Cordn umbilical humano que secreta HGF inducible MSC

derivados de la sangre producido a travs de mediada por TALEN

la Edicin del Genoma Promueve la Angiognesis

Las clulas madre mesenquimales (MSCs) promueven la angiognesis teraputica para curar
trastornos vasculares graves. No obstante, su perodo de supervivencia y la capacidad secretora de
citocinas son limitados. Aunque el factor de crecimiento hepatocitario (HGF) puede acelerar la tasa
de angiognesis, recombinante HGF es limitada debido a su muy corta vida media (<3-5 minutos).
Por lo tanto, el tratamiento continuo con HGF es necesaria para obtener una respuesta
teraputica eficaz. Para superar estas limitaciones, hemos producido genoma-editado que MSCs
secretada HGF sobre drogas de induccin especfica.

Casete de expresin inducible de la HGF se integr en un sitio de safe harbor en un cromosoma

MSC TALEN utilizando el sistema, resultando en la produccin de TetOn-HGF/humano derivado de
la sangre del cordn umbilical (hUCB)-MSCs. La evaluacin funcional de la TetOn-HGF/hUCB-MSCs
mostr que tena una mayor movilidad a la induccin de la expresin de HGF. Adems, la
exposicin a largo plazo por la doxiciclina (DOX) tratados con TetOn-HGF/hUCB-MSCs mejorado las
respuestas antiapopttica de genoma-editado MSCs sometidos aestrs oxidativo y la mejora de la
capacidad de formacin de tubo.

Adems, TetOn-HGF/hUCB-MSCs encapsulada por arginina-glicina-cido asprtico (RGD)-alginato

microgel inducidas a expresar HGF mejorado de angiognesis in vivo en un modelo de ratn de la
isquemia de las extremidades traseras. Este estudio demostr que la inducible HGF-expresando
hUCB-MSCs son competentes para expresar continuamente y secretan HGF de manera controlada.
As, los CSM que expresan HGF en una forma inducible son una modalidad teraputica til para el
tratamiento de las enfermedades vasculares que requieren la angiognesis.

Introduccin
clulas madre mesenquimales derivado de la sangre del cordn umbilical humano (MSCs hUCB)
puede regenerar rganos1 y mejorar la angiognesis.2 Estas clulas pueden diferenciarse en
clulas de msculo liso y endoteliales que participan en el proceso de angiognesis y neo-
vasculogenesis.3 Adems, estas clulas muestran un bajo nivel de inmunogenicidad tras trasplante
alognico. Estas propiedades hacen hUCB.S. ideal para el tratamiento de la angiognesis.
Generalmente, la eficacia teraputica de estos CSM es debido a los efectos paracrinos de los
factores de crecimiento y citoquinas que segregan.4,5 Por lo tanto, la secrecin del factor de
crecimiento por MSCs es teraputicamente importantes. Sin embargo, las cantidades de factores
de crecimiento que estas clulas segregan son a menudo insuficientes para un efecto teraputico,
y es difcil controlar sus niveles de expresin/secrecin fisiolgicamente para lograr
concentraciones adecuadas. El nivel de secrecin de factor de crecimiento vara segn el estado de
las clulas y su paso nmero.6,7 Adems, in vitro en las metodologas utilizadas para recolectar,
cultivar y mantener MSCs de modo que dosis teraputicas de las clulas se obtienen son
problemas que requieren solucin antes de que estas clulas pueden ser aplicados en la clnica.
Estos retos deben ser superados y un mejor enfoque de las terapias con clulas madre debe ser
desarrollado.

Para controlar la cantidad de un factor de crecimiento secretada en un sistema, la protena

recombinante es ampliamente aplicada. Dependiendo de la concentracin especfica de un factor
de crecimiento recombinante, tiene un efecto similar al producido por la MSC tratamiento.8 Sin
embargo, algunos factores de crecimiento tienen una vida media corta y un muy bajo nivel de
eficacia teraputica. El factor de crecimiento hepatocitario (HGF), que tambin se conoce como
factor de dispersin y ha sido identificado como un excelente factor de angiognesis teraputica,
tiene una muy corta vida media de slo <3-5 minutos.9 Aunque HGF recombinante prometedores
en ensayos in vitro, in vivo, su utilidad es insignificante debido a su corta vida media.

HGF, un factor de crecimiento que es secretada por MSCs, se une al receptor c-met en las clulas
endoteliales. HGF no slo estimula el crecimiento de clulas endoteliales sin inducir la
proliferacin de clulas del msculo liso vascular, sino que tambin acelera la re-endothelialization
mientras causando un bajo nivel de hiperplasia intimal.10,11 La HGF tambin previene la muerte
de las clulas endoteliales a travs de sus actividades anti-apopttica.12 14 Adems, HGF es uno
de los principales factores determinantes de si el epitelio permanece en un estado inactivo o pasa
a un estado proliferativo durante el desarrollo y la reparacin de los tejidos.15 Sin embargo, el
nivel normal de FGH en hgado, rin, bazo y clulas es muy baja, y HGF expresin est restringida
a las clulas de origen mesenquimal.16 Aunque la HGF endgeno nivel aumenta despus de la
lesin, el nivel alcanzado no es suficiente para la reparacin debido a una muy corta vida media de
<3 a 5 minutos en vivo.9 Por lo tanto, ms controlable y estable sistema de expresin es necesaria
para mejorar la terapia angiognica. Una de las muchas estrategias para resolver el problema de
FVH en la clnica de campo es la tcnica de edicin gentica capaz de expresar el gen teraputico
en el PPP1R12C sitio en el cromosoma humano 19 (llamado el sitio de Safe Harbor).

