienen que ser exactamente iguales, ya que es factible que algunas de ellas sufran
mutaciones y se diferencien de las restantes. Cada uno de los cultivos puros que com ponen una
especie se denomina cepa.
Las diferentes tcnicas de aislamiento son la estra cruzada, el vaciado en placa y la extensin con
varilla, pero en ocasiones la muestra tiene gran cantidad de microorganismos que tenemos que recurrir
a la realizacin de:
Realizacin de diluciones (NOM-110-SSA11994, Bienes y servicios. Preparacin y dilucin de
muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico)
La dilucin primaria tiene por objeto obtener una distribucin lo ms uniforme posible de los
microorganismos contenidos en la muestra destinada para el anlisis.
La preparacin de diluciones decimales adicionales, si son necesarias, tiene como objetivo reducir el
nmero de microorganismos por unidad de volumen, para permitir, despus de la incubacin, la
observacin de la prueba en el caso de tubos o matraces y la cuenta de colonias en el caso de placas.
Dilucin primaria, es la suspensin o emulsin obtenida despus de pesar o medir una cantidad del
producto bajo examen y mezclarla con una cantidad de nueve veces en proporcin de diluyente.
47
Diluciones decimales adicionales, las suspensiones o soluciones obtenidas al mezclar un determinado

volumen de la dilucin primaria con un volumen de nueve veces un diluyente y que por repeticin de
esta operacin con cada dilucin as preparada, se obtiene la serie de diluciones decimales adecuadas
para la inoculacin de medios de cultivo.
Estra cruzada en placa:
Esta tcnica consiste en establecer un gradiente de diluciones por medio de las estras cruzadas sobre
la superficie de un medio slido, para separar a los microorganismos, dando origen a colonias
separadas que generalmente corresponden a un cultivo puro, aqu no se puede hacer un recuento.
TCNICA DE VACIADO EN PLACA:
El fundamento de la tcnica consiste en contar las colonias, que se desarrollan en el medio de eleccin
despus de un cierto tiempo y temperatura de incubacin, presuponiendo que cada colonia proviene de
un microorganismo de la muestra bajo estudio. El mtodo admite numerosas fuentes de variacin,
algunas de ellas controlables, pero sujetas a la influencia de varios factores.
En la lectura seleccionar aquellas placas donde aparezcan entre 25 a 250 UFC, para disminuir el error
en la cuenta en caso contrario seguir las indicaciones de la NOM 092
Unidades Formadoras de Colonias (UFC), trmino que debe utilizarse para reportar la cuenta de
colonias en placa, las cuales pueden surgir de una clula o de un cmulo de clulas.
TCNICA DE EXTENSIN EN PLACA CON VARILLA ACODADA
Esta tcnica se utiliza para el aislamiento y recuento de microorganismos, donde el inculo se distribuye
con la varilla, previamente esterilizada. La cantidad de inculo utilizado puede ser de 0,1 o 0,5 ml.
En algunos casos el aislamiento lo podemos hacer directamente en un medio selectivo, pues lo que
deseamos es ver la produccin de un metabolito, por ejemplo para el aislamiento de microorganismos
productores de amilasas se utiliza el medio denominado agar almidn.
El aislamiento nos sirve para obtener la morfologa colonial, microscpica y observar alguna
caracterstica como hidrlisis o hemlisis.
3. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS
3.1 MATERIAL POR EQUIPO
Cuatro Cajas de Petri estriles Cuatro cajas de Petri con Agar Nutritivo
Cajas de Petri con EMB o medio selectivo Cilindro con pipetas de un ml estriles
Matraz con 100 ml de ACS o PDA Seis frascos de dilucin con 90 ml de
solucin salina al 0.85%
Balanza granataria
3.2 MATERIAL QUE DEBE TRAER EL ALUMNO
3.2.1 Muestra de queso, agua de sabor, leche en punto de venta, helado, etc.
4.1 Realizar diluciones de la muestra como lo indique el profesor y segn el siguiente esquema.
4.1.1 DILUCIONES
a. Para muestras lquidas no viscosas (agua, leche, refrescos, etc.) en las cuales la distribucin de
microorganismos es homognea o fcilmente homogeneizable por medios mecnicos (agitacin, etc.).
48
b. Para muestras congeladas de un alimento originalmente lquido o licuable, fundir por completo en
bao de agua de 40 a 45C un tiempo mximo de 15 minutos y homogeneizar agitando vigorosamente.
c. Para la parte lquida de una muestra heterognea la cual sea considerada suficientemente
representativa de la muestra total (por ejemplo la fase acuosa de grasas animales y vegetales).
d. Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm
efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 10 ml de la muestra si es muestra lquida y 10 g si es
muestra slida y diluir con 90 ml del diluyente el cual debe encontrarse a una temperatura similar a sta,
evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente (todo en condiciones de esterilidad).
e. Utilizar pipetas diferentes para cada dilucin inoculando simultneamente las cajas que se hayan
seleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad total de la
pipeta.
f) La seleccin de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a inocular, dependen
del nmero esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de anlisis previos y
de la informacin que se obtenga del personal de inspeccin que la haya colectado. En ausencia total
de informacin, trabajar con las diluciones de la primera a la sexta.
4.2 AISLAMIENTO Y RECUENTO POR LA TCNICA DE VACIADO EN PLACA. Agar cuenta

estndar (ACS) o agar de papa y dextrosa (PDA)
NOM-092-SSA-1994, Mtodo para la cuenta de bacterias aerobias en placa y NOM-111-SSA11994,

Bienes y servicios. Mtodo para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos
a) Una vez realizadas las diluciones se procede a inocular las placas
b) Distribuir las cajas estriles en la mesa de trabajo de manera que la inoculacin; la adicin de medio
de cultivo y homogenizacin, se puedan realizar cmoda y libremente. Marcar las cajas en la base de
la misma con los datos pertinentes previamente a su inoculacin y correr por duplicado.
c) Se inocula un ml de las dos ltimas diluciones segn las diluciones que se hayan realizado en las
cajas Petri estriles, agregar de 12 a 15 ml del medio preparado que es agar cuenta estndar,
mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj,
6 en sentido contrario y 6 de atrs a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una
completa incorporacin del inculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas.
Dejar solidificar.
49
d) Incluir una caja sin inculo por cada lote del medio preparado como testigo de esterilidad.
e) El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que
finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.
f) Incubar las cajas en posicin invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se
requieran.
g) Para bacterias y levaduras 37C 24 a 48 horas.
h) Contar todas las colonias en aquellas cajas que tengan entre 25 y 250 colonias
i) Si se cuenta la ltima dilucin y no tiene entre 25 y 250 sino ms, y las colonias estn bien
distribuidas, dividir la placa en dos y contar solo una mitad, el resultado se multiplica por dos, si an
tenemos muchas colonias, dividir la placa en cuatro y solo contar un cuadrante y el resultado se
multiplica por cuatro, y si todava tenemos muchas contar 5 cm 2, sumarlos y sacar un promedio, el
resultado se multiplica por 65, cuando la placa utilizada sea de 100 X 15 mm.
j)Para el aislamiento y recuento de mohos es el mismo procedimiento solo que ahora hay que acidificar
el PDA con 1.4 ml de acido tartrico al 10 % por cada 100 ml de medio, incubar a 28 C de 3 a 5 das y
contar todas las colonias en aquellas cajas que tengan entre 15 y 150 colonias.
4.3 AISLAMIENTO Y RECUENTO POR LA TCNICA DE EXTENSIN EN PLACA (Agar Nutritivo)
a. Distribuir las cajas estriles en la mesa de trabajo de manera que la inoculacin; la adicin de medio
de cultivo y homogenizacin, se puedan realizar cmoda y libremente.
b. Etiquetar las cajas en la base previamente a su inoculacin y correr por duplicado.
c. Inocular 0.1 ml de las dos ltimas diluciones de las muestras preparadas sobre la superficie del
medio.
d. Humedecer una varilla de vidrio en forma de L con alcohol y pasarla por la flama del mechero.
e. Enfriar la varilla, una vez fra extender el inoculo por toda la superficie del agar nutritivo.
f. Incluir una caja sin inculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo de esterilidad.
g. El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que
finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.
h. Incubar las cajas en posicin invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se
requieran, segn el tipo de alimento y microorganismo de que se trate.
i. Para bacterias 37C 24 a 48 horas.
j. Se procede a contar el nmero de bacterias haciendo los clculos como en la tcnica de vaciado en
placa.
50
4.4 AISLAMIENTO POR ESTRIA CRUZADA (Medio selectivo)
a. Este sistema de siembra en estras en placas de Petri con medios slidos y es el procedimiento
habitual para aislar microorganismos. (En caso de duda ver la prctica anterior.)
b. Incubar las cajas en posicin invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se
requieran, segn el tipo de producto y/o microorganismo de que se trate.
c. Realizar la morfologa colonial de las colonias que estn previamente aisladas.
5 CUESTIONARIO:
5.1 Informe de resultados de la tcnica de Vaciado en placa:
Tcnica Vaciado en placa ACE/PDA Extensin con varilla (AN)
No. de UFC/ml
5.2 Reportar como: Unidades formadoras de colonias, ___________UFC/g o ml de bacterias aerobias

en placa en agar cuenta estndar, incubadas: ______________horas a _______________C
Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o ml) de mohos en agar papa - dextrosa
acidificado, incubadas a 25 1C durante 5 das.
Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o ml) de levaduras en agar papa-dextrosa
acidificado, incubadas a 25 1C durante 5 das.
Reportar como: Unidades formadoras de colonias, ___________UFC/g o ml de bacterias aerobias en
placa en agar cuenta estndar, incubadas: ______________horas a _______________C.
5.3 Informe de resultados de la tcnica de Extensin en con varilla.
5.4 En qu casos aplicaras la tcnica de estra cruzada?
5.5 La tcnica de estra cruzada permite contar el nmero de colonias?
5.6 Cul es el fundamento de la tcnica de vaciado en placa?
5.7 Cul es el fundamento de la tcnica de extensin en placa?
5.8 En qu casos aplicaras utilizar diluciones?
6. ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS.
Discutir las ventajas y desventajas de cada una de las tcnicas de aislamiento y analizar los resultados
obtenidos en cada una de las tcnicas.
51
7. CONCLUSIONES
Elabora tus conclusiones tomando en cuenta los resultados obtenidos.
8. BIBLIOGRAFA
8.1 NOM-109-SSA1-1994 Procedimientos para la Toma, Manejo y Transporte de Muestras de Alimentos
para su Anlisis Microbiolgico
8.2 NOM-110-SSA1-1994 Preparacin y Dilucin de Muestras de Alimentos para su Anlisis
Microbiolgico
8.3 NOM-092-SSA-1994, Mtodo para la cuenta de bacterias aerobias en placa
8.4NOM-111-SSA11994, Bienes y servicios. Mtodo para la cuenta de mohos y levaduras en
alimentos
8.5 Koneman, Diagnstico Microbiolgico 3ra. Edicin, Edit. Panamericana 2003.
52
PRCTICA No. 6
CONSERVACIN DE MICROORGANISMOS
UNIDAD IV: Nutricin y cultivo microbiano.
1. OBJETIVOS:
1.1 El alumno diferenciar cada uno de los mtodos de conservacin de cepas de acuerdo a las
caractersticas de este.
1.2.1 El alumno conocer los mtodos de conservacin de cepas y conservar algunas cepas de inters
eligiendo el mtodo ms adecuado.
1.2.2 El alumno realizar pruebas de viabilidad microbiana.
2. INTRODUCCIN
En un laboratorio de microbiologa existen cepas microbianas las cuales hay que preservar, tenindose
varios mtodos para su conservacin, aunque necesario tomar en cuenta las caractersticas del
microorganismo, los materiales y los recursos con que se cuenta para elegir el mejor mtodo, pues
sucede que nuestra cepa de inters puede en un momento dado sufrir daos como la deshidratacin,
cambios genticos o perdida de la viabilidad.
Las tres condiciones que hay que alcanzar para conservar correctamente las cepas microbianas en un
laboratorio son:
Que el cultivo a conservar sea puro, evitando que se produzcan contaminaciones durante el
proceso de conservacin;
Que durante el tiempo de conservacin sobrevivan al menos del 70-80% de las clulas, y
Que estas clulas permanezcan genticamente estables.
Las dos primeras condiciones no son muy difciles de conseguir cuando se conoce bien la tcnica
microbiolgica, pero el tercero puede presentar dificultades, y este es el motivo por el cual existen varios
mtodos de conservacin. Los mtodos de conservacin de cepas se van a agrupar en tres apartados,
que son: Mtodos de eleccin o de conservacin a largo plazo, mtodos alternativos y mtodos
restringidos.
A.- Mtodos de eleccin o de conservacin a largo plazo.
Son los mejores porque en ellos se detiene el crecimiento de las clulas microbianas, pero stas no han
muerto. As se garantiza al mximo la estabilidad gentica, por evitarse la aparicin de generaciones
sucesivas. An as no se puede descartar algn cambio originado por el mtodo. Los mtodos de
conservacin pertenecientes a este grupo son dos: Congelacin y liofilizacin.
Conservacin por congelacin.
Se congelan las clulas en suspensin en un lquido con un agente crioprotector y se guardan a
temperaturas inferiores a 0C, con lo que el agua se congela. De esta forma, al no disponer las clulas
de agua en forma lquida, no hay crecimiento. Cuando se quiere trabajar con las clulas as
conservadas, se recuperan subiendo la temperatura. Este es el mejor mtodo de conservacin desde
todos los puntos de vista, pero tiene el inconveniente de requerir aparatos especiales. Los cuatro
53
factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las clulas conservadas por este mtodo es la
edad de las clulas, velocidad en la congelacin y descongelacin, temperatura de almacenamiento: y
empleo de agentes crioprotectores.
Conservacin por liofilizacin.
Tampoco se da crecimiento en las clulas conservadas por este mtodo, puesto que se les ha quitado
el agua mediante la liofilizacin, que es un proceso suave. Con ello la estabilidad gentica es alta, pero
a veces no tanto como en la congelacin, porque la liofilizacin se consigue por sublimacin del hielo de
las clulas. Por lo tanto, primero tenemos que congelar el agua libre de las clulas y despus eliminarla
mediante el vaco, sin que haya necesidad de subir la temperatura, lo que acabara afectando a la
viabilidad del microorganismo. Para este proceso se emplean los aparatos denominados liofilizadores.
Las clulas microbianas as conservadas se someten a un tratamiento ms complejo que en el caso de
la congelacin, pues la liofilizacin se hace en dos etapas y se aade la sublimacin del agua a la
congelacin previa. Sin embargo, este es un mtodo muy recomendable por su comodidad para el
almacenamiento y para el envo de las cepas, pues una vez conseguidos los lifilos pueden
almacenarse a temperatura ambiente (18C-20C), con lo cual su envo es fcil.
Los factores que debemos tener en cuenta para hacer una buena liofilizacin son los mismos que
influyen en la congelacin, a los que hay que aadir otros que surgen como consecuencia de la
deshidratacin. La congelacin puede hacerse rpida o lentamente, la primera sumergiendo los tubos
en nitrgeno lquido. Respecto a los crioprotectores, se pueden utilizar varios dependiendo del tipo de
microorganismo, pero para liofilizar no se debe utilizar glicerol, debido a su elevado punto de
evaporacin y a su higroscopicidad, que provoca que los lifilos queden muy viscosos. Tampoco es
conveniente utilizar el dimetilsulfxido, porque es algo txico, y al concentrarse por la evaporacin del
agua puede daar a las clulas microbianas. Por lo tanto, para la liofilizacin se recomiendan como
crioprotectores el inositol para la mayora de las bacterias y la leche descremada para mohos y
actinomicetos, pero para algunos microorganismos pueden ser ms convenientes otros crioprotectores,
como por ejemplo el glutmico-glutamato para las bacterias lcticas y mezclas de glucosa con caldo
hgado (sin carne) para bacterias anaerobias.
Los nuevos factores que influyen especficamente en la eficacia de la liofilizacin como medio de
conservacin son: el tipo de microorganismos, la concentracin celular, el grado de deshidratacin
alcanzado, la atmsfera de oxgeno en el tubo y las condiciones de almacenamiento.
B.- Mtodos alternativos.
Son los que se utilizan cuando no se pueden emplear los mtodos de eleccin, bien por carecer de los
equipos necesarios, o bien porque la cepa microbiana no resiste los tratamientos de la conservacin por
estos mtodos. Conviene tener en cuenta que nunca se debe usar un nico mtodo alternativo, sino
que se recomienda conservar el microorganismo empleando varios de estos mtodos.
a).- Conservacin por transferencia peridica.
La cepa microbiana se guarda en forma de cultivo activo en el medio de cultivo en el que ha crecido. Sin
embargo, estas clulas no pueden permanecer indefinidamente en el mismo tubo, porque al seguir
activas excretan productos txicos del metabolismo que se acumulan, provocando el envejecimiento y
muerte celular, por lo que es necesario transferirlas a otro tubo con medio de cultivo fresco. Este es el
peor mtodo para conseguir la estabilidad gentica, puesto que al estar las clulas creciendo hay una
alternancia de generaciones, y al cabo del tiempo las clulas que se estn guardando sern
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descendientes lejanas de las clulas iniciales y es posible que ya no conserven algunas de sus
caractersticas. A veces se suele recubrir el crecimiento con una capa de aceite mineral estril. Con
esto se consigue tambin evitar en la medida de lo posible la desecacin del medio de cultivo, que
podra ser txico para las clulas al aumentar su concentracin. Hay que tener en cuenta que los
microorganismos muy aerobios, como por ejemplo los mohos filamentosos, no se pueden guardar en
tubos completamente cerrados. Por ltimo, otro inconveniente que tiene la transferencia peridica es
que la contaminacin de los cultivos resulta ms fcil al tener que manejar los tubos a lo largo del
tiempo y tambin por la posibilidad de entrada de caros en los mismos.
b).- Conservacin por suspensin en agua destilada o en agua de mar estril.
Es un mtodo alternativo muy utilizado y que da altos porcentajes de viabilidad en diversos tipos de
microorganismos, tanto mohos filamentosos como levaduras y algunas bacterias. Consiste en
suspender en agua estril clulas del cultivo que se quiere conservar. Se pueden preparar en criotubos,
en este caso la concentracin celular no debe ser superior a 10 4-105 clulas /ml en el caso de bacterias
y levaduras. Para los mohos filamentosos que no esporulan, se pueden poner en suspensin trocitos de
agar con el crecimiento del hongo. En el caso de microorganismos marinos, la suspensin se hace en
agua de mar diluida.
C.- Mtodos restringidos.
En este grupo se engloban mtodos no empleados habitualmente, pero a los que es necesario recurrir a
la hora de conservar grupos de microorganismos muy determinados que no resisten bien la liofilizacin
o la congelacin, como por ejemplo los gneros bacterianos Spirillum, Rhodospirillum, etc.
a).- Desecacin en papel de filtro.
Se utiliza un papel bastante absorbente que se impregna con una solucin muy densa de clulas y se
deja secar al aire (en condiciones estriles). Tambin es posible desecarlos por el procedimiento que se
llama desecacin lquida porque se utiliza para ello el liofilizador, pero sin que haya habido congelacin
previa de las clulas. El vaco producido por el liofilizador deseca las clulas, pero hay que evitar que un
vaco excesivo provoque evaporacin brusca con ebullicin o que la temperatura disminuya demasiado,
ocasionando la congelacin incontrolada de las clulas.
b).- Desecacin en suelo, arena, silicagel, etc.
Se aaden las clulas a estos sustratos que las protegern al desecar. Los microorganismos
productores de esporas se pueden conservar durante bastante tiempo por este mtodo, este mtodo es
barato y de fcil conservacin.
c).- Desecacin en bolitas de alginato.
ste es un procedimiento eficaz, las clulas se encuentran en una matriz de alginato y la eliminacin del
agua se hace por tratamiento con soluciones hipertnicas sucesivas y posterior desecacin al aire hasta
que se pierde un 70% de su contenido en agua. Estas bolitas de alginato se pueden conservar en tubos
cerrados hermticamente y a temperaturas de entre 4C y 18C, pudindose guardar incluso a 80C
debido al bajo contenido en agua de las clulas y la proteccin que suministra el soporte de alginato.
Este es un mtodo que se est utilizando para la conservacin de algas y clulas vegetales.
Para demostrar la eficiencia de un mtodo de conservacin en cepas se tiene que determinar el
porcentaje de viabilidad en diferentes periodos, determinar la estabilidad morfolgica y fisiolgica,
bioqumica, la virulencia y la antigenicidad, para garantizar que l cepa es efectiva.
55

3.1. EQUIPO
Incubadora a 35 C Autoclave
Congelador Horno
Refrigerador Balanza digital
3.2. MATERIAL
Cajas de Petri Gasa y algodn para un tapn

Portaobjetos Un tubo eppendorff de dos ml
Pipetas de un ml Una esptula de acero inoxidable
3.3. MEDIOS DE CULTIVO:
Dos tubos de 13 X 100 con TSA inclinado Un matraz con 30 ml de caldo BHI
con tapn de baquelita
Un tubo de 16X150 mm con PDA inclinado
Un tubos con 4 g de arena estril en tubos con tapn de baquelita (Cosecha
de esporas)
Un matraz con 80 ml de ACS
Dos tubos de 13 X 100 con PDA inclinado
Un tubo de 13 X 100 con TSA o agar base con tapn de baquelita
sangre con tapn de algodn
Un tubo de 13 X 100 con PDA con tapn de
Cinco tubos con 9 ml de solucin salina
algodn.
Un matraz con 30 ml de BHI
Un tubo de 13 X 100 mm estril con tapn de
Un matraz con 80 ml de PDA baquelita
3.4. REACTIVOS:
Glicerol al 60 % estril Aceite mineral

