Perfil de expresin de microRNAs circulantes en pacientes con cncer

colorrectal espordico

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Medicina
Maestra en Gentica Humana
Bogot D.C. Colombia
2015
Perfil de expresin de microRNAs circulantes en pacientes con cncer
colorrectal espordico

Hctor Javier Ardila Molano

Cdigo: 05599278

Trabajo de grado para optar por el ttulo de Magster en Gentica Humana

Directora

Martha Luca Serrano Lpez MD, MSc, PhD.

Profesora Asociada-Departamento de Qumica
Facultad de Ciencias-Universidad Nacional de Colombia

Grupo rea de Investigaciones

Instituto Nacional de Cancerologa

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Medicina
Maestra en Gentica Humana
Bogot D.C. Colombia
2015

2
Este trabajo est dedicado a mis padres, mis hermanos y mi novia que han sido un
apoyo constante en cada momento de mi vida, e igualmente lo dedico a todos los
pacientes que padecen cncer por ser el motivo suficiente para querer realizar un
trabajo de investigacin en este campo.

Las dificultades son oportunidades disfrazadas.

3
Agradecimientos

En primer lugar agradezco a Dios por permitirme realizar este trabajo porque sin su
compaa no habra sido posible culminar.
A mis padres por brindarme su ejemplo de constancia y entrega y por siempre
apoyarme.
A Yormaris Castillo por ser mi alma gemela por estar siempre a mi lado en todas las
situaciones de la vida y brindarme su compaa y amor.
A la Dra. Martha Luca Serrano por acogerme en su grupo de trabajo por su temple
y por el aprendizaje constante, por darme la oportunidad de involucrarme en
desafos da a da a lo largo de este proyecto de investigacin.
Al grupo de Biologa del Cncer y al Banco Nacional de Tumores Terry Fox por
prestar las instalaciones y equipos para la realizacin de todas las actividades
experimentales.
A Esperanza Trujillo, Natalia Acosta Silvia, Pilar, Jessica, Laura, Josefa y Johana
por sus consejos su amistad y su comprensin.
Al Dr. Pablo Moreno, Silvia Serrano y Esperanza Trujillo por sus comentarios y
consejos sobre el proyecto.
A Ximena Meneses de la Unidad de Anlisis del Instituto Nacional de Cancerologa.
A los profesores Harvy Velasco, Clara Arteaga y Mauricio Rey, por sus enseanzas
y a la Maestra en Gentica Humana por ayudarme a avanzar en mi proceso y no
dejarme desistir a pesar de las adversidades.
A Lorena Daz y Rafael Ros de la Universidad El Bosque, Yolanda Gmez de
CORPOICA e Ivan Lesende de la Universidad de la Corua por su ayuda con la
asesora en la elaboracin de libreras.
Al grupo de la Unidad de Gentica y Resistencia Antimicrobiana (UGRA) de la
Universidad El Bosque, por el montaje del experimento de la secuenciacin de
ltima generacin en su equipo miSeq Illumina .

4
 Contenido
1 Resumen .................................................................................................................................... 8

2 Lista de Figuras ........................................................................................................................ 9

3 Lista de Tablas .......................................................................................................................... 9

4 Introduccin ............................................................................................................................. 10

5 Marco Terico ......................................................................................................................... 12

5.1 Cncer colorrectal .......................................................................................................... 12

5.1.1 Vas moleculares del cncer colorrectal ............................................................. 14

5.1.2 Cncer de colon espordico y hereditario .......................................................... 16

5.1.3 Biomarcadores en cncer colorrectal ....................................................................... 17

5.2 microRNAs descubrimiento, biognesis y funcin .................................................... 19

5.2.1 Genes que codifican para miRNAs...................................................................... 19

5.2.2 Biosntesis de los miRNAs.......................................................................................... 21

5.2.3 Mecanismos de regulacin de la expresin gnica por miRNAs .................... 23

5.2.4 miRNAs circulantes ................................................................................................ 24

5.3 miRNAs y cncer ............................................................................................................ 27

5.3.1 miRNAs como biomarcadores de cncer ........................................................... 27

5.3.2 microRNAs circulantes como biomarcadores en cncer.................................. 28

5.4 microRNA circulantes y cncer colorrectal ................................................................. 30

5.4.1 microRNAs en tejido como biomarcadores de cncer colorrectal .................. 30

5.4.2 microRNAs circulantes como biomarcadores en cncer colorrectal .............. 31

6 Objetivos .................................................................................................................................. 34

6.1 Objetivo General ............................................................................................................. 34

6.2 Objetivos especficos ..................................................................................................... 34

7 Materiales y mtodos ............................................................................................................. 35

7.1 Poblacin y muestras biolgicas analizadas .............................................................. 35

5
 7.2 Extraccin de microRNAs ............................................................................................. 37

7.2.1 Extraccin de microRNAs de tejido ..................................................................... 37

7.2.2 Extraccin de miRNAs de suero ................................................................................ 38

7.3 Cuantificacin de miRNAs ............................................................................................ 39

7.4 Elaboracin y agrupamiento de las bibliotecas de miRNAs .................................... 40

7.5 Desnaturalizacin y dilucin de las bibliotecas agrupadas ...................................... 43

7.5.1 Mtricas de calidad del experimento de secuenciacin ................................... 43

7.6 Seleccin de miRNA para ser validados por qRT-PCR ........................................... 46

7.7 Cuantificacin de los microRNAs por qRT-PCR ....................................................... 46

7.8 Anlisis Estadstico ........................................................................................................ 47

7.9 Anlisis Bioinformtico................................................................................................... 47

8 Resultados ............................................................................................................................... 49

8.1 Elaboracin de bibliotecas de cDNA y control de calidad ........................................ 49

8.2 Mtricas de calidad de los datos de la secuenciacin.............................................. 53

8.3 Anlisis de los datos de secuenciacin. ..................................................................... 56

8.4 Prediccin de nuevos miRNAs asociados a cncer colorrectal .............................. 60

8.5 Evaluacin de la expresin de miRNAs por qRT-PCR............................................. 61

8.5.1 Correlacin de la expresin de miRNAs en muestras de tejido y suero de

pacientes y controles ............................................................................................................. 62

8.6 Evaluacin de la deteccin de miRNAs circulantes en casos y controles ............ 64

8.7 Anlisis de sitios diana de miRNAs circulantes ......................................................... 67

9 Discusin ................................................................................................................................. 73

9.1 Integridad de los miRNAs en muestras crio preservadas ........................................ 73

9.2 Bsqueda de miRNAs por secuenciacin de ltima generacin ............................ 74

9.3 Alteracin de la expresin de miRNAs circulantes en cncer ................................. 77

10 Conclusiones ....................................................................................................................... 82

6
11 Perspectivas ........................................................................................................................ 83

12 Bibliografa ........................................................................................................................... 84

7
Ttulo en espaol
Perfil de expresin de microRNAs circulantes en pacientes con cncer colorrectal espordico.

Title in English

Profile of microRNAs expression in sporadic colorectal cncer patients

Resumen
Introduccin: El cncer colorrectal (CRC) ocupa el cuarto lugar en mortalidad en Colombia,
registrando cerca de 12 casos por cada 100 mil habitantes. An no existen estrategias de deteccin
temprana efectivas, no invasivas. En cncer los microRNAs (miRNAs) se han propuesto como
potenciales biomarcadores ya que alteran su expresin dependiendo el estadio tumoral y son tejido-
especficos. Objetivo: Evaluar los miRNAs circulantes en muestras de pacientes con cncer
colorrectal espordico. Metodologa: Se realiz la secuenciacin de miRNA en 16 muestras de
CCR, para seleccionar los miRNAs a evaluar en suero mediante qRT-PCR en tiempo real. Se
evaluaron los niveles de expresin de 21 miRNAs en 37 muestras de CCR, 15 individuos control
sanos, 17 muestras de plipos y 7 adenomas respectivamente. Se realiz una prediccin de blancos
moleculares para aquellos que presentaron diferencias significativas. Resultados: De los 21 miRNA
seleccionados se encontr que tres tuvieron una expresin diferencial: hsa-miR-10a-5p (p=0,05)
disminuy en comparacin a los controles mientras que, hsa-miR-20a-5p (p=0,04) y hsa-miR-423-
3p (p=0,02) presentaron sobre expresin. Por otro lado, hsa-miR-423-3p (p=0,04) present sobre
expresin en adenomas frente a plipos Los tres miRNAs circulantes fueron asociados a las vas
principales de carcinognesis de cncer colorrectal evidenciando su potencial diagnstico a futuro.
Conclusiones: La expresin diferencial de miRNAs de CCR y controles as como plipos y
adenomas, demuestra que la regulacin de los miRNAs puede hacer de ellos candidatos promisorios
a biomarcadores no invasivos en cncer colorrectal.

Palabras clave: miRNAs circulantes, cncer colorrectal, marcadores biolgicos, diagnstico

temprano, secuenciacin de miRNAs, PCR en tiempo real de miARNs.

Abstract

Introduction: colorectal cancer is the fourth cause of mortality in Colombia; there are about 12 new
cases per every 100.000 people per year. MicroRNAs are short transcripts (18-25 nucleotides) of
non-coding RNA that are able to regulate genic expression; in the context of cancer, these change
their expression depending upon tumor stage and tissue. Objective: Evaluate the presence of
circulating microRNAs in samples from patients with colorectal cancer taking healthy individuals as
controls. Methodology: complementary DNA libraries were built from sixteen cryopreserverved
tumor specimens of sporadic colorectal cancer. Next generation sequencing was performed using
MiSeq Sequencing System, miRNAs expression was validated by real time PCR in serum samples.
Results: Sequencing identified 763 sequence reads, from which 21 were evaluated by real time PCR.
Three circulating miRNAs, hsa-miR-10a-5p (p=0,05), hsa-miR-20a-5p (p=0,04) and hsa-miR-423-3p
(p=0,02)showed differences among cases and controls and were associated with the main pathways
of colorectal carcinogenesis. Conclusions: miRNAs sequencing is an effective method in the search
of miRNAs with clinical relevance. The evaluation of miRNAs differential expression is a
complementary strategy to currently available colorectal cancer screening tests. Circulating miRNAs
evaluated in this study may be promising diagnostic biomarkers candidates for colorectal cancer.

Key words: circulating miRNAs, colorectal cancer, biomarkers, early diagnosis, sequencing of
miRNAs, real time PCR of miRNAs.

8
1 Lista de Figuras
Pg.

Figura 1: Criptas colnicas y vas moleculares en cncer colorrectal--------------------------10

Figura 2: Vas moleculares de la carcinognesis en cncer colorrectal-----------------------11
Figura 3: Estructura precursora de los miRNAs (tallo y horquilla) ------------------------------18
Figura 4: Biognesis de los miRNAs y principales mecanismos de accin ------------------20
Figura 5: Mecanismos de transporte de los miRNAs ------------------------------------------------------22
Figura 6: Esquema metodolgico empleado en el proyecto ------------------------------------32
Figura 7: Muestras incluidas en el proyecto----------------------------------------------------------33
Figura 8: Flujo de trabajo de la secuenciacin realizada con la qumica de Illumina----37
Figura 9: Bibliotecas elaboradas empleando gel de agarosa al 1%----------------------------46
Figura 10: Cuantificacin de la biblioteca del tejido tumoral 761178-------------------------47
Figura 11: Cuantificacin bibliotecas agrupadas----------------------------------------------------48
Figura 12: Densidad de los grupos o clusters--------------------------------------------------------50
Figura 13: Valores Q para las lecturas de las muestras secuenciadas--------------------------------51
Figura 14: Porcentaje de lecturas identificadas en las 16 bibliotecas elaboradas-------------------52
Figura 15: Porcentaje de lecturas de los cinco miRNAs mas abundantes----------------------------53
Figura 16: Expresin de hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-20a-5p y hsa-miR-423-3p--------61
Figura 17: Expresin de hsa-miR-423-3p en adenomas y plipos-------------------------------------62
Figura 18: Blancos moleculares de hsa-miR-10a-5p ----------------------------- --------------------------64
Figura 19: Blancos moleculares del hsa-miR-20a-5p----------------------------- --------------------------66
Figura 20: Blanco molecular de hsa-miR-423-3p --------------------------------------------------------68

2 Lista de Tablas
Tabla 1: miRNAs circulantes con expresin alterada en CCR ------------------------------------------29
Tabla 2: Ensayos clnicos de miRNAs aprobados por la FDA---------- --------------------------30
Tabla 3: Valores Q para llamado de bases incorrectas durante la secuenciacin en sntesis -----40
Tabla 4: Cuantificacin de las extracciones de miRNAs realizadas en suero-------------------------49
Tabla 5: Prediccin de blancos moleculares de los cinco miRNAs--------------------------------------55
Tabla 6: Prediccin de candidatos a nuevos miRNAs y ubicacin de los loci-----------------56
Tabla 7: Lecturas de la secuenciacin de miRNAs estudiados-----------------------------------57
Tabla 8: Valores de significancia de miRNAs entre muestras de suero y tejido ----------------------59
Tabla 9: Valores de expresin de los 16 miRNAs en muestras de tejido y suero -----------60

9
3 Introduccin

El cncer colorrectal (CCR), es el cuarto tipo de cncer a nivel mundial con mayor
tasa de incidencia (17,2 casos) y mortalidad (8,5 casos) por cada 100.000
habitantes entre ambos sexos. En Colombia, el CCR ocupa el segundo puesto a
nivel de mortalidad, lo cual significa un problema de salud pblica que requiere
atencin, as como estrategias de diagnstico temprano (1).
Actualmente, las estrategias de deteccin de CCR incluyen; i) tacto rectal; ii) sangre
oculta en materia fecal; iii) enema de bario y iv) colonoscopia. Dichos mtodos,
suelen ser invasivos y en ocasiones detectan fases avanzadas del cncer (2).
El diagnstico molecular ha sido otra alternativa para el diagnstico del CCR, debido
a que tiene en cuenta las alteraciones moleculares ms prevalentes; algunos
ejemplos de estos son: la deteccin de mutaciones en los genes del oncogen viral
homologo al sarcoma de rata de Kirsten (KRAS), el receptor del factor de
crecimiento epidermal (EGFR) y al oncogn viral homologo al sarcoma murino V-
Raf (BRAF), entre los ms estudiados. La evaluacin de estos marcadores
moleculares, se realiza en el material tumoral (tejido embebido en parafina o crio-
congelado), y requiere de laboratorios que tengan la infraestructura adecuada y
equipos de alto procesamiento como laboratorios de referencia y/o biobancos (3).
Otra alternativa de diagnstico molecular, se ha desarrollado en los ltimos aos, la
cual emplea el tamizaje de bio-marcadores en muestras de suero o plasma
sanguneo, en este sentido, los miRNAs circulantes ofrecen la posibilidad de ser
empleados como bio-marcadores.