Con respecto a estos, hemos integrado un sistema HGFexpression Dox-inducible en el sitio de safe
harbor hUCB a travs de MSCs como activador de transcripcin endonucleasas efectoras (Talen)-
mediada la edicin del genoma para permitir a largo plazo HGF y controlable de la secrecin. Aqu,
nos informan que la HGF secretados por estos hUCB.S. tuvo a largo plazo y efectos teraputicos
sobre endothelialization controlable y la angiognesis. Tambin nos mostr que el tratamiento
con las clulas troncales editado genoma haba obtenido un mejor efecto teraputico sobre el
ratn modelo de isquemia de las extremidades traseras.

Resultados
Generacin inducible TetOn-HGF-expresin construir y la induccin de la expresin de HGF
hUCB-MSCs

Para una entrega constante de FVH en vivo, hemos diseado un humano HGF cDNA construir para
su integracin en las clulas madre humanas. Sin embargo, porque coherente HGF-Met es
conocido de sealizacin para desencadenar el crecimiento tumoral,17 el nivel de FGH expresin
debe ser controlada. As, hemos creado un constructo en el cual HGF expresin estaba bajo el
control de un sistema inducible TetOn. En este sistema, la tetraciclina/Dox tratamiento activa la
expresin del objetivo de FVH cadn.

Despus de la clonacin de la HGF cDNA, probamos si HGF expresinfue controlada por Dox.
Primero nos clonan inducible de la HGF-expresin construir enel vector pGEM provisional,
resultando en la produccin de CMVm pGEMTetOn/-HGF-EF1A-rtTA, tal como se explica en la
seccin de Materiales y Mtodos (Figura 1a). Este plsmido fue transitoriamenteen clulas
transfectadas 293T, y su expresin de HGF a travs de este vector se evalu mediante Western
blotting (Figura 1b). HGF expresin fue fuertemente inducida por Dox tratamiento. El nivel de
expresin fue similaral del control positivo en el cual HGF expresin estaba bajo el control del
promotor en la CMV pcDNA3.1 vector. El nivel deexpresin de FVH fue dependiente de la
concentracin Dox en bajas concentraciones <5 g/ml (Figura 1c). El nivel de expresin seredujo
cuando la dosificacin Dox era >10 g/ml (ver Figura complementaria S3C), probablemente debido
al dao celular causado por los efectos txicos de Dox porque observamos la muerte celular por
encima de esa concentracin. De hecho, se ha informado que 10 g/ml de Dox suprime la
proliferacin celular.18 a partir de nuestros resultados y el citado informe, decidimos que Dox
dosis ideal sera de 5 g/ml para maximizar la expresin de HGF y minimizar los efectos
secundarios del tratamiento Dox. Integrar de forma segura el tetn inducibles-HGF-expresin
construir en clulas madre humanas, luego nos clonan este constructo en pUC19 vector que tiene
dos brazos de recombinacin homloga (HA- HA-L y R) para la focalizacin del safe harbor
PPPR12C sitio en el cromosoma 19 (Figura 1d). La pTetOn-HGF plsmido fue evaluada mediante
mapeo de restriccin, Colonia, PCR y secuenciacin de ADN (vase Figura complementaria S1A,B).
La induccin de la HGF expresin a travs de la pUC-TetOn-HGF vector y la secrecin de FGH
fueron confirmados por Western blotting anlisis de ADSCs y el medio condicionado por estos
ADSCs, respectivamente (Figura 1e) y de transfectadas MSCs hUCB (Figura 1f) tratados con Dox.
MSCs hUCB transfectadas secretada ADSCs ms HGF de transfectadas. Cuando probamos la
eficacia de transfeccin de estos dos tipos de clulas con un plsmido de expresin de GFP, MSCs
hUCB resultaron ser transfectado en >50% de eficiencia, mientras que ADSCs fueron transfectadas
en ~10% de eficacia (vase la figura complementaria S2A,B). La alta eficacia de transfeccin de
MSCs hUCB ser beneficioso para su posterior edicin del genoma. Tambin es sabido que MSCs
hUCB tienen un bajo nivel de inmunogenicidad. Por estas razones, hemos utilizado principalmente
hUCB MSCs para posteriores estudios que hemos realizado. Tomados en conjunto, los resultados
obtenidos en esta etapa demostr que HGF expresin y secrecin podra ser controlado por Dox a
travs del pUC19 TetOn sistema en cual rtTA expresin fue impulsada por el EF1 promotor.

