http://dx.doi.org/10.21577/0100-4042.20170021 Quim. Nova, Vol. 40, No.

5, 594-601, 2017

USO DE NANOBASTES DE OURO PARA O DESENVOLVIMENTO DE AULAS PRTICAS DE

NANOTECNOLOGIA
Educao

Cyntia Silva Ferreiraa,*, Luiz Orlando Ladeirab, Cristiano Fantini Leiteb, Flvio Guimares da Fonsecac, Erica Milena
de Castro Ribeiroa, Alice Freitas Versianic, Jorge Fernando de Souza Silvaa, Cntia Lopes de Brito Magalhesa e Breno de
Mello Silvaa
a
Departamento de Cincias Biolgicas, Universidade Federal de Ouro Preto, 35400-000 Ouro Preto MG, Brasil
b
Departamento de Fsica, Universidade Federal de Minas Gerais, 31270-901 Belo Horizonte MG, Brasil
c
Departamento de Microbiologia, Instituto de Cincias Biolgicas, Universidade Federal de Minas Gerais, 31270-901 Belo
Horizonte MG, Brasil

Recebido em 05/10/2016; aceito em 09/01/2017; publicado na web em 14/02/2017

USE OF GOLD NANORODS FOR THE DEVELOPMENT OF PRACTICAL CLASSES IN NANOTECHNOLOGY. A gold
nanoparticles functionalization experiment was conducted in a biotechnology summer course at UFOP as a model for the introduction
of the laboratory practice in nanotechnology for postgraduate courses in the areas of chemistry and biotechnology. The gold
nanorods were synthesized by the seed method and then, functionalized with anti-IL-6 antibodies using the reagents EDAC/NHS
and polyethyleneimine (PEI). This nanocompound was tested against the binding with the specific antigen (IL-6) and changes in the
longitudinal plasmon absorption spectrum showed the coupling efficiency, which was also verified by the decrease in zeta potential.
The experiment was satisfactory, with a positive feedback from participants, and could be implemented in nanotechnology practical
classes from postgraduate courses, as a way for improve education in the emergent area of nanobiotechnology.

Keywords: gold nanorods; surface plasmon resonance; nanotechnology experiment.