Los miRNAs son secuencias cortas de RNA no codificante de 18 a 25 nucletidos

de longitud, que pueden alterar la expresin gnica unin de su secuencia al 3
UTR del mRNA, conduciendo a la degradacin del dplex mRNA:miRNA o
realizando un mal apareamiento con el mRNA lo que impide la traduccin a protena
(4).

10
La bsqueda de miRNAs circulantes, como biomarcadores de cncer, se
fundamenta en: i) su expresin es desregulada en cncer, ii) su expresin es tejido
especfica (lo que brindara informacin detallada del sitio de inicio del tumor) y iii)
hay presencia de miRNAs en biofludos (4).

Debido a lo anterior, resultara importante conocer el perfil de los miRNAs

circulantes en CCR, para de esta manera seleccionarlos como candidatos
promisorios a biomarcadores sanguneos de esta patologa.

11
4 Marco Terico

4.1 Cncer colorrectal

El CCR es un problema de salud pblica debido a su alta prevalencia y nivel de
mortalidad. Actualmente, se estima que un 5-8% de los nuevos casos de cncer
detectados anualmente son CCR. Por otro lado el ndice de mortalidad que se le
atribuyen al CCR se encuentra alrededor del 2-7%. En Colombia, el CCR se
encuentra catalogado como uno de los cnceres ms prevalentes, registrando 12
casos por cada 100.000 habitantes y ocupando el cuarto lugar en mortalidad, segn
el ltimo boletn de Globocan de 2012 (1).

El CCR es una enfermedad multifactorial cuyos factores de riesgo pueden tener un

componente ambiental y/o un componente hereditario. Entre los principales factores
ambientales se encuentran: la dieta rica en carnes rojas y grasas, la obesidad, el
tabaquismo y el consumo de alcohol entre las principales. En cuanto al componente
hereditario puede ir desde sndromes mendelianos hasta polimorfismos y haplotipos
de susceptibilidad (5).

El CCR se origina por un proceso de transformacin que ocurre en las criptas

colnicas o criptas de Lieberknh. Las criptas colnicas se encuentran en la luz del
intestino y funcionalmente se dividen en dos zonas: la de proliferacin y la de
diferenciacin. En la zona de proliferacin se encuentran las clulas madre
pluripotentes, que se encargan del recambio celular; esta zona se caracteriza por
tener alta expresin de molculas que promueven la proliferacin celular y baja
apoptosis. En la zona de diferenciacin las clulas se convierten en clulas del
epitelio del colon (figura 1) (6).

12
Figura 1. Zona de recambio celular en las criptas colnicas y vas moleculares participantes. Tomado
de Sanabria et al (2012) (6). Protenas morfognicas seas (BMPs).

Unas de las lesiones iniciales en el epitelio del colon son los plipos. Un plipo es
una lesin benigna catalogada como un tumor no maligno, una proporcin de los
plipos pueden progresar a cncer y esto est relacionado con el tipo de plipo (5).
Los plipos adenomatosos tienen el potencial para transformarse en cncer,
mediante la va aserrada donde hay alteracin de proto-oncogenes como KRAS y
BRAF.

Los plipos hiperplsicos y los plipos inflamatorios no se consideran pre-

cancerosos (5).

13
4.1.1 Vas moleculares del cncer colorrectal

Durante el desarrollo y la progresin del CCR, se destacan procesos de

acumulacin de alteraciones genticas y epigenticas que permiten la
transformacin del epitelio del colon normal a adenocarcinoma de colon; este
proceso se conoce como progresin adenoma/adenocarcinoma y se caracteriza
principalmente por ser el resultado de la acumulacin de cambios moleculares
aditivos en lesiones precancerosas como plipos y adenomas que finalmente
desarrollarn cncer. As mismo, la progresin adenoma/adenocarcinoma, presenta
dos fenotipos moleculares ya caracterizados: la va supresora descrita por
Volgestein en 1988 (7) y la va mutadora descrita por Liu en 1995 (8), las cuales se
detallarn a continuacin (figura 2).

Figura 2. Principales vas moleculares de la carcinognesis en CCR. Tomado de Sanabria et al 2012

(6).

La va supresora est involucrada en el desarrollo del 85% de CCR espordicos, se

asocia morfolgicamente al colon distal y se caracteriza principalmente por

14
inestabilidad cromosmica (CI, por su sigla en ingls), aneuploida y prdida de la
heterocigocidad (LOH por su sigla en ingls) y son frecuentes las mutaciones en los
genes APC y CTNNB1, como evento inicial, que alteran la va Wnt/B-catenina,
estimulando la expresin de oncogenes, estimulando as la progresin a adenoma
temprano (7). La progresin a adenoma intermedio se asocia con mutaciones en
KRAS que genera CI, la cual lleva a una prdida de la expresin de los genes DCC,
SMAD4, SMAD2 y ITF2, entre otros. De hecho la literatura reporta que los genes
que se ven alterados por esta condicin son ms de 100, entre los cuales se
incluyen genes importantes en el control del ciclo celular. Estos cambios generan
inmortalizacin celular y progresin hacia adenoma tardo. Por consiguiente, la
inmortalizacin del adenoma tardo, promueve a su vez mutaciones en la protena
tumoral (P53), factor determinante en el desarrollo del adenocarcinoma (6, 9) (figura
2).

La otra va vinculada, es la va mutadora o fenotipo mutador, la cual comprende

cerca del 15% de los CCR espordicos, se encuentra morfolgicamente asociada
al colon proximal y su principal caracterstica es la inestabilidad microsatelital (MSI
de sus siglas en ingls). Esta va tambin ha sido asociada al sndrome de Lynch,
conocido como cncer de colon no polipsico hereditario; molecularmente esta va
est relacionada a la inactivacin de miembros de la familia gnica de reparacin
de malos apareamientos de DNA (DNA MMR, por sus siglas en ingls) (9). Anlisis
del DNA de tumores con MSI, presentan en sus secuencias, microsatlites que
pueden alargarse o acortarse en longitud en comparacin al DNA no tumoral en el
mismo individuo (10).

Mltiples mutaciones puntuales en los genes MMR as como la MSI son detectados
en esta clase de tumores. Uno de los puntos crticos en esta va durante la
transformacin del epitelio normal al adenocarcinoma, se da por un doble hit que
inactiva los dos alelos de algn miembro de la familia MMR; en el caso del sndrome
de Lynch, la primera mutacin viene de la lnea germinal. Los principales genes

15
afectados en esta va se vinculan con puntos de control del ciclo celular ejemplo de
ello estn CTNNB1, TGF-IIR, BAX y PTEN, entre los ms importantes. Mutaciones
en CTNNB1 se vinculan a un fenotipo hiperproliferante, mientras TGF-IIR, BAX y
IGF-IIR estn directamente relacionados con resistencia a la apoptosis (10).

Por otro lado la va aserrada, es una va accesoria de la carcinognesis en CCR.

Esta va se caracteriza por presentar mutaciones tanto en BRAF como en KRAS, el
primero, gen esencial para la transduccin de la seal al ncleo, a travs de la va
RAS/RAF/MAPK, esta seal hace que se desarrollen focos de criptas aberrantes
(AFC de sus siglas en ingls) que resulta en el desarrollo de plipos hiperplsicos,
que son los precursores de plipos ssiles aserrados que a su vez progresaran a
adenomas aserrados, con un genotipo de metilacin en genes de la familia MMR,
favoreciendo desarrollo de MSI y CCR. Las alteraciones por mutaciones en KRAS,
igualmente alteran la va RAS/RAF/MAPK que progresar a CCR (6).

4.1.2 Cncer de colon espordico y hereditario

Cerca del 85% de los CCR son espordicos y el 15% restante presentan
asociaciones con familiares afectados de primero o segundo grado. Dentro de los
canceres familiares se ubican los sndromes hereditarios autosmicos dominantes:
el sndrome de poliposis adenomatosa familiar (FAP por sus siglas en ingls) y el
sndrome de cncer de colon heredable no polipsico o sndrome de Lynch (HNPCC
por sus siglas en ingls) (11).

El CCR espordico genera inestabilidad genmica por CI y MSI, como se mencion

anteriormente. En la progresin de adenoma temprano a adenoma tardo se destaca
la activacin mutacional del oncogn KRAS y la mutacin de p53 por perdida de
heterocigocidad del alelo normal remanente de TP53 (6, 11).

16
Las mutaciones en el gen BRAF son encontradas principalmente en tumores
espordicos con MSI y no se evidencia en tumores con sndrome de Lynch; este
rasgo los separa fenotpicamente en dos grupos.

Por su parte, los sndromes hereditarios han sido caracterizados por presencia de
mutaciones puntuales en genes supresores tumorales como APC o en genes
reparadores del DNA como MLH1, MSH2, MSH6; estas alteraciones moleculares
ocasionan una acelerada ganancia de transformaciones celulares que inducen la
progresin de adenoma a adenocarcinoma o reducen el tiempo en el que se
desarrolla el cncer, lo que significa un aparicin temprana de la enfermedad (9).

4.1.3 Biomarcadores en cncer colorrectal

Los biomarcadores, son sustancias o molculas que se encuentran en tejidos o
biofludos, que en presencia de algn desequilibrio en la homeostasis del organismo
pueden alterar su concentracin y de esta manera informar que algo no est
funcionando bien. Tanto las clulas normales como las tumorales, tienen la
capacidad de elaborar molculas que pueden funcionar como biomarcadores; sin
embargo en el contexto de la clula tumoral, estos biomarcadores son alterados en
cuanto a su concentracin, generando informacin tanto al paciente como al clnico,
sobre el estado del paciente. Una sustancia que se catalogue como biomarcador,
debe ser medible y de fcil obtencin, adems debe aportar informacin al clnico
sobre la mejor estrategia a seguir durante el proceso canceroso.

Actualmente, los programas de tamizacin de CCR son importantes en la

sobrevivencia de los pacientes con CCR, la reseccin del tumor en estadios
tempranos de la enfermedad, brindara mayores expectativas para el paciente como
para el manejo clnico de la enfermedad. Sin embargo, la reseccin de las lesiones
precancerosas tienen como desafo, un diagnstico prematuro de la enfermedad
que no es fcil debido a su baja sintomatologa. Por esta razn los marcadores
moleculares son importantes en el diagnstico temprano debido a que cambios

17
fisiopatolgicos en lesiones tempranas, causan modificaciones de estos en cuanto
a concentracin y/o expresin. En CCR se han establecido los siguientes
marcadores moleculares:

i) Antgeno carcinoembrionario (CEA de sus siglas en ingls): es una

protena que se expresa en el aparato digestivo del feto y se deja de
expresar cuando nace. En el 90% de tumores colorrectales en adultos, ha
sido encontrada al igual que en fumadores, en casos de cirrosis,
peritonitis y colitis ulcerosa; valores entre (5-15 ng/mL) es un indicativo de
menor sobrevivencia a 5 aos y presencia de metstasis ocultas. Niveles
de CEA por debajo de 5ng/mL post-operacin es un indicativo de
supervivencia global (12).
ii) LOH 18q: esta condicin, hace que la expresin del gen supresor tumoral
DCC y el gen TGF--RII, SMAD2 o SMAD4. Estas alteraciones
moleculares son asociadas con mal pronstico (13).
iii) p53: se codifica en el brazo corto del cromosoma 17 aunque tiene
importantes funciones a nivel celular, una de las principales es la
inactivacin del ciclo celular frente al dao celular induciendo apoptosis,
presencia de mutaciones en este gen producen su inactivacin que se
relacionada con el peor pronstico (14).
iv) KRAS: el gen codifica para una protena con funcin GTPasa, mutaciones
puntuales en los codones 12, 13 y 61 del exn 2, promueven una
expresin constitutiva de la protena y una alteracin en la transduccin
de la seal, alterando funciones celulares vitales como proliferacin
celular, diferenciacin y apoptosis. Deteccin de las mutaciones de KRAS
se utiliza como marcador predictivo ante la respuesta al tratamiento con
Cetuximab (15).
v) miRNAs circulantes: la expresin tejido especfica de los miRNAs, la
alteracin de la expresin diferencial en cncer y la expresin diferencial

18
 en todos los estadios de la enfermedad, hacen que estas molculas
cortas de RNA, sean candidatos promisorios de nuevos marcadores
moleculares en CCR. La realizacin de perfiles de expresin de miRNAs
circulantes en lesiones precancerosas y en estadios intermedios y
avanzados del CCR, brindara un consenso de miRNAs con aplicacin
clnica (16).

4.2 microRNAs descubrimiento, biognesis y funcin

Los miRNAs, son secuencias de RNA cortas no codificantes de 18-26 nucletidos

de longitud, que son sintetizados en el ncleo y exportados y procesados en el
citoplasma, donde finalmente ejercen un mecanismo de regulacin de la expresin
gnica.

En 1993, Ambros y su grupo, descubrieron el primer miRNA Lin-4 un gen que

controlaba el desarrollo de C. elegans no codificaba para un producto final proteico,
en cambio produca dos transcritos ms cortos uno de 22 y otro de 61 nucletidos.
Ms adelante se pudo establecer que el transcrito ms largo adoptaba una
conformacin de horquilla y que era el precursor del transcrito de 22 nucletidos.
As mismo, observaron que estos ltimos anclaban de una manera antisentido en la
regin 3UTR del gen Lin-14 disminuyendo la expresin de la protena, sin disminuir
la concentracin del mRNA (17).