Acido tartrico Colorantes para tincin de Gram
Colorantes para tincin de esporas Azul de algodn lactofenol
3.5. CEPAS MICROBIANAS Y MEDIOS SELECTIVOS PARA SU IDENTIFICACIN COLONIAL

Escherichia coli Agar eosina azul de Rhizopus sp Agar de papa y
metileno dextrosa
Bacillus subtilis Agar nutritivo Aspergillus niger Agar de papa y
dextrosa
Micrococcus luteus Agar nutritivo Penicillium sp Agar de papa y
dextrosa
Staphylococcus aureus Agar de sal y manitol Pseudomonas. aeruginosa Agar cetrimida
Saccharomyces cerevisiae Agar cuenta estndar Lactobacillus delbrueckii Medio MRS
56
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL:
Para la conservacin de cepas la distribucin ser la siguiente:
Equipo Cepa a conservar Equipo Cepa a conservar
1,6 Escherichia coli 4,9 Saccharomyces cerevisiae
2,7 Bacillus subtilis 5,10 Aspergillus niger
3,8 Micrococcus luteus 11 y 12 Lactobacillus delbrueckii
PARA BACTERIASY LEVADURAS:

DA 1
1) Realizar una tincin de Gram para verificar la pureza de la cepa, en caso de ser un microorganismo
esporulado, realizar la tincin de esporas.
2) Sembrar un matraz con 30 ml de caldo infusin cerebro y corazn (BHI) estril con dos asadas del
microorganismo que te ha tocado segn el nmero del equipo, incubarlo a 35 C durante toda la noche
en agitacin a 150 rpm.
DA 2
3) A partir del matraz sembrar por estra simple 3 tubos con agar de soya y tripticasena, e incubarlo a
35 C y por 24 horas. Recuerda que se te debe proporcionar 2 tubos con tapn de baquelita y uno con
tapn de algodn.
4) Etiquetar cada uno de los tubos, anotando el nombre de la cepa, fecha de siembra, fecha de
conservacin y fecha en que se determinar la viabilidad.
DA 3 Despus de la incubacin realizar lo siguiente
Tubo No. 1 que tiene el tapn de algodn Se conservar a temperatura ambiente
Tubo No. 2 que tiene el tapn de baquelita Se conservar a temperatura en refrigeracin a 4C
Tubo No. 3 que tiene el tapn de baquelita Se le adicionar aceite mineral y se conservar a
temperatura de refrigeracin de 4 C
Matraz con 30 ml de BHI y la cepa que te La suspensin es para obtener el nmero de clulas / ml
ha tocado
Del matraz realizar lo siguiente:

4) Tomar un ml con pipeta estril del cultivo del matraz y colocarlo en un tubo eppendorff previamente
etiquetado, adicionarle un ml de glicerol al 60 % estril, mezclar y conservarlo en el congelador.
57
Conservacin en congelacin
5) Con la misma pipeta anterior tomar un ml del cultivo del matraz y colocarlo en el tubo que contiene
arena estril previamente etiquetado, homogenizarlo y conservarlo a temperatura ambiente
6) Determinacin del nmero de UFC/ ml (No): Con la misma pipeta tomar un ml de la suspensin
microbiana y realizar diluciones, hasta 10-5 y por la tcnica de vaciado en placa sembrar las dos ltimas
diluciones. Incubar a 35 C durante 24 h y contar para obtener las UFC/ ml, de esa manera sabemos
cuntos hemos conservado en el glicerol y arena.
En la bitcora llevar el registro de la conservacin, con un cuadro como el que se muestra a
continuacin.
Nombre Fecha de Fecha de Fecha de Determinacin Determinacin % de

de la siembra del siembra de conservacin de viabilidad de viabilidad Viabilidad
cepa matraz los tubos (1era. vez) (2da.da vez)
Conservar los tubos por dos meses, y una vez transcurrido este tiempo realizar lo siguiente:
Al tubo 1, 2 y 3 Sembrar el cultivo por estra cruzada o simple y verifica si hay crecimiento del
microorganismo, recordar utilizar el medio adecuado segn el tipo de microorganismos que se ha
conservado y consulta a los dems equipos para llenar el siguiente cuadro.
Cepa a conservar Medio de Conservacin a Conservac Conservacin con

cultivo temperatura in a 4 C aceite mineral y a 4
ambiente C
Escherichia coli EMB
Bacillus subtilis AN
Micrococcus luteus AN
S. aureus ASM
S. cerevisiae ACS
P. aeruginosa
Agar
cetrimida
L. delbrueckii Medio MRS
Al tubo (eppendorff)
1.- Etiquetar 5 tubos con 9 ml de solucin salina
2.- Tomar un ml del tubo eppendorff y realizar las cinco diluciones
3.- Sembrar la dilucin 10 -4 y 10 -5 por duplicado por la tcnica de vaciado en placa
4.- Utilizar ACS para la siembra e incubar las placas e incubar las placas
5.- Realizar el recuento (Nf) para calcular el % de viabilidad
58
Al tubo con arena

2.- Tomar un g de arena y realizar las cinco diluciones
-4
3.- Sembrar la dilucin 10 y 10 -5 por duplicado por la tcnica de vaciado en placa
4.- Utilizar ACS para la siembra e incubar las placas
PARA MOHOS: DA 1
1.- Realizar una preparacin en fresco del moho (Lo correcto para verificar la pureza es un
microcultivo, pero en este momento an no conoces la tcnica).
2.- Sembrar un tubo de 13 X 100 mm con PDA inclinado con tapan de algodn
3.- Sembrar dos tubos de 13 X 100 mm con PDA y tapn de baquelita
4.- Sembrar un tubo de 16 X 150 mm con PDA y tapn de baquelita
5.- Incubar los tubos por 5 das a 28 C
DA 6 Despus de la incubacin realizar lo siguiente
Tubo No. 1 que tiene el tapn de Se conservar a temperatura ambiente
algodn
Tubo No. 2 que tiene el tapn de Se conservar a temperatura en refrigeracin a 4C
baquelita
Tubo No. 3 que tiene el tapn de Se le adicionar aceite mineral y se conservar a temperatura de
baquelita refrigeracin de 4 C
Tubo de 16 X 150 mm con tapn Realizar una suspensin, para ello colocarle aproximadamente 3 ml
de baquelita de solucin salina y con la ayuda del asa resuspender para tener la
cosecha de esporas y poder obtener el No de clulas / ml
Del tubo de 16 X 150 mm que tiene la suspensin de esporas realizar lo siguiente:
1.- Depositar la suspensin en un tubo estril, para facilitar el trabajo
2.- Tomar un ml con pipeta estril del cultivo del matraz y colocarlo en un tubo eppendorff previamente
etiquetado, adicionarle un ml de glicerol al 60 % estril, mezclar y conservarlo en el congelador.
3.- Con la misma pipeta anterior tomar un ml del cultivo del matraz y colocarlo en el tubo que contiene
arena estril previamente etiquetado, homogenizarlo y conservarlo a temperatura ambiente
4.- Determinacin del nmero de UFC/ ml (No): Con la misma pipeta tomar un ml de la suspensin
microbiana y realizar diluciones, hasta 10-5 y por la tcnica de vaciado en placa sembrar las dos ltimas
diluciones. Incubar a 28 C durante 5 das y contar para obtener las UFC/ ml, de esa manera sabemos
cuntos hemos conservado en el glicerol y arena.
En la bitcora llevar el registro de la conservacin, con un cuadro como el que se muestra a
continuacin.
Nombre de Fecha de Fecha de Fecha de Determinacin de Determinacin de % de
la cepa siembra del siembra de los conservacin viabilidad (1era. viabilidad (2da.da Viabilidad
matraz tubos vez) vez)
59
Conservar los tubos por dos meses, y una vez transcurrido este tiempo realizar lo siguiente:
Al tubo 1, 2 y 3 Sembrar el cultivo por punto y verificar si hay crecimiento del microorganismo, utilizar el
agar de papa y dextrosa y consulta a los dems equipos para llenar el siguiente cuadro.
Cepa a conservar Medio de Conservacin a Conservaci Conservacin con aceite
cultivo temperatura ambiente n a 4 C mineral y a 4 C
Rhizopus sp
PDA
Aspergillus niger PDA
Penicillium sp PDA
Al tubo (eppendorff)
2.- Tomar un ml del tubo eppendorff y realizar las cinco diluciones
-4
4.- Utilizar PDA acidificado para la siembra e incubar las placas a28 C
Al tubo con arena
2.- Tomar un gramo de arena y realizar las cinco diluciones
-4
4.- Utilizar PDA acidificado para la siembra e incubar las placas a28 C
Llenar la siguiente tabla: Antes de la conservacin
Mtodo /cepa Temperatura Refrigeracin Refrigeracin + Aceite Congelacin Arena
ambiente Crecimiento + Crecimiento + UFC/ml UFC/g
E. coli
B. subtilis
M. luteus
S. aureus
S. cerevisiae
P. aeruginosa
L. delbrueckii
Rhizopus sp
A. niger
Penicillium sp
+ Solo indicar si hay abundante o no.
60
Despus de la conservacin
Mtodo /cepa Temperatura Refrigeracin Refrigeracin + Congelacin Arena
ambiente Crecimiento Aceite UFC/ml UFC/g
Crecimiento
Escherichia coli
B. subtilis
M. luteus
S. aureus
S. cerevisiae
P. aeruginosa
L. delbrueckii
Rhizopus sp
Aspergillus niger
Penicillium sp
Determinar el % de reduccin bacteriana del microorganismo (RBM)
5.1 Segn el microorganismos que conservaste Cul es el mejor mtodo para consrvalo?
5.1 Investiga otros mtodos de conservacin como la liofilizacin.
5.2 Cual el papel del crioprotector?
5.3 Menciona el periodo mximo de conservacin de cada uno de los mtodos utilizados en la prctica
5.4 investiga la morfologa colonial en la bibliografa del microorganismo que conservaste y el medio que
utilizaste
Discutir las ventajas y desventajas de cada uno de los mtodos de conservacin
7. CONCLUSIONES
Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al anlisis y discusin de stos, a la
bibliografa consultada y a los objetivos de la prctica.
8.1 Brock, T.D.; Smith y M.T. Madigan. Biologa de los Microorganismos. 10. Edicin. Prentice-Hall.
Espaa.
8.2 Prescott, H, Microbiologa, Ed. McGraw-Hill, Interamericana, New York, 2004, 1005 p.
Edicin. Interamericana. Mxico. 140 p.
61
8.4 NOM-181-SSA1-1998, salud ambiental. Agua para uso y consumo humano. Requisitos sanitarios
que deben cumplir las sustancias germicidas para tratamiento de agua, de tipo domstico
62
63
PRCTICA No 7
IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS (bacterias)
No. DE UNIDAD: V: Metabolismo
UNIDAD IV: Identificacin Microbiana
1. OBJETIVOS:
Objetivo general
El alumno identificar bacterias de inters farmacutico, a travs de su metabolismo microbiano.
1.2.1 El alumno realizar pruebas para determinar la actividad enzimtica sobre los carbohidratos y
sales orgnicas como principales fuentes de carbono.
1.2.2 El alumno realizar pruebas de hidrlisis para aminocidos y protenas para demostrar su
actividad enzimtica.
1.2.3 El alumno realizar pruebas para demostrar la actividad enzimtica en los procesos de xido-
reduccin.
2. INTRODUCCIN
El metabolismo es un proceso qumico, mediante el cual los seres vivos transforman una serie de
compuestos qumicos con el fin de obtener energa. Los microorganismos son capaces de efectuar
reacciones bioqumicas para degradar nutrientes cuyos productos finales permiten su identificacin, a
este grupo de reacciones se les denomina pruebas bioqumicas, las cuales se han clasificado segn
su origen:
a) Reacciones de carbohidratos (almidn, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, etctera).
b) Reacciones para sales orgnicas (citrato, malonato, urea).
c) Reacciones para protenas y aminocidos (gelatina, casena, triptfano, lisina, arginina y ornitina).
d) Por el tipo de respiracin que efectan (aerobios estrictos, microaeroflicos, anaerobios facultativos y
anaerobios estrictos).
La identificacin bacteriana preliminar pueden efectuarse observando las caractersticas de las colonias
y la morfologa microscpica, pero la caracterizacin final de un aislamiento bacteriano desconocido en
gnero y especie se logra mediante la deteccin de ciertos sistemas enzimticos exclusivos de cada
especie.
En el laboratorio estos sistemas se detectan inoculando una pequea porcin de la colonia aislada a
una serie de medios de cultivo que contienen substratos especficos, e indicadores qumicos que
detectan los cambios de pH o la presencia de un subproducto.
Para poder realizar una identificacin bacteriana es necesario primero sembrar por estra a los
microorganismos, ya que generalmente se parte de un cultivo mixto, de esta manera se logra aislar y
observar su morfologa colonial. Una vez que se tiene el cultivo puro, se transfiere a un medio de cultivo
en la cual se desarrolle, para poder lograr estos pasos es necesario saber la temperatura ptima de
crecimiento. Cuando se tiene el cultivo puro, se procede a realizar la tincin de Gram para clasificarlo y
saber a qu grupo pertenece G+ G-. Adems en la morfologa microscpica permite conocer la forma
y agrupacin del microorganismo (bacilo, coco, coma, etc.)
64
Recientes avances biotecnolgicos son usados para el anlisis microbiolgicos. Las pruebas de
identificacin bioqumica esta miniaturizada y automatizada hacindose el anlisis ms rpido y
econmico. Los microorganismos patgenos deben ser aislados e identificados debido a que producen
enfermedades a cientos de personas causando daos econmicos. Una vez aislados podemos medir
especficamente los cambios fisicoqumicos resultado del crecimiento o actividad metablica aunque la
formulacin de un producto con protenas, aceites, cidos grasos, conservadores hace que en un
momento dado favorezcan o inhiban el crecimiento microbiano.
Algunos mtodos utilizados para identificar grupos microbianos o microorgansimos (gnero y especie)
son:
Placa Petrifilm, Deteccin de Salmonella por el sistema VIDAS, Sistema API, Coli-complete, Sistema
VITEK, Identificacin por PCR, etc
En nuestro caso identificaremos a los microorganismos por medio de pruebas bioqumicas de manera
tradicional, ya que existen mtodos rpidos que facilitan el trabajo, pero es necesario saber el
fundamento.
PRUEBAS BIOQUMICAS RECOMENDADAS PARA BACTERIAS GRAM NEGATIVAS
Fermentacin de carbohidratos (glc lac, Hidrlisis de la gelatina (licuefaccin de

sac, manitol, dulcitol, salicina, adonitol, la gelatina), en el medio gelatina
sorbitol, raf, ram, xilosa) en el medio base
Crecimiento en caldo nutritivo
CRF.
Utilizacin de la esculina, medio de bilis
Fermentacin de la glucosa, produccin
y esculina
de cido sulfhdrico, produccin de gas,
en el medio TSI Utilizacin del gluconato (oxidacin),
medio caldo gluconato peptona
Descarboxilacin de la lisina, en el
medio LIA Requerimientos de oxgeno, condiciones
aerobias y anaerobias
Movilidad, descarboxilacin de la ornitina
y la produccin de indo, en el medio MIO Produccin de Catalasa y oxidasa
Movilidad, produccin H2S, produccin de Reduccin de nitratos, en caldo nitrato.
indol, en el medio SIM Deteccin del metabolismo oxidativo
Prueba cuantitativa para la produccin /Fermentativo, en el medio OF con
de cidos. Prueba de Rojo de metilo, sacarosa
medio RM/VP Utilizacin del citrato, en citrato de Sodio
Produccin de ureasa, en caldo urea Utilizacin de Malonato, en malonato
Produccin de acetil metil carbinol.
PRUEBAS BIOQUMICAS RECOMENDADAS PARA BACTERIAS GRAM POSITIVAS
Fermentacin de carbohidratos (glc, lac, sac, Crecimiento en bilis al 40 %

manitol, dulcitol, salicina, adonitol, sorbitol,
Coagulasa
raf, ram, xilosa, etc.)
Hidrlisis de gelatina (licuefaccin de la
Fermentacin de la glucosa, produccin de
gelatina), en el medio gelatina
cido sulfhdrico, produccin de gas, medio
65
de TSI Hidrlisis de la esculina, en caldo esculina

Descarboxilacin de la lisina, medio de LIA Produccin de acetil metil carbinol, prueba
Voges Proskauer, medio VP/RM
Movilidad, descarboxilacin de la ornitina y
la produccin de indol, medio de MIO Produccin de la fosfatasa, medio PDP
Movilidad, produccin de indol y produccin Prueba de la DNAsa, en el medio agar ADN

de cido sulfhdrico, medio SIM Crecimiento a 10 y 45 C
Produccin Catalasa y oxidasa Reduccin con azul de metileno en leche
Reduccin de nitratos Hidrlisis en caldo hipurato de sodio
Produccin de hemlisis, en agar sangre Formacin de cpsula
Crecimiento en NaCl al 5, 10 y 15 % Hidrlisis de almidn,
Sensibilidad a optoquina y bacitracina
Debemos mencionar que para la identificacin de un microorganismo es necesario consultar la literatura

para hacer una seleccin de pruebas recomendable y logras su identificacin lo ms rpido posible y sin
prdida de tiempo y de pruebas, las pruebas antes mencionadas son algunas de las cuales podemos
realizar en un momento dado y a continuacin se describirn algunas de ellas.
FUNDAMENTO DE ALGUNAS PRUEBAS BIOQUIMICAS
1 PRUEBA DE HIDRLISIS DEL ALMIDN
Determinar la capacidad de un microorganismo para secretar la enzima amilasa para la degradacin de
almidn en molculas ms pequeas para ser utilizadas en su metabolismo.
2 PRUEBAS DE FERMENTACIN DE CARBOHIDRATOS EN TUBOS CON CALDO ROJO DE FENOL
Determinar la capacidad de un organismo de fermentar un carbohidrato incorporado a un medio,

produciendo cido y/o gas en una campana de Durham; el medio es lquido y como indicador contiene
rojo de fenol.
3 PRUEBAS EN AGAR TRIPLE AZCAR Y HIERRO (MedioTSI)
Deteccin de fermentadores de glucosa y lactosa en agar de hierro de Kligler (KIA) o agar triple azcar
hierro (TSI). Este medio sirve para determinar la fermentacin de glucosa, sacarosa y lactosa adems
de la produccin de gas a partir de glucosa y la produccin de cido sulfhdrico que precipita como
sulfuro frrico al reaccionar con el hierro, la liberacin del cido sulfhdrico se libera por accin
enzimtica, de los aminocidos que contienen azufre produciendo una reaccin visible de color negro.
La frmula del TSI y del KIA son idnticas, salvo que el TSI contiene 10 g/l de sacarosa adems de
glucosa y lactosa (triple azcar), el agar est preparado en pico de flauta, de tal manera que se tienen 2
cmaras de reaccin dentro del mismo tubo. La porcin inclinada, pico de flauta expuesta en toda su
superficie al oxgeno, es aerbica y la parte inferior llamado fondo est protegida del aire y es
relativamente anaerobia. Al preparar el medio es importante que el medio solidifique en forma de pico
de flauta y el fondo, adems que estos tengan la misma longitud de aproximadamente 3 cm cada uno, a
fin de conservar este efecto de las dos cmaras. La tcnica de inoculacin es por picadura y por estra
en el pico de flauta, para esto hay que utilizar el asa recta, primero se introduce en la parte profunda y
66
luego se estra el pico de flauta con un movimiento hacia uno y otro lado, el indicador de pH: rojo de
fenol y un pH cido da una coloracin amarilla y en un pH alcalino es rojo.
4. PRUEBA DE ROJO DE METILO
El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6-8 amarillo) y 4,4 (rojo), esta prueba es
cuantitativa para la produccin de cido y requiere de organismos positivos que produzcan cidos
lctico, actico, o frmico a partir de la glucosa, por la va de la fermentacin mixta. Dado que existen
muchos microorganismos que producen cidos, slo se consideran rojo de metilo positivo aquellos
organismos que puedan mantener este pH bajo un largo tiempo de incubacin (48-72 h),
contrarrestando el sistema estabilizador de pH del medio.
Controles
Prueba Control negativo Control positivo

Rojo de metilo Escherichia coli Enterobacter aerogenes
5. PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER
La reaccin de Voges Proskauer se basa en la conversin del acetilmetilcarbinol (acetona) en
diacetilo por accin del KOH al 40 % y el O 2 atmosfrico, la acetona se convierte en diacetilo el -naftol
acta como catalizador para revelar un complejo de color rojo, el indicador de pH es el Rojo de metilo.
Controles