INTRODUO de superfcie (SPR). A SPR se caracteriza pela oscilao coletiva

O universo da nanotecnologia se expandiu consideravelmente
na esfera da pesquisa cientfica em todo mundo nos ltimos anos e
constitui uma rea que certamente acarretar em enormes retornos
econmicos. Materiais e tecnologias em escala nanomtrica tm
sido empregados em diversas reas, tais como no setor alimentcio,
sistemas de energia renovvel, bioinformtica e na medicina.1-4 Alm
disso, constituem matria-prima nobre para o desenvolvimento de
dispositivos e sistemas multifuncionais que se adequam aos mais
variados produtos e processos industriais.
Perante a complexidade e relevncia da nanotecnologia, emerge
a necessidade de abordagens prticas e sistmicas nos cursos de
graduao e tambm de ps-graduao. Entretanto, apesar de j
desenvolvidos e utilizados h algum tempo em pesquisas de diversas
reas, os conceitos da nanotecnologia ainda no so abordados em
muitos cursos tericos e prticos de ps-graduao no Brasil.
Neste contexto, uma classe de nanomateriais de grande potencial
tecnolgico e educacional so as nanopartculas de ouro (AuNPs), que
possuem propriedades pticas, magnticas e estruturais interessantes
para aplicaes qumicas e biolgicas. So ainda as nanopartculas
metlicas mais estveis que se tem conhecimento.5,6 Elas podem ser
sintetizadas em diversos tamanhos e formatos, tais como nanoesferas,
nanobastes, nanogaiolas, nanoestrelas e nanoconchas.5 A sntese das
AuNPs geralmente econmica, pois embora demande reagentes
onerosos, estes so empregados em concentraes muito baixas.7
Entre as vrias aplicaes das nanopartculas de ouro, o sensoria-
mento tido como uma das reas de maior interesse na atualidade.
Nesse contexto, dentre as diferentes formas de nanopartculas, dada
grande ateno s nanoesferas e nanobastes de ouro. Isso se deve ao
grande volume de conhecimento obtido sobre a caracterstica mais pe-
culiar das nanopartculas de ouro, a chamada ressonncia plasmnica
*e-mail: csf.ferreira@gmail.com
dos eltrons de conduo das partculas metlicas desencadeada
pela exposio luz, a qual pode ser detectada por espectroscopia.8,9
Descritas pela primeira vez por Faraday em 1857, as nanoesferas
de ouro so usualmente sintetizadas a partir de uma reao de reduo
aquosa de cido clorourico (HAuCl4) por citrato de sdio.10,11 J os
nanobastes de ouro so frequentemente sintetizados pelo mtodo
mediado por sementes, descrito por Murphy e colaboradores em
2001,12,13 no qual os nanobastes so preparados partir da adio
de nanoesferas recobertas por citrato (sementes), uma soluo
contendo HAuCl2 em elevadas concentraes, resultante da reduo
de HAuCl4 por cido ascrbico (C6H8O6) na presena do surfactante
brometo de cetiltrimetilamnio (CTAB) e ons de prata. O CTAB
essencial para a sntese controlada em forma de bastes, devido ao
fenmeno de ligao preferencial s diferentes faces dos bastes aps
o incio do crescimento das sementes.14
Quanto propriedade de SPR e sua aplicabilidade como sensores,
as nanoesferas de ouro apresentam uma banda de absoro plasmnica
na regio do espectro visvel, em torno de 520 nm. Por outro lado,
os nanobastes exibem duas bandas de SPR, visto que a oscilao
coletiva dos eltrons pode ocorrer em dois sentidos, dependendo
da polarizao da luz incidente. Assim, para os nanobastes existe
uma banda de absoro no comprimento de onda semelhante ao das
nanoesferas (denominada banda transversal),15 e uma banda longitu-
dinal (>600nm) como resultado da absoro induzida pelo eixo longo
dos nanobastes, a qual varia de acordo com sua relao de aspecto
(comprimento/largura). Com o aumento dessa razo, que pode ser
determinado tanto pela modificao do tamanho da nanopartcula
quanto pela ligao de molculas em sua superfcie, a cor do ouro
em soluo alterada do azul para o vermelho e o comprimento de
onda de ressonncia de plasmon deslocado.16-19
A existncia da banda de absoro plasmnica longitudinal
apresenta-se como o principal diferencial e grande vantagem dos
nanobastes frente s nanoesferas, no que diz respeito sua aplicao
Vol. 40, No. 5 Uso de nanobastes de ouro para o desenvolvimento de aulas prticas de nanotecnologia
como sensores. A ligao de uma molcula ao nanobasto causa uma
ligeira mudana no ambiente dieltrico prximo e consequentemente
um desvio no pico de absoro da banda longitudinal, alterao que
pode ser facilmente observada por meio da anlise espectrofotom-
trica.14,19 Assim, as medidas de absoro ptica podem ser realizadas
nas suspenses coloidais de nanobastes puros e acoplados a diver-
sos ligantes e/ou agentes biolgicos. O mesmo no possvel com
nanoesferas de ouro, j que possuem apenas uma banda de absoro
plasmnica que no sofre deslocamento aps tais interaes. Portanto,
os nanobastes de ouro oferecem alta sensibilidade de absoro ptica
aps qualquer ligao fsica ou qumica na sua superfcie, alterando
de maneira mensurvel o pico de absoro ptica relacionado ao
modo longitudinal.12,14,17
Para que as nanopartculas de ouro apresentem aplicabilidade, o
CTAB empregado na sntese deve ser removido ou substitudo antes
das etapas de funcionalizao qumica com ligantes e/ou molculas
de interesse, tais como polietileno glicol (PEG), oligonucleotdeos,
peptdeos, polmeros ou slica inorgnica.14,19 Molculas bi-funcio-
nais so amplamente empregadas (Tabela 1), e geralmente possuem
grupos de cido carboxlico que atuam como ligantes qumicos para
bioconjugao atravs de acoplamento mediado por carbodiimida
via amina primria.20
Tabela 1. Principais ligantes empregados para funcionalizar nanoesferas e
nanobastes de ouro
Ligante Referncias
PEG/ SH-PEG 21
Estreptavidina/Biotina 22
Aminocidos 23
Precursores de sais de diaznio 24
cido 3-mercaptopropinico (MPA) 25
cido 11-mercaptoundecanico (MUDA) 26
cido lipico 27
Polietilenoimina (PEI) 28
Cisteamina 29
Todos os eventos de funcionalizao descritos acima podem
ser facilmente monitorados atravs da ressonncia plasmnica de