TALEN-mediada la generacin de MSCs hUCB con una caja albergaba HGF expresin inducible
system

La constante y segura expresin de HGF, inducible de la pUC19--TetOn HGF expresin chasis se ha

integrado en el safe-harbor PPPR12C sitio en el cromosoma 19 a travs de talen-mediada la
edicin del genoma (Figura 2a). La pUC19 vector tiene dos brazos que se coordinan con el talen-
L/R secuencias para la recombinacin homloga. El original talen-L/R y las secuencias disponibles
comercialmente HA-L/R no se traducen en secuencias de genes eficiente integracin. Por lo tanto,
hemos diseado diferentes talen-L/R y HA-L/R y secuencias seleccionadas muy eficaces (aumento
de 10 veces en la eficiencia en comparacin con los de las secuencias originales de la L/R)
secuencias que haba 50 bp espaciadores entre las HA-L/R las secuencias de cada TALENL/R
secuencias (Cho et al., manuscrito presentado). Con el nuevo diseo y el nuevo sistema TALEN HA-
L/R secuencias en la pUC19 vector, hemos producido potente HGF-hUCB secretores de MSCs. Diez
das despus de la co-transfecting hUCB-MSCs con el TALEN y TetOn-HGF sistemas, stos fueron
tratados con Dox durante 2 das. Integracin de la pTetOn-HGF-expresin casete en el sitio de safe
harbor fue confirmada mediante un cruce-PCR (Figura 2b) y por secuenciacin del producto de
PCR. Los resultados mostraron que la expresin y el casete rtTA construir se han integrado
correctamente en el PPP1R12C sitio (vea Figura complementaria S3). Secrecin de FVH fue
demostrado tambin 12 das despus de la co-transfeccin cuando el transitoriamente genes
presentes haban desaparecido (Figura 2c). ELISA anlisis demostr la concentracin de segregada
de FVH fue ~15 veces superiores en medio condicionado por Dox-tratados HGF/hUCB-MSC celdas
que en este condicionado por la no-Dox tratados con controles (Figura 2d). Despus de la
generacin de TetOn-HGF/hUCB-MSC, MSC se caracteriz con marcadores de clulas madre, para
probar que todava tiene la troncalidad propiedad con o sin figura complementaria dox (S6).
Integracin del sistema de expresin en derechos ADSCs fue observado tambin 12 das despus
de la transfeccin (ver Figura complementaria S3B). El nivel de secrecin de FVH por hADSCs
tambin fue ptima cuando fueron tratados con 5-7 g/ml de Dox (ver Figura complementaria
S3B). Los resultados mostraron que el uso de la recientemente diseada TALEN sistema y nuevas
HA-L/R secuencias en la pUC19 vector, hemos producido potente HGF-hUCB secretores de MSCs.

HGF secretada por HGF/hUCB promovi la migracin de clulas MSCs

La HGF/Met pathway juega un papel importante en la remodelacin vascular tras dao

tisular.19,20 Se evalu el efecto de fomento de la migracin del FVH en FVH/hUCB-MSCs, que es
uno de sus ms notables efectos.21 La migracin de clulas troncales es crucial para la
regeneracin tisular.22,23 En la cicatrizacin de la herida assay, MSCs hUCB inducidas a expresar
HGF por Dox tratamiento migr a un ritmo significativamente ms rpido que los controles no
tratadas, al igual que tratados con MSCs hUCB hrHGF (a 50 ng/ml) (Figura 3a). Los resultados de la
trans-bien el ensayo de migracin celular mostr tambin que MSCs hUCB inducidas a expresar
HGF por Dox tratamiento migrarse a una tasa significativamente ms alta que sus homlogos no
tratada (Figura 3b). Estos resultados eran esperados porque HGF, que tambin se conoce como
factor de dispersin, hace que las clulas puedan migrar. Cuando contamos las celdas 1 y 2 das
despus de la siembra, el nmero de clulas en TetOn-HGF/hUCB-MSCs (Dox ) grupo no fue
significativamente diferente de la TetOn-HGF/hUCB-MSCs (Dox-) y MSCs hUCB grupos control
(datos no mostrados), sugiriendo que la migracin celular no fue debido a la proliferacin de
clulas en cultivo a corto plazo. As, nuestros resultados muestran que el HGF segregando hUCB-
MSCs tuvo un aumento de la migracin (efecto de dispersin).
A largo plazo los efectos biolgicos de la HGF secretada por HGF/hUCB-MSCs

Aunque TetOn-HGF/hUCB-MSCs (Dox ) no mostraron cambios en su tasa de proliferacin a corto

plazo, a largo plazo, las culturas de estas clulas mostraron una alta tasa de viabilidad celular,
incluso a finales de los conductos (Figura 4a,b). La tasa de viabilidad de TetOn-HGF/hUCB-MSCs
(Dox ) grupo fue ligeramente superior a la del grupo tratado con hrHGF. Estudios anteriores
mostraron que la HGF anti-apopttica y actividades antioxidantes.19 Para probar si TetOn-
HGF/hUCB.S. (Dox ) eran ms resistentes a la apoptosis en condiciones pro-apopttica, TetOn-
HGF/hUCB-MSCs fueron tratadas con STS, pro-apoptosis reactivo, o con H2O2, un reactivo
oxidante, en intervalos de 2 das durante 10 das. TetOn-HGF/hUCB-MSCs (Dox ) tratados con
staurosporine tuvo un mejor ritmo que la viabilidad de staurosporine tratados con clulas control
(Figura 4c,d), lo que sugiere que el HGF secretada por las clulas ex protegido contra la apoptosis.
Un efecto protector similar fue observado tambin en TetOn-HGF/hUCB-MSCs (Dox ) tratadas con
150 mol/l H2O2 (Figura 4e,f), indicando que, a largo plazo, la HGF tratamiento tuvo un efecto
antioxidante. Esta clula-efecto protector no se vio afectada por Dox en s, porque la morfologa y
viabilidad tasa de UCB-MSCs tratadas o no tratadas con Dox no difiri (ver Figura complementaria
S4A,B). Estos datos mostraron que a largo plazo la secrecin de FVH por TetOn-HGF/hUCB-MSCs
(Dox ) ha mejorado su supervivencia de pro-apopttica y estrs oxidativo.