4.2.1 Genes que codifican para miRNAs

Existen descritos al momento segn la base de datos mirbase.org actualmente,
24521 loci de miRNAs en 206 especies, 30424 miRNAs maduros; en humanos
existen 1881 precursores y 2588 miRNAs maduros (18). Los genes de los miRNAs
se localizan en regiones intergnicas e intragnicas, as como en secuencias
exnicas de genes que pueden codificar para protenas y en otras que no codifican.
Cuando los precursores de miRNAs se encuentran en secuencias codificantes,

19
estos pueden coexpresarse con el gen husped de cierta manera ejerciendo una
regulacin sobre este, teniendo la capacidad de ser especfico para dicho tejido. Por
otro lado, cuando el precursor se ubica en una regin no codificante, la regulacin
esta mediada por elementos propios reguladores (17).

De acuerdo con la nomenclatura explicada por Ambros et al (19), los miRNAs son
anotados utilizando el prefijo miR seguido de un numero entero que hace
referencia al orden cronolgico de descubrimiento; en cuanto a las letras empleadas
en algunos casos, por ejemplo: miR-13a y miR-13b significa que este miRNA tiene
alguna variante especfica que los diferencia, pero tienen otra secuencia
conservada dentro de la longitud del miRNA maduro. Otra importante caracterstica
en la nomenclatura establecida, son los sufijos 5p y 3p, estas denominaciones son
empleados para reconocer el brazo en el que estn localizados dentro de la
estructura precursora; posterior al procesamiento de la enzima Dicer, durante la
biognesis, esta enzima deja un grupo fosfato libre. Dependiendo s el miRNA
maduro est en el extremo 5del precursor este podr reconocerse, por ejemplo:
hsa-miR-10a-5p, pero s el miRNA maduro se encuentra en el extremo 3del
precursor, se reconocer as hsa-miR-10a-3p (figura 3) (18).

20
Figura 3. Ubicacin de dos miRNAs maduros dentro de su estructura precursora, destacndose en
verde la estructura de tallo y en azul y rojo las estructuras con forma de horquilla.

4.2.2 Biosntesis de los miRNAs

La biosntesis de los miRNAs se puede observar en la figura 4. La transcripcin de
los genes de los miRNAs la realiza la RNA polimerasa tipo II en el ncleo. El
transcrito primario, de aproximadamente 1kb, conocido como pri-miRNA, tiene una
estructura en forma de horquilla. Drosha, una RNasa tipo III, junto con su cofactor,
DGCR8 (conocido como Pasha en D melanogaster y Pash-1 en C. elegans), forman
un complejo proteico conocido como el microprocesador, que inicia el proceso de

21
maduracin por clivaje de la horquilla produciendo una molcula de 60-70
nucletidos denominada pre-miRNA (17, 20).

Esta molcula de pre-miRNA, es exportada al citoplasma para finalizar el proceso

de maduracin. Este transporte es mediado por la protena exportina 5, la cual forma
un complejo de transporte junto a la protena nuclear de unin a GTP (RAN/GTP);
RAN funciona como un cofactor que une GTP durante el exporte de RNA. En el
citoplasma la molcula de GTP es hidrolizada a GDP y el pre-miRNA es liberado
del complejo exportador (20) .

En el citoplasma, la molcula de pre-miRNA es clivada por la endonucleasa

Helicasa RNasa tipo III conocida como Dicer ms especficamente por el dominio
PAZ, en la regin cercana a la horquilla terminal, generando como producto final
una molcula corta de RNA dplex de aproximadamente 22 nucletidos. Una vez
clivado la horquilla de unin de las dos cadenas de RNA, las cadenas son separadas
y solamente una de ellas se convertir en el miRNA maduro (20).

Posterior al procesamiento por Dicer, el miRNA maduro es liberado y cargado dentro

de la Protena Argonauta (Ago-1-4). La protena de choque trmico 70 (HSP70) y la
protena de choque trmico 90 (HSP90), hidrolizan complejos de ATP para
transportar el dplex. La cadena pasajera es descartada y la cadena gua el
miRNA maduro, es preservada por una de las protenas Ago. La actividad cataltica
del complejo est a cargo de AGO2 la cual cliva el mRNA; por ltimo el complejo de
silenciamiento inducido por RNA (RISC de sus siglas en ingls) cumple funciones
catalticas sobre el mRNA blanco formando el complejo resultante conocido como
miRISC (21).

22
Figura 4. Biognesis de los miRNAs y principales mecanismos de accin. Tomado de
Schwarzenbach et al 2014 (21). UTR: regin no traducida. ncRNAs: RNAs no codificantes; (RISC):
complejo de silenciamiento inducido por RNA; AGO: protena argonauta. HDL: lipoprotenas de alto
peso molecular.

El complejo miRISC en humanos, es integrado por Dicer, la protena Argonauta 2,

la protena TRBP y PACT (la cual es una protena de unin a cadena doble); la
actividad cataltica del complejo est a cargo de AGO2. Las actividades ms
importantes del ensamblaje del complejo miRISC son: i) la seleccin del miRNA
maduro en la cadena sentido o anti-sentido del dplex y ii) la eliminacin de la
cadena no acoplada al complejo. Una vez el complejo ha sido ensamblado se
dirigir al mRNA para alterar su expresin positivamente (activacin) o
negativamente (represin) (21).

4.2.3 Mecanismos de regulacin de la expresin gnica por miRNAs

El mecanismo ms comn de regulacin ejercido por los miRNAs, es de regulacin
negativa, donde el producto codificante reduce la expresin del mRNA diana. En

23
este sentido dependiendo del tipo de acoplamiento realizado por el miRNA el
silenciamiento gnico puede darse en una manera total o parcial (22).

Cuando el complejo miRISC gua el miRNA maduro hacia el extremo 3UTR del
mRNA de una manera imperfecta, es decir no hay una complementariedad total
sino parcial de algunos de los nucletidos del miRNA respecto a mRNA, ocurre una
represin parcial del transcrito, disminuyendo su expresin. Por otro lado, cuando
el miRNA se une al mRNA en su extremo 3UTR en una configuracin perfecta, se
produce la degradacin del transcrito (figura 4) (22-25).

Sin embargo, aunque la regulacin negativa es la ms comnmente encontrada,

existe evidencia de que tambin podran ser reguladores positivos. En el 2007,
Vasudevan et al, descubrieron que algunos genes como el factor de necrosis
tumoral alfa (TNF), en condiciones especiales de detencin del crecimiento por
privacin de suero, pueden ser activados por miR-369-3 al realizarse el
reconocimiento de ciertos sitios de anclaje en el mRNA (26). Ms adelante, en el
2008, el grupo de Orom et al, encontraron que el miR-10a cuando se ancla a motivos
5TOP del extremo 5UTR de mRNAs de protenas ribosomales como Rpl3a, Rps16
y Rpl23 aumenta su expresin (27). La activacin por miRNAs, tambin tiene lugar
al unirse en las secuencias promotoras, como lo demostr Place et al, en 2008,
quienes encontraron que el miR-373 se ancla en la posicin -645 corriente arriba
del sitio de inicio de la transcripcin de la E-cadherina, causando un incremento de
los niveles de E-cadherina (28) (figura 4).

4.2.4 miRNAs circulantes

Aunque la biognesis y maduracin de miRNAs es una actividad restringida al
ncleo y el citoplasma, su rol biolgico no termina nicamente all, debido a que se
ha demostrado que poblaciones de miRNAs pueden migrar a travs de diferentes
mecanismos de transporte hacia los principales biofludos (figura 5).

24
Figura 5. Mecanismos de transporte de los miRNAs al exterior celular, detallando los exosomas
procedentes de los cuerpos multivesiculares (MVB). Tomado de Cortes et al 2011 (29). RNAs de
doble hebra (dsRNA); protena de unin a RNA fosfoprotena nucleolar B23 (NPM1); protena
Argonauta 2 (Ago2).

Uno de los primeros trabajos que sustentaron la presencia de miRNAs en el suero,

fue publicado por Lawrie en 2008, donde se detect la presencia de miR-21 y miR-

25
155 y su expresin diferencial en pacientes con linfoma de clulas B frente a

individuos sanos (30). Posteriormente, Weber et al, en el 2010, estableci que los

miRNAs tambin se encontraban en otros biofludos como: plasma, saliva, lgrimas,

orina, fluido amnitico, calostro, leche materna, secreciones bronquiales, fluido

cerebroespinal, fluido peritoneal, fluido pleural y fluido seminal, y ms importante

an los miRNAs detectados era fluido especficos (31).

Los miRNAs, asociados a biofluidos, presentan mecanismos de transporte que

pueden preservar su integridad y conferirles la capacidad de transitar por el torrente

sanguneo. Algunos de estos mecanismos son: microvesculas, lipoprotenas de alta

y baja densidad, y complejos proteicos.

Las microvesculas son pequeos cuerpos esfricos de origen endosomal, que

poseen membrana y que alojan en su interior cidos nucleicos y protenas. Existen

diferentes tipos de microvesculas: i) cuerpos apoptticos, son partculas de

aproximadamente 1-4m, que se encuentran como remanentes de la muerte celular

programada, ii) vesculas de derramamiento, son de diferente tamao (0,1-1 m)

y se forman por transporte de vesculas al exterior celular y posterior fusin con la

membrana plasmtica y iii) exosomas, que son las partculas ms pequeas (30-

100nm) que residen dentro de los cuerpos multivesiculares (MVBs) (32, 33).

Las lipoprotenas de alta (HDL) y baja densidad (LDL) son complejos que participan

en el transporte de miRNAs a travs de suero y plasma. Experimentalmente se ha

corroborado que existen diferencias en el patrn de expresin de miRNAs en

individuos sanos versus individuos que presentan hiper-colesterolemia familiar y

que los miRNAs transportados por molculas de HDL son capaces de guiar a los

miRNAs a clulas hospederas y promover su efecto modulador de la expresin

gnica. Estas partculas tienen un tamao que oscila entre 8 y 12 nm (34).

26
Los miRNAs han sido vinculados a diferentes complejos en los que se asocian con
protenas, entre ellas, la protena Argonauta 2 (Ago2) la cual es un efector del
complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). Estos complejos son
diferentes en tamao de las microvesculas, demostrando as que existe una
poblacin de miRNAs que se encuentran asociados a protenas. Estos complejos
proteicos son 1 nanmetro (35).

4.3 miRNAs y cncer

Una de las principales razones por las cuales los miRNAs han despertado el inters

en la investigacin del cncer, es su capacidad de ser tejido especficos y que

presentan desregulacin en el tejido neoplsico, lo cual los hace candidatos

promisorios para deteccin temprana, diagnstico, tratamiento y pronstico.

4.3.1 miRNAs como biomarcadores de cncer

Uno de los primeros estudios de miRNAs como biomarcadores en cncer, fue

realizado por Calin et al, en el 2002, encontraron que de 186 miRNAs evaluados,

98 (52,5%) se encontraban en regiones genmicas frgiles asociadas a cncer.

Entre ellos, miR-15 y miR-16, se encontraban en una regin en donde la frecuencia

de deleciones era de 50% en la leucemia linfoctica crnica de clulas B y

posteriormente se determin, que estos dos miRNAs tenan actividad de supresores

tumorales, al inhibir la expresin del efector anti-apopttico Bcl-2 (36).

As mismo, Lu et al, en el 2005, encontraron baja expresin global de 217 miRNAs

analizados en tejido tumoral de diferentes tejidos (colon, pulmn, tero, prstata y
seno) con respecto al tejido sano y por esto plantearon que el aumento en la
expresin de miRNAs se podra encontrar asociada a una mayor diferenciacin
celular en, tejidos sanos, en comparacin al tejido tumoral que presenta baja
diferenciacin. Este estudio tambin estableci que el perfil de los miRNAs

27
analizados era tejido especfico y que con un grupo de 200 miRNAs se podra
conocer el origen del tumor y clasificar los cnceres humanos (37).

Adicionalmente, Rosenwald y su equipo (38), desarrollaron una plataforma, que era

capaz de detectar tejido tumoral primario y poda ser aplicado como una prueba
clnica para 25 tipos de tumores slidos; por otra parte, Meiri et al, emple un grupo
de 64 miRNAs para identificar 42 tipos de tumores en 52 pacientes, de los cuales
no se saba cul era el origen de su tumor primario (39).

Por otra parte, Henegan et al encontraron que los niveles de expresin en suero de
miR-195 es un rasgo que logra diferenciar el cncer de seno de otros tipos de cncer
y de controles sanos (40). As mismo, Yu et al, evalu la expresin de miR-155 en
suero de pacientes con cncer de seno, demostrando que la expresin de este
miRNA logra diferenciar el grupo de pacientes con cncer de voluntarios sanos (41).

En cncer de prstata, Mhan et al 2011, evalu la expresin de miRNAs en suero,

entre ellos miR-26a, encontrando que la expresin diferencial de este miRNA, logra
separar a pacientes con expresin de antgeno prosttico (PCA de sus siglas en
ingls) e hiperplasia de prstata benigna de controles sanos (42).

4.3.2 microRNAs circulantes como biomarcadores en cncer

El primer trabajo en observar la presencia de miRNAs circulantes en cncer, fue
realizado por Lawrie et al en el 2008; ellos evaluaron pacientes con linfoma de

clulas B, y encontraron que miR-155, miR-210 y miR-21 incrementaban su

expresin en los pacientes frente a individuos sanos. Interesantemente en este

modelo de cncer, la expresin de miR-21 fue asociada a una mejor tasa de

supervivencia en los pacientes con linfoma. Los resultados de este trabajo, fueron

determinantes para la bsqueda y validacin de miRNAs circulantes en

enfermedades crnicas principalmente en cncer; por esta razn los investigadores

28
centraron su atencin en los principales miRNAs circulantes expresados en lesiones

pre-cancerosas hasta procesos metastsicos (30).

Desde el primer trabajo en el que fue demostrado el potencial diagnstico de los

miRNAs circulantes, las investigaciones en este campo incrementaron en diferentes

modelos de cncer, a continuacin se describirn algunos estudios.

Con el nimo de identificar miRNAs circulantes en suero, para evaluar propiedades

diagnsticas y correlacionarlo con el pronstico de pacientes en cncer de prstata,

Moltzahn et al 2011, encontraron que miR-106a increment su expresin en

muestras de cncer de prstata frente a controles sanos, adems este resultado fue

relacionado con un alto riesgo en pacientes con cncer de prstata (43). Estos

resultados, amplan el conocimiento respecto a miRNAs circulantes en cncer de

prstata, sin embargo haran falta ms estudios que pudieran validar los miRNAs

reportados y aplicarlos en un contexto clnico a futuro.