superfcie, j que a ligao de biomolculas na superfcie das na-
nopartculas altera o ambiente circundante e afeta a densidade de
cargas dos eltrons ali presentes, o que acarreta em deslocamento
da banda de absoro longitudinal.30 Nesse contexto, existem in-
meras aplicaes baseadas nas alteraes da ressonncia plasmnica
de superfcie. Uma delas o biosensoriamento, conhecido por
nanoSPR, obtido pela ligao de biomolculas (como anticorpos)
aos nanobastes j acoplados a um ligante. A posterior interao
com o alvo conclui a deteco, resultando em um deslocamento
observvel da banda longitudinal.19 Estes nanomateriais, portanto,
podem ser empregados em ensaios de biosensoriamento qumico,
com fcil deteco do resultado final por meio da verificao do
deslocamento da banda de absoro plasmnica longitudinal em
espectrofotmetro.7
Trabalhos contendo propostas para introduo da nanocincia
em cursos de graduao envolvendo nanopartculas sintetizadas a
partir de diferentes materiais (incluindo pontos de carbono, ouro
e prata) j foram documentados.31-33 Alguns autores demonstraram
a aplicabilidade de aulas prticas sobre sntese de nanopartculas
de prata e ouro.32,33 Nesses trabalhos, alm dos mtodos de sntese,
foram abordadas as principais propriedades pticas dependentes
do formato e tamanho e catalticas das nanopartculas de ouro.33
595
Recentemente foi reportada uma proposta de aula prtica sobre
nanopartculas de ouro depositadas em filmes de biopolmeros,
na qual os alunos puderam verificar a atividade antimicrobiana da
nanopartcula.34 No entanto, apesar da relativa facilidade com que as
nanopartculas de ouro podem ser preparadas e modificadas quimi-
camente, no h ainda relatos da utilizao destes nanomateriais em
aulas prticas com foco em aplicaes biotecnolgicas. A experincia
prtica de sintetizar e manipular estes nanomateriais seria de grande
relevncia na formao acadmica de estudantes de ps-graduao
para a expanso e consolidao do conhecimento terico e prtico
da nanotecnologia no Brasil.
Alm de envolver conceitos de qumica (como teorias de ligao
metlica, estrutura atmica, reaes de oxidao-reduo e espectros-
copia), a prtica experimental em nanotecnologia utilizando AuNPs
como biosensores envolve tambm conceitos bioqumicos como
interaes antgeno-anticorpos e conformao de molculas. Este
carter interdisciplinar agrega conhecimento aos alunos e valor aos
cursos, j que a nanotecnologia uma nova rea que vem ganhando
espao no Brasil e no mundo.
Portanto, o presente trabalho retrata a experincia de uma aula
prtica de funcionalizao de nanobastes de ouro, realizada durante
o III Curso de Vero em Biotecnologia na Universidade Federal de
Ouro Preto (UFOP). Essa uma iniciativa de divulgao da nanobio-
tecnologia, de significativa importncia para o avano tecnolgico e
valorizao da pesquisa. Alm disso, este trabalho descreve as etapas
de acoplamento do ligante polietilenoimina (PEI) superfcie de
nanobastes de ouro e posterior ligao com o anticorpo anti-Inter-
leucina 6 (IL-6). A IL-6 uma protena pr-inflamatria, glicosilada
com peso molecular de 26 kDa, identificada pela primeira vez em
1980, produzida por macrfagos, clulas dendrticas, algumas clulas
TCD4+ (dos tipos Th2 e Th17) e tambm por clulas no imunes
(fibroblastos e clulas endoteliais).35,36 Este , portanto, um modelo
para o desenvolvimento de novos ensaios de deteco de biomolculas
que podem ser aplicados pesquisa e ao ensino, na formao de ps
graduandos em qumica e em biotecnologia.
PARTE EXPERIMENTAL
Reagentes
Para a sntese de nanopartculas de ouro foram utilizados os
reagentes cido tetraclorourico 99% (Sigma-Aldrich), brometo de
cetiltrimetilamnio P.A. (CTAB, Sigma-Aldrich), cido ascrbico e
nitrato de prata, ambos com pureza mnima de 99% (Aldrich). As
nanopartculas foram funcionalizadas com o ligante polietilenoimina
50% w/v em gua (Sigma-Aldrich). Foi utilizado o par anticorpo-
-antgeno do kit para ELISA de IL-6 humana (BD OptEIA). Os
anticorpos foram suspendidos em tampo fosfato salino (PBS), em
cloridrato de N-etil-N-(3-dimetil-aminopropil)carbodiimida P.A.
(Sigma-Aldrich) e em N-hidroxisuccinimida 98% (Sigma-Aldrich).
Para bloqueio da superfcie dos nanobastes, foi utilizada a albumina
srica bovina com pureza mnima de 98% (GE, Sigma). Todas as
solues aquosas foram preparadas com gua deionizada e filtrada
(18 M) e as vidrarias lavadas exaustivamente com cido ntrico
65% (Vetec).
Sntese de nanobastes de ouro
As nanopartculas de ouro foram sintetizadas pelo mtodo
mediado por semente.13,37 Nesta sntese, as sementes de ouro foram
preparadas por meio da mistura de 2,25 mL de HAuCl4 (5 mmol
L-1), 1,25 mL de CTAB (0,2 mol L-1) e 0,9 mL de soluo resfriada
de NaBH4 (1 mmol L-1) sob agitao contnua, resultando em uma
596
soluo marrom-amarelada. A soluo de crescimento foi obtida
misturando-se 5 mL de soluo HAuCl4 (1 mmol L-1) com 5 mL
de CTAB (0,2 mol L-1) e AgNO3 (4 mmol L-1). Ento, 0,07 mL de
cido ascrbico (0,0788 mol L-1) foram adicionados durante agitao
vagarosa. Nessa etapa o cido ascrbico age como agente redutor
e altera a cor da soluo de amarelo intenso para transparente. Por
fim, 0,012 mL da soluo semente foram adicionados soluo
recm-preparada para iniciar o crescimento dos nanobastes. A cor
da soluo se alterou gradualmente entre os primeiros 15-20 min, at
se estabilizar em tom arroxeado. Os nanobastes foram purificados
retirando-se o excesso de CTAB por dupla centrifugao a 5.600 g
por 15 min e redispersos em gua ultrapura deionizada.
Funcionalizao de nanobastes de ouro
Para permitir o acoplamento dos anticorpos, foi realizada a ligao
de PEI superfcie dos nanobastes de ouro. Esse reagente capaz
de mediar a ligao covalente nanobasto-anticorpo devido aos vrios
grupos amina reativos.38 Para isso, 250 L de soluo de nanobastes
de ouro foram centrifugados a 4000 g por 10 min, ressuspendidos em
250 L de PEI (0,3% em gua ultra pura) e incubados a temperatura