La angiognesis es mejorada por medio condicionado por TetOn-HGF/hUCB-MSCs (Dox )

HGF es un factor esencial para re-endothelialization sin hiperplasia de clulas del msculo liso
vascular.11 Para evaluar el efecto de la angiognesis pro medio condicionado por TetOn-
HGF/hUCB-MSCs (Dox-), una formacin del tubo ensayo fue realizado. Media condicionada por las
clulas cultivadas bajo condiciones diferentes fueron recolectados y se utilizaron para la formacin
de un tubo de ensayo de clulas endoteliales de vena de cordn umbilical humano aumentado con
una mnima concentracin de factor de crecimiento endotelial vascular en medio. Condicionado
por UCB.S. o por TetOn-HGF/hUCB-MSCs (Dox-) demostraron una dbil capacidad de formacin de
tubo. Sin embargo, su formacin del tubo fue dramticamente mejorado por medio condicionado
por HGF secretores TetOn-HGF/hUCB-MSCs (Dox ) y medio a los que se aadi hrHGF (Figura
5a,b). El efecto de la ex medio fue comparable con la de medio conteniendo 50 ng/ml de hrHGF.

TetOn-HGF/hUCB-MSCs (DOX) mejora el flujo sanguneo en el ratn modelo de isquemia de las

extremidades traseras

HGF secretada por TetOn-HGF/hUCB-MSCs (Dox ) mejora la angiognesis in vitro. Para probar el
efecto de TetOn-HGF/hUCB.S. (Dox ) en vivo, hemos utilizado el ratn modelo de isquemia de las
extremidades traseras. Uno de los escollos que se deben superar al aplicar tratamientos con
clulas madre para los modelos animales in vivo es la prdida de las clulas inyectadas. Antes de
modificar las clulas madre pueden tener un efecto, pueden perderse debido a una respuesta
inmunitaria o una actividad biolgica. Por esta razn, se encapsulan las clulas manipuladas en un
material biodegradable-RGD alginato. En un estudio anterior, encapsulando las celdas de alginato-
RGD microgels no slo disminuy la tasa de prdida de clulas sino tambin el aumento de la tasa
de supervivencia de las clulas y el perodo durante el cual el factor de crecimiento fue segregada
en los tejidos que rodean el sitio de la inyeccin.24 Antes y despus de la formacin de microgel,
el nivel de secrecin de FVH por TetOn-HGF/hUCB-MSCs (Dox ) se determin mediante Western
blotting y un ensayo ELISA (ver Figura complementaria S5A,C,D). La concentracin de la HGF
secretada por TetOn-HGF/hUCB-MSCs (Dox ) fue ligeramente, pero no cambi significativamente
despus de la formacin del cordn. El flujo de sangre en ambas extremidades traseras del
modelo de ratones fue medido antes y despus de la induccin de la isquemia en una de las
extremidades traseras. Una semana despus de la induccin de la isquemia de las extremidades
traseras, los ratones fueron tratados con PBS, UCB-MSC hrHGF, un alginato-RGD microgel con
UCB-MSCs, un alginato-RGD microgel conteniendo TetOn-HGF/hUCB-MSCs (Dox-) o un RGD-
alginato microgel conteniendo TetOn-HGF/hUCB-MSCs (Dox ). Los ndices de perfusin sangunea
fueron medidos utilizando un caudalmetro Doppler semanalmente durante 4 semanas. Como se
muestra en la Figura 6a, el flujo sanguneo a las extremidades traseras afectadas fue disminuido
considerablemente despus de la ciruga se haba realizado. En las primeras, el punto
posquirrgicos no microgel grupos tratados (tratados con MSCs o hrHGF) mostr un aumento del
flujo de sangre que disminuy gradualmente por la tarde semanas despus de la ciruga. En
contraste, el cordn microgel grupos tratados mostraron constantemente un mayor nivel de flujo
sanguneo en la extremidad isqumica. La TetOn-HGF/hUCB.S. (Dox )-grupo de tratamiento
mostraron un alto nivel de mejora continua en el flujo sanguneo durante todo el periodo
experimental (Figura 6a,b). Como se esperaba, a pesar del tratamiento con una alta concentracin
de hrHGF (2 g), el flujo sanguneo en la extremidad isqumica no fue restablecido en el grupo
hrHGF y la extremidad se perdi en el plazo de 1 semana despus de la ciruga (Figura 6a,b). El
mejorado efecto de TetOn-HGF/hUCB-MSCs (Dox ) podra atribuirse no slo al efecto paracrino
proangiogenic de MSCs sino tambin su constante secrecin de HGF.