Igualmente, Yaman et al 2011 evalu la expresin de miR-21, miR-141 y miR-121,

en muestras de plasma de pacientes con cncer de prstata y controles sanos

encontrando, una expresin incrementada de miR-21 en pacientes frente a los

controles. Por otro lado en pacientes diagnosticados con cncer de prstata

metastsico, los tres miRNAs presentaron alta expresin (44).

Otro ejemplo de la utilidad de los miRNAs circulantes ha sido documentado en

cncer gstrico; miR-17-5p, miR-21, miR-106a y miR-106b fueron estudiados,

encontrando que los niveles de expresin de miR-21 son altos en pacientes con

cncer gstrico despus de ser operados presentando una baja tasa de

supervivencia (45). Aunque la sobre regulacin de los miRNAs pueden ser una

caracterstica marcada entre grupos de pacientes e individuos sanos, la baja

regulacin de estos biomarcadores tambin constituye una firma de alteracin en

29
cncer. En el mismo modelo de cncer gstrico, Tsujiura et al 2010, encontr que

posterior a la gastrectoma los niveles de expresin de Let-7a disminuyeron en

pacientes con cncer gstrico, estableciendo a Let-7a como un biomarcador

pronostico en este modelo (46).

En cncer, la idea de que algunos miRNAs tienen una funcin dual como supresores

tumorales y/o oncogenes, ha sido evaluada en grupos de sujetos afectos,

encontrando que los niveles de expresin de estos pueden alterarse por esta

condicin. Segn esto, Yu et al 2012, encontr que miR-218 disminua su expresin

en sueros de pacientes con estadios tardos de adenocarcinoma cervical (47).

4.4 microRNA circulantes y cncer colorrectal

4.4.1 microRNAs en tejido como biomarcadores de cncer colorrectal

En un estudio realizado por Schetter et al en el 2008, se encontraron cuatro miRNAs

(miR-20a, miR-21, miR-106a, y miR-203) cuya alta expresin es capaz de distinguir
muestras tumorales de individuos sanos y tumores que presentan lesiones in situ,
resultando en un mal pronstico. Igualmente observaron, que la expresin de miR-
21 fue baja en muestras de adenomas y altas en tumores de estadio IV, sugiriendo
un posible rol de este miRNA como marcador de progresin de adenoma a
adenocarcinoma (48).

Igualmente, Hu et al, realizo un perfil de expresin de 1200 miRNAs en tejido de

pacientes con CCR, evaluando estos como marcadores de respuesta a la
quimioterapia asocindolos con niveles de supervivencia; ellos encontraron que los
niveles de expresin de miR-4299 y miR-96b, presentan asociacin con el grado de
supervivencia de los pacientes y la quimioresistencia. Este resultado indica que el

30
potencial pronstico de los miRNAs en el tratamiento contra CCR, podra funcionar
como biomarcadores de intervencin de quimioterapia (49).

Otra reciente aplicacin de los miRNAs en CCR ha sido su bsqueda en heces

fecales como potenciales biomarcadores; Yau et al, evaluaron la presencia de miR-
20a en pacientes con CCR encontrando que la expresin aumentada de este
miRNA, separ el grupo de los pacientes con CCR de las muestras control (50).

4.4.2 microRNAs circulantes como biomarcadores en cncer

colorrectal
A continuacin se detallarn algunos estudios en CCR donde evalan presencia de
miRNAs circulantes como potenciales biomarcadores de esta enfermedad (tabla 1).

31
Tabla 1. miRNAs circulantes con expresin alterada en CCR. Todos los estudios evaluaron los
niveles de expresin de los miRNAs por qRT-PCR, a excepcin de los que tienen el asterisco (*) que
emplearon microarreglos de expresin (51-67).

miRNA alterado en CCR Nivel de expresin en Referencias

CCR
miR-372 Alto (45)
miR-103, miR-720 Alto* (46)
miR-21, miR-29a, miR-125b Alto (47)
miR-199-3p Alto (49)
miR-182 Alto* (50)
miR-21, Let-7g Alto en miR-21 y Let-7g (51)
Let-7a, miR-1229, miR-1246, miR-150, Alto en pacientes pre (52)
miR-21, miR-223, miR-23a ciruga y bajo pos ciruga
miR-200c Alto (53)
miR-193a-3p, miR-23a, miR-338-5p Altos (54)
miR-18a, miR-19a, miR-19b,miR15b, Altos (55)
miR29a, miR-335
miR-17-3p, miR-92 Altos (58)
miR-194; miR-29b Bajos (43)
miR-24, miR-320a, miR-423-5p Bajos (44)
miR-34, miR-150 Alto/Bajo (48)
miR-601, miR-760 Bajos (56)
miR-34a Bajo (57)

Actualmente, en la pgina www.clinicaltrials.gov (68), estn registrados tres

estudios relacionados con miRNAs circulantes en cncer colorrectal (tabla 2), lo cual
demuestra la importancia clnica potencial a futuro.

32
 Tabla 2. Ensayos clnicos registrados ante la FDA relacionados con cncer colorrectal y
miRNAs.
Ttulo
"Biomarkers for the Early
Diagnosis, Prediction,
Prognosis for Colorectal
Cancers"
microRNAs Tool for
Stratifying Stage II Colon
Cancer
"Effects of Eicosapentaenoic
Acid on Subjects at High Risk
for Colorectal Cancer"
Estado del estudio/ Entidad
Objetivo
Perodo del estudio financiadora/pas
Evaluar los blancos En curso Kaohsiung Medical
teraputicos de clulas Junio 2012-Diciembre University Chung-Ho
tumorales circulantes 2016 Memorial Hospital/
(CTCs) y miRNAs Taiwan
circulantes
Evaluar los miRNAs de
pacientes con cncer En curso Hospital, Sun Yat-
colorrectal estadio II que Diciembre 2015 Julio Sen University
podran beneficiarse con la 2020 China
quimioterapia.
Probar el efecto del cido
Azienda Ospedaliera
eicosapentaonico en Finalizado
Universitaria di
marcadores relevantes en Enero 2014-Agosto
Bologna Policlinico S.
CCR a nivel de expresin 2015
Orsola Malpighi/Italia
de genes y perfil de
miRNAs
33
5 Objetivos

5.1 Objetivo General

Evaluar el perfil de expresin de miRNAs circulantes como potenciales bio-

marcadores en CCR espordico.

5.2 Objetivos especficos

Determinar la correlacin de los perfiles de expresin de miRNAs circulantes y

en tejido de pacientes con CCR espordico.

Determinar la correlacin de los perfiles de expresin de miRNAs circulantes

entre pacientes con CCR y controles.

Identificar los blancos moleculares de los miRNAs que presenten diferencias en

expresin, entre casos y controles y determinar su participacin en las
principales vas de carcinognesis de CCR empleando datos in silico.

34
6 Materiales y mtodos

La figura 6 resume las actividades experimentales realizadas en el proyecto que

sern detalladas a continuacin:

Figura 6. Esquema metodolgico empleado en el proyecto.

6.1 Poblacin y muestras biolgicas analizadas

Las muestras biolgicas analizadas fueron obtenidas del proyecto Obesidad dieta
polimorfismos y cncer colorrectal del Instituto Nacional de Cancerologa (INC), el
cual se encuentra debidamente aprobado por el Comit de tica e Investigaciones
del INC (CEI) quien tambin aprob la realizacin del presente proyecto.
nicamente se incluyeron las muestras de individuos que firmaron consentimiento
de uso futuro. Se seleccionaron muestras de 15 controles, 12 plipos, 9 adenomas
y 40 muestras de CCR para cubrir diferentes etapas de progresin en
carcinognesis colorrectal (figura 7).

35
Figura 7. Muestras incluidas en el proyecto.

Los criterios para seleccionar a un sujeto como control fueron:

i) Individuos sanos que no tuvieran antecedentes de enfermedades

hematolgicas, neoplsicas ni historia familiar de CCR.
ii) Individuos que estuvieron de acuerdo en donar sus muestras firmando
consentimiento informado.
iii) Individuos que presentaron hasta 5 plipos con diagnstico de
colonoscopia normal.

Los criterios de inclusin para el estudio fueron:

i) Pacientes que tuvieran como diagnstico CCR espordico o adenomas y que

presentaran lesiones in situ o lesiones invasivas.

ii) Pacientes que estuvieron de acuerdo en donar sus muestras para estudios de
investigacin, a travs de la firma del consentimiento informado.

iii) Pacientes que tuvieran disponibilidad de muestras en tejido (resecciones) y

muestras de suero.

Por otro lado los criterios de exclusin fueron:

i) Pacientes que no tuvieran la suficiente muestra para realizar los anlisis.

ii) Pacientes que antes de enrolarse en el estudio recibieran tratamiento de
radioterapia o quimioterapia.
iii) Pacientes que tuvieran diagnstico de otro tipo de cncer.
iv) Pacientes que tuvieran un diagnstico de cncer de colon hereditario.

Las muestras biolgicas obtenidas de los casos fueron suero y tejido mientras que
de los controles sin colonoscopia slo se obtuvo suero. Las alcuotas de 200l de

36
suero se almacenaron a -80C hasta su uso. Para las muestras de tejido
criopreservado, se tomaron aproximadamente 20mg y se almacenaron en tubos
libres de nucleasas a -80C. La descripcin de las variables de edad, sexo y lesiones
de los pacientes se encuentran en el Anexo 3.

6.2 Extraccin de microRNAs

6.2.1 Extraccin de microRNAs de tejido

La extraccin de miRNAs se realiz a partir de 10 mg de tejido tumoral empleando

el estuche comercial miRCURY RNA Isolation Kit Tissue de Exiqon

(Copenhague, Dinamarca). Con el fin de obtener la concentracin requerida de

miRNAs (>1g) para la elaboracin de las bibliotecas, se realiz una metodologa

adicional para enriquecer la muestra de miRNAs tanto en tejido tumoral como en

suero.

Se adicionaron 5 ml de nitrgeno lquido y se macer con mortero hasta

homogenizar la muestra; posteriormente se agreg 1ml de Trizol y se incub a

temperatura ambiente durante 5 minutos. Se adicionaron 200ul de cloroformo por

cada mililitro de Trizol utilizado. Posteriormente, se centrifug a 12 000 x g 15 min

entre 2-8C y se realiz la separacin de la fase superior en la cual se encuentra el

RNA, tomando de la capa superior nicamente 200ul de esta fase y se adiciona 1ml

de etanol al 70%. El volumen del RNA ms el etanol, fue servido en una de las

columnas del kit miRCURY (Copenhague, Dinamarca) RNA Isolation Kits

Tissue y se centrifug a temperatura ambiente a 14000 x g por 1 minuto. Luego se
realizaron tres lavados empleando 400l de solucin de lavado y se centrifug a

14000 x g por 2 min a temperatura ambiente. Finalmente, los miRNAs unidos a la

columna fueron eludos con 30 l de buffer de elucin. Este paso final, se repiti dos

veces ms, recuperando el volumen eludo y pasndolo nuevamente por la

columna. Los miRNAs obtenidos se almacenaron a -80C hasta su uso.

37
6.2.2 Extraccin de miRNAs de suero
Las muestras fueron seleccionadas de la seroteca del proyecto Obesidad dieta

polimorfismos y cncer colorrectal las cuales se encontraban almacenadas en

crioviales a -70C; 1mL de suero, fue centrifugado a 3500 x g por 5 min y

posteriormente fueron tomados 200L de sobrenadante para realizar la extraccin.

Se utiliz el estuche comercial miRCURY RNA Isolation Kits-Biofluids de Exiqon

(Copenhague, Dinamarca). El primer paso es realizar la lisis de la muestra

empleando 60L (solucin de lisis BF) y precipitacin de las protenas 20L

(solucin de precipitacin de protenas BF) Esta lisis se realiza con el fin de liberar

los miRNAs de los exosomas y limpiar la muestra de otro detritus de origen proteico

que puedan interferir con la purificacin. Posteriormente las muestras son

centrifugadas a 11000 x g por 3 min. Los sobrenadantes recuperados se transfieren

a un nuevo tubo, y se adicionan 270L de alcohol isoproplico realizando un vortex

durante 30s. Despus los volmenes son transferidos a las columnas (mini

columnas de centrifugacin) y centrifugados a 11000 x g por 30s; luego se descarta

el volumen recuperado en el tubo de coleccin y se realizan lavados de la columna

con (solucin de lavado 1 BF y solucin de lavado 2 BF). Finalmente, los miRNAs

son recuperados de la columna agregando 30ul de agua libre de Rnasas y

centrifugando a 11000 x g por 1 min. Este paso final se repite dos veces ms para

enriquecer la muestra. Las muestras se almacenaron a -80C hasta su uso.

Para propsitos de la elaboracin de las bibliotecas para la secuenciacin, se realiz

igualmente un procedimiento para enriquecer la muestra; se parti de un volumen

inicial de suero de 200L se emple Trizol para aislar la fase de RNA total y la

purificacin se realiz con las columnas de recuperacin de 2 estuches comerciales

38
especficos para aislamiento de miRNAs en biofluidos (Exiqon y Zymo). Los miRNAs

obtenidos fueron almacenados a -80C.

6.3 Cuantificacin de miRNAs

Para la realizacin de la cuantificacin de las muestras de miRNAs fueron tomados
6 l de cada una de las muestras aisladas, las cuales se repartieron para la
cuantificacin en las diferentes metodologas 2l para anlisis con el chip que
cuantifica miRNAs (Agilent Small RNA) y el chip que cuantifica DNA (Agilent DNA
High sensitivity) en el equipo Agilent 2100 Bioanalyzer, 2l para la cuantificacin por
Qubit 2.0 Fluorometer y 2l para Nanodrop (Thermo Scientific).

Para el anlisis por Nanodrop se realiz la lectura de 2 l de la muestra blanco que

corresponde a la solucin de elucin de las muestras de miRNAs, del kit de Exiqon.
Una vez la lectura del equipo se registr en 0, se realiz la lectura de la muestras
empleando 2l de cada muestra. Entre lecturas se realiz un lavado del pedestal
empleando 2l de agua libre de nucleasas. Las lecturas fueron consignadas en el
reporte que genera el equipo exportado en formato Excel.