Voges - Proskauer Escherichia coli Klebsiella sp
UTILIZACIN DE SALES ORGNICAS
6. PRUEBA DE CITRATO
Algunos microorganismos pueden suministrar energa en ausencia de la fermentacin o produccin de
cido lctico empleando como nica fuente de carbono al citrato. El metabolismo del citrato comprende
una condensacin de acetilo con la coenzima A y oxaloacetato para entrar en el ciclo de Krebs. Los
productos obtenidos del metabolismo del citrato dependen del pH del medio si es alcalino se produce
ms acetato y formato con una disminucin del lactato y CO 2. Por encima del pH de 7 no hay
produccin de lactato y los productos son CO 2 cido frmico y cido actico.
Con un pH cido el acetil metilcarbinol y el lactato son los principales productos de la utilizacin del
citrato. El medio utilizado para la fermentacin del citrato contiene tambin sales de amonio inorgnicas,
un organismo que es capaz de utilizar citrato como su nica fuente de carbono utiliza tambin las sales
de amonio como su nica fuente de nitrgeno. Cualquier medio empleado para detectar la utilizacin de
citrato por parte de las bacterias en estudio debe estar desprovisto de protenas e hidratos de carbono
como fuente de carbono.
Controles

Citrato de sodio Escherichia coli. Enterobacter aerogenes
67
7. PRUEBA DE MALONATO
Determinar la capacidad de un organismo de utilizar malonato de sodio como nica fuente de carbono,
con la consiguiente alcalinidad.
El malonato es un inhibidor enzimtico ya que interfiere en la oxidacin del cido succnico en cido
fumrico, inhibiendo la accin cataltica de la enzima succinato deshidrogenasa, mediante un proceso
de inhibicin competitiva. El cido malonico (malonato) se une a la enzima bloqueando los sitios activos
de manera que la enzima no puede combinarse con su sustrato normal, el cido succnico. Esto
ocasiona un bloqueo en la oxidacin del cido succnico.
Segn la concentracin del malonato, el inhibidor puede retardar simplemente la velocidad de la
oxidacin del cido succnico o provocar su completa inhibicin. En el ciclo de Krebs, cada compuesto
cido es influido independientemente por enzimas especficas; se consume una molcula y se forma
otra en un proceso por etapas. Si se ha suprimido la formacin de un cido, y no es reemplazado, como
el cido fumrico, el ciclo se Krebs deja de funcionar, por lo tanto la clula bacteriana, recurre al ciclo
del cido glioxlico para la produccin de intermediarios, para ulterior biosntesis en el metab olismo.
Indicador de pH: Azul de bromotimol
Controles

Caldo malonato Salmonella Alcaligenes faecalis
8. PRUEBA DE UREASA
La urea es una diamida del cido carbnico y esta es fcilmente hidrolizada con la liberacin de
amonaco y dixido de carbono. La enzima ureasa que posee un microorganismo pueden hidrolizar a la
urea que est presente en el medio de cultivo de acuerdo con la siguiente reaccin: El amonaco
reaccionan en solucin para formar carbonato de amonio, producindose una alcalinizacin y un
aumento del pH del medio, el indicador de pH es el rojo de fenol.
Controles
Prueba Control positivo dbil Control positivo rpido Control negativo

Ureasa Klebsiella sp Proteus sp Escherichia coli
HIDRLISIS DE PROTENAS Y AMINOCIDOS:
9.- PRUEBA DE LICUEFACCIN DE LA GELATINA (MTODO DEL TUBO)

Determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas proteolticas que, a su vez son
detectadas por la digestin o licuefaccin de la gelatina presente. Las protenas que se producen son
demasiado grandes para entrar en la clula por lo tanto para ser metabolizadas deben ser hidrolizadas
a componentes ms pequeos, las enzimas extracelulares de tipo proteoltico son secretadas por
ciertas bacterias para desdoblar a las protenas y esta capacidad ayuda a la identificacin bacteriana. El
68
catabolismo de las protenas por las proteasas se da en dos etapas la primera origina polipptido y
posteriormente estos se desdoblan en aminocidos individuales.
Controles

Gelatina Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus
10. PRUEBAS EN MEDIO SIM. (MOVILIDAD, PRODUCCIN DE H 2S E INDOL).
El indol producido por las triptofanasas se combina con el aldehido del reactivo de Kovacs o de Erlich,
para originar un compuesto de color rojo. Las cepas mviles pueden apreciarse en este medio, por la
turbidez que producen alrededor de la puncin de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de
sulfhdrico se distinguen por la formacin de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del
tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.
11. MEDIO MIO (MOVILIDAD, INDOL Y ORNITINA).
La prueba de la descarboxilacin de la ornitina nos sirve para determinar la capacidad enzimtica de un
microorganismo de descarboxilarla para formar una amina, con la siguiente alcalinidad del medio. La
descarboxilacin es un proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas
especficas son capaces de atacar a los grupos carboxilo del aminocido dando una amina o una
diamina y anhdrido carbnico, la enzima que efecta esta reaccin se llama ornitina descarboxilasa, la
cual es una enzima inducida que es formada por el organismo cuando son cultivadas en un medio cido
en presencia del sustrato y los productos de la descarboxilacin provocan un cambio de pH hacia la
alcalinidad. Adems la descomposicin del aminocido se produce anaerobicamente y el proceso es
irreversible, no oxidativo y requiere de una coenzima comn, el fosfato de piridoxal.
El aminocido L-ornitina es descarboxilado por la enzima ornitina descarboxilasa para dar la diamina
putrescina y anhdrido carbnico. En ocasiones podemos producir condiciones de anaerobiosis si
recubrimos la superficie del medio con aceite mineral. La prueba de movilidad nos sirve para determinar
si un microorganismo es mvil por la presencia de flagelos o inmvil. La prueba de indol nos sirve para
determinar si un organismo es capaz de producir indol a partir de de la oxidacin del aminocido
triptfano. Este aminocido puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos
indlicos principales: indol, escatol e indolactico. El proceso es efectuado por varias enzimas que en
conjunto se denomina triptofanasa y el indicador de pH es el prpura de bromocresol.
Control
Sustancia Control positivo Control negativo

Indol Escherichia coli Klebsiella pneumoniae
Movilidad Enterobacter sp Klebsiella sp
Descarboxilacin de la ornitina Enterobacter cloacae Klebsiella sp
12. DESAMINACIN Y DESCARBOXILACIN DE AMINOCIDOS EN MEDIO LIA. (LYSINE IRON AGAR)
En este medio se determina la descarboxilacin de la lisina que se lleva a cabo en anaerobiosis y la

desaminacin de la lisina que se lleva a cabo en aerobiosis.
69
La prueba de la descarboxilacin de la lisina nos sirve para determinar la capacidad enzimtica de un

microorganismo de descarboxilarla para formar una amina, con la siguiente alcalinidad del medio. La
descarboxilacin es un proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas
especficas son capaces de atacar a los grupos carboxilo del aminocido dando una amina o una
diamina y anhdrido carbnico, la enzima que efecta esta reaccin se llama lisina descarboxilasa, la
cual es una enzima inducida que es formada por el organismo cuando son cultivadas en un medio cido
en presencia del sustrato y los productos de la descarboxilacin provocan un cambio de pH hacia la
alcalinidad. Adems la descomposicin del aminocido se produce anaerbicamente y el proceso es
irreversible, no oxidativo y requiere de una coenzima comn, el fosfato de piridoxal.
El aminocido L-lisina es descarboxilado por la enzima lisina descarboxilasa para dar la diamina
cadaverina y anhdrido carbnico. En ocasiones podemos producir condiciones de anaerobiosis si
recubrimos la superficie del medio con parafina o vaselina. Al Preparar el medio es importante que se
deje solidificar en pico de flauta y el fondo, que estos tengan la misma longitud de aproximadamente 3
cm. cada uno, a fin de conservar este efecto de las dos cmaras, el inicador de pH es el prpura de
bromocresol.
Controles:
Aminocido Control positivo Control negativo

Descarboxilacin de la Lisina Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae
Desaminacin de la Lisina Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes
DETERMINACIN DEL METABOLISMO OXIDATIVO Y/O FERMENTATIVO
13. REDUCCIN DE NITRATOS A NITRITOS
La capacidad de un organismo para reducir nitratos a nitritos es una caracterstica importante utilizada
para la identificacin y diferenciacin de muchas especies, todas las enterobacterias, excepto ciertos
biotipos de Enterobacter agglomerans reducen los nitratos.
Los organismos que reducen nitratos tienen la capacidad de obtener oxgeno de los nitratos para formar
nitritos y otros productos de reduccin. La presencia de nitritos en el medio se detecta aadiendo -
naftilamina y cido sulfanlico, con la formacin de un color rojo de diazonio, p sulfobenceno azo -
- naftilamina. El color en caso de ser positiva aparecer a los 30 s de aadir los reactivos y dado que los
reactivos solo detectan nitritos, este ltimo proceso llevara a una lectura falsa negativa, por lo tanto es
necesario aadir una pequea cantidad de polvo de Zn a los tubos que sean negativos. Los iones Zn
reducen los nitratos a nitritos, y el desarrollo de un color rojo tras agregar el polvo de Zn indica la
presencia de nitratos residuales y confirma la reaccin negativa verdadera.
Controles:
Prueba Control positivo Control negativo

Reduccin de nitratos Escherichia coli Acinetobacter calcoaceticus
70
14. DETERMINACIN DEL METABOLISMO OXIDATIVO Y/O FERMENTATIVO DE LA GLUCOSA EN MEDIO

DE HUGH Y LEIFSON
Los microorganismos sacarolticos degradan glucosa por va fermentativa u oxidativa, los subproductos
de la fermentacin son cidos mixtos relativamente fuertes, que pueden detectar en un medio de
fermentacin convencional. En cambio, los cidos formados por degradacin oxidativa la glucosa son
sumamente dbiles y para su deteccin se requiere de un medio de oxido fermentacin ms sensible,
como el medio OF.
Este medio difiere de otros medios de fermentacin de carbohidratos en lo siguiente:
a.- La concentracin de protena (peptonas) ha disminuido del 1,5 al 0,2 %.
b.- La concentracin de hidratos de carbono est aumentada del 0,5 % al 1 %.
c.- La concentracin de agar est disminuida de 1,5 a 0,25, con lo cual su consistencia es semislida.
La menor relacin protena a carbohidrato reduce la formacin de aminas alcalinas que pueden
neutralizar las pequeas cantidades de cidos dbiles derivados del metabolismo oxidativo. La
concentracin relativamente mayor de carbohidratos sirve para aumentar potencialmente la produccin
de cido. La consistencia semislida del agar permite que los cidos formados en la superficie se
difundan por todo el medio, facilitando la visualizacin del viraje del indicador de pH. Este medio es
tambin apto para determinar la movilidad de un microorganismo.
La prueba OF presenta limitaciones, ya que los bacilos fermentadores de desarrollo ms lento pueden
no producir cambios de color durante varios das, y las especies que son esencialmente proteolticas
pueden con el tiempo producir reversiones de las reacciones dbiles, confundiendo as la interpretacin
final. Para realizar esta prueba se necesitan dos tubos con 5 ml del medio en posicin vertical, se
inocula por picadura con la suspensin microbiana a estudiar, el asa debe ser introducida hasta 0,5 cm
desde el fondo del tubo Cubrir un tubo con 1 ml de aceite mineral estril o parafina fundida, dejando el
otro tubo abierto al aire, es decir sin aceite o parafina. Incubar ambos tubos a 35 C durante 48 h o
ms, el indicador de pH: Prpura de bromocresol.
Interpretacin.
Tipo de metabolismo Tubo abierto Tubo cubierto
Oxidativo cido amarillo Alcalino verde
Fermentativo cido amarillo cido amarillo
No sacaroltico Alcalino - verde Alcalino verde
Controles
Prueba Fermentador de la glucosa Oxidador de la glucosa No sacaroltico

OF Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Moraxella sp
15. PRUEBA DEL CIANURO DE POTASIO
Determinar la capacidad e un organismo de vivir y reproducirse en un medio que contenga KCN.
La respiracin es el conjunto de reacciones qumicas en las que se libera energa. La transformacin de
la energa puede ser aerobia o anaerobia. La respiracin aerbica es un proceso biolgico de oxidacin
reduccin que produce energa y por medio del cual un sustrato orgnico es oxidado, el mismo
71
trasfiere electrones e iones hidrgeno por medio del sistema de transporte de electrones, al aceptor final
de electrones, el oxgeno molecular. El proceso produce agua o perxido de hidrgeno, segn la
especie bacteriana y su sistema enzimtico. El cianuro de potasio es un inhibidor de la citocromo
oxidasa a nivel del complejo IV de la cadena respiratoria, compite con el O 2 y acta como aceptor final
de electrones, bloqueando la respiracin.
Controles

KCN Klebsiella Escherichia coli
16. PRUEBA DEL CITOCROMO OXIDASA
Los citocromos son hemoprotenas que contienen fierro y actan como el ltimo eslabn de la cadena
respiratoria, transfiriendo electrones (hidrgeno) al oxgeno, con formacin de agua. El sistema
citocromo oxidasa se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios facultativos, de modo que la
prueba de oxidasa es importante para identificar a aquellos organismos que carecen de la enzima o son
anaerobios obligados. La prueba es muy til para el conocimiento de las colonias sospechosas de ser
enterobacterias (todas negativas) y para la identificacin de colonias que se presume sean especies de
Pseudomonas o Neisseria (positivas).
**Esta prueba utiliza el reactivo diclororhidrato de p-fenilendiamina, que acta como aceptor final de
electrones, sustituyendo al oxgeno, la p-fenilendiamina es incolora en estado reducido, pero en
presencia de citocromo oxidasa y oxgeno atmosfrico se oxida formando azul de indofenol.
La prueba se lleva a cabo por 3 mtodos que son:
1.- La tcnica directa en placas, en la cual se aaden directamente 2 a 3 gotas de reactivo a las
colonias aisladas que se han desarrollado en la placa.
2.- La tcnica indirecta en tiras de papel filtro, en la que se aaden unas gotas del reactivo y,
3.- Tiras comerciales impregnados del reactivo y secos.
En la zona de papel donde se halla el reactivo se extiende un asa de la colonia sospechosa. Se
recomienda no emplear alambres de acero inoxidable, dado que los productos de la oxidacin de la
superficie formados al esterilizarse a la llama pueden producir reacciones falsas positivas.
Controles:

Citocromo oxidasa Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli
17.- PRODUCCIN DE CATALASA
Determinar la presencia de la enzima catalasa, que se encuentra en la mayora de las bacterias
aerobias y anaerobias facultativas que contiene citocromo. La catalasa es una enzima que se
descompone en perxido de hidrgeno en oxgeno y agua, qumicamente la catalasa es una
hemoprotena de estructura similar a la de la hemoglobina. El perxido de hidrgeno se forma como uno
de los productos finales del metabolismo oxidativo aerbico de los hidratos de carbono. Si se deja
72
acumular el perxido de hidrgeno es letal para la clula bacteriana. La catalasa transforma al perxido
de hidrgeno en agua y oxgeno en agua.
Controles

Catalasa Staphylococcus aureus Streptococcus sp
18 PRUEBA DE LA COAGULASA (SOLO PARA COCOS GRAM POSITIVOS)
Probar la capacidad de un microorganismo de coagular el plasma por la accin de la enzima coagulasa.
Un resultado positivo constituye por lo comn el criterio de diagnstico de para la identificacin de S.
aureus y con frecuencia se utiliza para indicar la virulencia de la cepa. La estafilocoagulasa, producida
por S. aureus es relativamente estable al calor y resistente hasta 60 C / 30 min. Esta enzima es una
protena que es excretada al medio extracelular y se inactiva fcilmente por las enzimas proteolticas.
19 HEMLISIS EN AGAR SANGRE (SOLO PARA COCOS GRAM POSITIVOS)
La infusin de msculo de corazn y la peptona, otorgan al medio un alto valor nutritivo, pues son la
fuente de carbono, nitrgeno, vitaminas y factores de crecimiento que permite el desarrollo de una gran
variedad de microorganismos exigentes. El agregado de sangre al medio de cultivo, en concentracin
final de 5-10 %, aporta nutrientes para el crecimiento bacteriano, y permite detectar hemlisis. El medio
est libre de azucares reductores, ya que estos influiran de forma adversa en reacciones hemolticas.
El tipo de hemlisis en agar sangre sirve para clasificar al gnero Streptococcus, la hemlisis est
asociada con una completa lisis de la clula alrededor de la colonia, la hemlisis se asocia con una
hidrlisis parcial y se manifiesta por una coloracin verde.
20.- CRECIMIENTO EN NaCl AL 7.5 %
Existen microorganismos que presentan crecimiento a diferentes concentracin de sales y se les
denomina halfilos, aunque existen otros que son denominados extremfilos ya que viven en
condiciones extremas y su hbitat natural son los lugares a salinos. En condiciones normales, la sal
hace que la clula se deshidrate debido a la smosis, cosa que no ocurre en los halofilicos debido a
diversas adaptaciones fisiolgicas que le permiten retener el agua para su metabolismo.

3.1. EQUIPO
Incubadora a 35 C Autoclave
Microscopio Horno
3.2. MATERIAL
Portaobjetos Asas bacteriolgicas

Pipetas Pasteur Colorantes para tincin de esporas
Gradilla metlica Colorantes para tincin de Gram

3.3. MEDIOS DE CULTIVO:
73
Pruebas de cada uno para Gram positivos Pruebas de cada uno para Gram negativos
Tincin de esporas Hidrlisis de almidn.
Hidrlisis de almidn Crecimiento en MacConkey.
Hemlisis en agar sangre Prueba de TSI.
Resistencia a polimixina de 300 Prueba de LIA
Prueba de TSI Prueba de citrato.
Prueba de SIM Prueba de MIO
Prueba de MIO Prueba de SIM.
Licuefaccin de la gelatina a 22 C Licuefaccin de la gelatina
Utilizacin del citrato Prueba de oxidacin-
Prueba de oxidacin fermentacin fermentacin.
Prueba de Voges Proskauer Prueba de ureasa.
Prueba de ureasa Prueba de reduccin de nitratos.
Fermentacin de glucosa Fermentacin de glucosa.
Fermentacin de manitol Fermentacin de lactosa.
Fermentacin de arabinosa Fermentacin de sacarosa
Fermentacin de Xilosa Fermentacin de manitol.
Fermentacin de lactosa Fermentacin Xilosa.
Crecimiento en NaCl al 6.5 % Rojo de metilo.
Prueba de reduccin de nitratos Prueba de Vogues Proakauer
Prueba de catalasa Crecimiento en caldo KCN.
Prueba de oxidasa Prueba de malonato.
Prueba de coagulasa Prueba de catalasa y catalasa
3.4. REACTIVOS:
Solucin de rojo de metilo Aceite mineral
Solucin de alfa-naftol Solucin de peroxido de hidrogeno al 1 %
Solucin de KOH N,N,N,N-tetrametil-p-
Reactivo de Kovac o Erlich fenilendiamina
Solucin de cido sulfanlico Reactivos para tincin de Gram
Solucin de alfa naftilamina Reactivos para tincin de esporas
Plasma de conejo Oxidasa
Tween 80 estril Catalasa
Plasma de conejo Jeringas de 10 ml
3.5. BACTERIAS:
Escherichia coli Micrococcus luteus
Salmonella typhi Staphylococcus aureus
Proteus mirabilis Lactobacillus acidophilus
Pseudomonas aeruginosa Bacillus subtilis
Shigella sp Corynebacterium glutamicum
74
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL:
A. Preparacin del inoculo
a) Tomar un inoculo del cultivo para realizar una tincin de Gram y esporas si fuera necesario, anotar la
morfologa microscpica y determinar si esta puro, si es as continuar con la identificacin, si no lo est
es necesario re-aislar.
b) En un tubo de ensaye que contenga 5 ml de solucin salina estril, colocar una asada del cultivo y
homogenizar perfectamente para obtener una suspensin microbiana.
c) Dependiendo el Gram, solicitar las pruebas bioqumicas indicadas para Gram (+) o Gram (-)
d) Ordenar los tubos por la forma de inoculacin y sembrar primero aquellos que no tienen inhibidores
Estra simple ( Citrato, placa con agar almidn, agar sangre)
Picadura y estra (TSI, LIA)
Picadura ( SIM, MIO, gelatina, OF )
Caldos (Fermentacin de carbohidratos, RM, VP, NaCl, Urea, CM, reduccin de NO 3 ,KCN..)
e) De la suspensin microbiana sembrar los tubos y en el caso de los caldos se puede hacer con el asa
o con una pipeta Pasteur colocar 2 gotas de la suspensin para que se estandarice un poco la cantidad
de inoculo.
f) Colocar una batera de bioqumicas como testigo
g) Incubar los tubos 24 horas y leer
h) La placa con agar almidn y agar sangre dividirla en cuatro partes, cada cuadrante corresponde para
un alumno y el cuarto cuadrante queda como testigo.
75
B LECTURA DE PRUEBAS
LECTURA DE LAS PRUEBAS BIOQUMICAS
PRUEBA RESULTADO
FERMENTACIN DE AZCARES
Agregar lugol sobre la estra
Hidrlisis de + Positiva: Si se forma un halo claro alrededor de la estra.
almidn
- Negativa: No se forma un halo claro alrededor de la estra.
+Positiva: El medio se torna amarillo con la produccin de gas, la
Fermentacin de campana est llena de gas
manitol - Negativa: El color del medio es rosa-rojizo.
+ Positiva: el medio se torna amarillo con la produccin de gas, la
Fermentacin de campana est llena de gas
lactosa - Negativa: El color del medio es rosa-rojizo.
Glucosa positiva: Fondo del tubo amarillo.
Fermentacin de Sacarosa y lactosa positiva: Superficie amarilla
TSI Fermentacin
de glucosa, lactosa Lactosa positiva: Color amarillo en el pico de flauta, Produccin
de H2S positivo: Coloracin negra en el medio.
y sacarosa con
produccin de H2S Produccin de CO2 y H2: Burbujas, ligera muesca sobre el costado
del tubo desplazamiento del medio.
Glucosa, sacarosa y lactosa ( - ) el medio se torna rojizo.
Produccin de H2S ( - ): sin coloracin.
Produccin de CO2 y H2 ( - ): no hay burbujas.
Prueba de rojo de Agregar 2 gotas de rojo de metilo
metilo + Positiva: Color rojo en la superficie del medio de cultivo
(Produccin de acetil-metil-carbinol).
-Negativa: No hay cambio en el color
agregar 6 gotas de naftol y 2 gotas de KOH
Prueba de Voges- +Positiva: El cultivo cambia a color rojo, en todo el tubo.
Proskauer
- Negativa: El cultivo no cambia de color
76