Discusin

es sin duda que las clulas madre son fuertes y material regenerativo potente fuente teraputica.
Los efectos paracrinos de citoquinas o protenas secretadas por MSCs facilitan enormemente la
regeneracin y resultados teraputicos.5,25 Sin embargo, los efectos teraputicos de citocinas
secretadas por los CSM son insuficientes debido a su corta vida media y la rpida degradacin de
los diversos tipos de MSCs. Por lo tanto, la nueva estrategia para mejorar la eficacia teraputica y
efecto paracrino de clulas madre es necesario. Para ello, hemos desarrollado el funcional
mejorada MSCs que secretan un factor de crecimiento utilizando talen-mediada la edicin de
genmica. MSCs genticamente modificados son capaces de expresar controllably e inducir HGF
bajo condiciones especiales usando una droga sensible promotor cassette. TALENs son
prometedoras, herramientas para la edicin de los genomas. Un TALEN es una enzima de
restriccin artificial que se genera mediante la fusin de ADN-efectoras tal dominio de unin a un
dominio de clivaje de ADN. TALENs exhiben fuertes y protena especfica de nucletidos de
reconocimiento.26 Aunque TALENs se puede dirigir a cualquier sitio, pocos sitios son seguros para
integracin de genes exgenos y estn en un estado cromosmico abierto. Las vlvulas1, que se
encuentra en el PPP1R12C gen en el cromosoma humano 19, es uno de los sitios de safe harbor.
Cuando un gen es insertado en las vlvulas1 en el cromosoma 19, es expresada de manera
eficiente.27 de ingeniera de MSCs producidos utilizando nuestro sistema de sitio de safe harbor
HGF protena secretada continuamente en una forma inducible que podra ser controlado por Dox.
As, la integracin de los TALENmediated HGF-sistema de expresin en un cromosoma de las
clulas madre no slo proporcion las clulas madre para terapia sino tambin resolver el
problema de la corta vida media de una protena teraputica.

Un HGF ELISA demostr que la concentracin de FGH secretada por la TetOn-HGF/hUCB-MSCs

alcanz 0,5-0,8 ng/ml (Figura 2d y ver la figura complementaria S5A,D). Si bien esta concentracin
es ~1% que de la hrHGF usado como control positivo, los efectos de la HGF secretores TetOn-
HGF/hUCB-MSCs en la mayora de los experimentos in vitro fueron similares a las del control
(Figuras 3 a 5). Estos efectos podran ser comparables debido a la consecuente liberacin de FVH
por la TetOn-HGF/hUCB-MSCs con Dox.

Hemos postulado que debido a la corta vida media de HGF (~5 minutos), spike tratamiento de una
alta concentracin de hrHGF no era suficiente y eficaz slo temporalmente. A continuacin, la
exposicin continua de FGH en concentraciones fisiolgicas producidas por las clulas
manipuladas tena efectos comparables a los de una alta concentracin de hrHGF. As, nuestros
resultados muestran la importancia de la continua secrecin de una citoquina de vida media corta
como el HGF. Uno de los principales obstculos basada en clulas troncales de terapia celular para
su aplicacin clnica es la supervivencia celular en duras condiciones en el sitio de tratamiento.

Las clulas madre son difciles de su mayor capacidad para sobrevivir en la presencia de ambiente
oxidativo afeccin. Sin embargo, HGF tiene la funcin de superar anti-apopttica y antioxidantes
dao celular mediado por el estrs. Por ese motivo, el mantenimiento de la correcta y
concentracin constante de FGH es particularmente importante en vivo. A largo plazo, el efecto
teraputico de una baja concentracin de FGH secretada por las clulas madre ingeniera fue
probado en la viabilidad celular in vitro de ensayo, el cual demostr que incluso la tasa de
viabilidad de estas clulas fue mayor que la del grupo control positivo tratados con una dosis alta
de HGF (50 ng/ml) (Figura 4). Para evaluar si el largo plazo HGF secretada por ingeniera gentica
en clulas madre tiene ms efecto significativo en vivo, los ratones fueron competentes inmune
inducida por isquemia de las extremidades traseras. Para mejorar la eficacia teraputica y superar
la baja supervivencia celular, clulas troncales de ingeniera fueron encapsuladas en alginato-RGD
microgel inyectable por electrospinning. En la Figura 6, el grupo tratado con hrHGF mostraron la
menor mejora en la isquemia de las extremidades traseras de entre todos los grupos tratados. Los
ratones en el grupo tratado con hrHGF perdido sus extremidades traseras lesionados dentro de la
primera semana despus de la ligadura de la arteria femoral y hrHGF de tratamiento. El grado de
deterioro de las extremidades fue similar a la del grupo control negativo tratadas con PBS.

Por otro lado, HGF secretora de MSCs en microgel mejor significativamente los efectos
teraputicos entre todos los grupos. Estos resultados indican claramente que la persistencia de
secrecin de HGF mejorado enormemente la angiognesis. En particular, no podemos administrar
un supresor inmunes a los ratones, incluso aunque las clulas madre humanas fueron implantadas
en ellos.

Al parecer, la modulacin inmune puede lograrse, no slo por proteger las clulas madre
encapsulandolos en un microgel sino tambin por los efectos de las MSCs y HGF. Se especula que
debido al efecto combinado de la FGR-alginato microgel hUCB MSCs encapsulado y la HGF que
estas clulas secretadas, nuestro sistema teraputico proporcionado an mejor modulacin
inmune a fin de que el tratamiento con un supresor del sistema inmunolgico no era necesario
para la eficacia teraputica de este sistema.28-30

Aunque Dox-tratados TetOn-HGF/hUCB-MSCs mejorado considerablemente las tasas de formacin

del tubo y de angiognesis in vivo, la mejora es necesaria antes de que puedan ser utilizados como
agentes teraputicos. Porque la hUCB-CSM son clulas primarias, su eficacia de transfeccin tasa y
la integracin de la TetOn-HGF transgen difieren dependiendo de su estado.