Para el montaje de las muestras en el Qubit, se prepar una solucin de trabajo que
contiene la sonda fluorescente (1l) y la solucin de trabajo (199 l) multiplicndolo
por el nmero de muestras a cuantificar. Una vez preparada la solucin de trabajo,
se sirven 190l de solucin de trabajo y 10l para los calibradores y 198l de
solucin de trabajo y 2l de muestra, se realiza agitacin por vortex durante 30
segundos y se deja a temperatura ambiente durante 3 minutos. Los calibradores y
las muestras se cargan en el equipo y los datos de las lecturas de concentracin
son almacenados en una USB.

Finalmente para el montaje de las muestras en el Bioanalyzer, se prepar la matriz

de gel, el cual contiene 2l de la sonda y 40l de gel pre-filtrado. Esta metodologa
es una tcnica de cuantificacin fluoromtrica donde la sonda se une a los cidos

39
nucleicos y emite fluorescencia que es detectada por el equipo e interpretada como
un electroferograma. Posteriormente, esta preparacin se monta en el chip DNA
high sensitivity Agilent (Santa Clara, California, Estados Unidos) aplicando vaco
con jeringa de 1mL. De esta manera, una vez el gel es disgregado en el chip, se
sirven 9l en los pozos restantes marcados con la letra G (el cual contiene el gel
con la sonda fluorescente) y 5l del marcador de peso, en el pozo descrito como
marcador y en cada uno de los pozos a analizar. Finalmente se sirve 1l del patrn
de peso que debe estar previamente desnaturalizado a 70C y 1l de las muestras
a analizar, en cada uno de los 11 pozos restantes.

6.4 Elaboracin y agrupamiento de las bibliotecas de miRNAs

En la figura 8 se ilustra el esquema de trabajo para la generacin de bibliotecas y
para la secuenciacin.

40
Figura 8. Flujo de trabajo de la secuenciacin realizada con la qumica de Illumina. Tomado de
Illumina 2014 (69). En la figura se observa: la etapa de preparacin de bibliotecas, donde se ligan
los adaptadores al 5y 3, la etapa de secuenciacin, donde se realiza la amplificacin por puente y
la generacin de grupos y por ltimo el anlisis de los datos donde las secuencias generadas son
contrastadas contra genomas de referencia o bases de datos especficas.

Para este trabajo, las bibliotecas fueron preparadas a partir de 1g de RNA de

muestras de tejido tumoral usando el kit de Illumina Truseq Small RNA, siguiendo
las indicaciones del fabricante. Brevemente, el DNA fue fragmentado empleando
nitrgeno lquido y mortero hasta obtener una solucin homognea, la ligacin de
los adaptadores 3y 5 se realiz con la enzima T4 RNA ligasa 2 delecin mutante
y T4 RNA ligasa respectivamente. Para la reaccin de transcripcin inversa se
emple la enzima SuperScript II Reverse Transcriptase de Invitrogen (Carlsbad

41
California, Estados Unidos) y se incub la reaccin a 50C por 1 hora. De esta
manera, a cada una de las bibliotecas se le asign un index que es la etiqueta de
reconocimiento post secuencia. Las condiciones de amplificacin fueron: 98C por
30 segundos, 11 ciclos a 98C por 10 segundos, 60C por 30 segundos, 72C por
15 segundos y una extensin final de 72C por 10 minutos. Las bibliotecas fueron
corridas en un gel de agarosa al 1% para corroborar por longitud del producto. El
peso esperado de las bibliotecas fue entre 147-157pb correspondiente a la longitud
de los miRNAs maduros (22 y de 30 nucletidos) unidos a los adaptadores (62-64
nucletidos aproximadamente).

Con la finalidad de realizar un agrupamiento de las 16 bibliotecas realizadas,

(debido a que durante el montaje de las muestras en el cartucho del equipo
nicamente se siembran 20pM del total de las bibliotecas agrupadas) se realiz la
cuantificacin de las bibliotecas empleando los estuches comerciales Qubit dsDNA
HS Assay y Bioanalyzer Agilent High Sensitivity DNA, realizando la conversin de
unidades de nanogramos a nanomoles con la siguiente ecuacin:

( )
=

La concentracin terica del agrupamiento de las bibliotecas fue ajustada a 10nM

de cada una en un volumen final de 100l.

Para el procedimiento de purificacin de los constructos del pool de las bibliotecas

de cDNA se realiz una electroforesis en gel de agarosa de bajo punto de fusin al
1% empleando como intercalante SYBR safe. El gel fue corrido a 50V durante 60
minutos. Se cort la banda de inters teniendo como referencia las bandas de los
marcadores de peso. El producto extrado del gel es purificado empleando el
estuche comercial Illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kits
recuperando al final 30l del pool de bibliotecas en buffer TE, repitiendo este paso
dos veces ms para enriquecer la muestra.

42
Finalmente, para realizar el control de calidad del pool de la librera purificada, se
cuantific nuevamente en un chip Agilent High Sensitivity DNA Kit hasta observar
un pico a la altura esperada (150 pb).

6.5 Desnaturalizacin y dilucin de las bibliotecas agrupadas

Una vez se tienen las bibliotecas agrupadas, se deben desnaturalizar y diluir antes
de sembrarlas en el cartucho de secuencia. El siguiente procedimiento fue realizado
tanto para las bibliotecas agrupadas como para el control de corrida PhiX, este
ltimo es una biblioteca de DNA de bacterifago. Brevemente, las bibliotecas son
desnaturalizadas empleando NaOH 0.2 N. Se tomaron 5l de las muestras de
bibliotecas agrupadas ajustadas a una concentracin de 2nM y se mezclaron con
5l de NaOH 0.2 N y se realiz una incubacin. Posteriormente, se mezcla en un
tubo nuevo 10l de DNA desnaturalizado con 990l de buffer HT1 previamente
descongelado y atemperado. La concentracin resultante fue de 10 pM del DNA del
grupo de las bibliotecas en 1mM de NaOH este mezcla se deja en hielo.
Posteriormente, fueron tomados 600 l de las bibliotecas y de PhiX que fueron
sembrados en el cartucho del estuche comercial Miseq Reagent Kit v2. Finalmente,
se realiza el montaje de las muestras en el cartucho de secuencia y este se instala
en el equipo miSeq Illumina para realizar la secuenciacin.

6.5.1 Mtricas de calidad del experimento de secuenciacin

Posterior al experimento, el equipo automticamente gener archivos en tiempo real

de las mtricas de calidad, que son utilizadas para realizar los anlisis secundarios,
los cuales son datos generados durante la secuenciacon, que brindan informacin
acerca de la calidad de los datos; estos resultados son dependientes de la calidad
de cada una de las bibliotecas elaboradas.
En primera instancia, el equipo determin el porcentaje de grupos que pasaron el
filtro (%PF) determinando el valor de pureza de la intensidad de cada grupo el cual

43
es examinado a partir de los 25 ciclos, este anlisis es determinado como: castidad,
este valor el equipo lo determina como:

Castidad = intensidad del brillo / (brillo + intensidad del brillo en segundos)

Los grupos que pasan el filtro, a partir de los 25 ciclos deben tener una castidad
menor a 0,6.

Otro parmetro a tener en cuenta, son las puntuaciones de calidad designadas con
la letra Q (Quality de su sigla en ingls), que es una probabilidad de una llamada de
bases incorrecta durante la incorporacin de las bases en la secuenciacin en
sntesis (Tabla 3).

Tabla 3. Valores Q para llamado de bases incorrectas durante la secuenciacin en sntesis

Por otra lado, los archivos Fastq generados por el equipo fueron extrados y
almacenados en el servidor para su posterior anlisis.

Fue realizada la edicin de las secuencias obtenidas mediante corte de las

secuencias adaptadoras de los extremos 5 y 3, fueron seleccionadas secuencias
>16 nucletidos y <27 nucletidos, este parmetro fue ajustado con el fin de abarcar
especficamente la longitud de los miRNAs y descartar otros transcritos no
relevantes en el anlisis. El flujo de trabajo de la herramienta miRAnalyzer se
presenta como (Anexo 1).

44
El anlisis gener un grupo de ficheros para las 16 bibliotecas, que contenan
informacin referente a: i) alineamiento de miRNAs conocidos, que son divididos en
dos grupos (maduros y precursores) y iii) miRNAs maduros nuevos.

Finalmente, para la prediccin de candidatos a nuevos miRNAs, se tuvieron en

cuenta los criterios establecidos por Kozomara & Griffiths 2014 que son: a) que por
lo menos 10 lecturas mapeen sin ningn mismatch a cada uno de los posibles
miRNAs maduros derivados del precursor; b) que por lo menos el 50% de las
lecturas mapeadas a cada brazo del precursor podran tener el mismo extremo 5;
c) que la estructura precursora pudiera tener una energa libre de plegamiento
menor a -0,2 kcal/ml/nt; d) que por lo menos el 60% de las lecturas en los miRNAs
maduros, sean acopladas a las estructuras precursoras predichas.

Respecto a los nalisis de prediccin de candidatos a nuevos miRNAs que realiza

la herramienta miRanalyzer, se destaca el agrupamiento de estos resultados en
cuatro categoras conocidas como: i) Dicer: aquellas lecturas que presentan una
superposicin perfecta en 2 nucletidos del extremo 3 del miRNA (este rasgo es
caracterstico del procesamiento de la enzima Dicer durante la biognesis) y no mas
de tres clusters de lectura alineadas en el precursor; ii) Dicer difuso: lecturas que
presentan una superposicin de 1-4 nucletidos en el extremo 3 y no mas de tres
clusters de lectura alineadas en el precursor; iii) fluctuacin baja: no hay deteccin
de patrn Dicer, existe solo un cluster de lectura; sin embargo el alineamiento
sugiere un patron de clivaje y iv) no Dicer: no hay deteccin de patrn Dicer, pero
existen clusters de lectura que aparecen alineados a precursores.

45
6.6 Seleccin de miRNA para ser validados por qRT-PCR

Se realiz una bsqueda entre los miRNAs ms abundantes hallados en la

secuenciacin y una revisin de la literatura con criterios como: i) miRNAs
circulantes en CCR, ii) miRNAs expresados en tejido tumoral en CCR y iii)
secuenciacin de miRNAs en CCR. Teniendo en cuento la informacin de la
secuenciacin y la informacin hallada en la literatura se seleccionaron 22 miRNAs.

6.7 Cuantificacin de los microRNAs por qRT-PCR

Inicialmente se realiz una cuantificacin de las extracciones de miRNAs mediante

Qubit. Se emplearon 5ng/l de cada una de las muestras para la reaccin de retro
transcripcin (RT) para la cual se utiliz el estuche comercial Universal cDNA
synthesis kit II de Exiqon (Copenhague, Dinamarca). En breve, se llev a cabo
una incubacin de 42C por 60 minutos y posteriormente la enzima retro-
transcriptasa fue inactivada por incubacin a 95C por 5 minutos.

Para la PCR en tiempo real las muestras de cDNA, obtenidas por la RT, fueron
diluidas en una relacin 1:100 en agua libre de nucleasas y sembradas en una
relacin (1:1) 5l de cDNA y 5l de mix de reaccin en los paneles Pick & Mix
microRNA PCR de Exiqon, los cuales tenan acoplados los primers de los 22
miRNAs que fueron evaluados. La reaccin se llev a cabo en termociclador Light
Cycler 480 de Roche con las siguientes condiciones: desnaturalizacin inicial de
95C por 10 minutos, seguido de 45 ciclos de 95C por 10 segundos, 60C por 1
minuto.

Para la seleccin del miRNA de normalizacin de la expresin, fue realizado un

anlisis estadstico donde se determin el coeficiente de variacin de los 22 miRNAs
en el total de muestras amplificadas. De este anlisis fue seleccionado, el miRNA
que present la variacin ms baja en todo el experimento, el hsa-miR-92a-3p. Los

46
niveles de expresin fueron determinados como las veces de cambio con respecto
al miRNA normalizador empleando la siguiente frmula (70):
2 - Ct

Donde Ct equivale a [(Ct del miRNA de inters Ct del control interno) muestra
de anlisis (Ct del miRNA de inters Ct del control interno) muestra de
referencia]. La muestra de anlisis y la de referencia depender de lo que se quiera
comparar (p.e. tejido vs. suero).

6.8 Anlisis Estadstico

Los niveles de expresin de los miRNAs se manejaron como variables continuas
con distribucin no normal probada mediante la prueba de Shapiro-Wilk, se
realizaron sub-bases teniendo en cuenta cada uno de los miRNAs para realizar la
comparacin con el miRNA control escogido mediante anlisis del nivel de variacin
la cual fue medida gracias al coeficiente de variacin. Los resultados fueron
presentados en diagramas de cajas, dado que los valores no son normales. Antes
de realizar los grficos, se revis la homocedasticidad mediante la prueba de
varianza; esta condicin se prob dado que la homogeneidad de varianzas es una
condicin muy importante para realizar anlisis de varianza (ANOVA), tcnicas de
regresin y anlisis discriminante. Finalmente, para las comparaciones entre los
miRNAs de muestras de tejido vs muestras de suero, se emple el estadstico
Mann-Whitney-Wilcoxon. Las pruebas estadsticas se hicieron a dos colas y los
valores de p fueron considerados estadsticamente significativos cuando fueran
menores a 0,05. Los anlisis fueron realizados empleando el software libre R
versin 3.2.2

6.9 Anlisis Bioinformtico

El anlisis bioinformtico fue llevado a cabo empleado el flujo de trabajo de

(Hackenberg et al 2011)(71). Brevemente, los archivos Fastq fueron exportados al

47
servidor y fueron analizados empleando el flujo de trabajo de la herramienta
miRanalyzer. Las lecturas fueron alineadas contra la base de datos miRBase para
detectar miRNAs maduros, RefSeq para detectar contaminacin con mRNA y el
genoma para predecir nuevos microRNAs.
Para evaluar el rol biolgico que presentaron los miRNAs hallados mediante
secuenciacin, sus genes blanco fueron identificados mediante la herramienta On
line TarBase v 7.0, la cual contiene los genes blanco de los miRNAs reportados en
la base de miRNAs (miRBase). Por otro lado, para el anlisis de las vas metablicas
de CCR fue consultada la base de datos de la Enciclopedia de Genes y Genomas
de Kioto (KEEG).