ambiente em banho ultrassnico por 30 min, para desestabilizao
do CTAB presente na superfcie das nanopartculas e acoplamento
do PEI. Em seguida, a soluo foi novamente centrifugada a 4000g
por 10 min e ressuspendida em 250 L de anticorpos anti-IL-6 a
0,4gmL-1 previamente preparados.
A soluo dos anticorpos foi preparada adicionando-se 18,7 L
de EDAC/HNS (0,4 mol L-1 / 0,1 mol L-1), 0,4 g mL-1 dos anticor-
pos anti-IL-6 e tampo fosfato salino (PBS 1X, pH 7.4, NaCl, KCl,
Na2HPO4, KH2PO4 em gua ultra pura) para um volume final de
250L e, em seguida, incubada por 30 min a 4 C. Por fim, a reao
de acoplamento dos nanobastes funcionalizados ao PEI com os
anticorpos foi realizada por 60 min temperatura ambiente em banho
ultrassnico. Ao final deste tempo foram novamente centrifugadas a
4000 g por 10 min e ressuspendidas em 100 L de PBS contendo 62
g mL-1 de BSA, para realizar o bloqueio de possveis regies livres
remanescentes na superfcie dos nanobastes de ouro. Transcorridos
30 min de incubao temperatura ambiente, a soluo foi centrifuga-
da a 4000 g por 10 min e ressuspendida em 100 L de PBS contendo
100 pg mL-1 do antgeno especfico IL-6.
Instrumentao
Os espectros de absoro plasmnica das solues coloidais
foram obtidos em um espectrofotmetro Shimadzu UV-1800, utili-
zando-se cubetas de quartzo de 1 cm de caminho ptico. As amostras
foram tambm analisadas por leitura de potencial zeta, com o qual
possvel aferir estabilidade e comprovar a ligao de molculas nas
nanopartculas, atravs da modificao da sua carga superficial quando
dessa interao. Para as leituras, 10 L de amostra ressuspendida em
PBS foram diludos em 1,5 mL de gua ultra pura e ento, aplicados
em cubetas especficas. As medidas foram feitas utilizando Zetasizer
(NanoSeries Malvern). Alm disso, os dados resultantes da leitura
em espectrmetro UV-Vis-NIR foram normalizados utilizando o
software PeakFit V.4 e os grficos foram gerados em GraphPad
Prism e Origin v. 8.0.
Segurana e riscos
Todos os procedimentos experimentais so de simples execuo
e no expem os alunos a riscos, desde que sejam realizados seguin-
do-se as normas bsicas de biossegurana.
Deve ser dada ateno especial aos seguintes reagentes:
Ferreira et al. Quim. Nova
PEI, cido tetraclorourico, borohidreto de sdio, NHS e EDAC:
causam irritao na pele e olhos. Portanto, utilize luvas de prote-
o e vesturio de proteo (jaleco) durante seu manuseio. Caso
entre em contato com os olhos, enxague continuamente com gua
corrente, remova lentes de contato e procure atendimento mdico.
Brometo de cetiltrimetilamnio (CTAB) altamente txico para
o sistema respiratrio quando inalado. Portanto, utilize mscara
durante sua pesagem. Em caso de ingesto acidental, enxague
imediatamente a boca e procure atendimento mdico.
Nitrato de prata e do cido ntrico so reagentes que causam
irritao na pele e nos olhos, alm de serem txicos quando
inalados. Seu manuseio tambm requer a utilizao de luvas de
proteo, vesturio de proteo (jaleco) e mscara. Alm disso,
deve-se manter estes reagentes longe de materiais combustveis
e afastados do calor, fascas, chamas e/ou superfcies quentes.
RESULTADOS E DISCUSSO
Sntese de nanobastes de ouro
O procedimento de sntese permitiu a obteno de uma soluo
coloidal de cor arroxeada altamente estvel de nanobastes de ouro.
Tal como na sntese de nanoesferas, a formao dos nanobastes
envolve a reduo de AuCl4- para Au0 pela ao do borohidreto de
sdio, e, em seguida do cido ascrbico, que atuam como agentes
redutores.32
O processo de sntese de nanobastes mediado por sementes
consiste no alongamento assimtrico de nanoesferas de ouro (se-
mentes) em apenas uma direo, devido interao com o surfac-
tante CTAB e ons de prata. Diferentes teorias tentam explicar tal
fenmeno de crescimento assimtrico direcionado.39,40 Basicamente,
os tomos de ouro encontram-se organizados em uma estrutura
cbica de face centrada e suposto que a deposio de outros to-
mos de ouro (presentes na soluo de crescimento) cause a quebra
de assimetria dessa estrutura e o incio do crescimento na direo
em que ocorreu essa deposio inicial.12,14 A partir desse ponto,
essa diferena estrutural acarreta em diferenas conformacionais e
faces com diferentes energias de superfcie, fato que, por sua vez,
responsvel pela interao preferencial do surfactante (e dos ons
de prata) com regies especficas do basto em crescimento.14,19 A
face em que o crescimento foi iniciado apresenta um espaamento
entre os tomos que mais propcio interao do CTA+ do que
com as demais. Por outro lado, as demais faces apresentam maior
energia de superfcie, a qual estabilizada pela interao com o
CTAB. Na soluo de crescimento, os tomos de ouro encontram-se
na forma de AuCl2- ligado micelas de CTAB. A interao entre os
campos eltricos do AuCl2- (carregado negativamente) e da semente
em crescimento (carregada positivamente) faz com que as colises
entre as partculas sejam mais frequentes na extremidade em que
o crescimento foi iniciado, direcionando o alongamento em forma
de basto.14 Alm do papel exercido pelo CTAB, os ons de prata
tambm so importantes no controle da sntese por exercerem duas
atividades fundamentais.12,19 A primeira consiste em diminuir a
densidade de carga dos ons brometo e reduzir a repulso entre as
molculas de CTAB ligadas s faces no-crescentes da semente,
aprimorando a forma dos bastes. A segunda funo exercida pelos
ons de prata a limitao do tamanho dos bastes. Isso ocorre
devido reduo dos ons Ag+ a Ag0 que ocorre na presena de
outros metais (como o ouro) e posterior deposio lenta nas faces
em que houve alongamento, limitando o comprimento dos bastes
a aproximadamente 100 nm.14,41
Ao final das etapas da sntese os alunos observaram que a solu-
o resultante apresentou uma colorao arroxeada, e desta soluo
Vol. 40, No. 5 Uso de nanobastes de ouro para o desenvolvimento de aulas prticas de nanotecnologia 597

