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1.1 Introduccin
Las enzimas son protenas catalticas que permiten acelerar reacciones qumicas
en sistemas biolgicos. Logran su efecto al bajar la energa de activacin de las
reacciones, un proceso que involucra el enlazar de forma no covalente las molculas de
sustrato a la enzima. El(los) sustrato(s) es(son) la(s) molcula(s) que son transformadas
en la reaccin qumica. Una vez que se consume el sustrato los productos son liberados y
la enzimaque no sufre ningn cambio permanentepuede repetir el proceso siempre y
cuando estn presente ms molculas de sustrato.
Varios factores pueden afectar las propiedades fsicas y qumicas de las enzimas
de forma temporal o permanente. Los cambios temporales en la estructura terciaria de
una enzima bajan la tasa de una reaccin qumica; los cambios permanentes provocan la
desnaturalizacin de las protenas desactivando permanentemente a las enzimas. La
temperatura, el pH, las concentraciones relativas de enzima y sustrato son algunos de los
factores que alteran la tasa con la cual una enzima cataliza una reaccin qumica.
Esta semana la estrella del show de la prctica de laboratorio ser la enzima
peroxidasa. En muchas plantas y animales su funcin es de convertir la sustancia txica
perxido de hidrgeno (subproducto de reacciones metablicas) en agua y oxgeno. El
perxido de hidrgeno, H2O2, es por tanto el sustrato de la peroxidasa.
H2O2 + ZH2 2 H2O + Z
La peroxidasa facilita la transferencia de uno de los tomos de oxgeno a una
molcula orgnica (denominada Z en la ecuacin). En esta reaccin de reduccin-
oxidacin (o simplemente reaccin redox) el perxido de hidrgeno es reducido y una
molcula orgnica es oxidada. La molcula orgnica que aceptar el oxgeno en nuestro
experimento ser el guayacol (o guaiacol).
1.2 Objetivos
1. Disear un experimento para medir el efecto de variables ambientales sobre la
tasa de reaccin de una enzima.
2. Colectar datos usando un espectrofotmetro.
3. Analizar una grfica para determinar la tasa de una reaccin qumica.
4. Graficar y analizar tasas de reacciones enzimticas bajo diferentes condiciones
ambientales.
5. Explicar y discutir el efecto que tiene el ambiente sobre la actividad de las
enzimas, tanto a nivel de organismo como molecular.
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subproductos metablicos generados en la raz del nabo que, siendo un rgano de
almacenamiento energtico, mantiene un metabolismo activo.
Perxido de hidrgeno (H2O2)El perxido de hidrogeno es una sustancia
oxidante poderosa que puede seriamente afectar el funcionamiento de la clula o causar
su muerte. Por qu hay perxido de carbono en la raz del nabo? La presencia de ese
qumico se debe a que las clulas de la raz son metablicamente activas, produciendo
cmo subproducto al perxido de hidrgeno. Por otro lado se ha descubierto que en
algunas plantas las concentraciones bajas de H2O2 actan como una hormona regulando
el crecimiento, la cicatrizacin de heridas y la respuesta inmunolgica ante patgenos
(Bajji et al. 2007, Bajji et al. 2008, Panina et al. 2004). Debido a que la peroxidasa afecta
la cantidad de H2O2 en la clulas, esta enzima tiene funciones reguladoras de estos
procesos importantes para la planta.
GuayacolEs un compuesto orgnico con la frmula qumica C6H4(OH)(OCH3)
que ocurre de forma natural en algunas plantas. En este experimento ser la sustancia
orgnica oxidada por la peroxidasa. La ventaja del guayacol para nuestro experimento es
que cambia progresivamente de un color transparente a un color caf mientras se oxida.
Eso significa que podemos medir la tasa de la reaccin indirectamente notando el cambio
de color de la solucin experimental. Para medir con alta precisin el cambio de color en
la solucin experimental vamos a usar un espectrofotmetro.
1.4.1 El espectrofotmetro
El espectrofotmetro es un instrumento importante para las prcticas de
laboratorio. Sin embargo, su utilidad depende de que lo usemos con mucho cuidado. Por
ejemplo, es fcil verter los contenidos lquidos de las cubetas sobre la fuente de luz
daando no slo todos los datos subsiguientes sino al espectrofotmetro.
