Tema 5.

Difraccin de rayos X
Espectro electromagntico y Rayos X
Los rayos X son radiaciones electromagnticas de la misma naturaleza que la luz pero
de longitud de onda mucho ms corta. La unidad de medida en la regin de los rayos X
es el angstrom (), igual a 10-10m y los rayos X usados en difraccin tienen longitudes
de onda en el rango 0.5-2.5 mientras que la longitud de onda de la luz visible est en
el orden de 6000 (600nm). Son radiaciones penetrantes, producidas por el bombardeo
de tomos metlicos con un haz de electrones de alta velocidad. Al aumentar el nmero
atmico del metal bombardeado, la energa de los rayos X caractersticos aumenta.
Los rayos X que ms interesan en el campo de la cristalografa son aquellos que
presentan una longitud de onda alrededor de 1, que corresponde aproximadamente con
las distancias interatmicas. Por ello, esta radiacin es capaz de interaccionar con
tomos y molculas, proporcionando as informacin sobre los mismos.
Estado cristalino
En muchos materiales slidos, las grandes fuerzas de atraccin o cohesin que existen
entre las partculas que lo componen hacen que stas se distribuyan regular y
simtricamente en el espacio. Los slidos que presentan este tipo de estructura ordenada
(o cristalina) reciben el nombre de slidos cristalinos o cristales. La cristalografa es la
ciencia que se encarga de estudiar los cristales y su formacin.
La estructura cristalina es, por tanto, la forma en que se ordenan y empaquetan los
tomos, molculas o iones de manera ordenada, con patrones de repeticin que se
extienden en las tres dimensiones del espacio. En la estructura cristalina de los
materiales inorgnicos, las unidades repetitivas son tomos (cristales atmicos, como el
diamante) o iones (cristales inicos, como el NaCl) enlazados entre s, de modo que
generalmente no se distinguen unidades aisladas y de ah su estabilidad y dureza. En los
cristales moleculares las unidades aisladas que forman el cristal son molculas con
uniones ms dbiles y son generalmente materiales ms blandos e inestables, a
diferencia de los cristales inorgnicos, donde las entidades que forman el retculo
cristalino son tomos o iones. En el caso de macromolculas como las protenas,
tambin existen unidades moleculares (como en otros materiales orgnicos), pero son
mucho ms grandes. Las fuerzas que unen estas macromolculas son tambin similares
a las de los cristales moleculares, pero su empaquetamiento en los cristales deja muchos
huecos que se rellenan con agua no ordenada y de ah su extrema inestabilidad.
Un cristal es, por tanto, una estructura slida formada por agrupaciones ordenadas de
tomos, iones o molculas que se caracteriza por la repeticin en las tres direcciones del
espacio de una unidad estructural mnima, llamada "celda unidad". Esta celda unidad se
define como la estructura geomtrica tridimensional (paraleleppedo) cuya repeticin
genera el cristal y est formada, a su vez, por una unidad mnima que se denomina
"unidad asimtrica". Las propiedades bsicas del cristal van a depender por un lado de
las dimensiones de la celda unidad (definidas por las distancias a, b, c y los ngulos,
, , o bien por los vectores no coplanarios , ) y, por otro lado, de su simetra.

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Los cristales se clasifican segn sean las propiedades de simetra de la celda unidad. Los
elementos de simetra son los puntos, ejes o planos alrededor de las cuales tienen lugar
las operaciones de simetra (inversin, rotacin, reflexin y traslacin). Las
restricciones que estos elementos de simetra ejercen sobre las longitudes y ngulos de
la celdilla unidad permiten clasificar a los cristales en siete sistemas cristalinos (cbico,
tetragonal, ortorrmbico, hexagonal, trigonal, monoclnico y triclnico). Para determinar
completamente la estructura cristalina elemental de un slido, adems de definir la
forma geomtrica de la red, es necesario establecer las posiciones de los tomos en la
celda. Bravais mostr que catorce celdas unidad estndar (conocidas desde entonces
como redes de Bravais) podan describir todas las estructuras reticulares posibles.