foi separada uma alquota para a anlise espectroscpica na regio
UV-Vis-NIR (Figura 1A). Alm disso, quando disponvel, os alunos
podem realizar imagem por microscopia eletrnica de transmis-
so (TEM) para visualizao do material sintetizado (Figura 1B).
Previamente realizao do experimento, os alunos no consideravam
a hiptese do ouro assumir diferentes cores. Os alunos responderam
em questionrio que o ouro certamente possui cor amarela, podendo
assumir diferentes tonalidades apenas quando associado a outros
metais. Nenhum aluno fazia ideia da maneira pela qual poderiam
ser sintetizadas nanopartculas de ouro em laboratrio e ficaram
satisfeitos com o resultado e aprendizado, principalmente com a
variedade de cores que as nanopartculas metlicas podem assumir.
Dessa forma, esse experimento possibilitou a discusso dos conceitos
de ressonncia plasmnica de superfcie e confinamento quntico,
responsveis, respectivamente, pela origem e variedade de cores das
nanopartculas em funo do tamanho.32
Montagem do biosensor
Os anticorpos anti-IL-6 foram acoplados aos nanobastes de
ouro por intermdio do reagente polietilenoimina (PEI), que se liga
eletrostaticamente superfcie do ouro. Tal etapa de suma impor-
tncia para que ocorra a ligao covalente de um dos grupos amina
(-NH2) expostos no PEI com o grupo carboxila (-COOH) presente
na poro C-terminal do anticorpo. As imunoglobulinas da classe G
(IgG) so constitudas de duas cadeias pesadas, unidas entre si por
pontes dissulfeto, e duas cadeias leves, unidas s cadeias pesadas
tambm por pontes dissulfeto (Figura 2). Quando digeridas pela
enzima papana, as IgGs so separadas em uma regio constante
(Fc), que determina as funes efetoras do anticorpo, e duas regies
variveis (Fab), responsveis pela especificidade de ligao para cada
antgeno.42 Durante a ligao ao reagente PEI, essas regies devem
permanecer livres para permitir o posterior acesso do antgeno. Por