PRUEBA RESULTADO
UTILIZACIN DE SALES INORGNICAS

Utilizacin de citrato + Positivo: Desarrollo abundante, cambio de color verde a azul
de sodio
- Negativa: No hay desarrollo ni cambio de color.
Utilizacin de Positivo: Desarrollo abundante con o sin alcalinizacin (color azul).
malonato de sodio
Negativa: No hay desarrollo (medio de
Hidrlisis de urea + Positiva: Color rosa fucsia en el medio.
Produccin de
- Negativa: Sin cambio de color en el medio
ureasa
HIDRLISIS DE PROTENAS Y AMINOCIDOS
Licuefaccin de la Para leer la prueba los tubos se colocan en el cuarto fro durante cinco
gelatina minutos.
+ Positivo: licuefaccin de la gelatina.
- Negativo: Si no hay licuefaccin de la gelatina volver a incubar,
descartar la prueba negativa hasta los 14 das.
MIO (movilidad, indol Movilidad: Crecimiento alrededor de la picadura.
y ornitina)
Descarboxilacin de la ornitina:
+ Positiva: Color prpura del medio.
- Negativa: Color amarillo del medio.
Despus de leer las dos pruebas se agregan 3 gotas de reactivo de
kovacs y se observa:
- Indol + Positivo: Se forma un anillo de color rosa o rojo.
- Negativo: No se forma el anillo.
SIM (produccin de Produccin de H2S: Presencia de un precipitado color negro
H2S, indol y alrededor de la picadura o en todo el tubo
movilidad)
Produccin de Indol: Presencia de un anillo de color rojo en la
superficie al adicionarle el reactivo de Kovacs.
Movilidad: Turbidez alrededor de la picadura.
Nota: Cuando el microorganismo es mvil y productor de cido
sulfhdrico el medio se torna completamente negro.
LIA (Desaminacin y Desaminacin de aminocidos:
descarboxilacin de
+ Positiva: La superficie del tubo es de color rojo vino.
aminocidos)
- Negativa: La superficie no tiene cambios.
Descarboxilacin de aminocidos
+ Positiva: El fondo del tubo es de color prpura.
- Negativa: El fondo del tubo es de color amarillo.
77

PRUEBA RESULTADO
METABOLISMO OXIDATIVO FERMENTATIVO

Reduccin de Agregar 3 gotas de naftilamina y 3 gotas de cido sulfanlico.
nitratos a nitritos
+ Positiva: Aparicin de un color rojo en 30 segundos
- Negativa: Sin cambio de color.
Prueba del cianuro + Positivo: Presencia de crecimiento (turbidez)
de potasio
- Negativo: Ausencia de crecimiento (medio claro)
Prueba de citocromo Tomar una asada del cultivo TSI y colocarla en un pedazo de papel
oxidasa filtro impregnada con el reactivo (N.N.N.N-tetrametil-p-fenilendiamina).
+ Positiva: aparicin de un color azul violeta.
- Negativa: No hay cambio de color.
Determinacin de TUBO SIN SELLO DE ACEITE
metabolismo
Oxidativo: + positivo cidoamarillo, - negativo verde, sin cambios
oxidativo y/o
fermentativo de la Fermentativo: + positivo cidoamarillo, - negativo verde, sin
glucosa (OF) cambios
Sacarolitico: + positivo cidoamarillo, - negativo verde, sin
cambios.
TUBO CON SELLO DE ACEITE
Oxidativo: + positivo cidoamarillo, - negativo verde, sin cambios
Fermentativo: + positivo acidoamarillo, - negativo verde, sin
cambios
Sacarolitico: + positivo acidoamarillo, - negativo verde, sin
cambios.
Prueba de la Tomar una asada del cultivo TSI y colocarla en un portaobjetos que
catalasa contiene 2 gotas de perxido de hidrogeno y observar.
+ Positiva: Presencia de burbujas de oxgeno.
- Negativa: Ausencia de burbujas de oxgeno.
78

PRUEBA RESULTADO
Prueba de la a) -Sembrar una colonia del Staphylococcus sp en un tubo

coagulasa (Solo con 0.5 ml de caldo infusin cerebro-corazn. Incubar a 35C
para cocos Gram durante 24 h.
positivos)
b) Inocular en la misma forma cepas conocidas de S. aureus
y S. epidermidis como testigos positivo y negativo.
c) -En un tubo de ensaye colocar 0,2 ml del cultivo anterior,
0.2 ml de plasma de conejo diluido volumen a volumen con
solucin salina estril.
d) -Incubar en bao de agua de 35 a 37C y observar
durante 6 h a intervalos de 1 h; si no hay formacin de
cogulo, observar a las 24 h. Considerar positiva la prueba si
hay formacin de cogulo.
e) Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo
se aade una gota de cloruro de calcio al 5% a 0,5 ml de
plasma reconstituido empleado, formndose un cogulo en 10-
15 s.
f) En caso de utilizar plasma de humano citratado o
heparina.
Positiva: Coagulacin del plasma.
Negativa: El plasma esta lquido.
Hemlisis en a) -En una placa con agar sangre estriar con la cepa
agar sangre (solo presuntiva de Streptococcus sp, al final de la estra enterrar el
para cocos Gram asa en el medio, para crear un ambiente de microaerofilia.
positivos)
b) Incubar durante 24 horas a 35 C y determinar el tipo de
hemlisis que presenta.
Positiva: Hemlisis transparente alrededor de la colonia.
Positiva: Hemlisis color verde tenue alrededor de la colonia.
Negativa: Sin cambio de color en el medio.
Crecimiento en Incubar el tubo a 35 C durante 24 h, despus de este tiempo
NaCl AL 7.5 % registrar la turbidez.
Positiva: Turbidez del medio.
Negativa: Sin cambio de color en el medio.
79
Llenar los siguientes cuadros y con la ayuda de la bibliografa y a la informacin obtenida durante el
desarrollo de la prctica menciona el gnero y si es posible la especie del microorganismo.
Nombre del microorganismo: ______________________________________________________
5.1. Explicar el significado de la presencia o ausencia de un halo claro, al agregar el lugol, en las
pruebas de hidrlisis del almidn.
5.2. Explicar por qu en las pruebas de fermentacin de azcares en tubos con campana de Durham se
emplea un indicador de pH, cual es el indicador y cul es su intervalo de sensibilidad.
5.3. Qu otros azcares se pueden utilizar para la fermentacin de azcares?
5.4. Cul es el indicador de pH que se emplea en las pruebas de utilizacin de sales orgnicas y cul
es su intervalo de sensibilidad?
5.5. Explicar cul es la utilidad de detectar la capacidad de hidrlisis de protenas que tienen ciertos
microorganismos. De qu manera se detectan estas enzimas proteolticas de los microorganismos?
Discutir la importancia de la morfologa microscpica y colonial, el aislamiento de los microorganismos,
la adecuada seleccin de pruebas bioqumicas a realizar y el uso de las claves para la identificacin de
los microorganismos.
7. CONCLUSIONES
7.1. Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al anlisis y discusin de stos, a la
7.2. Concluir el gnero del microorganismo analizado de acuerdo a las pruebas bioqumicas.
8.1 Koneman, E.W. y S.D. Allen, W. R. Bocuell. Diagnstico Microbiolgico. 5 edicin Mdica
Panamericana. 2001. Mxico. 1432 p.
8.2 Mac Faddin. Pruebas Bioqumicas, Identificacin de Bacterias de Importancia Clnica. 3 Edicin.
Mdica panamericana. Buenos Aires. 850 p.
80
Tablas de Cowan para la identificacin de microorganismos
Tabla No. 1 Primera etapa para la identificacin de bacterias Gram positivas.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Forma S S S S S S S R R R R R R R R R R R R R R
Acido resistencia - - - - - - - - - - - - - - - - - - - w +
Esporas - - - - - - - - - - - - - - - - + + - - -
Movilidad - - - - + - - + - - + - - - - - D D - - -
Crecimiento aerobio + + + + + + - + + + + + + - - - - + + + +
Crecimiento anaerobio - + w w + + + - + + + + - + + + + D - - x
Catalasa + + w - - - - + + + + - + + - - - + + + +
Oxidasa - - - - - - - - - - - - x x x x x d - - -
Glucosa (prod. acido) D + + + + + +/- - - + + + + + + - D D + + +
O/F O/- F F F F F F/- - - F F F F F F - F/- F/O/- O O O/NT
Micrococcus +
Staphylococcus +
Aerococcus + +
Streptococcus + +
Pediococcus +
Gemella +
Cocos anaerbicos* +
Kurthia +
Corynebacterium + +
Listeria +
Erysipelothrix +
Lactobacillus +
Arachnia +
Rothia +
Propionibacterium +
Actinomyces +
Bifidobacterium +
Eubacterium + +
Clostridium <> <> +
Bacillus <> <> <> <> +
Nocardia + +
Mycobacterium +
81
Tabla No. 2 Primera etapa para la identificacin de bacterias Gram negativas.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Forma R S S S S/R R R R R R R R R R R R R R
Movilidad - - - - - - + + - + - - + D - - + -
Crecimiento aerobio - - + + + + + + + + + + + + + -* - +
Crecimiento anaerobio + + - - - - - - - + + + + + + + - +
Catalasa d D + + + + + + + + + - + + D - D -
Oxidasa - x + + - + + + + + + + + - - + + -
Glucosa (prod. acido) D - + - + - + - + + + + + + D - - +
Carbohidratos [f/o/-] F/- - O - O - O - O O F F F F NT - - F
Bacteroides +
Veillonella +
Neisseria +
Branhamella +
Acinobacter +
Moraxella +
Brucella +
Bortedella +
Chromobacterium lividum +
Alvaligenes +
Flavobacterium +
Pseudomona +
Actinibacillus +
Pasteurella +
Necromonas +
Cardiobacterium +
Chromobacterium violaceum +
Benecktea +
Vibrio +
Plesiomonas +
Aeromonas +
Enterobacterias +
Haemophilus +
Eikenella +
Campylobacter +
Streptobacillus +
Mycoplasmas +
82
Tabla No. 3. Equivalencias de los smbolos utilizados en las Tablas 1 y 2.
Smbolo Significado
Tabla No. 1
* Peptococcus, Peptostreptococcus (tambin Leuconostoc)
Tambin Actinomyces odontolyticus
D Reacciones diferentes en distintas especies del gnero
d Reacciones diferentes en distintas cepas
F Fermentacin
O Oxidacin
w Reaccin dbil
x No se conoce
<> Variantes no esporgenas
Formas tpicas
Presentan algunas caractersticas comunes
S Cocos
R Bacilos
NT No probada
Tabla No. 2
* Crecimiento en aire + CO2
Crecimiento en oxgeno 5-6%
Tambin Shigela dysenteriae
Forma tpica
x No se conoce
Presentan algunas caractersticas comunes
NT No probada por mtodos comunes
Para ambas tablas
+ Del 85-100% de las cepas son positivas (generalmente todas o la mayor parte)
d Del 16-84% de las cepas son positivas (muchas , algunas)
- Del 0-15% de las cepas son positivas (ninguna, pocas algunas)
() Reaccin tarda en la prueba o crecimiento tardo
(d) Reacciones positivas tardas en diferentes cepas
(w) Reaccin dbil y tarda
w/- Reacciones dbiles y crecimiento escaso en diferentes cepas
D Reacciones diferentes en distintos grupos (gneros, especies y variedades)
No se conoce
Tablas tomadas de: Cowan, S. T. Manual for identification of medical bacteria2 nd Cambridge University
1974. pp167.
83
PRCTICA No 7 (parte b)
IDENTIFICACIN DE MOHOS Y LEVADURAS
1. OBJETIVOS
El alumno identificar mohos filamentosos y levaduras de una muestra.
1.2.1 El alumno identificar un moho por medio de la tcnica Ridell (microcultivo).
2.-INTRODUCCIN
Existen aproximadamente 100,000 especies de mohos microscpicos, y la mayora viven en el suelo
como saprofitos sobre materia orgnica en descomposicin, manteniendo as la fertilidad de los suelos.
Alrededor de 50 especies producen enfermedades en los animales, y aproximadamente 8,000 especies
causan enfermedades en las plantas, por las que se producen prdidas econmicas en la agricultura.
En la industria farmacutica algunos mohos son utilizados para obtener antibiticos, como la penicilina a
partir del gnero Penicillium.
En el campo de la elaboracin de alimentos y la biotecnologa, los mohos microscpicos se utilizan para
elaboracin de cerveza, vino, pan, maduracin de quesos, produccin de diversos cidos orgnicos,
etc.
Los mohos tambin se pueden usar, por ejemplo, en la degradacin de hidrocarburos en el caso de
derrames de petrleo en el mar. Los mohos pueden crecer tanto en agua dulce como el agua marina.
Tambin es relevante el hecho de que algunos mohos forman sustancias txicas al crecer en alimentos.
MORFOLOGA DE LOS MOHOS
Se les llama tambin Eumicetos, no producen flagelos, es decir, son inmviles la mayor parte de ellos.
Los mohos mi8croscpicos pueden ser:
1) Mohos Unicelulares: se llaman mohos levaduriformes o levaduras.
2) Mohos filamentosos: se llaman mohos y constan de muchas clulas.
Tanto las levaduras como los mohos presentan clulas eucariotes, es decir, con cromosomas mltiples,
membrana nuclear bien definida, mitocondrias, retculo endoplsmico y pared celular.
Son microorganismos que contienen paredes celulares rgidas hechas de glucgeno, de celulosa o de
quitina o mananas. Adems la membrana celular fngica, a diferencia de la bacteriana, presenta
esteroles. Estos microorganismos carecen de clorofila y son hetertrofos.
El conjunto celular de los mohos son llamados micelios. Es decir, a cada filamento individual se le llama
hifa, al conjunto de hifas se le llama micelio, y a la colonia entera del moho se le llama talo. El aspecto
que presentan las colonias de mohos es de tipo aterciopelado, algodonoso o polvoso, con muy diversas
coloraciones que abarcan toda la gama de color. Los mohos poseen hifas multinucleadas y estas
pueden tener septos o carecer de ellos con base en esta caracterstica, se clasifican en:
1) Mohos con micelio cenoctico : son los que carecen de septos o tabicaciones
2) Mohos con micelio septado: son los que presentan septos o tabicaciones entre las clulas.
84
Cada hifa puede tener un grosor uniforme o puede terminar en porciones ms delgadas o anchas. El
dimetro va desde 0.5 hasta 100 micras, y su longitud puede ser desde unas cuantas micras hasta
varios metros. En algunas formas superiores de mohos, las hifas estn pegadas juntas para formar
cuerpos fructiferos grandes, de estructura compleja, formado los llamados mohos carnosos o
macroscpicos. Pero aun cuando alcancen tales dimensiones, todos los mohos siguen siendo
microorganismos primitivos, debido a su especializacin en tejido es reversible.
En cuanto a su funcin, las hifas y micelios se clasifican en 2 tipos:
1) Hifa o micelio vegetativo: son las que penetran al sustrato para absorber las sustancias nutritivas.
2) Hifa o micelio areo o reproductivo: son las que se proyectan sobre el sustrato y producen
estructuras de reproduccin.
Muchos mohos patgenos presentan dimorfismo, desarrollndose como formas de aspecto de levadura
o como micelios. Por ejemplo, cuando cierto moho crece a temperatura de 37 C en el cuerpo humano,
se pueden presentar como levaduras, pero cuando crece en un medio de cultivo para mohos a 25 C
presenta forma de moho con micelio y esporas asexuales.
REPRODUCCIN
Los mohos se reproducen principalmente por medio de esporas, que son estructuras especializadas
para la propagacin del moho y estn capacitados para soportar condiciones adversas del medio
ambiente, sin embargo son ms sensibles, en general que las endosporas bacterianas. Las esporas
fngicas pueden formarse asexualmente o pueden ser el resultado de un proceso sexual. A
continuacin se muestran la clasificacin de estas esporas:
Esporas asexuales:
I.- Talosporas:
a) Artrosporas. Son esporas que se forman por fragmentacin de hifas generalmente son rectangulares
con doble pared gruesa.
b) Blastosporas. Se forman en las levaduras por gemacin a partir de una clula preexistente; una vez
que la yema ha alcanzado su mximo desarrollo se separa de la clula madre y en este estado o
todava unida, produce un nuevo brote, pudindose formar un pseudomicelio.
c) Clamidosporas. Se forman cuando las condiciones del medio se tornan adversas, las clulas
aumentan de tamao y se hinchan. Estas esporas son redondeadas y poseen doble pared gruesa que
les confiere gran resistencia.
II.- Conidiosporas.
Son esporas producidas libremente, por segmentacin de las puntas de unas hifas especializadas,
llamadas conidioforos.
85
a) Microconidias. Son esporas unicelulares que se presentan diversidad de tamaos, formas y

colores. Son producidas por los conidiforos, mediante el estrangulamiento sucesivo.
b) Macroconidias. Son esporas multicelulares, las hay de diversas formas. Las macroconidias
pueden dividirse en dos o ms clulas por tabiques transversales y pueden adoptar forma de huso o de
clava. La forma de estas estructuras vara, segn el gnero.
III.- Esporangiosporas.
Son esporas producidas en estructuras especializadas llamadas esporangios, que son sacos redondos
unidos al micelio vegetativo por una estructura especial llamada esporangiforo.
Esporas sexuales
I.- Cigosporas o Zigosporas:
Espora que surge cuando dos hifas cercanas se unen y fusionan sus contenidos genticos,
desarrollndose paredes gruesas. Las dos hifas que se unen pueden ser homotlicas (ambas
provenientes de la misma colonia o talo), o heterotlicas (provenientes de dos talos distintos).
II.- Ascosporas.
De la fusin de los gametos masculino y femenino surge una estructura llamada asco o asca. Las
ascosporas se desarrollan en el interior del asca, que es un saco que contiene generalmente ocho
ascosporas.
III.- Basidiosporas
De la fusin de los gameto masculino y femenino surge una basidia, en cuyo interior estn las
basidiosporas; se desarrollan en grupo de cuatro como carcter atpico a partir de los extremos de
estructuras en forma de maza, que debido a su forma reciben el nombre de basidios.
IV.- Oosporas
Esporas que surgen de la unin de dos estructuras llamadas anteridio (gameto masculino) y oogonio
(gameto femenino), y que van a producir una sola oospora.
FISIOLOGA DE LOS MOHOS MICROSCPICOS.
Respecto a sus requerimientos nutricionales, los mohos son hetertrofos. Al faltarles la clorofila
lgicamente no llevan a cabo fotosntesis, y comparndolos con las bacterias, los mohos en general
tienen requerimientos nutritivos extraordinariamente simples y sus procesos metablicos y de
biosntesis los llevan a cabo por las vas ms comunes. Por lo tanto pueden vivir en condiciones ms
severas que otros microorganismos, casi en cualquier sustrato. Por ejemplo: cuero, madera, alimentos,
mermelada, frutas, plantas, el cuerpo humano, animales, etc.
El pH ptimo en el cual se desarrollan es de 3 a 5. Pueden crecer en humedad pero tambin resisten la
falta de agua. Son aerobios estrictos y carecen en un rango de temperatura ptimo de 22 a 30 C.
Algunos mohos son capaces de desarrollarse en condiciones extremas, como deteriorando carne a 0 C
(mohos psicrfilos), o crecimiento a 62 C (mohos termfilos).
Las fuentes de carbono que pueden utilizar los mohos son: glucosa, sacarosa, maltosa, almidn o
celulosa. Las fuentes de nitrgeno que pueden utilizar los mohos son: nitrgeno orgnico, nitrgeno
inorgnico y nitratos. Algunos iones que requieren son: Zn, Cu, Mn, Fe y Mo.
De acuerdo al color de las hifas estas pueden ser hialinas cuando no estn pigmentadas o dematiceas
cuando poseen con color caf oscuro
86