Siga cuidadosamente los siguientes pasos para tomar las mediciones con el
modelo de espectrofotmetro marca Zuzi que estaremos utilizando. En parntesis
hacemos referencia a las secciones correspondientes del Manual del instrumento, que se
encuentra junto a ste.
1. Prenda el espectrofotmetro (el interruptor est detrs del instrumento).
2. Espere 20 minutos hasta que la mquina se caliente debidamente.
3. Presione el botn GOTO para acceder la pantalla de seleccin de la longitud de
onda. Ajuste la onda con los tringulos al lado derecho del panel [Punto 1 en Pg.
5 del Manual].
4. Presione el segundo botn de la derecha en la fila superior con la raya horizontal
( ) [botn 2.6 en la Figura 2 en Pg. 3 del Manual].
5. Presione SET para seleccionar las diferentes funciones del equipo [Punto 3 en
Pg. 6 del Manual].
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6. Elija 1. Test mode presionando el segundo botn de la izquierda de la fila
superior que tambin tiene una raya horizontal ( ) [botn 2.5 en la Figura 2 en
Pg. 3 del Manual].
7. Elija 2. T% y presione OK [Figura 6 en Pg. 6 del Manual].
8. La lmpara de deuterio debe estar apagada (recomendacin del fabricante). Para
ello escogemos 2. D2 Lamp Off y presione OK [Figura 7 en Pg. 7 del
Manual].
9. Escoge la opcin 2. Off y presione OK [Figura 7 en Pg. 7 del Manual].
10. Solo los paralelos de las 7:30 am tienen que hacer este paso: En el men de
SET presione 4. Dark current y presione OK [Figura 9 en Pg. 8 del
Manual]. Una vez terminado este proceso presione el botn Cancel.
11. Ahora estamos listos para medir la solucin blanco o de referencia. La
composicin qumica de la solucin de referencia se describe ms abajo. Ponga la
cubeta con la solucin de referencia en el compartimiento porta-cubetas y presione
el botn BASIC [Punto 2 en Pg. 5 del Manual].
12. Ahora coloque la cubeta con la muestra a ser analizada (pero vase las
instrucciones ms abajo) en el porta-cubeta y aplaste el botn izquierdo de la
rayita horizontal [botn 2.5 en la Figura 2 en Pg. 3 del Manual] y siga el
procedimiento hasta concluir su experimento.
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Tome lecturas cada 10 segundos durante 3 minutos. Repita este procedimiento un total
de tres veces (hasta dominar el procedimiento). Registre sus datos en la Tabla 1-1.
Tabla 1-1. % transmitancia de luz de 470 nm en condiciones de pH fisiolgico (lnea base).
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Pregunta: _______________________________________________
Ttulo del experimento: El efecto de ______ sobre la tasa de reaccin de la peroxidasa.
Variable de tratamiento: __________________________
Variable de respuesta: ____________________________
H0: ____________________________________________________
HA: ____________________________________________________
Explique el raciocinio de la HA (porqu tiene sentido):
_______________________________________________________
Diseo experimental (procedimiento, nmero de rplicas, anlisis estadstico, etc.):
_______________________________________________________
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2 Respiracin celular aerbica
(preparado por Markus Tellkamp)
2.1 Introduccin
El metabolismo es la suma total de todas las reacciones bioqumicas necesarias
para la vida. Cada ser vivo es un sistema abierto que necesita obtener energa para
transformarla en trabajo, energa qumica y finalmente calor. Por lo tanto para determinar
el metabolismo de un organismo de forma directa pudiramos medir la cantidad de
energa trmica que produce. Sin embargo, medir el calor emitido por un organismo es
problemtico y por tanto los fisilogos usan mtodos indirectos que estiman la tasa de
metabolismo midiendo la cantidad de oxgeno consumido o dixido de carbono
producido. Para entender cmo funcionan los mtodos indirectos tenemos que considerar
lo que pasa durante la respiracin celular.
La respiracin celular es el proceso que convierte molculas orgnicas, tal como
la glucosa, en molculas portadoras de energa, comnmente el adenosin trifosfato (ATP).
Este nucletido forma parte de todas las reacciones en la clula que requieren un aporte
energtico para transformar reactivos en productos (o sea permite catalizar reacciones
endergnicas). Ya que la glucosa es la fuente principal de energa que reciben las clulas
vamos a enfocarnos en el metabolismo, o estrictamente el catabolismo, de esta molcula.
