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Biocatalizadores
Los biocatalizadores son protenas con actividad cataltica (enzimas) o pueden ser
cidos nucleicos (ribosimas) estos ltimos descubiertos en la dcada de los 80s.
Hoy en da, sabemos que las enzimas son necesarias en todos los sistemas vivos,
para catalizar las reacciones necesarias para su supervivencia y reproduccin. Las
enzimas aisladas (fuera de la clula o sistemas biolgicos) tambin pueden catalizar
estas mismas reacciones. Estas excelentes propiedades de las enzimas se utilizan
en la tecnologa de enzimas. Por ejemplo, se pueden utilizar como biocatalizadores
para catalizar reacciones qumicas en escala industrial de manera sostenible.
Clasificacin enzimtica
AH2 B A BH2
AB C A BC
AB H2O AH BOH
AB A B
A BIsom
A B XTP AB XDP Pi
Toda enzima esta nominada con un nmero de cuatro cifras, los cuales se refieren
a:
Todas las enzimas son de composicin proteica (cuya unidad fundamental son
aminocidos unidos mediante enlaces peptdicos), pero estn estructuradas en dos
partes bien definidas: la protena llamada Apoenzima y un grupo prosteico (fraccin
no proteica) llamado Coenzima, la cual forma parte estructural de la enzima. La
combinacin de la apoenzima con la coenzima, recibe el nombre de holoenzima.
Los cofactores son molculas que aumentan o disminuyen la actividad de un
enzima. La diferencia entre un coenzima y un cofactor radica que el primero hace
parte integral, no es disociable y le brinda estabilidad a la enzima; mientras que el
cofactor son grupos transitorios, disociables y se pueden unir tanto a la enzima
como al sustrato.
V= -d[S] = d[P]
dt dt
donde:
V : es la velocidad.
[S]: concentracin de sustrato.
[P]: concentracin de producto.
dt: periodo de tiempo.
Ejemplo:
Concentracin de azucares
Tiempo (min)
reductores totales (mg/ml)a
0 0
2 0.03
4 0.26
8 0.48
16 0.92
32 1.23
64 1.54
a: La curva de calibracin utilizada relaciona Absorbancia (540 nm) y concentracin
(mg/ml) de azucares expresado en glucosa
1,8
Concentracin de azcares
1,6
reductores (mg/ml)
1,4
1,2
1 a
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 20 40 60 80
Tiempo (h)
1,8
y = 0,0595x - 0,019
Concentracin de azcares
1,6
reductores (mg/ml)
1,4
1,2
1 b
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 20 40 60 80
Tiempo (h)
Los valores tomados son aquellos que se encuentran en los primeros instantes de
la determinacin de los productos (puntos rojos de la grfica b), cuya pendiente sea
mas cercana a la unidad, igual mente se descartan los valores cuya pendiente sea
cero (0) o incidan de forma significativa en la disminucin del valor de la pendiente.
En este caso se tomaran los valores: (0,0); (2, 0.03); (4, 0.26); (8, 0.48); (16, 0.92)
y se descartaran: (32, 1.23) y (64, 1.64); la lnea de tendencia central con una
pendiente de 0.06 (mg/ml)/min implica la actividad enzimtica (U)
Ruptura celular
Lo anterior hace referencia a que las bacterias Gram son mas difciles de romper
que las Gram + esto se debe a la estructura de la pared, como se muestra en la
figura 28.
Formas fsicas:
Formas enzimticas
En la eleccin del mtodo de ruptura celular depende de seis factores: (i) Naturaleza
y fuente de la enzima (origen animal, vegetal, microbiana: fngica o bacteriana) (ii)
Escala de la operacin (laboratorio, planta piloto o industrial) (iii) Velocidad del
mtodo de extraccin, (iv) Estabilidad de la enzima, (v) Pureza requerida y (vi) costo
del proceso.
No mecnicos Temperaturas
extremas Formacin y fusin de cristales de hielo. Rompimiento con
(congelacin, Nitrgeno lquido de tejidos vegetales.
Fsicos descongelacin)
Purificacin de enzimas
La naturaleza bioqumica del enzima, cobra valor en la medida que se pueda utilizar
diversas metodologas tecnolgicas o la combinacin de ellas, segn lo permita el
mantenimiento de su actividad enzimtica en cada uno de ellos. Algunas enzimas
son menos estables que otras (muy delicadas en cuanto a la permanencia de su
actividad) lo cual limita significativamente cada metodologa de purificacin. Por
ejemplo la enzima fructosil transferasa proveniente de Aspergillus aculeatos
utilizada para la sntesis enzimtica de fructooligosacridos (FOS) es mas estable
a la temperatura que las bacterianas del gnero Erwinia herbicola, lo cual permite a
las primeras, procesos de purificacin a temperaturas por enzima de 18 oC, sin
afectar significativamente su actividad. (Iraj Ghazi et al., 2007).
Existen variados mtodos para la purificacin de enzimas entre los mas utilizados
tenemos las separaciones cromatogrficas, las cuales se basan en las diferencias
de carga, tamao o afinidad de las diferentes protenas. La cromatografa utilizada
en la separacin de enzimas puede ser de dos tipos: (i) preparativa y (ii) analtica;
la diferencia radica en el volumen de muestra y la recuperacin de fracciones que
permitan obtener protenas para su posterior utilizacin, esta es la preparativa a
diferencia de la analtica que no permite esto ltimo.
Figura 29. Caracteristicas generales de una purificacin enzimtica.
Existen distintos tipos de cromatografas en tres ellos: (i) cromatografa por filtracin
o exclusin molecular (ii) cromatografa de intercambio inico (iii) cromatografa
hidrofbica y (iv) cromatografa de afinidad.
32,500 KDa.
