APNDICE G

Identificacin bioqumica de enterobacterias por el sistema API 20E

OBJETIVO:
- Establecer la metodologa en la identificacin de enterobacterias por medio de
pruebas bioqumicas estandarizadas y miniaturizadas.

GENERALIDADES:
El sistema API 20E (Biomriux 2010) es un sistema de pruebas bioqumicas para
la identificacin de bacterias de la familia Enterobacteriaceae y otros bacilos
Gram-negtivos, mediante 23 pruebas bioqumicas estandarizadas y miniaturizadas
y una base de datos. Este sistema puede identificar 108 gneros y 104 especies
de estas bacterias. La galera API 20E consta de 20 microtubos que contienen los
sustratos deshidratados de las pruebas bioqumicas tradicionales. Se inoculan con
una suspensin bacteriana que rehidrata los medios y despus de la incubacin
se observan los cambios de color con o sin adicin de reactivos (Tabla 1).

La lectura de las reacciones se hace de acuerdo con la tabla de lectura y la

identificacin mediante la tabla de identificacin Analytical Profile Index API 20E
o el software APILAB.

MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y SOLUCIONES

a
1 caja de agar MacConkey
Colorantes y reactivos para tincin de
a a
Gram Tiras para prueba de oxidasa
b
1 tubo de 16 x 150 mm con 5 ml de solucin salina isotnica 0.85% (P/V)
1 tubo de 16 X 150 mm con solucin de MacFarland (mezlcar 0.3 ml de BaCl 2 al
b
1% y aadir 9.7 ml de H2SO4 al 1%)
b
Tiras API 20E (1 por colonia que se desee identificar)
b
Aceite mineral estril
b
Agua para llenado de la cmara hmeda
c
Reactivo de cloruro frrico (TDA)
c
Reactivo de Kovacs (IND)
Reactivo para VP1 (potasa alcohlica al
c c
40%) Reactivo para VP2 (-naftol)

MATERIAL
- b
1 pipeta Pasteur estril
- a, b
Mechero
- a, b
asa microbiolgica
- a, b
Incubadora 352C
- b
Bulbo o propipeta
NOTAS:
a
Material necesario al inicio de la tcnica.
b
Material necesario a las 24 horas de iniciada la tcnica.
c
Material necesario a las 48 horas de iniciada la tcnica.

PROCEDIMIENTO

* Resembrar las colonias seleccionadas por estra en Agar MacConkey.

* Incubar a 352C durante 18 a 24 h.
* Realizar tincin de Gram y observar caractersticas morfo-coloniales de la cepa
con el objetivo de verificar pureza de la colonias seleccionadas. En caso de tener
un carcter Gram-negativo y observar uniformidad en morfologa y tamao de
bacterias proceder con el siguiente paso.
* Efectuar la prueba de la oxidasa. En caso de ser negativa proceder con el
siguiente paso.
* Suspender el crecimiento obtenido en 5 ml de solucin salina al 0.8% (P/V)
(NaCl 0.8 %) hasta igualar turbidez del tubo 3 de MacFarland (preparar mezclando
0.3 ml de BaCl2 al 1% y aadir 9.7 ml de H2SO4 al 1%).
* Proceder a inocular el sistema API 20E de acuerdo con la siguiente metodologa:

* Llenar el tubo y la cpula de las pruebas CIT, VP, GEL con la suspensin
bacteriana.
* Llenar los tubos pero no las cpulas de las dems pruebas.
* Llenar la cpula de las pruebas ADH, LDC, ODC, URE y H2S con aceite mineral
estril para obtener anaerobiosis.
* Incubar a 352C durante 18 a 24 h.

INTERPRETACIN DE RESULTADOS

Pasado el tiempo de incubacin consultar el Cuadro 1, para la adicin de reactivos

en los tubos respectivos y para la interpretacin de resultados.
Consultar el Cuadro 2 para obtener un nmero de identificacin caracterstico para
cada especie.
Consultar la Tabla de identificacin del sistema API 20E (API 20E Analytical Profile
Index, Bio-Mriux 2019) o el software APILAB (Bio -mriux), para determinar el
gnero y la especie de la cepa aislada (En caso de no contar con la bibliografa
mencionada, se podr consultar el Bergeys Manual para la identificacin de la
cepa aislada con base en los resultados de las pruebas bioqumicas).