Integracin de diferentes tipos de genes a travs de talen puede dar lugar a distintas
concentraciones de la protena secretada. Tarde pasajes de CSM son una preocupacin
importante. En el momento en que el sistema de expresin se ha convertido en la hUCB-MSCs,
comienzan a llegar a la senescencia. Por lo tanto, es difcil producir un nmero suficiente de
TetOn-HGF/hUCB-MSCs para su uso como agentes teraputicos. Son necesarios ms estudios para
estandarizar el procedimiento que hemos utilizado y para superar el problema de la senescencia.

La seguridad es siempre un tema importante para la terapia con clulas madre. Un problema
importante para el vstago de la terapia gnica mediada por clulas est controlando el nivel de la
expresin gnica. Sin embargo, nuestro sistema proporciona un ejemplo de cmo controlar los
efectos secundarios del tallo- terapias celulares y genticas.

Respecto a los efectos secundarios de la terapia gnica, HGF la expresin del transgen por nuestro
sistema puede ser controlado por una droga, Dox (tetraciclina) porque est bajo el control de un
sistema de tetraciclina, que tambin fue integrado en el sitio web de safe harbor utilizando talen-
mediada la entrega de genes. Respecto a los efectos secundarios de la terapia celular, MSCs hUCB
son toleradas por el sistema inmune, y estas clulas estn ms protegidos del ataque del sistema
inmune por ser encapsuladas en alginato-RGD. Tomados en su conjunto, nuestros inducible HGF
segregando CSM son una herramienta eficaz como un tallo-cellbased agente teraputico.

Conclusin

Pleiotropic HGF es una citocina que se ha sabido de largo para ser involucrados en la regeneracin
de clulas y tejidos. Sin embargo, las herramientas disponiblesque pueden producir sus efectos
teraputicos son clnicamente insuficiente. En este estudio, hemos generado inducible TetOn-
HGF/hUCB-MSCs via TALEN genoma basadas la edicin. En particular, estas clulas en RGDalginate
microgel secretada HGF y mejorado la movilidad celular, celdas protegidas contra la apoptosis, y
mejor el nivel de angiognesis en un ratn modelo de isquemia de las extremidades traseras.
Nuestro estudio demostr claramente que el gen edicin permitida HGF secrecin por hUCB.S. y
superar las limitaciones de otros HGF proangiogenesis basados en terapias para enfermedades
vasculares como la isquemia.

Materiales y mtodos de

cultivos de clulas MSCs.

hUCB aislados de hUCB fueron recolectados como se ha descrito anteriormente.31 El
procedimiento de aislamiento-MSC hUCB fue aprobado por la Junta de Revisin Institucional
Borame y la Universidad Nacional de Sel (IRB n 0603/001-002-07C1). La hUCB-MSCs se
mantuvieron en queratinocitos-sin suero suplementado con humana recombinante del factor de
crecimiento epidrmico y extracto de pituitaria bovina (Gibco-Life Technologies, Grand Island, NY)
a 37 C y 5% de CO2. Clulas madre derivadas de tejido adiposo (ADSCs) aisladas de tejido adiposo
humano fueron gentilmente cedidas por el EDH Bio y se mantuvieron en el medio que contiene el
suplemento MesenPro-kit reactivos (Gibco-Life Technologies) bajo las mismas condiciones. Clulas
HEK293T, una lnea de clulas de rin embrionario humano, fueron adquiridos de la American
Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). HEK293T las clulas fueron cultivadas en Dulbecco's
medio de Eagle modificado (DMEM) (HyClone-GE, Sur de Logan, UT) suplementado con 10% de
Suero Fetal Bovino (SFB) (HyClone-GE) y penicilina y estreptomicina (Gibco- Life Technologies).

Preparacin de un plsmido que contenga derechos HGF ADNC y la TetOn sistema.

Para clonar los derechos HGF cDNA en un vector para la recombinacin homloga especfica
expresin inducible, cebadores que se superponen al final de cada fragmento de ADN fueron
diseados y reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) fue realizada. Debemos primero por
separado TetOn clonada/CMVmin promotor, HGF-pA, y hEF1a-rtTA-pA construye en un vector
pGEM. Entonces, estos tres fragmentos de ADN fueron amplificados por PCR y se ligaban en el
plsmido pGEM bsicas usando un kit de fusin (Clontech Lab, Mountin View, CA) (Figura 1a).
Entonces, los derechos HGF ADNC y TetOn construir fueron transferidos en la pUC19-virus adeno-
asociado integracin sitio 1 (vlvulas1) vector, que contiene dos sitios de recombinacin homloga
(HA-HA-L y R) para focalizar las vlvulas1 en el cromosoma humano 19. En este plsmido, la
expresin humana de FVH hrHGF recombinante (Adnc) est regulada por la TetOn/minimal
promotor, que es activado por la tetraciclina- rtTA protena que se expresa a travs de la EF1
promotor (Figura 1a). Corregir la ligadura en el vector fue confirmado mediante mapeo de
restriccin (mediante NotI y PCR AgeI) y Colonia (ver Figura complementaria S1A). El plsmido final
tambin fue evaluada mediante la secuenciacin del ADN y result ser correcta (consulte la Figura
complementaria S1B). Purificada pUC19-TetOn- HGF plsmido Se transfectaron en HEK 293-T
celdas usando Lipofectamine. La expresin de HGF fue confirmada por Western blot utilizando un
anticuerpo anti- HGF (ab83760; Abcam, Cambridge, UK) despus de cido tricloroactico (TCA),
basado en la precipitacin de las protenas en el medio condicionado por las clulas transfectadas.