Desde un punto de vista geomtrico, una red plana puede considerarse originada por la
aplicacin de una serie de traslaciones coplanares de la celda unidad. En una red
cristalina pueden trazarse series o familias de planos paralelos y equidistantes entre s,
llamados planos cristalinos, construidas de forma que todos los puntos de la red
(elementos de la celdilla unidad) caen en alguno de los planos de cada familia. La
distancia "d" entre dos planos consecutivos de una misma familia se denomina distancia
interplanar, o simplemente espaciado.

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https://www.youtube.com/watch?v=C1cYJthlBZY&feature=youtu.be
La difraccin de rayos X
Cuando un haz de rayos X incide sobre un material ocurren varios fenmenos:

El fundamento de la difraccin de rayos X reside en el fenmeno conocido como

dispersin scattering, que se produce cuando una radiacin incide sobre la materia
provocando su atenuacin (es uno de los mecanismos responsables de la atenuacin de
los rayos X). Este fenmeno consiste en la desviacin de los fotones del haz incidente
de su direccin original de propagacin al interaccionar con el material irradiado. Si esta
desviacin ocurre sin prdida de energa (la de la radiacin incidente no cambia en la
radiacin dispersada), la dispersin ser "elstica". Por el contrario, cuando el haz es
desviado con prdida de energa, entonces la dispersin es "inelstica". La cristalografa
de rayos X se basa en la dispersin elstica de la radiacin causada por los cristales
objeto de estudio, ya que es la responsable del fenmeno de difraccin de rayos X.
La difraccin de rayos X es esencialmente un fenmeno de dispersin que provoca
interferencias entre las ondas dispersadas. Las interferencias constructivas ocurren slo
en determinadas direcciones del espacio, en funcin de:
la distancia entre los elementos que se repiten en la estructura peridica.

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 la longitud de onda de la radiacin incidente y dispersada (que son iguales, al
tratarse de una dispersin elstica).
Bragg descubri que la geometra del proceso de difraccin de rayos X es anloga a la
reflexin de la luz por un espejo plano (para repasar el fenmeno de difraccin,
consultar el anexo I).
En una estructura cristalina tridimensional,
debido a su periodicidad, es posible
construir familias de planos paralelos y
equidistantes entre s (llamados planos
cristalinos), con idnticas disposiciones
atmicas. La figura representa dos de estos
planos de la red cristalina, donde "d" es la
distancia entre ellos (distancia interplanar)
y "" es el ngulo entre los rayos incidentes
y el plano normal.
El proceso de difraccin se produce por la dispersin de los rayos X al interactuar con
las nubes electrnicas que rodean los tomos del cristal. Esta interaccin genera un
patrn de difraccin regular (al igual que la estructura
atmica del cristal), resultado de la interferencia
constructiva y destructiva de la radiacin dispersada
por todos los planos cristalinos. Los tomos dispersan
la radiacin incidente en todas direcciones pero slo
en algunas de ellas los rayos dispersados estarn
completamente en fase y, por tanto, se reforzarn
mutuamente (interferencia constructiva) para formar
rayos difractados.
La ley de Bragg impone que, para que se produzca una interferencia constructiva, la
diferencia de camino ptico entre los rayos dispersados por dos planos cristalinos
adyacentes sea mltiplo entero de la longitud de onda. Esta ley (que puede expresarse
segn la ecuacin 2d sin = n) permite estudiar las direcciones en las que la difraccin
de rayos X sobre la superficie de un cristal produce interferencias constructivas, dado
que permite predecir los ngulos en los que los rayos X son difractados por un material
con estructura atmica peridica.
Se dice que la interferencia es constructiva cuando la
diferencia de fases entre dos ondas electromagnticas es
proporcional a un mltiplo entero de 2. Cuando un
cristal difracta rayos X, las ondas electromagnticas
dispersadas interfieren entre s constructivamente (es
decir, se refuerzan) slo en algunas direcciones,
anulndose en el resto.

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La amplitud dispersada por una celda unidad se obtiene sumando la amplitud dispersada
por todos los tomos en la celda unidad, de nuevo la suma debe tener en cuenta la
diferencia de fase entre todas las ondas dispersadas.