3.1 MATERIAL
Pipetas de 1 ml Caja de Petri con Varilla en forma de V con
porta y cubreobjetos estriles.
Bistur
Asa micolgica
Mechero
3.2 EQUIPO
Autoclave Horno a 170C
Incubadora a 28C y 35 C Microscopio
3.3 MEDIOS DE CULTIVO
Tubos con PDA inclinado Tubos de ensaye de 13 X 100 con campana de
Durham con los azucares siguientes
Caja de Petri con PDA (para microcultivo)
Glucosa 10 %
Matraz con 50 ml de glicerol al 10 % estril
Lactosa al 10 %
Matraz con 50 ml de formaldehdo al 10 %
Maltosa al 10 %
Rafinosa al 10 %
Sacarosa al 10
3.4 CEPAS DE MOHOS Placas con cultivo de:
Penicillium sp Aspergillus niger
Rhizopus sp S. cerevisiae
4.1 MORFOLOGA COLONIAL DE MOHOS
Observar la morfologa colonial de los mohos que estn en la placa y reportar tamao, forma, aspecto,
adems de observar si hay pigmento difusible.
4.2 IDENTIFICACIN DE MOHOS POR LA TCNICA DE RIDELL (microcultivo)
a) De una caja de Petri con PDA cortar cuadros de 1 cm de lado y 5 mm de espesor con un bistur
estril.
b) Colocar el cuadro de PDA en un portaobjetos que esta sobre una varilla de vidrio doblada en forma
de V en una caja de Petri (Todo esto previamente esterilizado).
c) Tomar con el asa el inculo del moho al cual se quiere identificar.
d) Inocular por picadura cada uno de los 4 lados del cuadro de agar.
e) Colocar sobre el cuadro de agar un cubreobjetos y presionar ligeramente para que se adhiera.
f) Adicionar a la caja 10 ml de glicerol al 10 %
g) Cerrar la caja de Petri e incubarla a 28 C.
h) Realizar observaciones mnimo cada 24 horas para identificar los cuerpos fructferos.
i) Si se observa que el moho ya se ha desarrollado y se puede identificar las estructuras de
reproduccin, quitar el glicerol con una pipeta Pasteur y desecharlo en el benzal.
j) Adicionar 10 ml de formaldehdo al 40 % para inactivar el moho por 15 minutos.
87
k) Desprender con cuidado el cubreobjetos que se encuentra sobre el cuadro de agar y colocarlo
sobre un portaobjetos que contenga una gota se azul de algodn lactofenol, sellar la preparacin con
barniz de uas transparente.
l) Desprender con cuidado el cuadro de agar y depositarlo en la caja de Petri, colocar una gota de
azul de algodn lactofenol donde estaba el cuadro de agar y colocar un cubreobjetos
m) Si re requiere la preparacin con barniz
n) Realizar las observaciones de las preparaciones en el microscopio con el objetivo de 10 y 40 X.
o) Dibujar las estructuras observadas y con ayuda de la bibliografa comparar las estructuras
reproductivas e identificar el moho.
4.3 OBSERVACIN MICROSCPICA DE LEVADURAS

a. De la suspensin proporcionada realizar un frotis, fijarlo con calor y realizar una tincin simple.
b. Observar la preparacin al microscopio con el objetivo de 10 y 40 X
c. Dibujar la levadura que se observ.
4.4 IDENTIFICACIN DE LEVADURAS POR ASIMILACIN O FERMENTACIN DE AZUCARES.
Se utiliza para identificar diversos gneros y especies fngicas, principalmente levaduras y algunas
bacterias pertenecientes a los Actinomycetes, con base en sus capacidad de fermentar azucares.
a. De la suspensin a la que se le hizo la tincin simple y si resulto ser una levadura
b. Inocular una gota a cada tubo que contiene diferentes azucares.
c. Incubar de 24 48 h y observar la fermentacin o asimilacin del carbohidrato y comparar los
resultados que se buscarn en la bibliografa como la siguiente tabla.
d. Identificacin de levaduras del gnero Candida.
88
Dextrosa Maltosa Sacarosa Galactosa Lactosa Trehalosa

C. albicans + + - + - +
C. tropicales + - + + - +
C. glabrata + - - - - +
C. guilliermondi + - + + - +
C. parapsilosis + - - + - +
C. krusei + - - - - -
C. kefyr + - + + + +
C. lipolitica + - - - - -
C. zeylanoides +* - - - - -
4 RESULTADOS Y CUESTIONARIO.
5.1 Dibujar la levadura observada al microscopio
4.2 Dibujar las estructuras de reproduccin del moho
5.5 +Anota el nombre del moho identificado ____________________________
5.6 Anotar la composicin y utilidad de los medios de cultivo: Saboraud, agar de papa y dextrosa y agar
rosa de bengala
5.7 Porqu es necesario realizar la tcnica de microcultivo para identificar mohos?
5.8 Cul es la funcin del glicerol y el formaldehdo en un microcultivo?
5.9 Cmo identificaras un moho contaminante en un producto biotecnolgico?
ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS
6.1 Discutir las caractersticas de cada grupo de mohos, as como su importancia microscpica en la
naturaleza.
7 CONCLUSIONES
7.1 Elabora tus conclusiones tomando en consideracin los objetivos de la prctica, los resultados
obtenidos y la bibliografa consultada.
8. BIBLIOGRAFA
8.1 Koneman, E:W:& Morrison; Micologa, Diagnstico de Laboratorio, Edito.. Mdico Panamericana
1991.
8.2 Tortora, J. Gerard; Introduccin a la microbiologa, Editorial Acribia, 1993
89
Esquemas de mohos y levaduras
RPS
90
91
92
93
94
95
PRACTICA No. 8
CRECIMIENTO MICROBIANO
UNIDAD V: Crecimiento y cintica microbiana.
I. OBJETIVOS
El alumno aplicar las tcnicas ms utilizadas para el recuento de microorganismos y explicar qu
ocurre en cada una de las fases de crecimiento celular.
1.2 Objetivos Especficos
1.2.1 El alumno llevar a cabo una proliferacin de crecimiento celular de de Escherichia coli en cultivo
sumergido y agitacin (fermentacin) a nivel matraz por 24 horas.
1.2.2 El alumno cuantificar el nmero de microorganismos viables a travs del recuento por diluciones
y vaciado en placa como unidades formadoras de colonias (UFC).
1.2.3 El alumno estimar el crecimiento microbiano por la tcnica de turbidimetra.
1.2.4 El alumno cuantificar el nmero de microorganismos por cuenta directa con la tcnica de conteo
en cmara de Neubauer.
1.2.5. El alumno comparar los resultados obtenidos con CGS y caldo Luria, para determinar el mejor
medio de cultivo en funcin de la cantidad de masa celular producida.
2. INTRODUCCIN
Al hablar de crecimiento microbiano nos referimos al nmero de clulas, las clulas que crecen, estn
aumentando de nmero y forman cmulos de cientos de microorganismos, colonias de cientos de
microorganismos o poblaciones de miles de millones.
Al conocer las condiciones para el crecimiento microbiano, podemos predecir la rapidez con que
crecern estos en distintas situaciones y determinan la forma de controlar su crecimiento, estos
requerimientos pueden ser fsicos y qumicos. Los aspectos fsicos incluyen la temperatura, el pH y la
presin osmtica y entre los requerimientos qumicos estn el agua, las fuentes de carbono y nitrgeno,
las sustancias minerales, el oxigeno y los factores orgnicos de crecimiento.
Las bacterias se reproducen generalmente por fisin binaria, una divisin celular da lugar a dos clulas,
la divisin de estas clulas produce cuatro y as sucesivamente.
El tiempo necesario para que una clula se divida y por consiguiente para que su poblacin se duplique,
es lo que se llama tiempo de generacin o tiempo de duplicacin, puesto que, para los organismos
unicelulares; cada duplicacin constituye una nueva generacin, vara considerablemente entre los
diferentes microorganismos. La mayora de las bacterias tienen un tiempo de generacin de una a tres
horas.
Hay una serie de mtodos para medir el crecimiento bacteriano. Algunos mtodos miden el nmero de
clulas, otros la masa total de la poblacin. Las medidas de poblacin se refieren normalmente al
nmero de clulas que hay en un mililitro de lquido o en gramo de material slido.
Los mtodos de cuantificacin estn basados en mediciones directas o indirectas de muestras muy
pequeas, despus se determina mediante clculos el tamao de la poblacin total.
Los mtodos recomendados para medir la poblacin son:
Recuento en placa Diluciones seriadas.
Siembra por vaciado en placa. Siembra por extensin con varilla
Filtracin Mtodo del nmero ms probable
96
Recuento directo al microscopio (cmara de Neubauer).
Hay otros 3 mtodos llamados indirectos.

1.- Turbidimetra.
2.- Actividad metablica.
3.- Peso seco.
Es posible determinar la densidad celular empleando mtodos ms sencillos. Nos basta con una
cmara de conteo celular, por ejemplo la cmara de Neubauer, y un microscopio.
Para determinar la viabilidad celular se emplean diferentes mtodos. El ms comn es el de tincin con
azul tripn. El azul tripn es un coloide que se introduce en el interior de las clulas que presentan
roturas en la membrana.
Es importante diferenciar entre el crecimiento de las clulas individuales y el crecimiento de poblaciones
de clulas (proliferacin). El crecimiento de una clula es el aumento en su tamao y peso y
generalmente es la antesala de la divisin celular. Por otra parte, la proliferacin es el aumento del
nmero de clulas a consecuencia del crecimiento y la divisin celulares.
Una vez que se proveen de nutrientes necesarios al microorganismo, la clula empieza a crecer y/o a
producir algunos metabolitos.
Fase del crecimiento
En un cultivo microbiano todas las partes estn sujetas a las mismas condiciones de temperatura, pH,
concentracin de nutrientes, en la figura siguiente se indican diferentes fases que ocurren en un cultivo,
en donde se refleja los cambios en la biomasa y en el medio ambiente.
Parmetros de la curva de crecimiento
Si se sigue el crecimiento de un cultivo discontinuo a travs de la multiplicacin de la masa, nos
interesaran tres parmetros que son la produccin, la tasa de crecimiento y el periodo de latencia.
La produccin es la diferencia entre la masa bacteriana inicial y la mxima: X = X max- X0
La tasa de crecimiento exponencial es una medida de la velocidad del crecimiento celular (velocidad
especfica de crecimiento celular) se designa con la letra griega en la fase exponencial del
crecimiento. Se calcula a partir de las densidades bacterianas X 0 y Xt en los tiempos t0 y t, en la fase de
crecimiento exponencial segn
Hay una serie de mtodos para medir el crecimiento bacteriano. Algunos mtodos miden el nmero de
clulas, otros la masa total de la poblacin. Las medidas de poblacin se refieren normalmente al
nmero de clulas que hay en un mililitro de lquido o en un gramo de material slido.
Los mtodos que vamos a utilizar en el laboratorio de tcnicas microbiolgicas es el de cuenta viable
por la tcnica de vaciado en placa, cuenta directa al microscopio utilizando una cmara de Neubauer y
por turbidimetra que es un mtodo indirecto que mide la densidad de una suspensin por su extincin,
en algunas ocasiones se utiliza el nefelmetro.
97
3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS

3.1.- MATERIAL
Un matraz con 100 ml de caldo Luria estril Un matraz de 1 L con 600 ml de agar cuenta
(matraz semilla) estndar (para el vaciado en placa)
Un Matraz de 500 ml con 100 ml de caldo Luria 120 tubos de 16 x 150 mm con 9 ml de solucin
estril y/o caldo glucosa sales salina (para las diluciones)
Dos celdas y un portaceldas 40 Cajas de Petri estriles (para el vaciado en placa)
Pipetas de 2,5 y 10 ml estriles Una pizeta con benzal
3.2.-REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO
NaCI peptona Agar cuenta estndar
Caldo Luria Caldo glucosa sales al 5 %
3.3.- EQUIPO
Espectrofotmetro Incubadora a 37 C
Autoclave Contador de colonias
Horno Cmaras de Neubauer
3.4.- CEPAS:
Suspensin de Escherichia coli Suspensin de Saccharomyces cerevisiae
4.- DESARROLLO EXPERIMENTAL
ENSAYO DE LOS MTODOS (PRIMERA SESIN)
4.1 TURBIDIMTRIA. Para este primer ensayo no es necesario trabajar en condiciones de
esterilidad
De la suspensin de S. cerevisiae, seguir las indicaciones del profesor para leer la absorbencia en el
espectrofotmetro.
a) Colocar en el espectrofotmetro una portacelda y bloquear el paso de luz
b) Encender el espectrofotmetro y dejarlo calentar por 5 minutos, seleccionar la longitud de onda (540
nm) y la regin visible
c) Colocar en una celda espectrofotomtrica 3 ml de caldo Luria, este tubo ser el blanco
d) En la otra celda colocar aproximadamente 3 ml de la suspensin a leer
e) Limpiar con papel sanitario la celda, tomarlo con los dedos por la boca del tubo y colocar el blanco en
el portacelda. Acomodar la portacelda para dejar pasar la luz y ajustar a cero de absorbencia.
98
f) Una vez ajustado a cero, bloquear el paso de luz e insertar la celda de la suspensin a leer,
previamente limpiada con papel sanitario.
g) Cuando la lectura se estabilice ms o menos 3 segundos, tomar la lectura.
h) Bloquear el paso de luz y retirar la celda, vaciar el contenido en un recipiente con benzal y enjuagar
la celda dos o tres veces con benzal.
i) Una vez leda la muestra, apagar el espectro y retirar la portacelda.
Nota: Las celdas nunca se lavan con escobilln, no se colocan en una gradilla, para ello se entregaran
en un vaso
4.3 CUENTA DIRECTA EN CMARA DE NEUBAUER
a) Tomar la cmara y limpiarla con una torunda impregnada con alcohol, con mucho cuidado, ya que el
cuadriculado al frotarlo bruscamente se puede borrar.
b) La torunda depositarlo en un recipiente que contenga benzal, de la misma manera limpiar el
cubreobjetos (cubrehematocimetro) y colocarlo sobre la cmara.
c) Con una pipeta coloca la muestra de S. cerevisieae, entre la cmara y el
portaobjetos, para que por cohesin se llene la cmara, La cmara de
Neubauer es una cmara de conteo. Se trata de un portaobjetos con una
depresin en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la
ayuda de un diamante una cuadrcula como la que se ve en la imagen.
Es un cuadrado de 3 x 3 mm., con una separacin entre dos lneas
consecutivas de 0.25 mm. As pues el rea sombreada y marcada le
corresponde a un mm2. La depresin central del cubreobjetos est
hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre
con un cubreobjetos ste dista de la superficie marcada 0.1 mm, y el
volumen es de 0.1 mm3, es decir 0.1 l.
d) Colocar la cmara en la platina y enfocar con 10 y 40 X
e) Contar para las levaduras en los cuadrantes denominados en la figura A,B.C y D, sumar los valores
obtenidos, sacar un promedio; multiplicar por 10 000 y las unidades son clulas/ml.
f) Retira la cmara, lmpiala y ahora coloca una muestra de E. coli, pero ahora utiliza el cuadrante de
en medio y contar los cuadros sombreados, de igual forma contar el nmero de clulas, sumarlos y
obtener el promedio, despus multiplicar por 25 y luego por 10 000, obtenindose No. de clulas/ml.
4.3 DILUCIONES PARA REDUCCIN DE CARGA MICROBIANA

a) La muestra se toma en condiciones de esterilidad, tomar 1 ml del matraz cintica y colcalo en
-1
un tubo que contenga 9 ml de solucin salina, para realizar la dilucin 10 . Mezclar el tubo segn las
recomendaciones de la NOM 110 y tomar 1 ml, colocarlo en otro tubo con 9 ml de solucin salina para
-2
obtener la dilucin 10 y as sucesivamente.
b) El nmero de diluciones que realices depende del crecimiento que encuentres por turbidimetra
6 -6
o en el conteo directo, si el conteo es del orden de 1x10 , entonces realiza hasta las diluciones 10 y
99
-7
10 . Conforme aumente el nmero de microorganismos aumenta el nmero de diluciones, recordemos
que debemos tener un intervalo de conteo
4.4 CUENTA VIABLE
a.- Recordar la tcnica de vaciado en placa, segn la NORMA Oficial Mexicana NOM-092-SSA1-1994,
Bienes y servicios. Mtodo para la cuenta de bacterias aerobias en placa.
100
SESIN II
Organizacin de las cinticas: Se realizarn 4 cinticas en todo el grupo con las siguientes
consideraciones
Cintica A Cintica B Cintica C Cintica D
Equipos 1,2 y dos alumnos Equipos 3 y 4 y un alumno Equipos 6,7 y dos alumnos Equipos 8 y 9 y un alumno
del equipo 5 del equipo 5 del equipo 10 del equipo 10
150 ml de Caldo Luria 150 ml de CGS al 5% 150 ml de Caldo Luria 150 ml de CGS al 5%
Volumen del inculo 10 ml 10 ml 10ml
Si la As es de 0.8-0.9
4.5 PREPARACIN DE MATRAZ SEMILLA (DIA 1 y generalmente lo hace el profesor)

a) Inocular en condiciones de esterilidad un matraz conteniendo 50 ml de caldo Luria estril con 2.5
ml de una suspensin de Escherichia coli de 18 horas de cultivo.
b) Incubar a 35 C por 18 h en agitacin aproximadamente a 120 rpm. ste ser el matraz semilla.
4.6 PREPARACIN DEL MATRAZ CINETICA (DIA 2)
Trabajo para el profesor

a) El da de la cintica tomar en condiciones de esterilidad 4 ml y medir la turbidez y de acuerdo a este
valor indicar a los alumnos cuanto inocular en su matraz cintica
b) De lo que quede en la pipeta realizar una tincin de Gram para verificar la pureza.
4.7 INOCULACIN DE MATRAZ DE CINTICA
Trabajo para los alumnos

1.- Enjuagar una celda espectrofotomtrica con benzal y luego en condiciones de esterilidad
enjuagarla con alcohol, ahora con una pipeta estril tomar 4 ml de caldo Luria o CGS del matraz de
cintica y colocarlo en la celda espectrofotomrica y colocarle parafilm (este es el blanco para
ajustar el espectro y poder leer cada lectura).
2.- Homogeneizar la suspensin microbiana del matraz semilla y tomar el volumen indicado por el
profesor que puede ser 5 o 10 ml de esta suspensin en condiciones de esterilidad e inocular el
matraz con caldo Luria o CGS para la cintica y mezclar perfectamente, anotar este tiempo (t 0)
3.- Con una pipeta de 5 ml estril tomar 5 ml inmediatamente y dar el matraz a un compaero para
que lo lleve a incubar y agitar. El alumno que tiene la pipeta con la muestra realizar lo siguiente en
este orden:
a.- Colocar 1 ml en un tubo de dilucin y darle el tubo a otro compaero para que realice las
diluciones pertinentes, segn el cuadro de diluciones, siguiendo las recomendaciones de la
NOM 110, sembrar las dos ltimas diluciones por la tcnica de vaciado en placa siguiendo las
recomendaciones de la NOM 092. Dejar solidificar e incubar.
Una vez depositado el ml en el tubo de dilucin se puede apagar el mechero
b.- Tomar la otra celda espectrofotomtrica y colocar aproximadamente 3.5 ml, colocar la celda
en el vaso de precipitados que contiene la celda (blanco) y se la dar a un compaero para que
realice la lectura en el espectrofotmetro. (Esta segunda celda no es necesaria sanitizarla)
101
d.- De lo que queda en la pipeta colocar una gota en la cmara de Neubauer y drsela al
compaero que va a realizar el conteo en el microscopio.
e.- Con lo que queda en la pipeta realizar un Gram para corroborar la pureza del matraz semilla y
desechar la pipeta en el benzal.
f.- Este procedimiento se hace segn el cuadro de tiempos de toma de muestra
g.- Incubar las placar a 35/ 24 h y realizar el conteo

5.1 Anota los resultados obtenidos. As del matraz semilla: _________
Tiempo Tiempo real en min Absorbencia 540 nm Cuenta directa UFC / ml
To
T1
T2
T3
T4
T5
T7
102
5.2 Cuenta viable por vaciado en placa: Anota el nmero de UFC/ ml.
Tiempo Conteo Promedio Resultado
To Dilucin 10 Placa 1 =
Placa 2 =
Dilucin 10 Placa 1 =
Placa 2 =
T1 Dilucin 10 Placa 1 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
5.3.3 Es posible diferenciar clulas muertas de las vivas?
5.3.4 Construye una grfica del nmero de UFC/ml vs Tiempo, sealando en la curva las diferentes
zonas de crecimiento.
5.3.5 Construye una grfica del nmero de UFC/ml vs Tiempo (horas).
5.3.6. Construye una grfica del log del nmero de UFC/ml vs Absorbencia.
5.3.7 Determina la velocidad especfica de crecimiento mxima.
5.3.8 Calcula el tiempo de generacin de la cepa estudiada.
5.3.9 Define el trmino velocidad especfica de crecimiento
5.3.10 Menciona los factores de que depende la fase de muerte
5.3.11 Por qu es importante la cintica microbiana?
103