Figura 1. A: Espectro de absoro na regio do ultravioleta-visvel-infravermelho prximo (UV-Vis-NIR), com picos de absoro plasmnica transversal
(520 nm) e longitudinal (863 nm). Insero: aspecto visual da soluo de nanobastes de ouro. B: Imagem de microscopia eletrnica de transmisso (TEM)
representativa de um resultado de sntese atravs do protocolo aqui descrito

Figura 2. Estrutura tridimensional bsica de um anticorpo. Cada cadeia pesada (H) e leve (L) possui uma regio varivel (V) e uma regio constante (C). As
duas cadeias pesadas so unidas entre si e entre uma cadeia leve por pontes dissulfeto. A poro C-terminal contendo grupos carboxila est localizada na
regio constante das cadeias pesadas e a poro N-terminal contendo grupos amina situa-se na regio varivel que engloba ambas as cadeias leves e pesadas
598 Ferreira et al. Quim. Nova

Figura 3. Esquema de reao de crosslinking entre PEI e o anticorpo anti-IL-6 empregando EDAC e NHS. 1: Reao de adio eletroflica do EDAC ao
anticorpo. 2: Substituio nucleoflica do EDAC por NHS, formando um ster de NHS. 3: Reao entre o anticorpo contendo o ster de NHS e a amina primria
do PEI para formao da ligao amida. AuNB: Nanobastes de ouro