En un cristal hay distintas familias de planos, con distintos espaciados, y por lo tanto,
existirn tambin distintas direcciones de difraccin. El conjunto de espaciados de un
cristal es caracterstico para cada especie cristalina y esto nos permite decir que no
existen dos sustancias cristalinas que tengan un diagrama de difraccin idntico. Se dice
que el diagrama de difraccin es como una huella dactilar de las sustancias cristalinas.
En resumen, la difraccin es esencialmente un fenmeno de dispersin en el que
cooperan un gran nmero de tomos. Puesto que los tomos estn dispuestos
peridicamente en una red, los rayos dispersados tienen unas relaciones de fase
definidas entre ellos; estas relaciones de fase son tales que en la mayora de las
direcciones se produce una interferencia destructiva pero en unas pocas direcciones se
produce una interferencia constructiva y se forman rayos difractados.
Qu informacin nos proporciona la difraccin de rayos X?
a) La geometra de las direcciones de difraccin est condicionada nicamente por el
tamao y la forma de la celda unidad del cristal, de modo que conociendo estas
direcciones se puede deducir el sistema cristalino y las dimensiones de la celda.
b) Las intensidades de los rayos difractados estn ntimamente relacionadas con la
naturaleza de los tomos y con sus posiciones en la red cristalina, de forma que su
medida constituye un procedimiento para obtener informacin tridimensional acerca
de la estructura interna del cristal. La intensidad de los picos de difraccin
depende de la interferencia de los rayos dispersados por los sitios de la base. Si la
interferencia es constructiva entonces tendremos un pico de intensidad mxima, si al
contrario es destructiva no observaremos ningn pico (intensidad cero).
https://www.youtube.com/watch?v=XvkrgWKD6XI
http://www.xtal.iqfr.csic.es/Cristalografia/index.html
Cristalizacin
La cristalizacin es el proceso mediante el cual las molculas se ordenan de un modo
natural formando un retculo repetitivo que denominamos cristal. En este tema slo
mencionaremos brevemente algunas de las tcnicas ms extendidas que se usan para

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obtener cristales de protenas. Para encontrar ms detalles sobre estas tcnicas se puede
consultar el siguiente enlace:
http://www.xtal.iqfr.csic.es/Cristalografia/archivos_07/brochureUNESCO.pdf.
El experimento de cristalizacin comienza con una solucin de protena relativamente
concentrada (entre 2 y 50 mg/ml) a la que se aade lentamente algn reactivo
(precipitante) capaz de reducir la solubilidad de la protena y generar una precipitacin
controlada de la misma. A continuacin se fuerza un incremento paulatino de
concentracin controlando las condiciones, lo que normalmente origina diminutos
ncleos cristalinos cuyo tamao debe ir aumentando hasta obtener cristales de tamao
adecuado para los experimentos de difraccin (entre 0.1 y 0.5 mm).

El diagrama de cristalizacin (sobre estas lneas) muestra genricamente las diferentes

zonas de un sistema protena-precipitante en funcin de las concentraciones de ambos
componentes. Las zona de color azul claro representa las condiciones en las que la
protena estara solubilizada. En la zona de color marrn la protena dejara de ser
soluble y aparecera como un precipitado. Ambas zonas estn separadas por otras dos
(de colores verde y azul oscuro) en donde existe una ligera sobresaturacin, idnea para
la nucleacin (azul oscuro) y crecimiento cristalino (verde).
El mtodo ms comn para estos experimentos es el basado en la tcnica de difusin de
vapor, bien por el mtodo de la gota colgante o por el de la de la gota sentada. Se
colocan unos pocos microlitros (1-2 l) de la solucin de protena en el centro de un
cubre-objetos de vidrio (gota colgante) o de un pedestal en el centro de un pocillo (gota
sentada) y se le aaden otros tantos microlitros de la solucin del precipitante (con pH
equilibrado previamente mediante tampn) contenido en el pocillo. En el mtodo de la
gota colgante, el cubre-objetos que contiene a la gota de mezcla se invierte y con l se
tapa el pocillo mencionado. En el de la gota sentada, simplemente se tapa el pocillo que
contiene el precipitante rodeando el pedestal en que se encuentra la muestra. Este
sistema cerrado evolucionar por equilibrio de vapor y, como la mezcla de protena y
precipitante en la gota est menos concentrada que la solucin de precipitante en el
pocillo, el agua de sta se evaporar, unindose a la solucin del pocillo. De este modo,