48
7 Resultados
7.1 Elaboracin de bibliotecas de cDNA y control de calidad
Se seleccionaron 25 tejidos de CCR y 15 de suero para la realizacin de las
bibliotecas. La concentracin inicial del RNA fue una variable crtica para esto. En
los experimentos iniciales donde se parti de concentraciones inferiores a 1g de
RNA no fue posible obtener las bibliotecas (anexo1). Los miRNAs son molculas
que se encuentran en baja proporcin con respecto al RNA total, por esta razn, se
requieren concentraciones altas de material inicial.

De las muestras seleccionadas, slo 16 tejidos tumorales tuvieron la concentracin

requerida por el estuche comercial de Illumina (tabla 4) empleando la tcnica de
enriquecimiento de la muestra descrito en la metodologa, que permiti aislar en
primera instancia, todas las poblaciones de RNA de las clulas, evitando
contaminacin con trazas de DNA.

La cuantificacin de RNA de algunas muestras de tejido tumoral con el Qubit,

registraron valores > 6g que el equipo catalogaba como concentraciones muy altas
que posteriormente se corroboraron por gel de agarosa al 1% observando la banda
a la longitud esperada (anexo 2)

Por otro lado, la correcta elaboracin de las bibliotecas, fue verificada mediante
electroforesis en gel de agarosa al 1% a la muestra de tejido tumoral 761188,
observando un producto de longitud aproximada a 157 nt (figura 9). Esta longitud,
corresponde a los dos adaptadores ligados (aproximadamente 65 nt cada uno), ms
la longitud de los miRNA (aproximadamente 27 nt). Igualmente se observan otros
productos inespecficos; estos podran ser dmeros de primer que no anillaron en el
momento de la amplificacin de las bibliotecas o adaptadores que no se ligaron a
los miRNAs. Igualmente, el producto amplificado se encontr entre el marcador de

49
peso molecular Custom Ladder Illumina (160 y 145 pb); confirmando la longitud
esperada de las bibliotecas, corroborando que el ensamblaje de las bibliotecas, fue
apropiado.

Figura 9. Verificacin del tamao de las bibliotecas elaboradas empleando gel de agarosa al 1%. 1)
marcador de peso high resolution leadder, 2) marcador de peso custom leadder, 3) biblioteca
elaborada a partir de suero 761178, 4) biblioteca elaborada a partir de muestra de tejido tumoral
761188, 5) marcador de peso custom leadder.

Tambin se proces una muestra de suero para la elaboracin de una librera pero
no se obtuvo producto (figura 9). Este suero corresponda al CCR 761178 y la
cuantificacin de RNA y DNA fue de 245 g/ml y 7 g/ml respectivamente.

La longitud de las bibliotecas tambin fue confirmada mediante el Bioanalyzer

empleando el DNA High Sensitivity Chip de Agilent (figura 10). Se observ en el
reporte del anlisis que el pico nmero cuatro presenta la longitud esperada para
esta librera (153 pb).

50
Figura 10. Cuantificacin de la librera del tejido tumoral 761178 mediante Bioanalizador.

Aunque se observ el producto esperado, igualmente se observaron otros

productos inespecficos vistos en el gel de agarosa. Para eliminar estas
inespecificidades se realiz un agrupamiento de las 16 bibliotecas, las cuales se
llevaron a una concentracin de 10nM en 100l de volumen final para
posteriormente realizar una purificacin mediante extraccin de la banda del tamao
correspondiente, de un gel de agarosa de bajo punto de fusin, extrayendo el DNA
de la banda empleando el estuche comercial especfico para purificacin de
productos en gel illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification (Pittsburgh,
Estados Unidos). El purificado fue examinado mediante Bioanalizador empleando

51
el chip de DNA High Sensitivity para corroborar que se haban eliminado las bandas
inespecficas (figura 11).

Figura 11. Cuantificacin mediante Bioanalizador del purificado del agrupamiento de las 16 lbrerias.

Con el fin de optimizar el resultado obtenido con la biblioteca en suero, fueron

elaboradas nueve bibliotecas a partir de sueros de pacientes con CCR, empleando

52
tres metodologas de extraccin de los miRNAs, basadas en uso del Trizol y
mtodos de recuperacin de miRNAs por columnas de tres estuches comerciales
comerciales diferentes. Posteriormente, estos productos fueron cuantificados
mediante Qubit, observando que nicamente, tres de las nueve muestras tenan
una concentracin superior a 1g (tabla 4).

Tabla 4. Cuantificacin de las extracciones de miRNAs realizadas en suero.

ID Muestras Medicin Qubit [g/ml]

76196 5.60
76184 5.8
761178 7.6

Se realiz la elaboracin de las bibliotecas, con estas tres muestras y

posteriormente fueron evaluadas mediante un gel de agarosa al 1%, para verificar,
s el ensamblaje habia sido correcto. Cuando se revis el gel, no se oberv un
producto visible a la altura esperada (147-157pb). Con estos resultados, se descart
la elaboracin de bibliotecas de cDNA a partir de suero, continuando nicamente
con las bibliotecas de tejido tumoral.

7.2 Mtricas de calidad de los datos de la secuenciacin.

La figura 12 muestra un diagrama de caja que detalla los principales valores de

castidad para los grupos que fueron obtenidos en la secuenciacin; lmite superior
(0,675), percentil 75 (0,67), percentil 50 (0,666), percentil 25 (0,662), lmite inferior
(0,654). Todos los grupos tuvieron un valor >0,6 finalizados los 57 ciclos. El
resultado se presenta en el box plot.

53
Figura 12. Densidad de los grupos o clusters.

Las mtricas de calidad de los datos, mostraron un valor Q superior a 30 (figura 13)
indicando que hubo errores de incorporacin en una proporcin de 1 en cada 1000
pb. Se observ que el 96,86% de los datos, superaron este filtro de calidad. Se
obtuvo 20.9 x 105 lecturas generadas en la reaccin, de las cuales 18.6 x 105
pasaron el filtro.

54
Figura 13. Valores Q para las lecturas de las muestras secuenciadas. Se observa en verde los grupos
que pasaron el filtro Q30 y en azul los que no. Los grupos que pasan el filtro cuando hay un llamado
de base a partir del ciclo 25 tiene un valor de castidad < 0,6.

Los mtricas de calidad mostraron igualmente, el porcentaje de lecturas que

pasaron el filtro para cada una de las 16 bibliotecas (figura 14). Aunque se estim
una concentracin terica comn para las 16 bibliotecas en el momento de hacer el
pool, no fue observado un porcentaje uniforme de lecturas para cada una de las
bibliotecas realizadas.

55
Figura 14. Porcentaje de lecturas identificadas en las 16 bibliotecas elaboradas.

7.3 Anlisis de los datos de secuenciacin.

El fichero de los miRNAs maduros conocidos gener 763 alineamientos, los cuales
fueron organizados de mayor a menor teniendo en cuenta la frecuencia en el
nmero de lecturas (readCounts). Todos los miRNAs alineados en este fichero
presentan por lo menos un alineamiento. La abundancia en nmero de lecturas de
los miRNAs que alinearon con las bases de datos miRBase, Refseq, Rfam y el
genoma humano es resumida en la figura 15.

Fueron registrados los cinco miRNAs ms abundantes debido a que estos

representan el 58% de las lecturas registradas.

56
 22%

42%

16%

5% 10%
5%

hsa-miR-10a-5p hsa-miR-192-5p hsa-miR-10b-5p

hsa-miR-22-3p hsa-miR-26a-5p otros

Figura 15. Porcentaje de lecturas de los cinco miRNAs mas abundantes de los 763
secuenciados.hsa-miR-10 a-5p (22%), hsa-miR-192-5p (16%), hsa-miR-10b-5p (10%), hsa-miR-22-
3p (5%), hsa-miR-26a-5p (5%).

Con el propsito de evaluar los blancos moleculares de los cinco miRNAs ms

abundantes, fueron consultadas las bases de datos de dominio pblico Tarbase 7.0
(miRPath) y KEEG (Tabla 6); la primera es una herramienta que permite la
prediccin de blancos moleculares de miRNAs en secuencias codificantes como en
3 UTR; esta prediccin se basa en algoritmos DIANA-micro-TCDS o en
interacciones de miRNAs validados experimentalmente. Igualmente se emple la
herramienta de dominio pblico TargetScan v.7.0, para corroborar la interaccin del
miRNAs con el blanco molecular.

Aunque para cada uno de los miRNAs evaluados, los resultados arrojaron mltiples
vas de sealizacin, el anlisis fue dirigido unicamente a aquellas vas vinculadas
a blancos que participaran en cncer colorrectal. Dentro de los resultados, se
destacan vas de transduccin de la seal como: la va de las proteinas quinasas
activadas por mitgenos (MAPKs de sus siglas en ingles), involucradas en las
principales rutas de carcinogenesis, que participa activamente en procesos de

57
proliferacin celular, que es un rasgo estricto de las principales vas de
transformacin maligna. Como principales alteraciones en cancer colorrectal sobre
esta va, se han reportado las mutaciones en los codones 12, 13 y 61 del exon 2 del
oncogen K-ras, que generan la activacin de otros blancos moleculares corriente
abajo como serin/treonin quinansas, fosfoinositol 3 quinasa, que participan en la
sobrevida al proceso apopttico y progesin del ciclo celular.
As mismo, los resultados del anlisis evidenciaron una interaccin de los miRNAs
con la va de transduccin de la seal Wnt, la cual esta vinculada a procesos de
proliferacin celular atpica, disrupcin de esta causa arresto de la B-catenina en el
ncleo e igualmente alteraciones en el gen supresor tumoral APC, todo esto
alterando la va y desarrollando la transformacin de la clula normal a tumoral.
Finalmente, otra de las importantes vas reguladas por los miRNAs hallados en la
secuenciacin, fue la va del factor de crecimiento transformante beta (TGF-) esta
va dirige procesos vinculados a proliferacin celular, apoptosis, diferenciacin y
migracin celular, procesos que en cncer colorectal se ven alterados.

58
Tabla 5. Prediccin de blancos moleculares de los cinco miRNAs de mayor abundancia en el
experimento de secuenciacin.

miRNA Vas con las que interacciona Genes Tipo de interaccin

CRK
MAPK8
MAPK Transduccin de seal /proliferacin
DUSP3
hsa-miR-10a-5p MAPK7
BTRC
WNT MAPK8 Anti-apoptosis/proliferacin
MAPK7
WNT FOS
APC
MAPK
MAPK9 Anti-
hsa-miR-192-5p DCC APPL1 apoptosis/proliferacin/inestabilidad
BAX BCL2 de microsatlites/sobrevivencia
hMSH3 MSH6
BETA CATENINA TCF7
hsa-miR-10b-5p WNT NF1
SP1
hsa-miR-22-3p TGF-
BMP7
SMAD4 Anti-apoptosis/proliferacin
TGF- MYC
hsa-miR-26a-5p
SMAD1
WNT GSK3B

La revisin preliminar de los blancos moleculares de estos cinco miRNAs mas

frecuentes, nos permitio tener informacin acerca de los miRNAs encontrados con
respecto a las vas que estan regulando, dentro del modelo del cncer colorrectal.
Sin embargo, hasta este momento la presencia de cada uno de los miRNAs hallados
mediante la secuenciacin, no nos brindaba an informacin acerca de el tipo de
regulacin que podran estar ejerciendo estos miRNAs sobre estas vas ni sobre su
estado de regulacin. Ademas no se tena certeza, s estos miRNAs que fueron
hallados en tejido tumoral, tendran presencia en suero.

Por esta razn, fue realizado un diseo que permito evaluar el nivel de expresin
de 21 miRNAs hallados por secuenciacin y contrastados por literatura, en tejido y

59
suero. Este diseo incluy muestras de pacientes con cncer colorectal, adenomas,
plipos e individuos sanos.

7.4 Prediccin de nuevos miRNAs asociados a cncer colorrectal

Otro de los archivos generados del analisis por la herramienta miRanalyzer, fueron
los datos de las secuencias reportadas como nuevos miRNAs.
Para el anlisis de los nuevos miRNAs fue seleccionado el fichero de Dicer difuso
debido a que los resultados no arrojaron, el fichero del patron de Dicer perfecto y
los otros dos ficheros no fueron considerados, debido a que se tom el parametro
del patrn de Dicer como el principal criterio de inclusin a tener en cuenta y las
otras dos categoras restantes carecen de este. El programa identific 64 posibles
candidatos de los cuales se muestra la ubicacin del loci en la tabla 5.
Teniendo en cuenta los resultados de miRanalyzer y los criterios de miRBase, se
presentan los resultados de la prediccin de nuevos candidatos a miRNAs maduros
determinados por la herramienta miRanalyzer la tabla 6.

Tabla 6. Prediccin de candidatos a nuevos miRNAs y ubicacin de los loci.

Nombre Cromosoma
Cand_14, Cand_25, Cand_42 Cr1
Cand_12, Cand_13, Cand_15, Cand_18, Cand_19, Cand_26, Cand_32 Cr3
Cand_4, Cand_5, Cand_8, Cand_11, Cand_12, Cand_13, Cand_14 Cr5
Cand_5 Cr7
Cand_26, Cand_27, Cand_40, Cand_41, Cand_42, Cand_43, Cand_44, Cand_45, Cr10
Cand_46, Cand_47, Cand_49, Cand_50, Cand_52, Cand_53, Cand_54, Cand_58,
Cand_80, Cand_81, Cand_89, Cand_92, Cand_95
Cand_97 Cr11
Cand_104 Cr12
Cand_55, Cand_57 Cr14
Cand_56 Cr19
Cand_48, Cand_63, Cand_65, Cand_67, Cand_75, Cand_80, Cand_82, Cand_96, Cr17
Cand_129, Cand_138
Cand_36, Cand_48, Cand_88 CrX
Cand_40, Cand_45 CrY

60
7.5 Evaluacin de la expresin de miRNAs por qRT-PCR
La informacin generada en el experimento de secuenciacin, arrojo 763 miRNAs,
catalogados de acuerdo a la frecuencia del nmero de lecturas alineadas a las
bases de datos descritas anteriormente; con estos datos se realiz un anlisis de
los miRNAs con mayor porcentaje de lecturas y la literatura de aquellos miRNAs
reportados tanto en muestras de suero como en tejido del cual surgi una lista de
21 miRNAs tabla 7.