esse motivo, a ligao estabelecida com os grupos carboxila das

cadeias pesadas das IgGs, localizadas na extremidade da poro Fc.
A ligao amida do grupo carboxila presente na poro C-terminal
do anticorpo com os grupos amina do PEI obtida por meio de uma
reao de acoplamento (crosslinking), realizada com o emprego de
um agente acoplante (N-etil-N-(3-dimetil-aminopropil) carbodiimida
EDAC) e um agente estabilizante (N-hidroxisuccinimida NHS).
Ambos reagentes servem como ativadores do grupo carboxila. A
despeito do uso isolado do EDAC j resultar em um composto com
a capacidade de formar uma ligao amida, a reao entre esse com-
posto e o NHS forma um ster com menor probabilidade de sofrer
hidrlise, aumentando a probabilidade da reao entre o C-terminal
ativado e a amina primria do PEI. As reaes ocorridas em cada
etapa so mostradas na Figura 3. Alm disso, a Figura 4 resume as
principais etapas de sntese e funcionalizao dos nanobastes de
ouro, necessrias para a construo do biosensor no desenvolvimento
da aula prtica.
A ligao de molculas na superfcie dos nanobastes altera o
ambiente circundante e afeta a densidade de cargas dos eltrons ali
presentes, acarretando em um deslocamento da banda de absoro
longitudinal.5 Dessa forma, aps adio do reagente polietilenoimina
(PEI) soluo contendo nanobastes de ouro, pde ser observado
um deslocamento de 62 nm para a esquerda (blue-shift), comprovando
a ligao. O blue-shift do pico de absoro plasmnica longitudinal
indica que houve uma diminuio da constante dieltrica no meio
circundante. Em seguida, verificou-se a efetiva ligao do anticorpo
anti-IL-6 ao PEI, sendo observado um deslocamento de 29 nm para Figura 4. Principais etapas de sntese e funcionalizao de nanobastes de
a direita (red-shift), devido ao aumento do ndice de refrao do am- ouro para desenvolvimento da aula prtica utilizando biosensor
biente circundante. Ambos os deslocamentos podem ser facilmente
visualizados na Figura 5, comprovando a ligao do linker PEI (linha superfcie de nanopartculas de ouro43, os nanobiosensores foram
tracejada) e o posterior acoplamento do anticorpo anti-IL6 (linha incubados com BSA (62 g mL-1) para permitir o bloqueio de pos-
pontilhada). sveis stios dos nanobastes que no tenham sido ocupados. Nesta
Posteriormente, considerando que a protena modelo albumina reao, houve um deslocamento de apenas 4 nm para a esquerda, em
srica bovina (BSA) possui capacidade de se adsorver facilmente relao banda de absoro plasmnica longitudinal de nanobastes
Vol. 40, No. 5 Uso de nanobastes de ouro para o desenvolvimento de aulas prticas de nanotecnologia
Figura 5. Espectros de absoro ptica da funcionalizao de nanobastes
de ouro (AuNBs). Espectro resultante de AuNBs puros com pico mximo de
absoro plasmnica longitudinal de 863 nm em linha contnua; ligao de
PEI (0,3%) aos AuNBs com pico mximo de absoro plasmnica longitu-
dinal de 801 nm em linha tracejada e; ligao de 0,4 g mL-1 de anticorpo
anti-IL-6 com pico mximo de absoro plasmnica longitudinal de 830 nm
em linha pontilhada
j ligados ao PEI e aos anticorpos (Figura 6). Esse deslocamento no
significativo no que concerne ao efeito de biosensoriamento, mas
sugere que o BSA tenha sido adsorvido aos locais nos quais o reagente
PEI no havia se ligado. Alm disso, aps novas adies de BSA,
no ocorre deslocamento, o que corrobora a hiptese do completo
bloqueio. A ocupao de possveis stios remanescentes impede
posteriores ligaes inespecficas na superfcie dos nanobastes, que
poderiam ocasionar resultados falsos na etapa do biosensoriamen-
to. Dessa forma, a finalizao de tais etapas resultam na completa
funcionalizao dos nanobastes de ouro, que podem ser, a partir de
ento, considerados nanobiosensores.
Figura 6. Espectros de absoro ptica do bloqueio de nanobastes de ouro
com a protena albumina bovina srica (BSA). Espectro resultante de nano-
bastes puros ligados ao PEI (0,3%) e 0,4 g mL-1 de anticorpo anti-IL-6
com pico mximo de absoro plasmnica longitudinal de 830 nm em linha
contnua e; ligao de 62 g mL-1 de BSA aos nanobastes com pico mximo
de absoro plasmnica longitudinal de 826 nm em linha tracejada
Deteco nanosonda-alvo
Aps a etapa de preparo da nanosonda, a superfcie dos nanobas-
tes encontra-se recoberta por anticorpos ligados e os stios livres blo-
queados com BSA. Dessa forma, o nanosensor encontra-se apropriado
para os eventos de interao com o antgeno alvo. Portanto, a soluo
599
de nanobastes de ouro foi incubada com o antgeno especfico IL-6
(100 pg mL-1) e sua interao efetiva com o anticorpo resultou em
deslocamento significativo de 25 nm para a direita, como pode ser
visualizado na Figura 7.
Figura 7. Espectros de absoro ptica do biosensoriamento de AuNBs.
Espectro resultante do nanobiosensor com pico mximo de absoro plas-
mnica longitudinal de 826 nm em linha contnua e; ligao de 100 pg mL-1
de IL-6 aos AuNBs com pico mximo de absoro plasmnica longitudinal
de 851 nm em linha tracejada
A visualizao desse deslocamento na banda de absoro plas-
mnica longitudinal finaliza o experimento, comprovando de maneira
simples uma interao sonda-alvo. Alm de verificar a ligao de
molculas/biomolculas na superfcie dos nanobastes por meio
do deslocamento do comprimento de onda da banda de absoro
plasmnica longitudinal, existem outras maneiras que confirmam o
biosensoriamento. Dessa forma, todas as reaes de troca de ligantes
ou deteco de analitos podem ser avaliadas tambm pelo pico Raman
das biomolculas (especialmente das ligaes Au-S em cerca de 260
cm-1), pela estabilidade dos bioconjugados em soluo tamponada ou
ainda atravs de espectroscopia no infravermelho por transformada
de Fourier (FTIR). As ligaes qumicas possuem modos vibra-
cionais com assinaturas em comprimentos de onda especficos, e,
dessa forma, as ligaes envolvidas nas interaes PEI-nanobasto
e biosensor-antgeno podem ser comprovadas por meio da tcnica
de FTIR.44,45 Alm disso, as interaes podem tambm ser analisadas
atravs de alteraes do potencial zeta, o qual pode ser medido e
avaliado em suspenses coloidais.14
O potencial zeta, ou potencial eletrocintico, uma propriedade
fsica exibida por qualquer partcula em suspenso, muito empregado
na otimizao de formulaes de suspenses e emulses, auxiliando
tambm na predio da estabilidade a longo prazo.46 Dessa forma,
o potencial zeta constitui uma medida tanto da estabilidade quanto
da ligao de molculas nas partculas, uma vez que os valores mais
negativos ou positivos esto associados com solues mais estveis,
j que a repulso entre as nanopartculas reduz a agregao das
mesmas.47
Aps confirmao da interao sonda-alvo, visualizada atravs
do deslocamento do pico de absoro plasmnica longitudinal por
meio da espectroscopia na regio UV-Vis-NIR, foi realizada leitura
do potencial zeta. Devido simplicidade de execuo, o potencial zeta
pode ser empregado, quando disponvel, de maneira complementar
para aprimorar a anlise pelos estudantes e introduzir os conceitos
bsicos dessa tcnica. Ressaltamos que a realizao de uma aula
prtica somente com a visualizao espectroscpica do deslocamento