Western blotting y ensayo inmunoenzimtico.

Despus de la HGF-expresin plsmido fue en clulas transfectadas con un dispositivo de

electroporacin de nen (Invitrogen, Carlsbad, CA), 2 105 clulas transfectadas/bien fueron
sembradas en seis y plato de cultura (Thermo-Nunc, Jiangsu, China). Las clulas fueron tratadas
con Dox (a 5 g/ml) durante 2 das a 37 C. Entonces, las clulas en cada pocillo se lav con
tampn fosfato salino (PBS) y fueron disueltas con 100 l de tampn de lisis (RIPA buffer; Thermo
Fisher, Bellefonte, PA) que contenga un inhibidor de la proteasa cocktail (PIC, Roche, Mannheim,
Alemania). Las clulas fueron recolectados utilizando un rascador, y los lisados fueron incubadas
en hielo durante 20 minutos. Los extractos celulares se centrifugaron durante 10 minutos a 13.000
rpm para quitar la suciedad. Los sobrenadantes fueron recolectados, y se determinaron las
concentraciones de protenas usando un kit de ensayo de Bradford (Bio-Rad, Berkeley, CA). Para
producir medios condicionados, las clulas fueron incubadas en medio libre de suero durante 48
horas en condiciones diferentes. Entonces, las protenas en el medio condicionado se precipita con
TCA, como se ha descrito anteriormente. Western blotting ensayos se realizaron como se ha
descrito anteriormente.32 Brevemente, 20 g de protena de cada muestra fueron separados en
un gel de 10% por SDS-PAGE. Tras bloquear el blot para 1 hora con 5% de leche descremada, la
mancha se incubaron con un anticuerpo antihuman HGF durante 16 horas a una temperatura de 4
C y luego se incubaron con un anticuerpo secundario anti-conejo durante 1 hora a temperatura
ambiente. A continuacin, la etiqueta se detectaron bandas utilizando reactivos ECL (Thermo
Fisher). Para la prueba ELISA, los medios de comunicacin se filtra utilizando un 30K (filtro de corte
de Merck Millipore, Billerica, MA) y de las protenas fueron analizados utilizando un kit ELISA
antihuman HGF (ab100534; Abcam), tal como se ha descrito anteriormente.33

El cruce de la PCR.

Para confirmar que los derechos HGF cassette de expresin fue integrado en las vlvulas1 en el
cromosoma 19, una imprimacin de avance (5-ACTAAGTAAGGATCCA GACATGATAAGA-3) fue
diseado para detectar los derechos HGF porcin del cassette y un cebador inverso (5-
CCCACCCCAATGCTCCAGGC-3) fue diseado para detectar la pieza del PPPR12C locus genmico. La
PCR se realiz utilizando la Taq polimerasa (TaKaRa) segn el siguiente protocolo: un ciclo de 92 C
durante 3 minutos, luego de 35 ciclos de 92 C durante 1 minuto y 30 segundos, el 60,7 C durante
3 minutos y 72 C durante 2 minutos, y un ciclo final de 72 C durante 3 minutos. El producto de la
PCR fue evaluado usando un gel de agarosa al 1%. El producto de la PCR tambin fue secuenciado
utilizando los cebadores descritos anteriormente.

Ensayo de migracin celular.

Para la cicatrizacin de la herida/ensayo de migracin celular, TetOn- HGF/hUCB-MSCs (5 104

clulas) fueron sembradas en placas de 24 pocillos. Las clulas fueron cultivadas hasta llegar a
confluencia y luego fueron hambre durante 24 horas. Se cre una herida lineal en cada monocapa
utilizando una punta de pipeta. Motilidad celular en trminos de la herida fue evaluada por
fotografiar tres campos aleatorios 24 horas tras herir a la monocapa. Para el ensayo de migracin
trans-bien, la parte inferior de la cmara superior del transwell fue recubierto con 0,2% de gelatina
(Sigma, St. Louis, Missouri). Cada grupo de clulas fue privada de 16 horas, y entonces el mismo
nmero de clulas (2,5 104) fue resuspendido en cada medio condicionado y, a continuacin, se
sembraron en la cmara alta. La placa se incubaron en el 5% de CO2 a 37 C durante 24 horas.
Entonces, las clulas de la membrana se tieron con 0,1% de cristal violeta. La tasa de migracin
se determina contando el nmero de clulas migradas en tres campos aleatorios bajo un
microscopio de luz.
Ensayo de viabilidad celular.

TetOn-HGF/hUCB-MSC clulas fueron sembradas en placas de 48 pocillos de 1 104 clulas/bien.

El ensayo MTT (Amresco, Cleveland, OH) fue utilizada para determinar la tasa relativa de
crecimiento celular en 1, 3, 5 y 7 das de cultivo. MTT reactivo (100 l de 0,2 mg/ml de solucin)
fue aadido a los medios de comunicacin y las placas se incubaron durante 5 horas a 37 C.
Despus de quitar los medios de cultivo, los cristales restantes fueron disueltos en 500 l de
DMSO (Duksan, Sel, Corea) y la absorbancia a 470 nm se midi.

Anti-estrs antioxidantes apoptosis y ensayo.