Tabla 7. miRNAs seleccionados y porcentajes de lecturas halladas durante la secuenciacin.

Nombre % de lecturas
hsa-miR-10a-5p 22,4
hsa-miR-192-5p 16
hsa-miR-10b-5p 9,6
hsa-miR-22-3p 4,8
hsa-miR-26a-5p 4,7
hsa-miR-148a-3p 4,6
hsa-miR-143-3p 2
hsa-miR-486-5p 1,9
hsa-miR-141-3p 1,5
hsa-miR-27b-3p 1,4
hsa-miR-29a-3p 0,33
hsa-miR-221-3p 0,29
hsa-miR-200c-3p 0,27
hsa-miR-145-5p 0,1
hsa-miR-423-3p 0,096
hsa-miR-155-5p 0,089
hsa-miR-223-3p 0,080
hsa-miR-320a 0,087
hsa-miR-21-5p 0,036
hsa-miR-20a-5p 0,021

61
Para la determinacin del miRNA que servira como normalizador, fue realizado un
anlisis en el cual fue calculado el coeficiente de variacin para cada uno de los
miRNAs amplificados para todos los platos a lo largo del experimento. De acuerdo
a este anlisis se determino que el hsa-miR-92a-3p, fue el miRNA que menos
variacin (Cv = 0,096) dentro del experimento y se tom como miRNA normalizador.

7.5.1 Correlacin de la expresin de miRNAs en muestras de tejido y

suero de pacientes y controles

Los anlisis realizados evaluaron inicialmente s los 21 miRNAs seleccionados que

se expresaban en los tejidos de las bibliotecas de CCR tambin se encontraban en
suero. Slo se analizaron muestras provenientes de CCR debido a que uno de los
objetivo respecto a la bsqueda de miRNAs circulantes estaba orientado a realizar
un deteccin temprana del CCR. Se evaluaron tambin miRNAs en muestras de
tejido y suero de pacientes con adenomas colnicos, que son catalogados como las
lesiones precursoras del cncer y plipos que aqu son tomados como controles con
colonoscopia, lo que asegura que no tienen CCR ni adenoma y de los cuales se
tiene tejido para analizar.

Al analizar todos los datos, obtenidos por qRT-PCR se encontr que todos los
miRNAs seleccionados por su expresin en tejido se detectaban en suero. Con el
fin de establecer, el nivel de significancia global de los 21 miRNAs tanto en muestras
de suero como en tejido, fue realizado un anlisis de Wilcoxon-Mann Whitney, la
prueba establece un valor P < 0.05 como significativo, el cual se muestra en la tabla
9. Cinco de los 21 miRNAs analizados tuvieron una expresin similar entre suero y
tejido (p>0,05) y los 16 restantes presentaron diferencias significativas (p<0,05)
(tabla 8).

62
Tabla 8. Valores de significancia de miRNAs entre muestras de suero y tejido

Expresin miRNAs Wilcoxon

hsa-miR-10a-5p 0,05730
hsa-miR-221-3p 0,05483
Similar en suero y tejido hsa-miR-20a-5p 0,57406
hsa-miR-22-3p 0,37141
hsa-miR-26a-5p 0,27358
hsa-miR-155-5p 0,00002
hsa-miR-192-5p 0,00000
hsa-miR-200c-3p 0,00000
hsa-miR-10b-5p 0,01838
hsa-miR-21-5p 0,00000
hsa-miR-221-5p 0,00394
hsa-miR-223-3p 0,02027
hsa-miR-27b-3p 0,00003
Significativamente diferente hsa-miR-29a-3p 0,00000
hsa-miR-320a 0,01316
hsa-miR-423-3p 0,00454
hsa-miR-486-5p 0,00000
hsa-miR-141-3p 0,00000
hsa-miR-143-3p 0,00000
hsa-miR-145-5p 0,00000
hsa-miR-148a-3p 0,00001

Para analizar el comportamiento de los 16 miRNAs con expresin diferencial en

tejido y suero se compararon suero y tejido en tres categoras: CCR, adenomas y
plipos (tabla 9). Los tres grupos mostraron un mayor nmero de miRNA a nivel de
tejido de lo que fue detectado en suero. De los miRNA con mayor expresin en
tejido, diez fueron consistentes en los tres grupos y de los de mayor deteccin en
suero, dos presentaron el mismo comportamiento.

63
Tabla 9. Valores de expresin de los 16 miRNAs en muestras de tejido tumoral y suero de
pacientes con adenomas, plipos y CCR. En azul se muestran los miRNAs que se
encuentran con una mayor expresin en tejido de los tres grupos analizados y en rojo se
encuentran los miRNAs con mayor deteccin en suero en los tres grupos analizados

miRNAs Adenomas Plipos Carcinoma

hsa-miR-10b-5p hsa-miR-10b-5p
hsa-miR-141-3p hsa-miR-141-3p hsa-miR-141-3p
hsa-miR-143-3p hsa-miR-143-3p hsa-miR-143-3p
hsa-miR-145-5p hsa-miR-145-5p hsa-miR-145-5p
hsa-miR-148a-3p hsa-miR-148a-3p hsa-miR-148a-3p
Mayor en tejido hsa-miR-155-5p hsa-miR-155-5p
hsa-miR-192-5p hsa-miR-192-5p hsa-miR-192-5p
hsa-miR-200c-3p hsa-miR-200c-3p hsa-miR-200c-3p
hsa-miR-21-5p hsa-miR-21-5p hsa-miR-21-5p
hsa-miR-221-5p hsa-miR-221-5p hsa-miR-221-5p
hsa-miR-27b-3p hsa-miR-27b-3p hsa-miR-27b-3p
hsa-miR-29a-3p hsa-miR-29a-3p hsa-miR-29a-3p
hsa-miR-423-3p hsa-miR-320a hsa-miR-320a
hsa-miR-423-3p
hsa-miR-10b-5p
hsa-miR-155-5p
hsa-miR-223-3p hsa-miR-223-3p hsa-miR-223-3p
Mayor en suero hsa-miR-320a hsa-miR-423-3p
hsa-miR-486-5p hsa-miR-486-5p hsa-miR-486-5p

7.6 Evaluacin de la deteccin de miRNAs circulantes en casos y

controles

Con el fin de evaluar el potencial rol como biomarcadores en los 21 miRNAs

seleccionados en el estudio, se evaluo su nivel de deteccin en suero de CCR,
adenomas, plipos y controles sanos. Tanto para los CCR como para los controles,
se emplearon muestras de suero, mientras adenomas y plipos suero y tejido. Para
determinar los niveles de significancia entre las comparaciones de los grupos
seleccionados, se realiz la prueba estadstica Wilcoxon-Mann-Whitney. Los
resultados se presentan como diagramas de cajas y bigotes.

64
Al realizar la comparacin de los niveles circulantes de los miRNAs entre pacientes
con CCR y controles sanos, se observ que tres, presentaron diferencias
estadsticamente significativas hsa-miR-10a-5p (p = 0,005), hsa-miR-20a-5p (p =
0,04) y hsa-miR-423-3p (p= 0,02) figura 16. En el caso de hsa-miR10a-5p, los
niveles sricos son menores en los casos de CCR con respecto a los controles,
mientras hsa-miR-20a-5p y hsa-miR-243-3p son mayores en cncer que en
controles.

Figura 16. Niveles circulantes de hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-20a-5p y hsa-miR-423-3p

en pacientes con cncer colorrectal (n= 40) y controles sanos (n=15).

65
En un segundo anlisis se compararon las muestras, de adenomas frente a plipos
En todos los tratamientos evaluados no se obervaron diferencias estadisticamente
significativas, a excepcin del tratamiento en suero del hsa-miRNA-423-3p (p =
0,049). El cual se ecuentra elevado en adenomas en comparacin con los plipos (
figura 17) y el cual tambin se haba encontrado incrementado en pacientes con
CCR con respecto a controles (figura 17)

Figura 17. Expresin de hsa-miR-423-3p en adenomas (n = 9) y plipos (n=12), significancia (p <

0,05).

Es interesante que el hsa-miRNA-423-3p de igual manera se encuentre alterado en

cncer colorrectal, este rasgo podra vincular este miRNA a procesos de inicio y
progresin de la enfermedad ya que su expresin se aumenta tambin en
adenomas. Para este caso, la bsqueda de su sitio diana dentro de los mecanismos
moleculares que regulan la transformacin maligna en CCR, brindara informacin
importante acerca de los mecanismos que podran estar regulando la transicin
adenoma /adenocarcinoma.

66
7.7 Anlisis de sitios diana de miRNAs circulantes

De acuerdo con los datos presentados en las figuras 16 y 17, los experimentos
arrojaron un especial interes en tres miRNAs circulantes que alteraron su nivel de
expresin entre pacientes con cncer colorrectal y controles sanos estos fueron:
hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-20a-5p y hsa-miR-423-3p.
El anlisis de genes diana para hsa-miR-10 a-5p en vas de CCR, evidenci que
este miRNAs participa en la regulacin de los genes BIRC5 y MAPK8 (figura 18).

El inhibidor baculoviral de apoptosis que contiene 5 repeticiones (BIRC5) o

survivina, es un gen que codifica la protena BIRC5, cuya funcin principal es inhibir
la apoptosis. Esta protena es expresada durante la fase G2/M del ciclo celular;
durante el inicio de la mitosis, la survivina se une a los microtbulos del huso mitotico
formando una interaccin con las caspasas 9, 3 y 7 para evitar que clulas en
divisin entren en apoptosis. Estmulos internos como daos en el DNA activan la
va extrnsica de la apoptosis regulada principalmente por la caspasa 9. La survivina
localizada en la mitocondria inhibe la caspasa 9 y las protenas pro-apoptoticas
Smac/DIABLO. De esta manera la survivina, promueve la proliferacin aberrante
que genera cncer. Esta protena es altamente expresada en cncer colorrectal
(72).
Por otro lado, el gen MAPK8 codifica a la protena quinasa activada por mitgenos
8, la cual pertenece a la familia de las MAPKs, encargadas de integrar seales
bioqumicas que conectan estimulos clulares como es el caso del factor de
necrosis tumoral alfa (TNF-) para inducir apoptosis. En cncer esta protena, al
igual que los otros miembros de la familia MAPKs son alterados, debido a que tiene
a cargo importantes funciones celulares como proliferacin, diferenciacin,
sobrevivencia y apoptosis (73).

67
En referencia al hsa-miR-20a-5p, el analisis revel que sus blancos moleculares
fueron los genes: BCL2, CCND1, SMAD4, MYC y TGFBR2 (figura 19). El gen BCL2,
codifica a una protena de su mismo nombre cuya funcin principal es regular la
muerte celular programada teniendo una funcin antiapopttica. Alteracin de su
sobre expresin en cncer, lleva a la perdida de su funcin que ejerce una funcin
pro- apopttica sobre las clulas cncerosas.

68
Figura 18. Blancos moleculares de hsa-miR-10a-5p en las vas de transformacin molecular de CCR.
Los genes BIRC5 y MAPK8 se observan resaltados en amarillo y el miRNA en color azul. Tomado y
modificado de la enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG).

Por otro lado, el gen CCND1 o ciclina D1, codifica para una protena que regula la
actividad de protenas con caractersticas de quinasas dependientes de ciclinas y
forma un complejo con CDK4 y CDK6, las cuales hacen parte de la maquinaria del
ciclo celular en su etapa G1/S. En cncer, su desregulacin estimula la progresin
tumoral a travs del crecimiento celular independiente de anclaje y angiogenesis a
traves de VEGF. Igualmente la sobre expresin de esta ciclina, causa inhibicin de
Fas lo que incrementa la resistencia a la quimioterapia y evasin de la apoptosis
(74).

Respecto al gen SMAD4, codifica una protena involucrada en la transduccin de la

seal de la superfamilia del factor de crecimiento transformante beta (TGF-) y de
las protenas morfognicas seas, su principal funcin es la de conectar el estmulo
a travs de TGFBR hasta el ncleo. El alelo 18q21 se pierde en el 50-60% de
pacientes. Participando en esta misma va de transduccin de la seal, el receptor
II del factor de crecimiento transformante beta TGFBRII que es un tipo de receptor
serina-treonina quinasa, este receptor tiene funcin de supresor tumoral y se ubica
a nivel transmembranal; su ligando especifco es el TGF-, cuando se da la unin
ligando/receptor, se produce la seal al ncleo que media funciones celulares vitales
como la proliferacin celular. En cncer colorrectal, este gen se encuentra alterado
en cerca de 30% de los casos (75).
Por otra parte el gen MYC, codifica para un factor de transcripcin de tipo dedos de
zinc que se une a los motivos E de los genes y regula genes que participan tanto en
crecimiento celular como progresin del ciclo celular. Este factor es regulado
corriente arriba por la va de las MAPKs. En cncer, alteraciones moleculares que
le confieren una actividad constitutiva, ocasionan una aceleracin de la actividad
transcripcional, incrementando la tasa de proliferacin celular desmedida (76).

69
Figura 19. Blancos moleculares del hsa-miR-20a-5p. Tomado y modificado de KEEG

Finalmente, la prediccin del sitio diana para el hsa-miR-423-3p (figura 20), revel
el gen CDKN1A o inhibidor de quinasa depedendiente de ciclina 1A. Este gen es
caracterizado por codificar la protena p21 reguladora del ciclo celular en la fase G1
y es a su vez blanco del gen supresor tumoral p53. Su mecanismo de accin se

70
centra en la inhibicin de los complejos CDK2 y CDK4 ciclinas escenciales para la
transicin celular G1/S. En cncer esta protena se encuentra alterada impiendiendo
responder frente a estmulos como el estrs celular causando que el ciclo celular no
cese su activacin, generando multiplicacin de clulas aberrantes con capacidad
para generar tumores (77).

