Tinciones en Microbiologa

Tipos
a) Simples: utilizacin de un solo tinte con el cual podemos evaluar solamente la
morfologa.
Las tinciones simples es cuando toda la muestra se tie del mismo color y se
utiliza un solo colorante.
b) Compuestas especiales: constituidas por 2 ms tintes o reactivos y sirven para
clasificar las bacterias u observar sus caractersticas especiales.
c) Positivas: se observa teida la clula sobre un fondo claro.
d) Negativas: El fondo se tie de oscuro para observar la clula o estructuras
refringentes.

Tinciones compuestas.

1. Tincin de Gram

Principio: Composicin de la pared celular de las bacterias, las bacterias G+ est

compuesta por varias capas de peptidoglicanos, las bacterias G- tienen una membrana
externa con un componente estructural nico que son los lipopolisacridos.
Las bacterias G+ retienen el cristal-violeta despus de la decoloracin y aparecen de color
azul intenso (purpura), las bacterias G- no son capaces de retener el cristal-violeta despus
de la decoloracin y son teidas de rojo con safranina.

Pasos:
a. Preparar la extensin del cultivo: En un portaobjetos limpio, libre de grasa, y con un
asa bacteriolgica colocar una pequea cantidad de la colonia bacteriana. a. Muestra
solida: colocar solucin salina previamente a colocar la colonia, igual en muestra
semislida. b. Muestra liquida: colocar la colonia directamente.
b. Dejar secar al aire, luego fijar la preparacin pasando la placa rpidamente por el
mechero (2 3 veces)
La fijacin, procedimiento que permite preservar estructuras celulares, se puede
llevar a cabo con diferentes tratamientos: fijacin por calor o fijacin qumica. La
fijacin por calor es la ms utilizada para la observacin de bacterias. Este
procedimiento consiste en pasar el portaobjetos, con la suspensin bacteriana
extendida y seca, a travs de una llama de un mechero. La fijacin por calor
preserva la morfologa externa de los microorganismos pero no las estructuras
internas. La fijacin qumica con agentes como etanol, formaldehdo y cido actico
entre otros muchos, se utiliza para preservar las estructuras celulares.
c. Agregar violeta cristal durante 20 a 30 segundos (Colorante primario), enjugar con
agua seguidamente.
d. Agregar yodo Gram durante 40 a 60 segundos (mordente), enjuagar con agua
seguidamente
e. Agregar alcohol acetona y enjuagar con agua inmediatamente (decoloracin,
disuelve lpidos de la pared de G- )
f. Agregar safranina durante 20 segundos, enjuagar con agua seguidamente.

Mnica Guzmn
Facultad de Medicina de la Universidad de Panam
Noviembre 2016
 2. Tincin de Moeller (esporas)

Principio: Se suspende una bacteria del genero Bacillus, evidencia capsula incolora en un
contraste morado.

Pasos:
a. Se prepara el extendido de la muestra
b. Se deja secar y se fija con calor
c. Se tie con carbol-fuschina hasta llenar por completo el portaobjetos
d. Pase un mechero por debajo de la placa calentando hasta que vea que se emiten
vapores y sin dejar que hierva por 3 minutos. Si la placa se va secando, ir agregando
ms tinte hasta cumplir el tiempo. (Se calienta el tinte para que penetre la espora
que contiene dipecolinato de calcio)
e. Se enjuaga con agua y se coloca cido sulfrico al 1% por 2 minutos (decolorante
para retirar el carbol-fuchina)
f. Se enjuaga con agua y se tie finalmente con azul de metileno por 1 minuto
g. Dejar secar

Las esporas permiten a las bacterias pasar a un estado latente en condiciones ambientales
adversas. Su principal componente es Ca2+ fijado a cido dipicolnico. El calor despus de
la tincin con carbol-fuscina con permite que rompa la estructura que protege la espora para
que as pueda penetrar el colorante. Con el lavado de agua se retira todo tinte que se adhiri
a la bacteria, para despus teirse con azul de metileno.

Resalta de color rojo la espora y de color azul, la bacteria.

