Introduccin:

La tcnica de ELISA (Enzime-Linked Inmunosorbent Assay) es una tcnica de

ensayo basada en placa diseada para detectar y cuantificar sustancias tales
como pptidos, protenas, anticuerpos y hormonas. Otra tcnica que se basa en el
mismo principio es el inmunoensayo enzimtico (EIA).
La prueba se lleva a cabo primordialmente en placas de poliestireno, la cual se
puede unir a antgenos y anticuerpos, para que a su vez se unan una serie de
molculas que faciliten la deteccin del analito.
La deteccin del analito tiene lugar por la presencia de una enzima o un marcador
el cual se encuentra unido a un anticuerpo primario o secundario, los cuales son
afines por el analito. Las enzimas ms usadas son la peroxidasa de rbano
picante (HRP) y fosfatasa alcalina (AP). Existen otras enzimas aun no muy
aceptadas debido a su lmite de sustratos son la B-galactosidasa, la acetil
colinesterasa y la catalasa.
La prueba de Elisa puede sufrir una serie de modificaciones en su procedimiento
bsico. La clave est en la inmovilizacin del antgeno, la cual puede ser por
adsorcin en la placa o por unin con anticuerpos unidos a la placa. Y se puede
subdividir la prueba de ELISA en directa e indirecta, debido a deteccin del
antgeno con un anticuerpo primario o secundario respectivamente. La forma ms
sensible de la prueba de ELISA es el ensayo en sndwich, donde el analito se
detecta por la unin de 2 anticuerpos primarios (anticuerpo de captura y el
anticuerpo de deteccin). El tipo sndwich se usa principalmente por su robustez y
sensibilidad.

Elisa Directa
Ventajas Desventajas
Rpido debido a los pocos pasos a La inmunoreactividad del
seguir. anticuerpo primario puede verse
Se evita la reactividad cruzada afectada de manera negativa por la
generada por el anticuerpo unin de los marcadores o
secundario enzimas.
El marcado de cada anticuerpo
primario especfico para cada
ELISA requiere tiempo y dinero.
No hay flexibilidad del etiquetado
 de anticuerpos primarios entre
experimentos.
La seal de amplificacin es
mnima.

Elisa indirecta
Ventajas Desventajas
Una amplia variedad de Puede ocurrir reactividad cruzada
anticuerpos secundarios se con el anticuerpo secundario,
encuentra disponible en el dando una seal no especifica.
mercado. Requiere ms pasos de
Alta versatilidad incubacin.
Se tiene mxima inmunoreactividad
en el anticuerpo primario debido a
que este no se manipula con
anterioridad.
Alta sensibilidad ya que el
anticuerpo primario tiene varios
epitopos para el anticuerpo
secundario.
Versatilidad de marcadores

La prueba de ELISA competitiva consiste en la competencia entre el antgeno

presente en la muestra y el antgeno unido al anticuerpo primario anclado a la
placa. Para esto se adiciona la muestra, se cincuba y se lava con tensoactivos.
Debido a que el antgeno que se encontraba unido a los anticuerpos primarios
contena la etiqueta, al ser desplazado por el antgeno de la muestra, la intensidad
de la seal va a disminuir. Este mtodo presenta la ventaja de tener una alta
sensibilidad.
Se han desarrollado pruebas de ELISA mltiples portables, las cuales consisten en
placas con micropocillos precargados con reactivo, los cuales son lavados y
administrados con muestra gracias a la inmersin de una placa con 8-12 pernos
cargada con muestra o solucin de lavado. La ventaja de estas pruebas es que es
barata, no requieren de personal altamente calificado, o equipos de laboratorio,
por lo cual son ideales para entornos de bajos recursos.

Objetivos:
- Llevar a cabo una prueba de ELISA tipo sndwich para la deteccin de
anticuerpos contra suero bovino en suero de conejo.
- Identificar los puntos crticos durante una determinacin de ELISA.
- Conocer la importancia del aporte de una prueba de ELISA.
 Materiales y mtodo:

Placa con antgeno adsorbido Anticuerpo secundario

Micropipeta de 1000 L Leche entera (Sveltex)
Micropipeta de 200 L 9 tubos de ensaye de 12*75

1. Tomar 15L de anticuerpos y depositarlo en un tubo de ensaye previamente

etiquetado con la letra A Dilucin 1/40-, y adicionarle 585L de bloqueador
2. Tomar 200L de la solucin anterior y depositarlo en un tubo de ensaye
previamente etiquetado con la letra B Dilucin 1/80-, y adicionarle 200L
de bloqueador
3. Tomar 200L de la solucin anterior y depositarlo en un tubo de ensaye
previamente etiquetado con la letra C Dilucin 1/160-, y adicionarle 200L
de bloqueador
4. Tomar 200L de la solucin anterior y depositarlo en un tubo de ensaye
previamente etiquetado con la letra D Dilucin 1/320-, y adicionarle 200L
de bloqueador
5. Tomar 200L de la solucin anterior y depositarlo en un tubo de ensaye
previamente etiquetado con la letra E Dilucin 1/640-, y adicionarle 200L
de bloqueador
6. Tomar 200L de la solucin anterior y depositarlo en un tubo de ensaye
previamente etiquetado con la letra F Dilucin 1/1280-, y adicionarle 200L
de bloqueador
7. Tomar 200L de la solucin anterior y depositarlo en un tubo de ensaye
previamente etiquetado con la letra G Dilucin 1/2560-, y adicionarle
200L de bloqueador
8. Tomar la placa previamente cargada con el antgeno y bloqueador y
enjuagarla 3 veces con solucin de tensoactivos.
9. En cada pocito etiquetado de la A a la H adicionar 90L de cada dilucin
elaborada en los puntos anteriores, adicionando en el pocito H el blanco, el
cual se compone de puro bloqueador.
10. Incubar por 40 minutos y proceder a enjuagar con solucin de tensoactivos
11. Adicionar a cada pocito 90L de revelador (Anticuerpo secundario -dilucin
1:1000-), y dejar reposar 40 minutos
12. Enjuagar con solucin de tensoactivos 3 veces
13. Adicionar el sustrato de la enzima anclada e incubar por 10 minutos en
oscuridad
14. Observar la placa en la oscuridad con el aparato de ELISA.
 Resultados:
=490nm
1
A 0,126
B 0,082
C 0,061
D 0,069
E 0,076
F 0,067
G 0,072
H 0,096

Imagen 1. Grfica de barras de la respuesta emitida por cada dilucin de anticuerpos.

La prueba no sali debido a que el control present un valor superior al de las diluciones,
excepto al de la dilucin 1:40.

Conclusiones:
- No se logr realizar con eficacia la prueba de ELISA no competitiva por el
mtodo de sndwich debido a que el control mostr una respuesta mayor
que a las diluciones efectuadas. Por esta razn resulta conveniente en
estudios posteriores evaluar los factores que podran estar involucrados.
- Para asegurar la precisin de una prueba altamente especifica como la
llevada a cabo es necesario controlar de manera rigurosa las condiciones
bajo las cuales se lleva a cabo dicho ensayo, tales como limpieza, tiempos
de incubacin, temperatura, etc.
Bibliografa:
Gan S. & Patel K. (2013) "Enzyme Immunoassay and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay" en:
Journal of Investigative Dermatology, Volume 133, Issue 9, September 2013, Pages 13

ThermoFischer Scientific. Overview of ELISA, recuperado el 5 de mayo del 2017 de:

https://www.thermofisher.com/mx/es/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-
center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/overview-elisa.html