6.1 Discute las ventajas y desventajas de los mtodos empleados.
6.2 Analiza y discute sobre la base de lo anterior y a la investigacin bibliogrfica realizada, los
resultados obtenidos en esta prctica.
6.3 Discute la conveniencia o no de construir una curva de calibracin con los resultados de
turbidimetra y de cuenta viable para un microorganismo dado, de ser conveniente explica para qu
podr servir.
7. CONCLUSIONES
Elabora las conclusiones sobre la base de los resultados obtenidos, al anlisis y discusin de estos, a la
8. BIBLIOGRFIA
8.1.- Atlas, R. W. 1988. Microbiology. Second edition. Mc. Millan Public, U. K. 807 pg.
8.2.- Moat, A. G., J. W. Foster, M. P. Spector. 2002. Microbial Phisiology. Fourth edition. Wiley-Liss,
USA. 715 pg.
8.3.- Brock, T.D.; Smith y M.T. Madigan. 1997. Biologa de los Microorganismos. Octava edicin.
Prentice Hall, Espaa. 956 pg.
8.4.- Stanbury, F. Peter, A. Whitaker, S. Hall. 1998. Principles of Fermentation Technology. Second
edition. Pergamon Press, Oxford. 376 pgs.
8.5.- Reina, Manuel. 2003. Contaje de clulas: cmara de Neubauer. Departamento de Biologa Celular.
Universidad de Barcelona. ltima actualizacin 20 de octubre de 2003.
104
PRACTICA No. 9
EFECTO DE LOS FACTORES FISICOQUMICOS SOBRE EL CRECIMEITNO MICROBIANO
1. OBJETIVOS
1.1. Objetivo general
Al trmino de la prctica el alumno determinar:
1.1.1 La influencia de algunos factores ambientales sobre el crecimiento de algunos microorganismos.
1.2. Objetivos especficos.
1.2.1 Determinar el PTM y TTM) de algunos microorganismos.
1.2.2 Determinar el efecto de la presin osmtica, pH, metales pesados y temperatura sobre el
crecimiento de los microorganismos.
1.2.3 Determinar el efecto de un inhibidor sobre el crecimiento de un microorganismo.
1.2.4 Realizar una pasteurizacin como una aplicacin de un proceso trmico.
2. INTRODUCCIN
Cada microorganismo tiene sus propias necesidades, caractersticas de su propio crecimiento en un
medio ambiente por lo que determinado factor fisicoqumico lo afectara dentro de lmites diferentes.
Dentro de los principales factores fisicoqumicos que afectan el desarrollo microbiano se encuentran:
-Temperatura
-Presin osmtica
-Potencial de hidrgeno
-Potencial de oxido reduccin
GRUPO TEMPERATURA OPTIMA DE CRECIMIENTO
Psicrfilas 5C aproximadamente
Mesfilas de 20 a 45 C
Termfilas 55C y mayores
El calor es uno de los factores fsicos ms utilizados para esterilizar y desinfectar, como el calor es tan
eficaz para destruir a los microorganismos, es esencial disponer de una medida precisa de su eficacia
termodestructiva. Inicialmente, esta eficacia se expresaba con el punto de muerte trmica (PTM), la
temperatura ms baja a la que una suspensin microbiana se destruye en 10 minutos. En la actualidad
se emplea ms el trmino de tiempo de muerte trmica (TMT) el cual se define como el tiempo ms
corto necesario para destruir todos los organismos de una suspensin microbiana, a una temperatura
especifica y en condiciones definidas. Sin embargo esta destruccin es logartmica y en teora no es
posible destruir completamente los microorganismos de una muestra, incluso aumentando el tiempo de
calentamiento, por ello de tiempo de reduccin decimal (D) o valor D es ms preciso.
Cabe sealar que el crecimiento es el resultado de un conjunto de actividades metablicas del
microorganismo, as que se puede estudiar el efecto de los factores fisicoqumicas sobre el crecimiento,
o sobre alguna actividad microbiana.
Las bacterias mviles reaccionan frente a estmulos qumicos y en algunos casos huyen de estos, a la
respuesta frente a este estmulo se le llama quimiotaxis.
EFECTO DEL pH
105
Los iones H y OH son los iones ms mviles, por ello pequeas modificaciones en su concentracin
tiene consecuencias graves, la mayora de los microorganismos tienen un pH cercano a la neutralidad,
pero existen otros que estn en el intervalo alcalino (microorganismos alcalinfilos) y otros en el
intervalo cido (microorganismos acidfilos)
EFECTO DE LA PRESIN OSMTICA
Los microorganismos osmfilos y Xerfilos pueden descomponer los alimentos, los microorganismos
osmfilos crecen ptimamente en medios con una elevada concentracin osmtica, mientras que los
xerfilos prefieren un medio con baja Aw.
Los microorganismos halfilos se han adaptado bien a crecer a levados niveles de cloruro de sodio
ACTIVIDAD DE AGUA
Los microorganismos se diferencian entre s por el contenido de agua, para poder comparar las
disoluciones acuosas y las sustancias slidas desde el punto de vista del agua disponible se recurre a la
actividad acuosa Aw. Este parmetro hace referencia a la fase de vapor de agua que se encuentra en el
equilibrio con un material slido.
EFECTO DE LOS METALES PESADOS
Los iones metales como el Hg, Ag, Zn, y Cu se han empleado como germicidas, muchos metales
pesados son utilizados como bacteriostticos que bactericidas.
Los metales pesados se combinan con las protenas, a menudo con los grupos sulfhidrilos,
inactivndolas, tambin pueden precipitar las protenas.
EFECTO DE COMPUESTOS HALOGENADOS.
El yodo y el cloro son los principales agentes antimicrobianos, el yodo se utiliza como antisptico al
oxidar los constituyentes celulares y formar compuestos de yodo con las protenas celulares. El cloro es
un desinfectante que se emplea ampliamente, puede aplicarse como gas cloro, hipoclorito sdico, o
hipoclorito clcico produciendo cido hipocloroso (HClO) y posteriormente oxgeno.
EFECTO DE LOS ANTIBITICOS.
Los fenmenos de transferencia gentica y la aparicin de mutantes en las bacterias Gram + y -, han
dado lugar a la aparicin de cepas resistentes a uno o varios antimicrobianos, esto lleva a la necesidad
de conocer un patrn de susceptibilidad de las cepas. La prueba se fundamenta en que al colocar un
disco impregnado con determinada cantidad de antimicrobiano sobre un medio slido inoculado con el
microorganismo de prueba.
RADIACIONES
Las ms utilizadas son los rayos UV, X y gamma, la luz Uv (260 nm) es absorbida por los cidos
nucleicos formando dmeros de timina, las otras dos radiaciones deben su accin a la formacin de
radicales OH que disocian a la mayora de las molculas, y se utilizan generalmente para esterilizar
alimentos.
DETERGENTES
Son molculas que actan como agentes humectantes y emulsionantes porque poseen tanto extremos
hidrfilos polares como hidrfobos no polares, debido a su naturaleza antiptica solubilizan residuos
insolubles y son agentes limpiadores muy eficaces.
3. EQUIPO, MATERIAL., MEDIOS DE CULTIVO Y CEPAS MICROBIANAS
3.1. MATERIAL
Pipetas de 1, 2, 5 y 10 ml estriles. Cajas Petri con Agar cuenta estndar

Tubos de 16 x 150 mm con 5 ml de caldo nutritivo Tubos de 16 x 150 mm con 5 ml de caldo
nutritivos pH 3,5
Tubos de 16 x 150 mm con 5 ml de caldo nutritivo
Tubos de 16 x l50 mm con 5 ml de caldo nutritivo
106
Placas con agar nutritivo a pH 7,0

20 ml de leche en punto de venta (establo) Tubos de 16 x 150 mm con 5 ml de caldo nutritivo
a pH 9,0
Tubos con 9 rnl de agua peptonada al 0. 1%
Tubos de 16 x 150 mm con 5 ml de caldo nutritivo
Matraz de 150 ml con Agar bilis rojo violeta con 0,85 % de cloruro de sodio
Tubos de 16 x 150 mm con 5 ml de caldo nutritivo Pinzas de diseccin
con 1% de cloruro de sodio
Discos de papel filtro impregnados con hipoclorito
Tubos de 16 x 150 mm con 5 ml de caldo nutritivo de sodio
con 5% de cloruro de sodio
Discos de papel filtro impregnados con yodo
Discos de papel filtro de 1 cm de dimetro
Antibiogramas para Gram positivos y Gram
Cajas de Petri estriles negativos
3.2. EQUIPO
Una estufa a 28C Un bao Mara a 80C

Un bao Mara a 28C Un bao Mara a 92C
Un bao Mara a 35C Un bao Mara a 4C
Un bao Mara a 40C Un termmetro
Un bao Mara a 50C Un incubadora a 35C
Un bao Mara a 55C Un incubadora a 28C
Un bao Mara a 60C Una autoclave
Un bao Mara a 70C Horno
Sacharomyces cerevisiae Escherichia coli

Bacillus subtilis Aspergillus. niger
Pseudomonas sp Micrococcus luteus
4. 1. EFECTO DE LA TEMPERATURA DE CULTIVO SOBRE EL CRECIMIENTO
a. Se emplearan los siguiente microorganismos: Pseudomonas sp, Escherichia coli y B. subtilis
b. Hacer una suspensin del microorganismo con el que se va a trabajar
c. Etiquetar una serie de 4 tubos conteniendo cada uno 5 ml de caldo nutritivo con las siguientes
temperaturas. 5, 28, 35 y 55C. Anotar tambin el nombre del microorganismo que se inocular
d. Inocular cada uno de los tubos con 0,1 ml de la suspensin microbiana e incubar los tubos a la
temperatura correspondiente durante 24 h. Dejar un tubo sin inocular que servir como testigo
negativo del medio.
e. Despus de este tiempo observar si hay o no crecimiento haciendo anotaciones con un signo (+)
dependiendo de cuanto crecimiento se observe, si no hay crecimiento con un signo (-).
4.2. DETERMINACIN DEL PUNTO TRMICO MORTAL (PTM)
a. Etiquetar una serie de 6 de 13 x l00 tubos conteniendo cada uno 5 ml de caldo nutritivo (CN), con las
siguientes temperaturas: 35C, 50C, 60C 70C, 80C y 92C.
107
b. Inocular cada tubo con 0,1 ml de la suspensin microbiana

c. Calentar los tubos a las temperaturas correspondientes durante 10 minutos a bao Mara y colocar
0,1 ml del primer tubo sobre la superficie de una placa de agar nutritivo y homogeneizar con un a
varilla de vidrio estril
d. Realizar la misma operacin con los otros tubos. Incubar las placas durante 24 h a 25C para
Pseudomonas sp, a 35C para E. coli y B. subtilis. Al cabo de las cuales determinar el nmero de
unidades formadoras de colonias
En caso de no requerir conocer las UFC, observar la turbidez del tubo y con cruces anotar de la menor
turbidez a la mayor, posteriormente dividir una placa en 7 fracciones ms o menos equidistantes y en
cada una de las fracciones sembrar por estra simple para observar solo ausencia o presencia de
crecimiento.
4.3. DETERMINACIN DEL TIEMPO TRMICO MORTAL (TTM)

a. Etiquetar una serie de 7 tubos de 13 x 100 conteniendo cada uno 5 ml de caldo nutritivo con los
siguientes tiempos 5, l0, 20 y 30 min.
b. Inocular cada tubo con 0, 1 ml de la suspensin microbiana
c. Calentar las suspensiones a 70C en un bao Mara durante los tiempos indicados
d. Colocar 0,1 ml de cada tubo sobre la superficie de una placa de agar nutritivo y homogeneizar con
una varilla de vidrio estril
e. Incubar las placas durante 24 h a 25C para Pseudomonas sp y a 35C para E. coli y B. subtilis.
f. Una vez pasado este tiempo determinar el nmero de unidades formadoras de colonias por ml.
En caso de no requerir conocer las UFC, observar la turbidez del tubo y con cruces anotar de la menor
turbidez a la mayor, posteriormente dividir una placa en 7 fracciones ms o menos equidistantes y en
cada una de las fracciones sembrar por estra simple para observar solo ausencia o presencia de
crecimiento.
4.4. PASTEURIZACIN
a. A) Determinacin de organismos conformes y mesoflicos aerbicos en leche sin pasteurizar De la
leche sin pasteurizar realizar una dilucin colocando 10 ml en 90 ml de agua peptonada al 0,1% y
hacer diluciones en tubos con 9 ml con agua peptonada al 0,1% hasta la dilucin 10 -2
b. Hacer determinacin de Organismos conformes y mesoflicos aerobios como se indica en el
esquema.
c. B) Pasteurizar la leche colocndola a una temperatura de 63C durante 30 minutos despus de este
tiempo enfriar rpidamente en bao de hielo por cinco minutos y realizar determinacin de
microorganismos coliformes y mesoflicos aerobios como se indica en la figura
108
d Determina el nmero de UFC segn la NOM para leche en punto de venta y leche pasteurizada.
FACTORES FISICOQUMICOS.
4.5. EFECTO DEL pH
a. Se emplearan las cepas de Bacillus subtillis, Sacharomyces cerevisiae, y Escherichia coli
b. Hacer una suspensin del microorganismo que se va a trabajar en un tubo con agua destilada estril
c. Colocar en una gradilla una serie de 4 tubos de caldo nutritivo con los diferentes pH
d. Marcar los tubos con el nombre de la cepa que se va a estudiar
e. Homogeneizar la suspensin e inocular con 0,1 ml cada uno de los tubos. Incubar los tubos a 35C
para bacterias y a 28 C para levaduras durante 3 a 5 das.
f. Despus de este tiempo observar presencia o ausencia de crecimiento segn la turbidez para los
diferentes pH.
4.6. EFECTO DE LA PRESIN OSMTICA SOBRE EL CRECIMIENTO
a. Se emplearan las cepas de Bacillus subtillis, Sacharomyres cerevisiae, y Escherichia coli
b. Hacer una suspensin del microorganismo con el que se trabajar
c. Colocar en una gradilla una serie de tubos que contienen 5 ml de caldo nutritivo con diferentes
concentraciones de cloruro de sodio (0,85 %, 1, 3 y 5 %)
d. Homogeneizar la suspensin e inocular con 0,1 ml cada uno de los tubos.
e. Incubar las bacterias a 35C y las levaduras a 28 C durante 24 h
f. Despus de transcurrido este tiempo observar turbidez en los tubos problema.
4.7. METALES PESADOS
a. Humedecer los discos de papel filtro con los siguientes compuestos. AgNO3, HgCl2 , CuSO4 y CH 3
COOPb.
b. Sembrar masivamente una caja con agar nutritivo con el microorganismo que se ya a estudiar
109
c. Dividir la placa en 3 y anotar el nombre de la cepa as como con el metal correspondiente.

d. Esterilizar las pinzas de diseccin y tomar uno de los discos ya impregnado con el metal a estudiar, y
colocarla en el sitio correspondiente en la placa ya inoculada
e. Presionar ligeramente (con las pinzas) el disco de papel filtro e incubar a 35C durante 24 h.
f. Observar el crecimiento de las cepas y medir el halo de inhibicin con una regla graduada de cada
uno.
4.8. COMPUESTOS HALOGENADOS
a. Humedecer los discos de papel filtro con una solucin de hipoclorito de sodio y de yodo
respectivamente
b. Sembrar masivamente una caja con agar nutritivo con el microorganismo que se va a estudiar
c. En condiciones de esterilidad colocar los discos en la caja ya inoculada
d. incubar las placas a 35C durante 24 h.
e. observar el crecimiento y medir los halos de inhibicin
4.9. EFECTO DE LA ACTIVIDAD DE ANTIBITICOS SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO
a. Sembrar las placas de agar nutritivo masivamente con un hisopo estril y con la cepa
correspondiente
b. Colocar un multidisco o discos individuales sobre las placas sembradas con las cepas.
Nota: Determinar el tipo de Gram que es si no se sabe hay que investigarlo para no colocar un
multidisco que no corresponda.
c. Presionar ligeramente cada disco sobre el cultivo con ayuda de pinzas de diseccin para poner en
contacto el antibitico con la cepa
d. Incubar las placas a 35C durante 24 h.
e. Despus del tiempo de incubacin medir el dimetro del los halos de inhibicin del crecimiento
producido por cada antibitico estudiado y anotar los resultados.
Diferentes formas de observar la sensibilidad a los antimicrobianos.
110
5. RESULTADOS
5. 1. EFECTO DE LA TEMPERATURA DE CULTIVO SOBRE EL CRECIMIENTO
Temperatura 5 C 28 C 37 C 55C
Turbidez (en cruces)
5.2. DETERMINACIN DEL PUNTO TRMICO MORTAL (PTM)
Temperatura 37 C 50 C 60 C 70C 80C 92C
Crecimiento en el tubo
(Cruces)
Crecimiento en la placa
111
5.3. DETERMINACIN DEL TIEMPO TRMICO MORTAL (TTM)
Temperatura 37 C 50 C 60 C 70C 80C 92C
(Cruces)
Crecimiento en la placa
5.4. PASTEURIZACIN
Determinacin Leche en punto de venta Leche pasteurizada
UFC/mL UFC/mL
Organismos Mesofilicos
aerobios
Organismos coliformes
5.5. EFECTO DEL pH
Efecto del pH 3.5 5.0 7.0 9.0
(Cruces)
5.6. EFECTO DE LA PRESIN OSMTICA SOBRE EL CRECIMIENTO
Concentracin de NaCl 1% 35 5%
(Cruces)
5.7. METALES PESADOS
Efecto del pH AgNO3 CuSO4 HgCl 2 CH 3-COOPb
Dimetro de inhibicin
(mm)
5.8. COMPUESTOS HALOGENADOS O DESINFECTANTES
Halgeno o desinfectantes Cloro Yodo Benzal
(Cruces)
112
5.9. EFECTO DE LA ACTIVIDAD DE ANTIBITICOS SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO

ANTIBITICO Gram positivo Gram negativo
Nombre: ______ Nombre: ______
5.10 Cita tres ejemplos de microorganismos psicroflicos, mesoflicos y termoflicos, indicando su

importancia.
5.11 Define el trmino termodrico y menciona un ejemplo.
5.12.-Escribe correctamente el nombre de un microroganismos acidofilo, alcalinofilo y uno neutrofilo.
5.13 Explica brevemente que es el efecto bactericida, bacteriosttico, fungicida y fungisttico.
5.14 Explica la diferencia como actan los diferentes metales pesados utilizados en el laboratorio.
5.15 Qu accin tiene los halgenos sobre el crecimiento celular?
5.16 Qu aplicacin tienen los factores ambientales en la industria alimentaria?
6.1 Basndose en los resultados anteriores y a la bibliografa consultada, analizar y discutir los
resultados obtenidos en esta prctica, haciendo nfasis en el efecto causado a nivel molecular de los
factores estudiados y la importancia prctica que tiene el conocer el efecto de estos mismos sobre los
microorganismos.
7.-CONCLUSIONES.
7.1 Elabora las conclusiones basndose en los resultados, al anlisis y discusin que se hicieron de
estos, a la bibliografa consultada y a los objetivos de la prctica.
8.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS RECOMENDADAS.
8.1 Brock, T.D, Biologa de los microorganismos. 10a Edicin, Pearson Prentice Hall. Madrid, Espaa:
2004.
113
PRCTICA No. 10
MTODOS RPIDOS PARA LA IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS
UNIDAD VIII: Microorganismos de importancia alimentaria
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo general.
1.1.2 El alumno realizar pruebas de identificacin rpida de microorganismos y grupos microbianos
de importancia alimentaria.
Al trmino de la sesin el alumno:
1.2.1 Practicar la identificacin de microorganismos utilizando el sistema API
1.2.2 Practicar la identificacin de grupos microbianos de importancia alimentaria utilizando las placas
Petrifilm
2. INTRODUCCIN
Los mtodos tradicionales para la identificacin de microorganismos se basan en la observacin de los

cambios metablicos que se producen durante el crecimiento, sin embargo estos mtodos son costosos
y llevan mucho tiempo. Surge entonces la necesidad de obtener resultados rpidos y confiables, Los
nuevos avances tecnolgicos han llevado a disear nuevas tcnicas para el anlisis microbiolgico de
alimentos.
Los mtodos rpidos y la automatizacin en microbiologa es un campo de estudio que conjunta la

utilizacin de mtodos microbiolgicos, bioqumicos, fisiolgicos, inmunolgicos y serolgicos para el
aislamiento ms efectivo, la deteccin, caracterizacin y enumeracin ms rpida de microorganismos y
sus productos en muestras clnicas, ambientales o de alimentos.
Un mtodo rpido es aquel que es ms rpido, sencillo o confiable que lo convencional. Sin embargo,
siempre al hablar de metodologas rpidas estamos tratando subjetivamente, porque parten de un
cultivo aislado. Sin embargo, en lo que todos concuerdan es que estos mtodos han revolucionado y lo
seguirn haciendo, la forma de realizar los anlisis microbiolgicos.
Las pruebas rpidas de identificacin bioqumica estn miniaturizadas y automatizadas, lo que hace al
anlisis ms rpido y econmico. A la fecha muchas compaas comercializan sus propios sistemas
para la identificacin rpida, generalmente estos sistemas estn diseados para ser usados en la
identificacin de enterobacterias, ya que habitualmente son los agentes etiolgicos de las infecciones
gastrointestinales. Tambin estn disponibles distintos kits para diversos grupos bacterianos e incluso
para especies nicas, por ejemplo, se han desarrollado kits que contienen una batera de pruebas para
Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Neisseria gonorhoeae, Haemophilus influenzae y
Mycobacterirum tuberculosis.
Los microorganismos patgenos deben ser aislados e identificados debido a que producen
enfermedades a cientos de personas, causando daos econmicos a los productores de alimentos. Los
mtodos de diagnstico rpido dependen del crecimiento bacteriano, es decir que tienen que ser
aislados, para poder medir los cambios fisicoqumicos, resultado del crecimiento o actividad metablica,
el fundamento es entonces el mismo tanto en el mtodo tradicional como en los mtodos rpidos.
Algunos ejemplos de bacterias productoras de enfermedad transmitidas por los alimentos son:
Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Escherichia coli (enteroinvasiva y
114
enterotoxignica), Clostridium perfringens, Bacillus cereus, Yersinia enterocoltica, Listeria

monocytogenes y Vibrio cholerae,
Algunos mtodos rpidos utilizados para identificacin de microorganismos son:
Sistemas de Cuantificacin Microbiolgica.
1.- Placa Petrifilm. Las placas Petrifilm ayudan a maximizar la productividad en el laboratorio. Estas
placas listas para usarse reducen el tiempo y optimizan el espacio.
2.- Sistema Protocol es un sistema modular que abarca desde un sistema para la cuenta de las
colonias, hasta el clculo de las diluciones, pudiendo leer.
3.- Sistema Simplate. El sistema sirve para realizar recuento de organismos selectos: Cuenta total,
coliformes totales y fecales, Hongos, levaduras y Campylobacter.
Sistemas de Identificacin Microbiana
1.- El sistema API. Los sistemas de identificacin API comprende celdillas con 20 pruebas bioqumicas
en miniatura. Sistema Mirobac, tambin consiste de plaquitas con 16 pruebas bioqumicas. Ejemplos:
API 20E, API NFT, API Campy, API Listeria, API Staph, API NH, etc.
2.- El sistema REMEL N/F
3.- El sistema rapid NF PLUS
4.- El sistema Biolog. El sistema es capaz de identificar por encima de 1400 especies de bacterias
aerobias, anaerobias, hongos filamentosos y levaduras.
5.- El sistema VITEK. Sistema automtico que identifica en 2 a 24 h y realiza tambin confirmacin de
patgenos. Los equipos son expandibles con 32, 60, 120, 240 480 exmenes y adems realiza el
antibiograma y CMI.
6.- Los sistemas Microscan WALKAWAY-96 y 40
7.- El sistema sensititre AP80
8.- Deteccin de Salmonella por la tcnica TECRA UNIQUE
9.- Deteccin de Vibrio cholerae por el mtodo SMART
Sistemas de Identificacin mediante Mtodos Moleculares.
1.- Los sistemas BAX utilizan el poder del PCR para lograr resultados rpidos y confiables. Cada
prueba est diseada para amplificar un segmento de DNA especfico de cada organismo, produciendo
en pocas horas niveles tales para ser detectados. Incluyen todos los primers requeridos, polimerasa y
nucletidos en una pastilla nica, empaquetada dentro del tubo de muestra, evitando errores de
manipulacin
3. - The RiboPrinter Microbial Characterization System. Este sistema detecta mltiples copias del gen
RNAr 16 s logrando la identificacin de cualquier bacteria en menos de 8 horas.
Mtodos inmunolgicos para deteccin y/o cuantificacin de microorganismos.
115
1.- VIDAS y mini VIDAS. Emplea la tecnologa ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay) que utiliza el
principio de determinacin que asocia el marcaje por una enzima y una medida por fluorescencia.
Ejemplo deteccin de Salmonella por el sistema VIDAS.
2.- Sistemas VIP. Es un ensayo de inmuno-precipitacin, de fcil lectura y de alta reproducibilidad.
Dada la amplia diversidad de mtodos, mencionaremos los ms utilizados en el rea de alimentos.