da banda de absoro plasmnica longitudinal suficiente para que
os alunos comtemplem a interao nanosonda-alvo.
600
Os nanobastes de ouro so sintetizados com CTAB, uma molcu-
la carregada positivamente que confere estabilidade. Aps a ligao de
outras molculas na superfcie das nanopartculas, parte deste CTAB
retirada e, ento, a medida do potencial zeta deve ser reduzida. Isso
acontece uma vez que a soluo perde parte da estabilidade oferecida
pelo CTAB. No caso de molculas carregadas positivamente o valor
do potencial zeta continua positivo, e em caso contrrio, o valor se
torna negativo.48
Portanto, quando o PEI misturado aos nanobastes de ouro
carregados positivamente, a carga lquida diminuda. Da mesma
forma, a cada nova ligao efetiva, a carga tende a diminuir, se ne-
gativando de maneira dependente da carga dos ligantes. Em todos os
casos o valor do potencial zeta deve ser diferente de zero, garantindo a
estabilidade. A Figura 8 mostra as leituras obtidas, em que houve uma
diminuio dos valores em mV para os controles (AuNB+PEI+Ac;
AuNB+Bloqueio com BSA), em relao soluo pura de nanobas-
tes de ouro (AuNB). Na leitura aps adio de BSA (124 g mL-1),
um alvo inespecfico, os valores de potencial zeta foram equiparados
queles encontrados para o nanosensor, enquanto na presena de
IL-6 o valor em mV se tornou negativo, com diferena estatstica
significativa em relao nanosonda, comprovando sua deteco.
Figura 8. Potencial Zeta (mV) para as diferentes condies de preparo e
deteco do nanobiosensor. *intensidade em mV significativamente diferente
em relao ao nanobasto funcionalizado ao anticorpo anti-IL-6 (p 0,05).
n = 10
A anlise do potencial zeta complementa a avaliao da interao
nanosonda-alvo e fornece uma indicao da estabilidade do sistema
coloidal, sendo til para a introduo desse conceito aos estudantes.
Se todas as nanopartculas em suspenso possuem valores altos de
potencial zeta negativo ou positivo, elas tendero a se repelir umas s
outras e no haver tendncia para que as nanopartculas se unam. No
entanto, se as nanopartculas apresentam baixos valores de potencial
zeta, no haver fora para evitar que elas se agreguem.46 No caso
do experimento de biosensoriamento, os alunos puderam verificar,
atravs das leituras de potencial zeta, que houve ligao efetiva em
cada etapa, sempre mantendo a estabilidade do sistema.
Ao trmino dos experimentos, os alunos responderam um
questionrio a respeito da experincia adquirida e suas perspectivas
futuras para o emprego da nanotecnologia (Quadro 1). No mbito da
vida profissional, todos os alunos vislumbraram aplicabilidade das
nanopartculas de ouro em suas pesquisas de iniciao cientfica, e
se sentiram entusiasmados quanto isso. Alguns exemplos inclu-
ram novas formas de diagnstico, deteco de substncias no meio
Ferreira et al. Quim. Nova
ambiente e direcionamento de drogas. De maneira geral, os alunos
participantes do curso demonstraram vago conhecimento em relao
ao tema e afirmaram que o curso lhes proporcionou um aprofunda-
mento conceitual na rea da nanotecnologia, com o qual foi possvel
uma melhor compreenso de todas as etapas da abordagem prtica
na sntese dos nanobastes de ouro.
Quadro 1. Perguntas contidas no questionrio disponibilizado aps o expe-
rimento em nanotecnologia realizado com os alunos do III Curso de Vero
em Biotecnologia da UFOP
Perguntas realizadas
1. J conhecia o assunto abordado?
2. O que o curso realizado lhe proporcionou?
3. Durante o curso voc foi capaz de reformular conceitos respeito
do assunto?
4. O assunto possui aplicao prtica na sua vida profissional?
5. O material didtico utilizado foi suficiente?
6. Voc acha interessante a introduo de uma prtica laboratorial com
nanopartculas de ouro em cursos de ps-graduao em qumica/
biotecnologia?
As respostas do questionrio aplicado foram satisfatrias e mos-
traram que a aula prtica realizada desempenhou um impacto positivo
na vida acadmica dos participantes, uma vez que adquiriram o conhe-
cimento multidisciplinar das diversas aplicaes da nanotecnologia.
Todos os participantes avaliaram o material didtico como adequado
e suficiente (apostila contendo o roteiro prtico e os conceitos des-
critos nesse trabalho). Alm disso, todos os alunos consideram que
a introduo de aulas prticas envolvendo nanopartculas de ouro
de relevante importncia para a formao profissional nos cursos de
ps-graduao nas reas de qumica e/ou biotecnologia.
Na esfera educacional, fundamental que a interao dos alunos
com o ambiente da pesquisa seja cada vez mais incentivada, com a
aplicao prtica do conhecimento terico desenvolvido em sala.
Isso demostra a convenincia dessa aula prtica para a reviso de
conceitos de qumica e bioqumica, sendo vivel sua utilizao em
cursos de ps-graduao, nos quais os estudantes j so capazes de
aplicar esses conceitos interdisciplinares para seu desenvolvimento
tcnico-cientfico. Consideramos que, uma vez seguidas as diretrizes
contidas nesse trabalho, a utilizao de nanobastes de ouro para
aplicao em aulas prticas de nanotecnologia em maior escala ser
bem sucedida. Em vista disso, a sntese dos nanobastes de ouro, a
posterior confeco do nanobiosensor, a comprovao da deteco do
alvo especfico por espectroscopia UV-Vis-NIR e a anlise comple-
mentar do potencial zeta foram etapas realizadas satisfatoriamente e
se mostraram capazes de estimular ainda mais o interesse dos alunos
pela nanotecnologia.
CONCLUSO
A proposta de uma aula prtica envolvendo nanobastes de ouro
foi desenvolvida com xito e os alunos demostraram interesse em se
aprofundar nos diversos conceitos da nanotecnologia. A funcionali-
zao dos nanobastes de ouro com polietilenoimina e anticorpos,
e posterior deteco de IL-6, foi realizada por um grupo de quatro
graduandos sob superviso de um aluno da ps-graduao. A partir
dos ensaios realizados e dos resultados alcanados, sugerimos que
o biosensor proposto pode ser utilizado para o estabelecimento de
uma ou duas aulas prticas, uma vez que simples e multidiscipli-
nar, abrangendo conhecimentos de fsica, biologia e principalmente
qumica. Devido dificuldade mdia no entendimento da prtica, ela
Vol. 40, No. 5 Uso de nanobastes de ouro para o desenvolvimento de aulas prticas de nanotecnologia
proposta para alunos de ps-graduao, sendo factvel e gerando
muitos retornos para a formao do estudante. Essa abordagem contri-
bui ainda para a divulgao da nanotecnologia e, consequentemente,
para o avano tecnolgico e valorizao da pesquisa nesta rea. Por
fim, poder expandir horizontes aos estudantes, transmitindo novas
perspectivas de pesquisas e campos de trabalho.
AGRADECIMENTOS
Aos alunos participantes do III Curso de Vero em Biotecnologia
da UFOP, que participaram da aula prtica em nanotecnologia e auxi-
liaram na obteno dos resultados. Ao Laboratrio de Nanomateriais
do Departamento de Fsica da Universidade Federal de Minas Gerais e
ao Laboratrio Multiusurios da Escola de Farmcia da Universidade
Federal de Ouro Preto. s instituies de fomento FAPEMIG (projeto
FAPEMIG CDS APQ 01510-14), CAPES e CNPq.
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