Podemos resumir al metabolismo de glucosa con la siguiente frmula qumica:
C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O + energa qumica (ATP) + energa calorfica (1)
Obsrvese que por cada molcula de glucosa se consumen seis molculas de
oxgeno y se generan seis molculas de dixido de carbono y seis molculas de agua. Ya
que sabemos el contenido calrico de la glucosa podemos estimar la energa liberada por
el metabolismo correlacionndola con el nmero de molculas de oxgeno consumidas o
molculas de dixido de carbono producidas.
El cociente entre la cantidad de dixido de carbono producido y oxgeno
consumido es llamado el coeficiente respiratorio (CR) (Hill et al. 2012).
(producido)
CR = (2)
(consumido)
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Figura 2-1. Resumen del metabolismo de la glucosa (tomado de Audesirk et al. 2008)
Como vemos, las cadenas de reacciones bioqumicas no slo convierten glucosa
a piruvato en la gliclisis y luego a otras molculas orgnicas en el ciclo de Krebs, sino
que tambin se produce NADH y FADH2. Cul es la funcin de estas molculas?
Prcticamente son portadores de electrones de alto contenido de energa (cosechados de
la glucosa) que llevan la energa hacia la matriz de la mitocondria donde esa energa es
usada para hacer ATP mediante la fosforilacin oxidativa (que incluye la cadena
transportadora de electrones y la quimismosis). Una vez que los electrones pasan de una
molcula orgnica a otra, cul es su destino final? Como se puede ver en la Figura 2-1,
el receptor final de los electrones es el oxgeno que, aceptando los electrones, se une con
dos protones para producir agua.
En la prctica de hoy, evaluaremos el efecto de dos temperaturas sobre el
metabolismo (la tasa de respiracin) de grillos.
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2.2 Objetivos
1. Estimar la tasa de metabolismo de grillos (de nombre cientfico desconocido)
de forma indirecta, en dos condiciones de temperatura diferentes.
2. Aprender el uso de un sensor para medir la concentracin de CO2.
3. Determinar la influencia de la temperatura ambiental sobre el metabolismo de
poiquilotermos (animales de sangre fra).
2.3 Materiales
Neulog CO2 Logger Sensor
Computadora
Bao de agua a 23C
Bao de agua a 33C
Termmetros
Cmara metablica
Grillos (no identificados)
2.4 Procedimiento
1. Descargar e instalar el software del dispositivo Neulog CO2 Logger Sensor
(http://neulog.com/software/).
2. Descargar el manual para NeuLog Neuron Logger Sensor Network
Technology (http://neulog.com/wp-
content/uploads/2014/07/NeuLog_User_Guide_Ver_6_3_.pdf).
3. Conecte el sensor a la computadora y espere 30 min para calentarlo. Luego
ubquelo verticalmente para compensarlo y espere hasta que la lectura sea de
alrededor de 350 ppm, que es el valor mnimo de concentracin que puede el
sensor detectar. Para esto, es necesario la presencia de viento por lo puede
tener que salir fuera del aula.
4. Coloque silica gel en la cmara metablica (para absorber las molculas de
agua producto de la respiracin).
5. Coloque el grillo en la cmara metablica y tpela con el sensor.
6. Coloque la cmara metablica en un bao de agua a 23C tomando todas las
precauciones del caso para evitar que el sensor se moje.
7. Configure el software del sensor para que registre lecturas cada 2 segundos
durante 20 minutos.
8. Configure el software para que los datos del sensor comiencen a registrarse
cuando la concentracin de CO2 en la cmara (proveniente de la respiracin)
supere los 350 ppm (la mnima concentracin detectable por el sensor). Esto es
necesario porque la concentracin de CO2 en la atmsfera en altitudes
relativamente grandes (>2000 m) es <350 ppm.
9. Durante los 20 minutos del experimento es necesario monitorear el
comportamiento del grillo ya que su actividad aumentar la respiracin celular.
Las actividades pueden incluir caminar, saltar, estridular o mover las antenas.
Es necesario anotar el momento cuando inicia y termina una actividad.