Placas Petrifilm. Las placas Petrifilm han respondido a las necesidades de la industria de alimentos y
bebidas con soluciones innovadoras para el laboratorio, constituyen un conjunto de placas listas para
usarse que estn listas para usarse, y que estn diseadas para ahorrar tiempo, costos, espacio de
trabajo, incrementar la productividad, confiabilidad y eficiencia de las operaciones. Contrariamente a los
mtodos tradicionales estn listas para usarse y utilizar en forma directa para muestras de tipo
ambiental, son adems de fcil uso e interpretacin. Se requiere solo de 3 pasos: Inocular, las muestras
se inoculan fcilmente con placas Petrifilm. Incubar, se maximiza el uso de la incubadora con el diseo
de ahorro de espacio. Contar, el diseo de cuadrculas hace el conteo de las colonias rpido y fcil.
Las placas Petrifilm estn disponibles para la mayora de las necesidades de pruebas microbiolgicas,
incluyendo:
1.- Cuenta Aerobia.
2.- Cuenta de Coliformes
3.- Cuenta de Escherichia coli /Coliformes
4.- Cuenta de Enterobacterias
5.- Cuenta de Alta Sensibilidad de Coliformes
6.- Cuenta Rpida de Coliformes
7.- Cuenta Rpida de Staphylococcus aureus
8.- Cuenta Express de Staphylococcus aureus
9.- Cuenta de Mohos y Levaduras
10.- Para monitoreo de Listeria en ambientes (incluye Listeria monocytogenes, L. innocua, L. grayi,
L. murrayi y L. welshimeri)
11.- Para muestreo ambiental y muestreo de superficies.
Las placas Petrifilm estn recubiertas con nutrientes gelatinosos e indicadores especiales que tien a
las colonias, dndoles contraste para su fcil identificacin, en general la placa Petrifilm consta de: a)
una base que contiene papel laminado con polietileno impreso con cuadricula, los nutrientes mezclados
con gel soluble en agua fra y adhesivo, b) una pelcula de prolipropileno, un adhesivo con indicador, gel
soluble en agua fra.
Diferentes placas Petrifilm
El sistema API Es un mtodo de identificacin que combina una galera de reacciones bioqumicas, una
base de datos y un sistema automatizado de interpretacin. El sistema API 20E, diseado originalmente
para la identificacin de la familia Enterobacteriaceae, ha sido ampliado para incluir bacilos no
fermentadores como el gnero Pseudomonas.
116
El API NFT, es utilizado ampliamente para identificar a los microorganismos no fermentadores. El

sistema API incluye todos los reactivos para la identificacin, los cuales se encuentran listos para su uso
y para que podamos identificar a enterobacterias, no enterobacterias, Campylobacter, Staphylococcus,
Streptococcus, Lysteria, Neisseria, Haemophilus, levaduras, bacterias anaerobias estrictas, entre otros.
SISTEMA API 20E. Pruebas bioqumicas que incluye.
Prueba Reaccin / Enzimas Negativo Positivo

ONPG beta-galactosidasa sin color amarillo
ADH arginina deshidrolasa amarillo rojo o naranja
LDC lisina descarboxilasa amarillo rojo o naranja
ODC ornitina descarboxilasa amarillo rojo o naranja
CIT utilizacin del citrato verde azul oscuro o turquesa
sin precipitado
H2S produccin de H2S precipitado negro
negro
URE ureasa amarillo rojo o naranja
TDA triptfano desaminasa amarillo marrn-rojo
color rosa o anillo rosa-
IND produccin de indol amarillo
rojo
produccin de acetona (Voges-
VP sin color rosa-rojo
Proskauer)
GEL gelatinasa sin difusin difusin de pigmento
GLU fermentacin/oxidacin de glucosa azul o verde amarillo
MAN fermentacin/oxidacin de manitol azul o verde amarillo
INO fermentacin/oxidacin de inositol azul o verde amarillo
SOR fermentacin/oxidacin de sorbitol azul o verde amarillo
RHA fermentacin/oxidacin de ramnosa azul o verde amarillo
SAC fermentacin/oxidacin de sacarosa azul o verde amarillo
MEL fermentacin/oxidacin de melobiosa azul o verde amarillo
AMY fermentacin/oxidacin de amigdalina azul o verde amarillo
ARA fermentacin/oxidacin de arabinosa azul o verde amarillo
OX citocromo oxidasa
3.-MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO

3.1. MATERIAL
Contador de colonias Portaobjetos y cubreobjetos
Mechero Gradilla metlica
Asa bacteriolgica Tubos de ensaye
Incubadora a 37 C Frascos para dilucin
Pipeta automtica
3.2 REACTIVOS
Agua peptonada Placas Petrifilm para cuenta de organismos
coniformes
Tiras reactivas API 20E
Placas Petrifilm para cuenta de Escherichia coli
Placas Petrifilm para cuenta de aerobios
117
Solucin salina Placas Petrifilm para cuenta de hongos y levaduras

3.3 CEPAS
*Escherichia coli Salmonella sp
3.4 MUESTRAS
Jugo de zanahoria, chocolate en polvo, harina, queso, jamn
Placas Petrifilm
INSTRUCCIONES
1.- La preparacin de la muestra se realiza tal y como se indica en la tcnica y las diluciones son la que
se elija el analista dependiendo del tipo de muestra.
2.- Para la inoculacin levantar la superficie superior con cuidado y con la pipeta automtica inocular 1
mL en el crculo delimitado.
3.- Con cuidado dejar caer la pelcula superior evitando la formacin de burbujas.
4.- Con el difusor, extender la muestra por toda la superficie delimitada presionando con precaucin.
Esperar a que la muestra difunda por un minuto.
5.- Incubar a 35 2 C durante 24 horas
6.- Leer las placas Petrifilm con el contador de colonias o en forma visual.
RESULTADOS. (Interpretacin de placas Petrifilm)
Placa de recuento aerbico. Se presentan colonias rojas en la superficie de la placa, si el nmero es
mayor a 250 UFC, se procede a contar las colonias en 1 cm2 y multiplicar por 20 para obtener el nmero
total, esto es porque el rea total de una placa es de 20 cm 2.
Placa para recuento de Coliformes. El indicador rojo en la placa colorea las colonias fermentadoras de
lactosa, la pelcula superior atrapa el gas producido por los microorganismos coliformes.
Placa para recuento de Escherichia coli. Tiene el indicador -glucoronidasa para la deteccin de
coniformes, en particular Escherichia coli. Las colonias de Escherichia coli producen la enzima
glucoronidasa, reaccionando con el indicador, lo que da como resultado un precipitado azul alrededor
de la colonia, muchas de ellas producen gas, quedando atrapado en la pelcula. Las colonias que no
son de Escherichia coli muestran u color rojo.
Placa para recuento de Hongos y Levaduras. No se requiere de la adicin de antibiticos o de cido
tartrico. Este mtodo requiere de la diferenciacin de hongos y levaduras. Hongos: son colonias
filamentosas, difusas, el color es variable por los pigmentos, usualmente un foco en el centro de la
colonia. Levaduras: colonias pequeas, bien definidas y de colores tenues. En el caso de tener cuentas
incontables, contar en 1 cm2 y multiplicar por 30.
Los tiempos de incubacin y temperatura son similares a los mtodos convencionales.
Sistema API E20
Los microorganismos deben ser aislados y despus identificados, una vez aislados podemos medir
especficamente los cambios fisicoqumicos resultado del crecimiento o actividad metablica, para ello
se han desarrollado diversos mtodos debido a la necesidad de detectar a los microorganismos como
el sistema API
El APHI 20 E es un sistema estandarizado que permite la identificacin de enterobacterias y otros
bacilos Gram negativos no exigentes, que incluyen 21 pruebas bioqumicas mimiaturizadas.
118
Principio: La galera del sistema APHI 20 E se compone de 20 microtubos que contiene los sustratos
deshidratados. Loa microtubos se inoculan con una suspensin bacteriana
Reactivos complementarios: API OF
Es un mtodo de identificacin que emplea reacciones bioqumicas y el que vamos a utilizar es el API
20 E y el API STAPH.
INSTRUCCIONES
1) Primero tenemos que aislar al microorganismo en medios selectivos, posteriormente colocarla en un
caldo nutritivo o en una placa de agar de soya y tripticasena, de tal forma que el cultivo sea de 18 h.
2) Sacar la tira API (galera) que contiene las siguientes pruebas ONPG, ADH, LDC, ODC, CIT, H2S,
URE, TDA, IND, VP, GEL, GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY y ARA.
3) Preparacin de la galera: Reunir fondo y tapa de una cmara de incubacin y repartir
aproximadamente 5 ml de agua destilada en los alveolos para crqar una atmosfera humeda. Etiquetar
en la lengeta lateral.
4) Sacar la galera de su envase y colocarla en la cmara de incubacin
5) Preparacin del inoculo Preparar la suspensin microbiana en 5 ml de solucin salina fisiolgica y
a una turbidez del nefelmetro de Mac Farland de 2.
6) Inoculacin de la galera. Introducir la suspensin bacteriana en los tubos de la galera con la ayuda
de una pipeta, evitando la formacin de burbujas en el fondo de los tubos.
7) Para las pruebas: llenar el tubo y la cpula

8) Para las pruebas: ADH LCD ODC H2S y URE crear una atmosfera anaerobia llenando la cpula con
aceite de parafina.
9) Cerrar la cmara de incubacin
10) Incubar 36 h 2 C durante 18-24h.+
Lectura de interpretacin:
11) Prueba de TDA, agregar una gota de reactivo TDA. Un color marrn rojizo indica una reaccin (+)
12) Prueba de IND: agregar una dota del reactivo JAMES. Un color rosado que se disemina en toda la
cpula indica una reaccin (+)
13) Prueba de VP2 esperar un minuto de 10 minutos un color rosa o rojo indica una reaccin (+), una
dbil coloracin rosa que aparece despus de 10 minutos en (-).
14) Interpretacin: Determinar el perfil numrico, donde las pruebas estn separadas en grupos de 3,
como la galera API 20 E se compone de 20 ensayos sumar al interior de cada grupo los valores que
corresponden a las reacciones positivas y se obtiene el bionmero de 7 cifras.
15) Identificacin: se realiza a partir de la base de datos y se obtiene con el software de
identificacin.
16) En algunas ocasiones es necesario la realizacin de pruebas adicionales como la reduccin de
Nitratos a nitritos, para ello aadir una gota de los reactivos NIT 1 y Nit 2 en el tubo de GLU, esperar de
2 a 5 minutos y una coloracin roja indica una reaccin (+)
17) Control de calidad 1 Proteus mirabilis 2.- E. coli
119
ONPG ADH LCD ODC H2s URE TDA IND GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA NO2 N2
- - - + v + + + - - v + - - - - v - - - + -
+ - + + - - - - + - - + + - + + - + - + + -
Tabla de lectura
Prueba Componerntes activos Cantidad Reacciones-enzimas Resultados

Negativo positivo
ONPG 2 nitro fenilD- 0.223 galactyosidasa (Orto Nitrofenil Incoloro Amarillo (1)
galactopiranosido D galactopiranosido
ADH L-arginina 1.9 Arginina DiHidrolasa Amarillo Anaranjado(2)
LCD L- lisina 1.9 Lisina Descarboxilasa Amarillo Anaranjado
ODC L- ornitina 1.9 Ornitina DesCarboxilasa Amarillo Anaranjado (2)
CIT Citrato de sodio 0.756 Utilizacin del CITrato Verde palido- amarillo Azul-verde azu (3)l
H2S Tiosulfato de sodio 0.075 Produccin de H2S Incoloro grisceo Depsito negro
URE urea 0.76 UREasa Amarillo Rojo anaranjado(2)
TDA L- triptfano 0.38 Triptofano DesAminasa amarillo Marrn rojizo
IND L-triptfano 0.19 Produccin de InDol Verde plido amarillo rosa
VP Piruvato de sodio 1.9 Produccin de acetoina Rosa plido Rosa rojo(5)
GEL Gelatina bovina 0.6 GELatinasa No difusin Difusin del pigmento negro
GLU D- glucosa 1,9 GLUcosa Oxidacin- Azul-azul verdoso Amarillo/amarillo
fermentacin
MAN D-manitol 1.9 MANitol Fermentacin- Azul-azul verdoso amarillo
Oxidacin
INO Inositol 1.9 Fermentacin-Oxidacin Azul-azul verdoso amarillo
INOsitol
SOR D-sorbitol 1.9 Fermentacin-Oxidacin Azul-azul verdoso amarillo
SORbitol
RHA L-rammnosa 1.9 Fermentacin Oxidacin Azul-azul verdoso amarillo
RHAmnosa
SAC D-sacarosa 1.9 Fermentacin-Oxidacin Azul-azul verdoso amarillo
SACarosa
MEL D-Melobiosa 1.9 Ferm,entacin-oxidacin Azul-azul verdoso amarillo
MELobiosa
AMY Amigdalina 0.57 AMYgdalina Fermentacin Azul-azul verdoso amarillo
Oxidacin
ARA L-arabinosa 1.9 ARAbinosa Fermentacin Azul-azul verdoso amarillo
Oxidacin
1.- La aparicin de un color amarillo ligero implica un resultado +

2.- La aparicin de un color naranja tras 36 h de incubacin debe considerarse negativa
3.- Lectura en la cpula (zona aerobia)
4.- La fermentacin comienza en la parte inferior de los tubos, mientras que la oxidacin empieza en
la cpula
5.- Una ligera coloracin rosa, que aparece tras 10 minutos debe ser leda como negativa
120
INSTRUCCIONES
1.- De la suspensin bacteriana, inocular las tiras API proporcionadas
3.- Sacar la tira API que contiene las siguientes pruebas ONPG, ADH, LDC, ODC, CIT. H2 S, URE, TDA,
IND, VP, GEL, GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY Y ARA.
4.- Para la inoculacin de los pozos se llenan de diferente forma, el CIT, VP Y GEL, se llenan
completamente, lo que estn subrayados se llenan solo la base y se le adiciona una gota de aceite
mineral y los que no lo estn se llena nicamente la base.
5.- En la base de la tira API se colocan 10 mL de agua destilada para que el sistema este hmedo.
6.- Incubar a 35 2 o C durante 24 horas.
7.- Despus de la incubacin, leer los resultados adicionando los reactivos correspondientes.
5. RESULTADOS
En base a los resultados obtenidos en las placas Petrifilm, anota el alimento, el grupo bacteriano
encontrado y la cuenta que realizaste.
Alimento Cuenta total aerobia Organismos Escherichia coli Mohos y Levaduras
Coliformes
OMA
Con base a los resultados obtenidos en el sistema API E20, verifica que se trata de la cepa
proporcionada comparando con las tablas de pruebas bioqumicas.
Prueba Resultado Prueba Resultado
ONPG GLU
ADH MAN
LDC INO
ODC SOR
CIT RHA
H2S SAC
URE MEL
TDA AMY
IND ARA
VP OX
GEL
Cepa identificada_____________________________
121
5.1.- Investiga cmo se utilizan las placas Petrifilm para muestreo ambiental y de superficies
5.2.- Qu otros mtodos rpidos conoces?
5.3.- Qu muestras se pueden manejar con las placas Petrifilm?
5.4.- Qu mtodo elegiras para trabajar si tuvieras una demanda grande de trabajo, pero tambin
tienes que cumplir con las normas establecidas?
5.5- Qu enzima se detecta al hacer la cuantificacin de Escherichia coli?
6. ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS.
6.1 Discutir las ventajas y desventajas de cada una de los mtodos utilizados, en comparacin con los
mtodos convencionales.
7. CONCLUSIONES.
7.1 Elabora tus conclusiones tomando en cuenta los objetivos de la prctica, los resultados y la
bibliografa consultada.
http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/LabV/API/api.html
http://cms.3m.com/cms/MX/es/0-253/kReiiFN/view.jhtml
8. BIBLIOGRAFIA.
Brock,T.D.; Smith y M.T. Madigan. Biologa de los Microorganismos. 8. Edicin. Prentice- Hall. Espaa.
956 pgs.
Koneman, E.W. y S.D. Allen, W. R. Bocuell. Diagnstico Microbiolgico. 5 edicin Mdica
Panamericana. 2001. Mxico. 1432 pgs.
122
AGARES
1. AGAR BACTERIOLGICO
El agar bacteriolgico Bioxon se usa en la preparacin de medios de cultivo microbiolgicos slidos y
semislidos. Tambin puede utilizarse en concentraciones menores como retardante de la
penetracin del oxgeno en medios lquidos, la cantidad utilizada es de 15 g/l
2. AGAR NUTRITIVO
Frmula en g/l de agua destilada:
Peptona de gelatina 5g
Extracto de carne de res 3 g
Agar 15 g
pH final = 6,8 0,2
Mtodo de preparacin:
Suspender 23 g de polvo en un litro de agua destilada. Mezclar bien y dejar en reposo por 15
minutos. Calentar a ebullicin de 1 a 2 minutos. Distribuir y esterilizar a 121 C durante 15 minutos.
Determinar la funcionalidad del medio de cultivo con microorganismos tpicos.
3. AGAR PARA MTODOS ESTNDAR
Peptona de casena 5g
Extracto de levadura 2.5 g
Glucosa 1g
Agar 15 g
pH final = 7,0 0,1
Suspender 23,5 g de polvo en un litro de agua destilada. Disolver al calor y esterilizar a 121 C
durante 15 minutos, vaciar en placas estriles
4. AGAR CITRATO DE SIMMONS
Fosfato dehidrogenado de amonio 1,0 g
Fosfato dipotsico 1,0 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Citrato de sodio 2,0 g
Sulfato de magnesio 0,2 g
Agar 15,0 g
Azul bromotimol 0,06 g
Agua 1 000,0 ml
pH final 6,9 0,2
Suspender el medio deshidratado en un litro de agua, dejar remojar durante 5 a 10 minutos. Mezclar
bien y calentar agitando frecuentemente hasta ebullicin y completa disolucin. Distribuir volmenes
de 3 ml en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar a 121C durante 15 minutos. Los tubos se dejan enfriar
en posicin inclinada de manera que el medio de cultivo en el fondo del tubo alcance una profundidad
de 1 a 1,5 cm. Se puede emplear tambin como medio en placas.
5. AGAR DE HIERRO TRIPLE AZCAR
123
Mezcla de peptonas 20,0 g