Club de Informtica Mdica y Telemedicina (Universidad de Panam). Tincin de Meller. Telmeds.org [publicada
en lnea]. 2009(03). [citado 23 de Nov de 2016]. Disponible en: http://www.telmeds.org/atlas/bacteriologia/tecnicas-
bacteriologicas/tinciones-simples-y-especiales/tincion-de-moeller/

Mnica Guzmn
Facultad de Medicina de la Universidad de Panam
Noviembre 2016
 3. Tincin de Anthony (cpsula)

Principio: Es una tincin negativa en donde vemos la cpsula no teida sobre un fondo
morado y se visualiza la bacteria en el centro de la cpsula, esta pude ser de glicoprotenas
o polisacridos.

La cpsula es una sustancia viscosa producida por algunas especies que la sintetizan a partir
de polipptidos, polmeros de glucosa u otros amino azcares que contienen nitrgeno, que
despus de combinarse con el agua es segregada por todo el contorno de la pared celular
como un moco gelatinoso. Cuando la cpsula ha sido producida puede observarse en los
frotis coloreado por el mtodo de Gram como un halo incoloro alrededor de la bacteria.
Cuando se requiere ver la cpsula con ms detalle o inducir su produccin se recurre a
coloraciones especiales.

Pasos:
a. Colocar leche descremada al 20% o leche litmus en un extremo del portaobjetos
b. Agregar la muestra de bacteria en la leche del borde
c. Realizar un extendido con la ayuda de otro portaobjetos
d. Se deja secar al aire (no se fija con calor ya que la leche se pega al portaobjetos)
e. Teir por 2 minutos con violeta-cristal.
f. Lavar con sulfato de cobre.
g. Se deja secar al aire.

Las cpsulas no se tien normalmente con colorantes bsicos como el cristal violeta o la
safranina. Tincin negativa de cpsulas en que la leche litmus se tie con violeta cristal
como contraste de un fondo morado con el halo transparente de la cpsula incolora.

Club de Informtica Mdica y Telemedicina (Universidad de Panam). Tincin de Anthony. Telmeds.org [publicada
en lnea]. 2009(03). [citado 23 de Nov de 2016]. Disponible en: http://www.telmeds.org/atlas/bacteriologia/tecnicas-
bacteriologicas/tinciones-simples-y-especiales/tincion-de-anthony/

Mnica Guzmn
Facultad de Medicina de la Universidad de Panam
Noviembre 2016
 4. Tincin de cido-alcohol resistencia

Principio: Se trata de un procedimiento de tincin diferencial, conocido como mtodo de

Ziehl-Neelsen, que tiene gran relevancia por su aplicacin clnica. Permite poder distinguir
aquellos microorganismos cuya coloracin resiste la accin de alcoholes y cidos suaves
(cido-alcohol resistentes) de otros que no resisten la decoloracin (no cido-alcohol
resistentes).

Representacin esquemtica de la composicin de la pared celular de las micobacterias. Imagen en color

en: www.medigraphic.com/rid

Dentro de las bacterias cido alcohol resistentes encontramos dos importantes patgenos:
Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae, microorganismos responsables de la
tuberculosis y la lepra respectivamente. Estas bacterias pertenecen al Phyllum
Actinobacteria, un grupo grande y complejo de bacterias gram positivas, que incluye a la
Familia Mycobacteriaceae caracterizada por contener en sus paredes celulares un alto
contenido lipdico, ceras con una gran diversidad de cidos miclicos, molculas de 60 a 90
tomos de carbono. La presencia de estos lpidos, en la cara externa de la pared, hacen que
estas bacterias sean muy resistentes a la accin de compuestos qumicos presentes en su
entorno, caracterstica que se utiliza para aislar estos microorganismos: uno de los medios
ms frecuentes es el Loewenstein-Jensen con verde malaquita que permite el crecimiento
selectivo de estos microorganismos.

Procedimiento
a. Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequea porcin de un cultivo
bacteriano con el asa de siembra estril.
b. Hacer el frotis, formando una pelcula homognea sobre el portaobjetos con el asa
de siembra. Dejar secar.
c. Fijar la preparacin, pasando a travs de la llama del mechero el portaobjetos.
d. Cubrir con unas gotas de fuchina fenicada y aplicar calor con un hisopo de lana
e. de vidrio, mantener 5 minutos desde el comienzo de la emisin de vapores
f. Lavar el exceso de colorante con agua.
g. Aadir unas gotas de cido ntrico al 33% durante 30-40 segundos.