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la concentracin de la protena y del precipitante aumentarn lentamente en la gota (a la
misma velocidad). Como resultado, la protena precipita y, si las condiciones son las
adecuadas, se formarn cristales, con lo cual la concentracin de protena ir
decreciendo. Es importante tener en cuenta que, durante la fase de nucleacin, cuantos
menos ncleos se formen, menos cristales crecern, pero stos sern ms grandes, por lo
que interesa encontrar las condiciones experimentales para que se den estas
circunstancias. Por ello, para maximizar la posibilidad de xito de un intento de
cristalizacin es necesario probar diferentes condiciones iniciales (diferentes
concentraciones de protena y precipitante, temperatura, pH, aditivos, etc.).

Existen otras muchas tcnicas de cristalizacin que se usan para las protenas, como la
tcnica de Batch, los botones de dilisis, tcnicas basadas en la difusin en geles, etc.
(http://www.lec.csic.es/).
http://www.xtal.iqfr.csic.es/Cristalografia/parte_07_1.html
El difractmetro de Rayos X
Todo experimento de difraccin de Rayos X requiere una fuente de rayos X, un soporte
para la muestra y un detector para recoger los rayos X difractados.
Fuente de radiacin. Puede ser un tubo de rayos X si estamos trabajando con un
difractmetro convencional ("in house"), o bien los rayos X pueden generarse en un
acelerador de partculas si estamos trabajando en un Sincrotrn. Las ventajas ms
importantes de la radiacin sincrotrn es su amplio rango de longitudes de onda y su
elevada intensidad.

Acelerador de partculas: Lneas tangenciales de emisin de Esquema de un tubo de rayos X

radiacin electromagntica producida por un anillo central con
un haz de electrones.

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 Portamuestras. Consiste en un gonimetro rotacional, que es un sistema con una
mecnica muy precisa, que permite mediante giros colocar el cristal en cualquier
orientacin del espacio.
Detector. Adems de la clsica pelcula fotogrfica (en desuso en la actualidad),
existen cuatro tipos de detectores: los contadores proporcionales, los detectores de
centelleo, los detectores semiconductores y los detectores PSD.
http://www.uky.edu/~tzhai0/index_files/Page1203.htm
https://www.youtube.com/watch?v=suVNYD1nCm4&feature=youtu.be
http://www.shsu.edu/~chm_tgc/sounds/pushmovies/XAS.gif
Resolucin de estructuras
Los cristales pueden describirse mediante unidades que se repiten en las tres direcciones
del espacio y dicho espacio, que contiene todos los planos cristalinos, se denomina
espacio real o directo. Esas unidades repetitivas, llamadas celdillas elementales (o
celdas unidad), sirven como sistema de referencia para describir la posicin de los
tomos. Debemos recordar que en las celdas unidad operan elementos de simetra que
hacen que los tomos y molculas se repitan en su interior y que esto determina el
sistema cristalino al que pertenece un cristal. Este espacio real o directo es el mismo en
donde vivimos nosotros y se describe por la funcin de densidad electrnica, definida
en cada punto de coordenadas (xyz) de la celda. Cuando los rayos X interaccionan con
los electrones de los tomos que componen los cristales dan lugar a un patrn de
difraccin denominado espacio recproco, cuya simetra se relaciona geomtricamente
con la del espacio directo y en el que tambin se puede definir una celda de repeticin
(celda recproca), en cuyos nudos est almacenada la informacin sobre la intensidad de
la difraccin.
En resumen, un cristal presenta un espacio directo, con una celda unidad y unos ejes y
ngulos directos. Adems, presenta un espacio recproco asociado geomtricamente al
espacio directo y que se caracteriza por tener su propia celda unidad (la celda recproca,
con sus ejes y ngulos recprocos). El espacio recproco, por tanto, est formado por una
red de celdas recprocas y la difraccin de rayos X tiene lugar segn este patrn
reticular. Como consecuencia, el espectro de difraccin que obtendremos nos dar una
medida directa del espacio recproco y, por consiguiente, una medida indirecta del
espacio real, es decir, de la estructura del cristal.
El espacio directo y el espacio recproco se relacionan mediante la frmula matemtica
de la transformada de Fourier, que permite calcular un espacio recproco conociendo el
espacio directo. Sin embargo, en un experimento de difraccin de rayos X no podremos
calcular directamente la estructura de la red cristalina (es decir, el espacio directo), ya
que el experimento no puede proporcionar las fases relativas de los haces de difraccin
(necesarias para poder resolver la ecuacin) y no existen tcnicas experimentales para
medirlas. Por ello, es necesario encontrar una solucin al problema de las fases para
poder resolver la estructura de un cristal mediante difraccin de rayos X.