10. Luego de terminado el experimento, grabe los datos en su computadora.
11. Repita el experimento a la temperatura de 35 C.
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2.5 Clculos
Los siguientes clculos convierten las unidades de concentracin de CO2 de ppm
a l/h, y deben hacerse para los datos de los dos experimentos (para las dos temperaturas):
1. Calcule la diferencia de concentracin de CO2 [CO2, en ppm] antes y despus
del experimento:
1
n (CO2 producido, en ) = [CO2]
6.023 1023
3. De la Ecuacin de los Gases Ideales sacamos la relacin V = , por lo tanto
(unidades en parntesis):
V (CO2 producido, en ) =
() 8.21 x 104 ( 1 1 ) ()
0.78 ()
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3 Pigmentos fotosintticos
(preparado por Hugo Romero-Saltos)
3.1 Introduccin
Un pigmento es una substancia que absorbe y refleja la luz de una manera
caracterstica. La luz es energa, y cuando es absorbida por un pigmento, la energa
cambia de forma. En muchos casos, la energa se pierde a travs del movimiento
molecular al azar (entropa), como cuando el chasis de un carro negro absorbe la energa
de la luz solar y se calienta.
En el que es quizs el sistema biolgico ms increble de todos, la fotosntesis, la
luz absorbida por los pigmentos vegetales no se pierde. Por lo contrario, se convierte en
energa elctrica a travs de cadenas de transferencia de electrones (las reacciones de la
fotosntesis dependientes de la luz) y luego en energa qumica contenida en los enlaces
covalentes a travs de una serie de reacciones qumicas (las reacciones de la fotosntesis
independientes de la luz). Sin las plantas y sus pigmentos que capturan la luz, la vida en
la Tierra como la conocemos no existira.
Para comprender mejor el laboratorio de hoy, es necesario revisar el contenido
sobre fotosntesis en su libro de Biologa general, especialmente lo relacionado a los roles
que tienen los pigmentos fotosintticos con respecto a la captura de energa solar. En la
prctica de hoy, se extraern algunos de estos pigmentos y se examinarn algunas de sus
propiedades fsicas.
3.2 Procedimiento
Las clorofilas y carotenoides que son usados por las plantas para capturar energa
solar y convertirla en energa qumica estn embebidas en las membranas tilacoides
dentro de los cloroplastos. Extraeremos estas molculas de pigmento de las hojas de una
especie de planta que ser escogida por su instructor. Se recomienda escoger una planta
con hojas muy verdes y obscuras, pues esto indica una alta concentracin de pigmentos
(pero no escoja una planta con hojas muy gruesas). Esta prctica de laboratorio consiste
en aislar pigmentos a partir de clulas vegetales vivas, separarlos y examinar su espectro
de absorcin y otras propiedades fsicas. Se recomienda trabajar en grupos de 45
personas mximo.
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5. Retire el vaso de precipitacin con la solucin de pigmentos extrados de la
placa calefactora.
6. Vierta parte de la solucin de pigmentos extrados en etanol en un tubo de
ensayo hasta llenarlo hasta la mitad. Tenga cuidado de no vertir restos de hojas
u otros residuos.
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papel ANTES que el primer pigmento llegue al filo superior del papel! Djelo
secar.
Los carotenoides usualmente viajan con el frente del solvente y deberan formar
una banda amarillenta en la parte superior del cromatograma. Ms abajo, los xantfilos
deberan formar una banda amarillenta-anaranjada. La clorofila a debera aparecer luego
formando una banda verde obscura. Finalmente la clorofila b debera formar una banda
verde claro en la parte inferior del cromatograma.
Corte tiras del cromatograma y reprtalas a sus compaeros de grupo para que las
peguen en s u cuaderno de laboratorio y responda las siguientes preguntas en su
cuaderno de laboratorio:
Funcionan todos estos pigmentos en los fotosistemas I y II?
Cul es la funcin de cada pigmento?
Qu pigmentos estuvieron presente en su cromatograma?
Cul es el valor Rf para cada pigmento?
=
Por qu los valores Rf son diferentes para cada tipo de pigmento?
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accin de la reaccin. Si el espectro de accin de una reaccin qumica dada coincide con
el espectro de absorcin de algn pigmento(s) presente en el sitio de la reaccin, puede
hipotetizarse que dicho pigmento(s) est(n) involucrados en la reaccin.
Estudie el espectro de absorcin de las clorofilas y los carotenoides (Figura 3-1)
y comprelos con el espectro de accin del proceso de la fotosntesis (Figura 3-2).