Despus de TetOn-HGF/hUCBMSC celdas (5 105) haban sido cultivadas bajo cada condicin (con
o sin Dox Dox), que fueron sembradas en placas de cultivo de 60 (Thermo Fisher) y fueron
tratados con STC (30 nmol/l) durante 24 horas o con H2O2 (150 mmol/l) durante 3 horas.
Entonces, la morfologa celular se observa bajo un microscopio de luz (Juli; NanoEndTech, Sel
(Corea) y la tasa de viabilidad celular se midi mediante el ensayo MTT.

La formacin del tubo.

Las clulas endoteliales de vena de cordn umbilical humano (5 104 clulas/pocillo) se

sembraron en una capa de BD Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA) en placas de 24 pocillos. Las
clulas fueron expuestas al factor de crecimiento endotelial vascular a 50 ng/ml (R&D) y
acondicionado medios que haban sido recogidos de MSCs hUCB, TetOn-HGF/hUCB-MSCs que
fueron cultivadas con Dox y sin Dox (2 106 clulas/100 dish) en alta glucosa DMEM (Thermo
Fisher) con 5% de SFB (Thermo) y antibiticos o antimicticos (Gibco) durante 48 horas. DMEM
medios que contienen 5% de SFB fue usado como control. Las concentraciones de protenas en el
medio condicionado se enriqueci 10 veces 30K utiliza un filtro de corte, y los filtrados se
agregaron a las clulas endoteliales de vena de cordn umbilical humano, despus de que las
clulas fueron incubadas durante 12 horas para permitir a ellos para formar estructuras en forma
de tubo. La formacin del tubo fue analizada mediante el recuento del nmero de ramas por
campo de alta potencia.

Microgel trasplante celular en el modelo de isquemia de las extremidades traseras.

Celda microgels RGDalginate/ se prepararon como se describe en nuestra publicacin anterior. 24

Para evaluar el nivel de FGH secrecin por las clulas en el microgels, medios condicionados por
diferentes clulas fueron recolectadas despus de 48 horas de incubacin en alta glucosa DMEM
conteniendo 10% de SFB. Entonces, el HGF niveles en el medio condicionado se determinaron
mediante un ensayo de western blot y ELISA. Las formas de las clulas en la microgels se
examinaron utilizando un microscopio (NanoEnTek JuLI). La isquemia de las extremidades traseras
modelo fue generado como se describe en nuestra publicacin anterior.24 Una semana despus
de la ciruga, los ratones fueron inyectados con PBS, hUCB-MSCs slo, hrHGF (2 g), conteniendo
microgel hUCB-MSCs (2 107 clulas en 1 ml de Alginato per-RGD ratn), un microgel
conteniendo TetOn-HGF/hUCB.S. o un microgel conteniendo TetOn-HGF/hUCB tratados con MSCs
de Dox. Mircogels conteniendo clulas fueron inyectadas en tres o cuatro msculos gracilis en el
muslo medial en las extremidades isqumicas. Aproximadamente 0,5 ml de la mezcla se inyecta en
los msculos gracilis usando jeringas de insulina. La perfusin sangunea de las extremidades
traseras antes de oclusin y la completa falta de perfusin sangunea inmediatamente despus de
la oclusin fueron evaluados utilizando un caudalmetro Laser-Doppler (LDI, Moro Moro
instrumentos, Devon, Reino Unido); la perfusin de ambas extremidades traseras fue luego
evaluaron semanalmente durante 4 semanas. Los datos fueron analizados usando Moor LDI-PC-
software. Todos los estudios en animales se realizaron de acuerdo con la Universidad Nacional de
Sel directrices del Comit de cuidado de los animales de las directrices del Comit despus de
adquirir el permiso del comit (Protocolo #SNU-1).

La inmunohistoqumica.

Los tejidos fueron cosechadas, fijado en el 4% de paraformaldehdo (Wako), incluidos en parafina,

cortadas en secciones de 5 m (Leica, Buffalo Grove, IL). La inmunohistoqumica fue realizada
mediante un factor antivonWillebrand anticuerpo en una dilucin de 1:100 (Merck Millipore) y los
anticuerpos secundarios apropiados. Las secciones fueron teidas con hematoxilina y eosina. El
nmero de vasos sanguneos se contaba como se ha descrito anteriormente.31,32 Los datos
presentados son los valores promedio Se de tres extremidades traseras por grupo.

Anlisis estadstico.

Los datos se expresaron como media error estndar. Los datos fueron analizados mediante el
software de Excel, y se utiliz la prueba t para comparar los datos relativos a los diferentes grupos
experimentales. Las diferencias se consideraron significativas cuando los valores de p fueron
<0.05.

MATERIAL COMPLEMENTARIO

figura S1. HGF construccin de vectores.

Figura S2. Comparacin de la eficacia de transfeccin de ADSCs y UCB-MSCs.

Figura S3. La integracin de la HGF-sistema de expresin fue confirmada por secuenciacin

junction-PCR fragmentos y BM anlisis de la expresin y secrecin de FVH por ADSCs.

Figura S4. Doxiciclina tratamiento no afectan a la proliferacin celular.

Figura S5. HGF expresin diseado por UCB-MSCs encapsulada en un microgel.

Figura S6. La expresin de UCB-MSC polticas a partir de la transfeccin y doxiciclina tratamiento.

Agradecimientos
Esta investigacin fue apoyada por subvenciones de la Fundacin Nacional para la Investigacin
(NRF), financiado por el Ministerio de la ciencia, las tecnologas de la informacin y la planificacin
del futuro (donaciones n 2012M3A9C6049716 y 2014M3A9D5A01073598).