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 http://www.xtal.
iqfr.csic.es/Cristalografia/index.html

El problema de las fases

En difraccin de rayos X nos encontramos con un importante problema prctico: la
denominada prdida de la fase. El experimento de difraccin no proporciona una de las
magnitudes fundamentales, las fases relativas de los haces de difraccin, ya que no
existen tcnicas experimentales para medirlas. Perdemos por tanto la componente
necesaria para calcular el mapa de densidad electrnica (mediante la transformada de
Fourier) y as poder reconstruir la imagen. Para resolver la estructura cristalogrfica de
macromolculas es necesario recuperar la mencionada fase.
Para resolver el problema de la fase existen varios mtodos:
Reemplazamiento molecular (MR): se calcula la fase a partir de un modelo que se
acepta como una buena aproximacin. El modelo se extrae de otra molcula similar
de estructura conocida, por ejemplo de una protena relacionada con la protena de
estructura a resolver, o de la misma protena en diferente forma cristalina, etc.
Reemplazamiento isomorfo sencillo (SIR) o mltiple (MIR) (Single/Multiple
Isomorphous Replacement): se introduce en la red cristalina algn tomo pesado con
muchos ms electrones y por ello producen intensidades de radiacin dispersa mucho
ms grandes que los tomos ligeros. Para ello, partiendo de un cristal preformado
de la macromolcula no modificada, se aaden reactivos capaces de difundir en el
cristal y que contienen el tomo pesado. Los metales que se usan con mayor
frecuencia son mercurio, uranio, plomo y oro. Es un mtodo muy utilizado,
especialmente en la resolucin de estructuras de protenas y cidos nucleicos de los
que no se tiene ninguna informacin previa.
Difraccin anmala mltiple (MAD) (Multi - wavelength Anomalous Diffraction): se
basa en las pequeas diferencias en la intensidad de la difraccin causadas por el
fenmeno de la "dispersin anmala". Este fenmeno ocurre cuando la frecuencia de
los rayos X es similar a la frecuencia natural de oscilacin de los electrones de un
determinado tomo. En estas condiciones los electrones entran en resonancia con el
campo electromagntico (oscilando en fase con este) y son capaces de absorber la