Responda en su cuaderno de laboratorio:
Qu implica el sobrelapamiento (o falta de sobrelapamiento) entre el
espectro de absorcin de los diferentes pigmentos y el espectro de accin?
Por qu sera una ventaja tener varios tipos de pigmentos en vez de slo uno?
Figura 3-2. Espectro de absorcin de los pigmentos fotosintticos comparado con el espectro
de accin de la fotosntesis (tomado del libro Principles of Biology 2015).
A continuacin, realizaremos un anlisis CUALITATIVO del espectro de
absorcin de los pigmentos separados por la diferencia en solubilidad con los solventes
etanol y ter de petrleo. Para esto, utilizaremos un instrumento conocido como
espectroscopio (ver https://pantherfile.uwm.edu/awschwab/www/specweb.htm).
El procedimiento a seguir es:
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1. En el tubo de ensayo con las fases de ter y etanol separadas, absorba unos
1020 ml de la capa superior con la ayuda de una pipeta Pasteur (no es
necesario ser exactos) y deposite la solucin en un nuevo tubo de ensayo.
Luego haga lo propio con la otra fase, depositndola en otro tubo de ensayo.
Tenga cuidado en no mezclar las fases. DESECHE la porcin media natosa
que separa una fase de la otra.
2. Aada el solvente correspondiente (etanol o ter de petrleo, segn
corresponda) a cada uno de los tubos de ensayo para diluir la solucin.
3. Examine la solucin contenida en cada uno de los tubos pequeos con el
espectroscopio. Primero observe la luz natural (el arco iris) y luego cubra la
apertura del espectroscopio con el tubo de ensayo que contiene el extracto de
pigmentos. Qu colores desaparecen del espectro? Haga esto tanto para el
tubo con la solucin de clorofilas como con el tubo con la solucin de
carotenoides.
Dibuje lo observado en su cuaderno de laboratorio (utilice lpices de color). En
su dibujo, debe identificar claramente, aunque aproximadamente, las longitudes de onda
() correspondientes (ver Figura 3-1).
Responda en su cuaderno las siguientes preguntas:
Qu colores son absorbidos por la solucin de clorofilas? Qu colores son
transmitidos y reflejados por esta solucin?
Qu colores son absorbidos por la solucin de carotenoides? Qu colores
son transmitidos y reflejados por esta solucin?
Cul es la relacin entre la luz absorbida y la energa disponible para la
fotosntesis? cul tipo de pigmentos ser ms eficiente para llevar a cabo las
reacciones de luz de la fotosntesis? recuerde que a menor longitud de onda,
la energa contenida en los fotones de luz (o de cualquier radiacin
electromagntica) es mayor.
Aparte de la absorcin de energa lumnica, qu otros roles cumplen los
diferentes pigmentos? estn estos pigmentos presentes slo en las plantas?
(CONSULTE).
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absorbida? Recordemos por la Primera Ley de Termodinmica que la energa no puede
ser creada ni destruida, solo transformada.
Cuando el fotn fue absorbido inicialmente, su energa fue momentneamente
cambiada de energa lumnica a energa elctrica (el electrn excitado). Cuando el
electrn excitado regres a su orbital original estable, transforma nuevamente la energa
extra a energa lumnica. Es decir, otra vez la energa se transforma en un fotn! Debido
a que las transformaciones de energa de este tipo nunca pueden ser 100% eficientes, el
fotn que se emite al volver el electrn de su orbital excitado al orbital original tiene una
energa menor que el fotn que originalmente se absorbi, porque algo de su energa
original ya se perdi en forma de entropa (calor). Por tanto, la energa lumnica que se
observa en el espectro visible es una energa de amplia longitud de onda, es decir, de
qu color? Este fenmeno se conoce como fluorescencia.
Para observar la fluorescencia, siga los siguientes pasos:
1. Acerque el tubo de ensayo con la solucin de clorofila a una lmpara de 100
W, preferiblemente ubicando la solucin en frente de un fondo negro. Ante
tan fuerte irradiacin, la solucin debera cambiar de un color _____ a un
color _______. No es esto algo increble? La intensidad del color ______ va
a depender de la concentracin de clorofila en la solucin.
Responda las siguientes preguntas en su cuaderno:
Cul es el significado de la fluorescencia?
Podra ocurrir fluorescencia en plantas vivas? por qu s o por qu no?
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