Lactosa 10,0 g
Sacarosa 10,0 g
Dextrosa 1,0 g
Sulfato de amonio frrico 0,2 g
Rojo fenol 0,025 g
Agar 13,0 g
Tiosulfato de sodio 0,2 g
Agua 1 000,0 ml
pH final 7,3 0,2
Suspender el medio deshidratado en un litro de agua, remojar de 10 a 15 minutos. Calentar agitando
frecuentemente hasta ebullicin y completa disolucin. Distribuir en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar
a 118C durante 15 minutos. Los tubos se deben enfriar en posicin inclinada de manera que el
medio de cultivo en el fondo del tubo alcance una profundidad de 1,5 a 2,0 cm.
6. AGAR HIERRO Y LISINA (LIA)
Extracto de levadura 3g
Glucosa 1g
L-lisina 10 g
Citrato frrico de amonio 0,5 g
Prpura de bromocresol 0,02 g
Agar 13,5 g
pH final = 6,7 0,2
Suspender 33 g de polvo en un litro de agua destilada. Calentar agitando con frecuencia hasta el
punto de ebullicin para disolver el medio por completo. Distribuir 5 ml en tubos de 13 X 1000 mm y
esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Dejar enfriar en posicin inclinada.
7. AGAR EMB (AGAR EOSINA AZUL DE METILENO)
Digerido pancretico de gelatina 10,0 g
Fosfato dibsico de potasio 2,0 g
Agar 15,0 g
Lactosa 10,0 g
Eosina "Y" 0,4 g
Azul de metileno (Metiltionina) 0,065 g
Agua 1 000,0 ml
pH despus de esterilizar 7,1 0,2
Disolver el digerido pancretico de gelatina, el fosfato dibsico de potasio y el agar en el agua.
Esterilizar, dejar enfriar y antes de utilizar, agregar las siguientes soluciones a cada 100 ml de agar
lquido: 5 ml de solucin 1:5 de lactosa, 2 ml de solucin 1:50 de eosina "Y" y 2 m l de solucin 1:300
de azul de metileno. Mezclar.
8. AGAR PDA (AGAR DE PAPA Y DEXTROSA)
Infusin de papa (slidos) 4 g
124
Dextrosa 20 g
Agar 15 g
pH final = 5,6 0,1
Suspender 39 g del polvo en un litro de agua destilada. Mezclar perfectamente, calentar con agitacin
frecuente y hervir durante un minuto hasta disolucin completa, distribuir y esterilizar a 121 C
durante 15 minutos.
9. AGAR LISINA HIERRO
Peptona de gelatina 5,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Dextrosa 1,0 g
L-lisina 10,0 g
Citrato frrico-amnico 0,5 g
Trisulfato de sodio (anhidro) 0,04 g
Prpura de bromocresol 0,02 g
Agar 15,0 g
Agua 1 000,0 ml
pH final 6,7 0,2
Suspender el medio deshidratado, remojar unos 15 minutos, calentar para disolver los ingredientes
agitando con frecuencia y hervir durante un minuto o hasta disolucin completa. Distribuir en
porciones de 4 ml en tubos con tapn de rosca de 13 x 100 mm. Esterilizar en autoclave 12 minutos a
121C. Dejar solidificar en posicin inclinada a tener 4 cm de un extremo y 2,5 cm sesgado. Cerrar
con cuidado las tapas a fin de evitar prdidas de agua por evaporacin.
125
CALDOS
1. CALDO ROJO DE METILO Y VOGUES PROSKAUER (RM-VP)
Peptona especial No. 1 7,0 g
Dextrosa 5,0 g
Agua 1 000,0 ml
pH final 6,9 0,2
Disolver el medio deshidratado en un litro de agua, mezclar bien, si es necesario calentar un poco
hasta disolucin total. Distribuir y esterilizar a 121C durante 15 minutos.
2. CALDO NUTRITIVO
Extracto de carne de res 3g
pH final = 6,9 0,2
Suspender el almidn en 100 ml de agua destilada. Disolver los dems ingredientes en 900 ml de
agua destilada con calentamiento y agitacin continua, mezclar ambas suspensiones y esterilizar a
115 C por 15 minutos en autoclave.
3. CALDO DE MALONATO DE EWING MODIFICADO
Formula en g/l de agua destilada:
Extracto de levadura 1g
Sulfato de amonio 2g
Fosfato monopotsico 0,4 g
Cloruro de sodio 2g
Malonato de sodio 3g
Dextrosa 0,25 g
Azul de bromotimol 0,025 g
pH final = 6,7 0,2
Disolver 9,3 g de polvo en un litro de agua destilada. Distribuir en tubos de ensaye adecuado y
esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos.
4. CALDO DE INFUSIN DE CEREBRO Y CORAZN
Infusin de cerebro de ternera200 g
Infusin de corazn de res 250 g
Peptona de gelatina 10 g
Cloruro de sodio 5g
Fosfato disdico 2,5 g
Dextrosa 2g
pH final = 7,4 0,2
Disolver 37 g de polvo en un litro de agua destilada. Si es necesario calentar suavemente para
disolverlo.
126
Distribuir y esterilizar a 121 C durante 15 minutos, para obtener buenos resultados el medio debe
utilizarse el mismo da de su preparacin.
5. CALDO ROJO DE FENOL CON LACTOSA
Peptona de casena 10 g
Cloruro de sodio 5g
Rojo de fenol 0,018 g
Lactosa 5g
pH final = 7,4 0,2
Disolver 20 g de polvo en un litro de agua destilada. Mezclar y calentar frecuentemente hasta su
ebullicin y completa disolucin. Distribuir y esterilizar en autoclave de 116 a 118 C durante 15
minutos.
6. CALDO UREA
Urea 20 g
pH final = 6,8 0,2
Disolver 3,87 g en 100 ml de agua destilada. Esterilizar por filtracin. Distribuir en cantidades de 0,1 a
1 ml en tubo estriles. En lugar de esterilizarse por filtracin puede esterilizarse en autoclave a 108 C
de 7 a 10 minutos.
7. CALDO NITRATO
Nitrato de potasio 1g
pH final = 7,0 0,2
Pesar exactamente las cantidades, rehidratar con agua destilada y calentar suavemente hasta
disolucin total. Distribuir 5 ml en tubos de 13 X 100.y esterilizar a 121 C durante 15 minutos.
8. CALDO KCN
MEDIO BSICO
Peptona 3g
Cloruro de sodio 5g
Fosfato de potasio monobsico (KH2 PO4) 0,225 g
Fosfato dibsico de sodio (Na2 HPO4.2H2O) 5,64 g
pH final = 7,6 0,2
Pesar exactamente las cantidades y rehidratar con agua destilada, calentar suavemente si es
necesario hasta su disolucin. Distribuir 5 ml en tubos de 13 X 100 mm con tapn de rosca y
127
esterilizar a 121 C durante 15 minutos.

CIANURO DE POTASIO
Preparar un tubo con tapn de rosca, estril
KCN 0.5 g
No absorber la solucin de KCN con la pipeta por la boca, usar una pipeta de jeringa o bulbo. El
cianuro es sumamente venenoso y puede causar la muerte.
A los 5 ml del medio bsico fri agregar 1 ml de KCN al 0,5 % utilizando una pipeta de bulbo y
mezclar bien.
9. MEDIO ROJO DE METILO VOGES PROSKAUER
Peptona especial No. 1 7,0 g
Dextrosa 5,0 g
Agua 1 000,0 ml
pH final 6,9 0,2
Disolver el medio deshidratado en un litro de agua, mezclar bien, si es necesario calentar un poco
hasta disolucin total. Distribuir y esterilizar a 121C durante 15 minutos
10. CALDO UREA
Urea 20,0 g
Fosfato de sodio 9,5 g
Agua 1 000,0 ml
pH final 6,8 0,2
Disolver 38,61 g en 1 000 ml de agua, calentando en caso necesario a 60C como mximo. Esterilizar
por filtracin o tras distribucin a razn de 3 ml por tubo; o bien esterilizar con cuidado en marmita de
vapor durante 5 minutos. No esterilizar en autoclave.
128
MEDIOS SEMISLIDOS
1. MEDIO PARA PRUEBA DE MOVILIDAD (SIM)
Medio SIM
Peptona de casena 20,0 g
Peptona de carne 6,1 g
Sulfato de hierro y amonio 0,2 g
Agar 3,5 g
Agua 1000,0 ml
pH final 7,3 0,2
Suspender el medio deshidratado en un litro de agua, agitando frecuentemente. Remojar durante 10
minutos y hervir a ebullicin durante un minuto. Distribuir en tubos de ensayo a una altura de unos 4
cm y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos.
2. MEDIO BASAL OF o MEDIO DE HUGH Y LEIFSON
Peptona Casena 2,0 g
Azul bromotimol 0,03 g
Agar 2,5 g
Agua 1 000,0 ml
pH final 7,1 0,2
Suspender el medio deshidratado en un litro de agua, remojar de 10 a 15 minutos. Calentar agitando
con frecuencia, hasta disolver el agar. Agregar 10 ml de solucin de glucosa al 10% esterilizada por
filtracin (o del azcar apropiado) por cada 100 ml del medio fluido, mezclar y distribuir aspticamente
5 ml en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar en autoclave a 118C durante 10 minutos a fin de evitar la
degradacin del azcar. El medio tiene un color verde.
3. MEDIO INDOL ORNITINA (MIO)
Peptona 10,0 g
Triptona 10,0 g
L-ornitina 5,0 g
Dextrosa 1,0 g
Agar 2,0 g
Bromocresol prpura 0,02 g
Agua 1 000,0 ml
pH final 6,5 0,2
Disolver el medio deshidratado en un litro de agua, remojar unos 5 minutos, calentar a ebullicin.
Distribuir porciones de 4 ml en tubos de 10 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121C durante 15
minutos.
4. GELATINA NUTRITIVA
Gelatina 120 g
129
pH final = 6,8 0,2

Suspender 128 g de polvo en un litro de agua destilada. Calentar ligeramente para disolver y distribuir
en tubos. Esterilizar a 121 C durante 15 minutos.
130
SOLUCIONES Y REACTIVOS
1. Aceite mineral
Envasar y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos.
2. Solucin de rojo de metilo
Formula:
Rojo de metilo 0.1 g
Alcohol etlico 300 ml
Disolver el rojo de metilo en el alcohol y diluir con el agua destilada, para llevar a cabo la prueba,
aadir 5 gotas de la solucin a 5 ml del cultivo problema.
Resultados: Un color rojo demuestra un pH menor a 4,5 y la prueba es Positiva. Un color amarillo se
reporta como prueba Negativa.
3. Solucin de cido tartrico al 10% p/v
Formula:
Acido tartrico 10,0 g
Agua c.b.p. 100,0 ml
Disolver el cido tartrico en 50 ml de agua, aforar a 100 ml, envasar y esterilizar por filtracin por
membrana
4. Solucin de -Naftil amina
Frmula:
Dimetil alfa naftil amina 5,0 g
cido actico 5 N 1,0
5. SOLUCIN DE HIDRXIDO DE POTASIO AL 40 %
Frmula:
Hidrxido de potasio 40 g
6. SOLUCIN DE ALFA NAFTOL
Frmula:
Alfa naftol 5g
Etanol 100 ml
8) Reactivo de Kovacs y Ehrlich
Para-dimetil-amino-benzaldehdo 5,0 g
Alcohol amlico o butlico 75,0 ml
Acido clorhdrico (37%) QP 25,0 ml
Disuelva el para-dimetil-amino-benzaldehdo en el alcohol. Caliente suavemente la solucin en un
bao de agua tibia. Una vez disueltos los ingredientes, agregue el cido clorhdrico con cuidado.
9) Prueba de Vogues Proskauer
Esta prueba es para comprobar la presencia del diacetilo.
Formula:
Alfa naftol 5g
Alcohol etlico absoluto 100 ml
131
Aadir 0,6 ml de la solucin de alfa naftol y 0,2 ml de una solucin acuosa al 40% de KOH a 1 ml de
cultivo.
Resultados: El desarrollo de una coloracin roja en 15 minutos constituye una reaccin Positiva.
10) Reaccin de Indol (reactivo de Kovac)
Formula:
P-dimetilaminobenzaldehdo 5,0 g
Alcohol amlico.o alcohol isoamlico750 ml
Acido clorhdrico concentrado 25 ml
Disolver el p-dimetilaminobenzaldehdo en el alcohol amlico y agregar el cido clorhdrico
lentamente, gota a gota y agitando. Debe conservarse en frasco mbar con tapn esmerilado; el
color del reactivo va del amarillo al caf claro. Se debe conservar a 4 C.
Disolver los ingredientes en agua destilada. Mezclar bien y calentar a ebullicin, agitando
ocasionalmente hasta completa disolucin. Enfriar a 60 C y ajuste el pH de 7,3 0,1.
11) Solucin de cido sulfanilico
Formula:
cido sulfanlico 8,0 g
cido actico 5N
(Una parte de cido actico glacial a 2.5 partes de agua) 1,0 L
12) Solucin de agua oxigenada 1:10
Preparacin:
Preparar momentos antes de usarla. Colocar 1 ml en 9 ml de agua destilada.
13) Solucin de telurito de potasio al 1% p/v
Telurito de potasio 1,0 g
Disolver el telurito en 50 ml de agua, aforar a 100 ml, envasar y esterilizar por filtracin por
membrana.
14) Solucin salina al 0,85%
Agua c.b.p. 1 000,0 ml
Disolver el cloruro de sodio en 500 ml de agua, aforar a 1 000 ml, ajustar el pH a 7,2 0,1 filtrar,
envasar y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos.
15) Solucin de agua oxigenada al 3% v/v
Perxido de Hidrgeno 3,0 ml
Mezclar el perxido en agua, aforar a 100 ml y envasar.
16) Solucin indicadora rojo de metilo
Rojo de metilo 0,1 g
Alcohol al 95% 300,0 ml
Mezclar el rojo de metilo en el alcohol y diluir con agua a 500 ml.
132
17) Solucin yodo-yodurada

Yoduro de potasio 2,0 g
Yodo 1,0 g
Agua 100,0 ml
Triturar en un mortero el yodo y el yoduro de potasio, adicionar el agua necesaria para que se
disuelva el yodo, agregar agua hasta un volumen de 100 ml. Conservar protegido de la luz.
18) Solucin safranina
Safranina "O" 2,5 g
Alcohol etlico al 95% 100,0 ml
Disolver la safranina "O" en el alcohol etlico.Tomar 10 ml de esta solucin y llevar a 100 ml con
agua. Agitar.
19) Solucin alcohol-acetona
Partes iguales de acetona y alcohol etlico al 95%.
20) Reactivo de Ehrlich
Frmula:
Para-dimetil amino benzaldehdo 2g
Alcohol etlico absoluto 190 ml
cido clorhdrico concentrado40 ml
133
COLORANTES, DECOLORANTES Y MORDENTE

1) Cristal violeta
Formulacin en g/100 ml:
Cristal violeta 2
Agua destilada 80
Etanol al 95% 20
Oxalato de amonio 0,8
Preparacin:
Disolver el cristal violeta en 20 ml de etanol al 95%. Posteriormente disolver 0,8 g de oxalato de
amonio en 80 ml de agua. Una vez terminadas las soluciones mezclarlas.
2) Yodo (lugol-Mordente)
Yoduro de potasio 2
Yodo 1
Agua destilada 100
Preparacin:
Disolver 2 gramos de yoduro de potasio en agua destilada. Agregar el gramo de yodo metlico y
disolver. Aforar a 100 ml con agua destilada y colocarlo en un frasco mbar.
3) Alcohol cetona
Acetona 50
Alcohol etlico 100
Preparacin:
Adicionar lentamente el alcohol etlico a la acetona y mezclar con cuidado. Guardar en frasco
hermticamente cerrado, hasta su uso.
4) Safranina
Agua destilada 100
Safranina 0,5
Preparacin:
Disolver los 0,5 g de safranina en 20 ml de agua destilada. Despus aforar a 100 ml con agua
destilada.
5) Fucsina fenicada
Formulacin:
Solucin A
Fucsina bsica 0,3
Alcohol etlico al 95% 10
Mezclar hasta disolucin completa
Solucin B
Cristales de fenol 5
Agua destilada 95
Preparacin:
Combinar las dos soluciones A y B. Filtrar a travs de un papel filtro Whatman No 2. Mantener la
solucin en un frasco mbar, protegida de la luz y filtrar nuevamente si es necesario.
6) Azul de metileno
Formulacin:
Azul de Metileno 1g
134

Preparacin:
Disolver el gramo de azul de metileno en los 100 ml. de agua destilada.
7) Verde de malaquita
Formulacin:
Verde de malaquita 10 g
Preparacin:
Disolver el colorante en el agua. Filtrar a travs de papel filtro Whatman No. 2. Guardar el colorante
en frasco mbar.
135
ESTNDARES NEFELOMTRICOS DE McFARLAND
1.- Preparacin de estndares: Sulfato de bario

Reactivos:
BaCl2, solucin acuosa al 1 %
H2SO4 QP al 1 %
BaCl2, + H2SO4 BaSO4 + 2 HCl
2.- Preparar 10 tubos nuevos con tapa de rosca de igual tamao, mismos dimetro, limpios y
enjuagados con agua destilada.
3.- Agregar los reactivos a los tubos rotulados de la siguiente manera en las cantidades que se indican a
continuacin:
Estndares de sulfato de bario
Tubo nmero 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
BaCl2, al 1 % (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
H2SO4 al 1% (ml) 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9,0
Densidad aprox. De 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
clulas (X 108/ml)
Densidad aprox. de 300 600 900 1200 1500 1800 2100 2400 2700 3000
clulas en millones /ml
4.- Tapar los tubos y rotulas

5.- El precipitado de BaSO4 suspendido corresponde aproximadamente a la densidad de clulas
homogneas de E. coli por ml.
Precauciones:
Si el caldo de cultivo es claro, o si es coloreado.
136

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Manual de microbiologa UPIBI_IPN

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BSICAS

Refugia Prez Snchez

NOMBRE DEL ALUMNO: ________________________________________________________

PROFESOR DE TEORA: ________________________________________________________

PROFESORES DE LABORATORIO: _______________________________________________

PERIODO LECTIVO: ____________________________________________________________

Instrucciones generales _____________________________________________________________ 4

Practica No. 1 Microscopia __________________________________________________________ 9

Practica No. 2 Preparaciones fijas y en fresco ____________________________________________ 16

Practica No. 3 Mtodos de esterilizacin y reduccin de la carga microbiana ___________________ 23

Practica No. 4 Nutricin y cultivo de microorganismos aerbicos ____________________________ 31

Practica No. 5 Aislamiento y recuento de microorganismos aerbicos________________________ 46

Practica No. 6 Conservacin de microorganismos_________________________________________ 52

Practica No. 7 Identificacin de microorganismos (bacterias)________________________________ 63

Practica No. 7 Identificacin de microorganismos (mohos y levaduras)________________________ 83

Practica No. 8 Crecimiento microbiano _________________________________________________ 95

Practica No. 10 Mtodos rpidos para la identificacin de microorganismos____________________113

Medios semislidos________________________________________________________________ 128

Soluciones y reactivos _____________________________________________________________ 130

Colorantes, decolorantes y mordente_________________________________________________ 133

Nefelmetro de McFarland________________________________________________________ 135

Una bata limpia y con botones Una fotografa tamao infantil

Un rollo de Masking tape Una regla graduada

Por seccin se deber traer un candado Una caja de cubreobjetos

III.- DEL HORARIO Y COMPORTAMIENTO DE LOS ALUMNOS.

8.- Evitar desplazarse en el laboratorio.

El microscopio es un instrumento ptico que amplifica la imagen de un objeto pequeo. Es el

Funcin bsica de cada parte del microscopio:

a.- Sistema mecnico

b.- Sistema de iluminacin

Tabla 1. Correspondencia entre los

aumentos que tiene el objetivo con el que se est observando.

Microscopio de contraste de fase

Microscopio compuesto Preparaciones fijas de bacterias

4.1 Cuidado y limpieza del microscopio

Pasos a seguir para la iluminacin de Khler en un microscopio

5- Subir completamente el condensador con la 6.- Enfocar la preparacin con el objetivo 4X

4.3 OBSERVACIONES DE UNA PREPARACIN FIJA.

a) Tomar una preparacin y enfocarla a 10 y 40 X.

5.- RESULTADOS Y CUESTIONARIO

Esquematiza la preparacin observada a 40 y 100X, anota el nombre de la muestra (etiqueta):

5.1 Consulta la bibliografa y llena la siguiente tabla

Parte del microscopio Funcin Sistema al que pertenece

Portaobjetos Frasco gotero con solucin de cristal violeta

Staphylococcus aureus Rhizopus sp

3.3 MUESTRA BIOLGICA

a. Si se proporciona un tubo con una suspensin bacteriana, entonces encender el mechero.

4.2 Examen en fresco de una muestra de agua estancada

a. Colocar una gota del colorante azul de algodn lactofenol

e. Lavar los frotis con agua de la llave.

5.3 Tincin simple

5.4 Tincin de Gram:

Escherichia coli Escherichia coli Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus

Micrococcus luteus Micrococcus luteus Bacillus subtilis Bacillus subtilis

5.5 Tincin de Gram (con exceso de decoloracin)

5.6 Tincin de Gram (mezcla de un Gram + y un Gram -)

Aumento real (40X) _______ (100X) _______

5.8 Tincin de Shaeffer - Fulton

(problema y testigo positivo) y se coloca en un recipiente que se va a esterilizar en la forma habitual.

Autoclave a 121 C Incubadora a 35 C

cm para envolver pinza o tijera Cuatro cajas de Petri limpias

3.3 MEDIOS DE CULTIVO

Aumento real (40X) _ (100X) _