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 energa de los rayos X. La dispersin producida por los electrones en este estado es
diferente a la dispersin normal. Para resolver el problema de las fases mediante este
mtodo, se realizan dos (o ms) experimentos de difraccin, empleando rayos X con
longitudes de onda diferentes para obtener espectros de difraccin con y sin
dispersin anmala. Analizando las diferencias entre los datos de difraccin
obtenidos es posible calcular la distribucin de amplitudes y fases que generan los
dispersores anmalos. Estas diferencias son normalmente pequeas en cristales de
materiales orgnicos, como las protenas o cidos nucleicos. El efecto es mucho ms
detectable cuando se usan metales u otros tomos pesados como dispersores
anmalos. Los tomos pesados pueden estar presentes naturalmente en la molcula
orgnica o ser incorporados a la molcula mediante tcnicas qumicas o biolgicas.
Estos mtodos proporcionan (directa o
indirectamente) un conocimiento aproximado de
las fases de los haces de difraccin. Combinando
esta informacin con los mdulos obtenidos a
partir de las intensidades recogidas en el
experimento de difraccin, podemos generar un
mapa de densidad electrnica que conducir a la
interpretacin del modelo. Este paso de
interpretacin consiste en completar el mapa de
densidad electrnica final (de alta resolucin),
asignando a la estructura obtenida la secuencia de
aminocidos. Para finalizar el proceso de
modelizacin, es necesario realizar un paso de
refinamiento de datos mediante comparacin de
amplitudes experimentales y tericas, aplicando
de nuevo la transformada de Fourier y repitiendo
hasta obtener un mapa fiable.

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El siguiente esquema muestra un resumen del procedimiento para la determinacin de la
estructura tridimensional de una macromolcula mediante difraccin de rayos X.

Para finalizar, hay que remarcar la importancia que esta tcnica tiene para la resolucin
de estructuras de macromolculas biolgicas. De hecho, era el nico mtodo disponible
hasta el desarrollo de las tcnicas modernas de espectroscopa por resonancia magntica
nuclear. Quizs el ejemplo ms conocido sea la resolucin de la estructura del ADN por
James Watson y Francis Crick en el ao 1953, gracias a los datos de difraccin de rayos
X obtenidos por Rosalind Franklin.
https://www.youtube.com/watch?v=Bjk4MHCNzyM&feature=youtu.be
https://www.youtube.com/watch?v=u7RrXAjuNRk&feature=youtu.be

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ANEXO I
El fenmeno de la difraccin de la luz
El fenmeno de difraccin viene determinado por el principio de
Huygens. Cuando una luz se hace pasar por una rendija ancha en
comparacin con la longitud de onda de la radiacin, la onda se
propaga casi inalterada. Si la rendija es del tamao de la longitud de
onda, se propaga en todas direcciones. La rendija se comporta como
una nueva fuente a partir de la cual las ondas se irradian de manera
que el frente de ondas se curva al pasar entre los dos bordes de
dicha rendija. Si a una cierta distancia se sitan dos rendijas estrechas, segn el
principio de Huygens se convierten en dos nuevos focos (fuentes). Las ondas que se
generan en ellos producen interferencias que pueden ser constructivas o destructivas. La
difraccin es, por tanto, una consecuencia de la interferencia.
Si se ilumina con radiacin monocromtica dos rendijas estrechas (B y C) situadas a
una cierta distancia y a continuacin se coloca una pantalla (figura izquierda), se
observan una serie de imgenes oscuras y luminosas perpendiculares en ella. Si se
representan las intensidades de las bandas en funcin de la distancia a lo largo de la
pantalla (figura derecha), se observa que disminuyen de forma gradual segn aumenta la
distancia respecto a la banda central (E). Esta banda central intensa es consecuencia de
una interferencia constructiva de los rayos difractados por las dos rendijas.

Cuando las ondas salen de las rendijas, se transmiten perpendicularmente y forman un

ngulo con la normal, lo que origina un desfase entre ellas. Cuando dos ondas
interfieren diferencindose entre ellas un nmero entero de se produce el
reforzamiento (zonas iluminadas), pero si difieren un nmero impar de entonces se
produce disminucin o anulacin (zonas oscuras). Si estn defasadas una completa, se
aparece la zona iluminada que corresponde a las bandas de 1er orden (D), menos
intensas que la central (E). La siguiente zona iluminada, correspondiente a las bandas de
2 orden, que aparecen a dos completas (y as sucesivamente).
Si la radiacin que incide es policromtica, aparece la banda central igual que en caso
anterior. Tambin aparecen la imagen de 1er orden, pero como cada longitud de onda de
la radiacin policromtica tiene un ngulo diferente, aparece un espectro en lugar de
una banda. En las imgenes de rdenes superiores ocurre lo mismo.

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