Mnica Guzmn
Facultad de Medicina de la Universidad de Panam
Noviembre 2016
 h. Lavar el exceso de colorante con agua.
i. Lavar la preparacin con alcohol de 96 durante 30 segundos.
j. Lavar con abundante agua.
k. Cubrir con el colorante de contraste, azul de metileno durante 1 minuto.
l. Lavar el exceso de colorante con agua.
m. Dejar secar al aire.
n. Aadir una gota de aceite de inmersin.
o. Observar con objetivo de inmersin (100 x).

Estas bacterias son resistentes al tratamiento con alcoholes y cidos suaves conservando el
colorante fundamental, mientras que organismos que no posean esta caracterstica son
rpidamente decolorados y pueden teirse con el colorante de contraste en este caso azul de
metileno.

Muestra de Esputo BAAR (+) con Tincin de Ziehl Neelsen. Telmeds.org [publicada en lnea]. 2009(10).
[citado 23 de Nov de 2016]. Disponible en: http://www.telmeds.org/atlas/bacteriologia/mycobacterias-
nocardia-y-actinomyces/muestra-de-esputo-baar-con-tincion-de-ziehl-neelsen/
Mnica Guzmn
Facultad de Medicina de la Universidad de Panam
Noviembre 2016
 5. Tincin de azul algodn de lactofenol

El examen microscpico es de gran importancia en micologa para la observacin de las

diferentes especies de hongos de inters clnico. Se deben utilizar tinciones que logren
preservar la integridad de las estructuras fngicas.

La tincin de azul algodn de lactofenol no es considerada una tincin diferencial, sin

embargo, posee caractersticas tintoriales que permiten observar cada uno de los
componentes fngicos y apreciar fcilmente las estructuras para una adecuada
identificacin.

Principio: El fenol inactiva las enzimas lticas de la clula e impide que sta se rompa; de
igual forma, destruye la fl ora acompaante e inactiva a la clula, quitndole el grado de
patogenicidad; adems, acta como mordiente cuando se usa en combinacin con
colorantes. El cido lctico preserva las estructuras fngicas al provocar un cambio de
gradiente osmtico con relacin al interior fngico, lo que genera una pelcula protectora.
El azul de algodn es un colorante cido, que tie el citoplasma y la quitina presente en las
clulas fngicas, mientras que el glicerol mantiene hmeda la preparacin. Una vez
preparado el colorante, se debe colocar la muestra microbiolgica en un portaobjetos por
medio de una impronta (proceso en el cual se coloca una impresin de la muestra sobre una
estructura utilizando una cinta adhesiva transparente).

Preparacin de la impronta
a. Colocar el material necesario en la campana de seguridad tipo 2A.
b. Seleccionar las colonias para realizar las improntas.
c. Cortar segmentos de cinta adhesiva transparente aproximadamente de 1 cm
d. Pegar los segmentos de cinta en un asa micolgica.
e. Poner una gota de azul de algodn en el portaobjetos.
f. Con el lado adhesivo de la cinta, tocar la parte superior de hongo.
g. Colocar la cinta sobre la gota de azul de algodn y poner otra gota de azul de
algodn.
h. Poner un cubreobjetos sobre la preparacin.
i. Observar en 40x.

Las estructuras fngicas se observarn de color azul sobre un fondo blanco (Figura 8)

Fotomicrografa de hongos filamentosos con el mtodo de azul algodn de lactofenol.

Exserohilum sp. (izquierda); Mucor spp. (derecha) (aumento 40x).
Imagen en color en: www.medigraphic.com/rid

Mnica Guzmn
Facultad de Medicina de la Universidad de Panam
Noviembre 2016
 Bibliografa

1. Luis Esa Lpez-Jcome, Melissa Hernndez-Durn, Claudia Adriana Coln-Castro,

Silvestre Ortega-Pea, Guillermo Cern-Gonzlez, Rafael Franco-Cendejas.
(marzo, 2014) Las tinciones bsicas en el laboratorio de microbiologa. Obtenido de
http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf

2. Covadonga Vzquez, Ana Martn, M Isabel de Silniz, Susana Serrano,

Departamento de Microbiologa III. Facultad de Ciencias Biolgicas. Universidad
Complutense. Madrid. (2010). Tcnicas bsicas de Microbiologa, Observacin de
bacterias. Obtenido de
http://revistareduca.es/index.php/biologia/article/view/819/834

Mnica Guzmn
Facultad de Medicina de la Universidad de Panam
Noviembre 2016