Cuadro 1. Tabla de lectura para las pruebas bioqumicas del sistema API 20E.
Pruebas Sustratos Reacciones/Enzimas Resultados
Negativo Positivo
 ONPG ortonitrofenol-- -galactosidasa incoloro amarillo (1)
galactsido
AD arginina arginina dehidrolasa amarillo rojo/naranja (2)
H
LDC lisina lisina descarboxilasa amarillo naranja
ODC ornitina ornitina descarboxilasa amarillo rojo/naranja(2)
CI citrato sdico utilizacin de citrato verde azul-verde/verde
T
plido/amarillo (3)
H 2S tiosulfato produccin de H2S incoloro/grisceo depsito negro
sdico
UR urea ureasa amarillo rojo/naranja
E
TDR/lectura inmediata despus de
TDA triptofano triptofano deaminasa agregar el reactivo TDA (5)
amarillo marrn oscuro
IND/lectura 2 min despus de agregar el
IND triptofano produccin de indol reactivo IND (5)
amarillo anillo rojo
VP1 mas VP2/lectura 10 min despus de
VP piruvato sdico produccin de acetona agregar los reactivos VP1 y VP2 (5)
incoloro rosado/rojo
GEL gelatina de gelatinasa no ha difusin de difusin de
Kohn pigmento negro pigmento negro
GL glucosa fermentacin/oxidacin azul/azul-verdoso amarillo
U
(4)
MAN manitol fermentacin/oxidacin azul/azul-verdoso amarillo
(4)
INO inositol fermentacin/oxidacin azul/azul-verdoso amarillo
(4)
SOR sorbitol fermentacin/oxidacin azul/azul-verdoso amarillo
(4)
RH ramnosa fermentacin/oxidacin azul/azul-verdoso amarillo
A
(4)
SA sacarosa fermentacin/oxidacin azul/azul-verdoso amarillo
C
(4)
ME melibiosa fermentacin/oxidacin azul/azul-verdoso amarillo
L
(4)
AMY amigdalina fermentacin/oxidacin azul/azul-verdoso amarillo
(4)
AR arabinosa fermentacin/oxidacin azul/azul-verdoso amarillo
A
(4)
(1) Un amarillo muy plido debe considerarse como positivo.
(2) Un color naranja despus de 24 h de incubacin debe considerarse negativo.
(3) La lectura debe hacerse en la cpula (aerobiosis).
(4) La fermentacin empieza en la parte inferior de los tubos, la oxidacin en la cpula.
(5) TDA:cloruro frrico; IND: reactivo de Kovacs; VP1: hidrxido de potasio 40%; VP2: -naftol.

Fuente: Manual del sistema de identificacin para Enterobacteriaceae y otros bacilos Gram-negativos mediante 23 tests
bioqumicos estandarizados y miniaturizados, y una base de datos, (1989).
Cuadro 2. Sistema de numeracin de las pruebas positivas, para determinar el nmero de identificacin de
enterobacterias por el sistema de identificacin bioqumica API 20E.
VAL
OR ONP ADH LDC ODC CIT H2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA OX
ASIG G
-
NAD
O
a
1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4

sumar valores sumar valores sumar valores sumar valores sumar valores sumar valores sumar valores
a Se le asigna este nmero si el resultado de la prueba fue positivo; si el resultado fue negativo el valor asignado es cero.

Fuente: Giles M. (1995) Estudio sobre las interacciones microbianas importantes para el incremento de protena durante
la fermentacin del pozol. Tesis de licenciatura. Facultad de Qumica, UNAM. 73 p.
BIBLIOGRAFA.

Bio-mriux (1989) API 20E SISTEMA DE IDENTIFICACIN PARA

Enterobacteriaceae Y OTROS BACILOS GRAM-NEGATIVOS. No. 20100.
Biomriux S.A. (de.). Francia. 24 pp.

Giles M. (1995) Estudio sobre las interacciones microbianas importantes para el

incremento de protena durante la fermentacin del pozol. Tesis de Licenciatura.
Facultad de Qumica, UNAM. 73 pp.