0.07
0.06
62,000 KDa.
Absorbancia (280 nm)
0.05 Ft.asa
0.03
0.02
0.01
0
2.9 14.5 26.1 37.7 49.3 60.9 72.5 84.1 95.7 107.3 118.9 130.5 142.1 153.7
0.05 0.05
0.04 0.04
0.03 0.03
0.02 0.02
0.01 0.01
0 0
3 12 21 30 39 48 57 66 75 84 93 102 111 120 129 138 147 156
Existen tres parmetros tericos que permiten cuantificar y comparar los diversos
mtodos de purificacin; estos son: (i) el porcentaje de rendimiento, (ii) el factor de
purificacin y (iii) la actividad enzimtica.
Ejemplo:
La metodologa propuesta por Erich, establece siete (7) pasos de purificacin para
la Levanasa; se parte del extracto inicial, el cual la actividad enzimtica total
(U)extracto inicial es: 4,10 unidades por ml, y el contenido de protena es:1,4 (mg)extracto
inicial/ml.
KDa
Precipitacin por sales: Por aos, la adicin de sales neutras a los extractos
enzimticos para su purificacin y concentracin, ha sido la tcnica mas
utilizada. En la separacin por solubilidad diferencial, al adicionar el soluto, se
pueden presentar dos fenmenos importantes para la enzima a separar; (i) que
la protena presente una mayor solubilizacin en el solvente debido a la
interaccin de los grupos cargados que se relacionan a su vez con los iones de
la sal incrementando la densidad de carga con una mayor repulsin
intermolecular, este fenmeno es conocido como: solubilizacin por salado o
salting in. Lo contrario de esto es la (ii) precipitacin por salado o salting out,
los grupos hidrofbicos superficiales originan un ordenamiento de las molculas
de agua alrededor de estas zonas dando como resultado un estado ordenado
termodinmicamente inestable que lleva a la agregacin y precipitacin de la
protena.
Donde:
0 106 134 164 194 226 258 291 326 361 398 436 476 516 559 603 650 697
5 79 108 137 166 197 229 262 296 331 368 405 444 484 526 570 615 662
10 53 81 109 139 169 200 233 266 301 337 374 412 452 493 536 581 627
15 26 54 82 111 141 172 204 237 271 306 343 381 420 460 503 547 592
20 0 27 55 83 113 143 175 207 241 276 312 349 387 427 469 512 557
25 0 27 56 84 115 146 179 211 245 280 317 355 395 436 478 522
30 0 28 56 86 117 148 181 214 249 285 323 362 402 445 488
35 0 28 57 87 118 151 184 218 254 291 329 369 410 453
80 0 33 67 103 139
85 0 34 68 105
90 0 34 70
95 0 35
100 0
Temperatura (o C)
0 10 20 25 30
Moles de (NH4)2SO4 por 1000 g de H2O 5,35 5,53 5,73 5,82 5,91
Porcentaje en peso 41,42 42,22 43,09 43,47 43,85
Gramos de (NH4)2SO4 requeridos para saturar
706,8 730,5 755,8 766,8 777,5
1000 ml de H2O
Gramos de (NH4)2SO4 por 1 litro de solucin
514,7 525,1 536,1 541,2 545,9
saturada (G)
Molaridad de la solucin saturada 3,90 3,97 4,06 4,10 4,13
Densidad (g/cm3) 1,2428 1,2436 1,2447 1,2450 1,2449
volumen especfico parcial del (NH4)2SO4 en la
0,5281 0,5357 0,5414 0,5435 0,5458
solucin saturada
Permitividad
Material
relativa ()
Agua 82
Etanol 24
Metanol 33
cido frmico 58
n-propanol 20
cido actico 6,2
Isopropanol 18
Acetona 21
Acetonitrilo 37
Acetato de etilo 6,0
Cloroformo 4,8
Benceno 2,3
Caracterizacin enzimtica
Uno de las medidas ms importantes en los trabajos con enzimas son los
parmetros cinticos cuyos ms representativos son: la constante de michaelis (Km)
y la velocidad mxima (Vmax ).
V= Vmax - Km(V/S)
Enzima 1 Enzima 2
Sustrato Actividad Actividad
(M)a (U) (U)
0 0 0
0,11 1,5 1
0,22 1,9 1,5
0,33 2,3 2
0,44 2,5 2,3
0,55 2,8 2,5
0,66 3 2,8
0,77 3 2,8
0,88 3,2 2,9
1,1 3,2 2,8
1,32 3,2 2,8
a) Concentracin molar de sacarosa en buffer fosfatos 50 mM a pH: 5.5.
Enzima 1
1,35
1/V
1,15 y = 0,0843x + 0,2473
0,95
Enzima 2
0,75
0,55
0,35
0,15
1. Permiten reutilizacin
5. Posibilidad de contaminacin
Existen tres tipos de aplicaciones bsicas: (i) Procesos industriales, (ii) procesos
analticos y (iii) uso clnico.
1. Industria de Alimentos
2. Industria Farmacutica
3. Industria Textil
4. Industria de Detergentes
5. Industria del Cuero
las caractersticas de este tipo de enzimas son: (i) Uso masivo, (ii) Estructura simple,
(iii) preferiblemente extracelulares, (iv) estables y (v) sin requerimientos de
cofactores disociables.
Campo
Enzima Fuente Usos frecuentes
Industrial
Bibliografa
Belma zbek, Kutlu lgen. The stability of enzymes after sonication. Process
Biochemistry, Volume 35, Issue 9, May 2000, Pages 1037-1043.
Alline Artigiani Lima Tribst, Marcelo Cristianini. High pressure homogenization
of a fungi -amylase. Innovative Food Science & Emerging Technologies, Volume
13, January 2012, Pages 107-111.