71
Figura 20. Blanco molecular de hsa-miR-423-3p. Tomado y modificado de KEGG.

72
8 Discusin

8.1 Integridad de los miRNAs en muestras crio preservadas

Como se detall en la seccin 4.1, las muestras eran procedentes de un estudio
previo, el cual realiz la recoleccin de las muestras hace 3 aos, estas muestras
de tejido y suero tumoral, fueron colectadas y almacenadas empleando
criopreservacin a -70C. Actualmente la literatura centra un debate, acerca del
mejor mtodo de almacenamiento para preservar la integridad de los miRNAs; es
sabido que por su longitud entre 22-30 nucletidos, los miRNAs difcilmente seran
susceptibles a la degradacin por RNasas. Esto fue corroborado por Chen et al,
quien evalu el nivel de degradacin de miRNAs en muestras de suero, al realizar
una digestin por 3 horas con RNasa A; encontrando que los miRNAs no fueron
susceptibles a la digestin de la enzima cuando se evalu su expresin mediante
PCR en tiempo real; otros RNAs como rRNA18S o U6RNA empleados control
fueron degradados por la RNAasa (78).

Los principales mecanismos de proteccin de los miRNAs circulantes, son sin duda
sus propios mecanismos de transporte, principalmente los exosomas. Estas
pequeas microvesculas son las que evitan que las RNasas del medio los
degraden, ya que s circularan como molculas de va libre sin esta proteccin se
degradaran en segundos. Esto ha sido bien documentado por Gallo et al, quienes
observaron que partculas entre 50-110nm de dimetro, contenan en su interior
miRNAs que fueron posteriormente evaluados mediante PCR en tiempo real,
determinando que en suero la mayora de miRNAs se encuentran dentro de
exosomas (79). Otro estudio que corrobora estos resultados es el realizado por
Ogata-Kawata et al, quien encontr expresin diferencial de miRNAs en muestras
de suero en pacientes con CCR frente a controles sanos, demostrando que los
exosomas son las estructuras encargadas de preservar la integridad de los miRNAs
circulantes (60). Otro aspecto importante es discutido por Maclellan et al, quienes
detallan el efecto de la hemolisis en los niveles de miRNAs en muestras de suero,

73
observando que las muestras que se encuentran hemolizadas con una
concentracin de hemoglobina > 0.1g/L hay una mayor deteccin de miRNAs que
muestras no hemolizadas, atribuyendo esto, al hecho que debido a la lisis de clulas
sanguneas las muestras de suero podran enriquecerse de miRNAs provenientes
de productos celulares derivados de la sangre, presentando un falso perfil de
miRNAs al no discriminar entre miRNAs provenientes del suero y miRNAs
provenientes de la lisis de clulas sanguneas (80). Para el caso de nuestro estudio,
aunque no fueron cuantificados los niveles de hemoglobina de las muestras, no se
colectaron aquellas muestras que presentaran un aspecto rojizo o hemolisado para
evitar un enriquecimiento sesgado de las muestras. De acuerdo con nuestra
experiencia durante el desarrollo de los experimentos iniciales de aislamiento y
cuantificacin de miRNAs en tejido y suero, el procedimiento que nos brind certeza
de la integridad del material extrado de las muestras, fue la construccin de las
bibliotecas de cDNA de los miRNAs, debido a que la longitud de las bibliotecas
ensambladas tenan una longitud especifica cuando los miRNAs eran de 27 o de 30
nucletidos.

8.2 Bsqueda de miRNAs por secuenciacin de ltima generacin

Desde el diseo experimental del estudio, fue planteada una metodologa que
permitiera la bsqueda de miRNAs tanto reportados como nuevos, donde se
generaran los datos que posteriormente seran validados mediante PCR en tiempo
real. Algunos autores, parten del conocimiento previo de los miRNAs que desean
evaluar, estos estudios enfocan principalmente su atencin en aquellos miRNAs
que alteran su expresin en cohortes donde evalan casos frente a controles sanos;
sin embargo, esta metodologa restringe la cantidad de datos que se podra llegar a
obtener si se empleara alguna metodologa de alto procesamiento como la
secuenciacin a gran escala. Otra estrategia de bsqueda de miRNAs son
experimentos de microarreglos de miRNAs, los cuales analizan un nmero de genes
mayor dependiendo de la plataforma, sin embargo es un experimento que se disea

74
con un conocimiento previo de los miRNAs que se quieren evaluar. La bsqueda de
miRNAs mediante secuenciacin de ltima generacin permite evaluar un nmero
de muestras establecido, obteniendo datos de calidad y de alta reproducibilidad,
que pueden ser corroborados y analizados mediante anlisis bioinformtico.

Para este trabajo, fue realizada la secuenciacin de ltima generacin de 16

muestras de tejido tumoral de cncer colorrectal, desde la construccin hasta la
cuantificacin y validacin de las bibliotecas. Importantes desafos metodolgicos
fueron sobrellevados durante este proceso, siendo la concentracin inicial de RNA
input o inicial uno de los principales. Debido a que la concentracin de RNA exigida
por la tcnica es de 1g, en muestras de suero esta variable fue la limitante principal
por la cual no se llev a cabo la secuenciacin de muestras de suero. La literatura
reporta diferentes abordajes para sobrellevar esta condicin metodolgica; Williams
et al, emplearon 5ng de muestras de suero y plasma y afirman que cuando no tenan
esta cantidad trabajaban con la cantidad que tenan en el momento del aislamiento
(81); Para este estudio sin embargo, fueron evaluadas bibliotecas procedentes de
suero que fueron ensambladas con RNA inicial entre 5-7g de RNA y en el momento
de verificar la longitud de la biblioteca se observa que no haba sido ensamblada
eficazmente. Estrategias de elaboracin de bibliotecas que establezcan
concentraciones iniciales inferiores a 1g, podran ser implementadas en estudios
futuros, Shanker et al, reporta el uso de diferentes metodologas de construccin de
bibliotecas en los que encuentra que a partir de 50pg se puede detectar la presencia
de miRNAs por PCR en tiempo real (82).

El resultado de la secuenciacin de las 16 bibliotecas, permiti la deteccin de 763

miRNAs maduros, los cuales se alinearon por lo menos 1 vez con algunas de las
bases de datos de miRBase (para detectar miRNAs reportatdos), RefSeq o Rfam
(para detectar transcritos que no sean miRNAs y generen contaminacin en el
anlisis) y al genoma humano (para detectar nuevos miRNAs)(71). De estos 763 se
realiz un anlisis para evaluar participacin en vas moleculares de CCR a los 5

75
miRNas que presentaron el mayor frecuencia en el nmero de lecturas estos fueron
hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR22-3p y hsa-miR-26a-
5p. Nuestro resultado, corrobora lo reportado por Schee et al, quienes trabajaron
con una cohorte de 88 pacientes con CCR, obteniendo 523 miRNAs maduros de los
cuales tres de estos hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-192-5p y hsa-miR22-3p fueron los
ms abundantes (83). Esto demuestra, la alta reproducibilidad y la concordancia de
los datos presentes en nuestro estudio.

Las principales vas de sealizacin en CCR modificadas por estos tres miRNAs
fueron WNT, MAPKs y TGF-.

Durante la formacin de las criptas colonicas la va WNT/-catenina participa en el

recambio de clulas madre activando la proliferacin celular y reprimiendo la
apoptosis; sin embargo cuando esta va se altera se favorece la proliferacin y
disminuye la apoptosis, hsa-miR-10a-5p puede tener efectos sobre esta va.
Respecto a la va MAPK esta, participa activamente en la va aserrada de la
carcinognesis colorrectal, que modula la transformacin de plipos benignos a
adenomas aserrados a travs de la participacin de los oncogenes BRAF y KRAS.
Por otro lado, la alteracin de TGF-, provoca inhibicin del efecto anti-proliferativo,
que conlleva a la generacin de procesos tumorales(6).

hsa-miR-10a-5p y hsa-miR-22-3p podran tener un papel como biomarcadores en

la medida que participan activamente en la regulacin de genes involucrados en las
vas clsicas en cncer colorrectal.

Otra de las virtudes de la secuenciacin de ltima generacin, es el descubrimiento

de nuevos candidatos a miRNAs. Existen varios parmetros a tener en cuenta a la
hora de poder catalogar una secuencia como un candidato a miRNA maduro.
Kozomara & Griffiths (18), determinaron los criterios para reportar una secuencia
localizada en el genoma como un candidato a miRNA, sin embargo para estos
autores el principal argumento para anotar nuevas secuencias de miRNAs maduros

76
en la base mirBase, es que estos resultados sean aceptados y publicados, para de
esta manera citarlos como secuencias previamente sometidas a revisin.

Para el caso de nuestro estudio, se obtuvieron 64 predicciones de candidatos de

nuevos miRNAs maduros, obteniendo sus coordenadas genmicas de localizacin
de sus secuencias precursoras, destacndose la regin genmica contenida en el
cromosoma 10. Observaciones preliminares de genes asociados a cncer
colorrectal, ubican algunos genes de susceptibilidad y otros de alto riesgo en el
cromosoma 10: VTI1A:10q25.2, TCF7L2:10q25.3, BMPR1A:10q22.3, ZEB1
10p11.2, MAP3K8:10p11.23, PRINS:10p12.1, VIM:10p13, ALOX5:10q11.2, DKK1:
10q11.2, ERCC6:10q11.23, PLCE1:10q23,SNCG:10q23.2-q23.3, ACTA2: 10q23.3,
CYP2C9:10q24, ABCC2:10q24, SFRP5:10q24.1, BNIP3:10q26.3 y PTEN: 10q23.3
(84).

8.3 Alteracin de la expresin de miRNAs circulantes en cncer

El principal propsito de este estudio, se centr en evaluar el perfil de expresin de
los miRNAs que fueron generados mediante la bsqueda por secuenciacin de
muestras de pacientes con cncer colorrectal. El diseo original enmarcaba la
secuenciacin de bibliotecas procedentes de muestras de tejido y suero, sin
embargo como se ha explicado a lo largo del documento, nicamente se realiz la
secuenciacin en muestras de tejido tumoral. Por esta razn el estudio se enmarco
en establecer los niveles de expresin de 21 miRNAs, con el fin de evaluar cules
podan ser potenciales biomarcadores con implicaciones clnicas a futuro.

Para este fin, fue diseado un experimento que pudiera validar la informacin
obtenida en la secuenciacin, por esta razn se determin realizar PCR en tiempo
real. La literatura reporta que para fines de anlisis de la expresin de miRNAs, el
mejor mtodo de anlisis es la cuantificacin relativa frente a la cuantificacin
absoluta debido a que esta ltima no tiene en cuenta la calidad del RNA evaluado
al realizar cuantificaciones con diluciones y concentraciones establecidas por el

77
investigador (85). El anlisis de cuantificacin relativa por su parte, aunque tiene la
ventaja de ser menos dispendioso metodolgicamente, requiere una revisin
rigurosa y asertiva del gen que se empleara como normalizador. Algunos estudios
donde evalan expresin de miRNAs, suelen emplear como normalizador RNAs
endgenos nucleolares como es el caso de RNU6A o RNU6B, sin embargo estos
transcritos no son miRNAs por lo que no reflejan la naturaleza bioqumica de las
molculas de miRNA (85). Otro de los aspectos a tener en cuenta es la variabilidad
que estos RNAs endgenos pueden presentar, Xiang et al, evaluaron la expresin
de RNU6 en muestras de suero, encontrando fluctuaciones en la expresin de este
cuando es sometido a diferentes ciclos de congelacin y descongelacin (86).

Otra estrategia se basa en el uso de normalizadores exgenos como genes de

referencia, estos podran ser RNAs sintticos que en algunos casos son empleados
como controles de referencias respecto a la variabilidad tcnica entre una muestra
y otra; Estos miRNAs sintticos han sido utilizados como normalizadores en algunos
estudios, sin embargo estas molculas sintticas no tienen en cuenta la calidad de
la muestra por lo que no resultara comparable con las muestras a normalizar (87).

Finalmente, algunos autores deciden emplear otros miRNAs como normalizadores,

pero en algunos casos las mismas condiciones que desean evaluar terminan
alterando al normalizador o solo son estables para un determinado tipo de
enfermedad o condicin. La literatura argumenta que an no existe un consenso
que sugiera un normalizador que se emplee como un estndar en estudios de
miRNAs circulantes en cncer colorrectal (87).

Para el caso del presente estudio, se evaluaron los valores Ct de los 22 miRNAs y
posteriormente se evalu cules eran los ms estables en trminos de coeficiente
de variacin, determinando que el hsa-miR-92-3p fue el ms estable dentro de los
22 miRNAs analizados. Algunos autores han determinado la presencia de hsa-miR-
92-3p en muestras de sangre esto lo describe Lpez et al, quien realiza un estudio

78
en diferentes tipos de muestras incluyendo sangre y posteriormente secuenciacin
de ltima generacin de estas muestras, determinando un importante nmero de
miRNAs en sangre entre los que se encontraba hsa-miR-92a-3p(88). Por otro lado
Arroyo et al, realizaron un estudio donde demuestra que existen poblaciones de
miRNAs que circulan en plasma y suero, que se encuentran acopladas a la protena
Ago2, dentro de este grupo, igualmente encuentra presencia de hsa-miR-92a-3p en
muestras de voluntarios sanos (35).

De los 21 miRNAs circulantes evaluados, tres presentaron una expresin diferencial

entre cncer y los individuos sanos; interesantemente, uno de los tres present un
nivel de expresin reducido en los casos frente a los controles, este fue el caso de
hsa-miR-10a-5p. De acuerdo a lo reportado por Wang et al, en el que evalu un
perfil de expresin de miRNAs circulantes en plasma de 10 pacientes con CCR,
encontr que la expresin de hsa-miR-10 a-5p fue bajamente regulada en los
pacientes afectados en comparacin a los controles presentando una reduccin de
0,14 veces respecto al normalizador (64). Por otra parte Schee et al, determina que
por secuenciacin hsa-miR-10a-5p, fue uno de los ms abundantes en cuanto a
nmero de lecturas, a pesar de esto, ellos no realizaron una comparacin entre
casos y controles de CCR (83). Nuestro resultado corrobora lo reportado por Wang
et al y sugiere que este miRNA podra tener un efecto de supresor tumoral, en la
medida que se encuentra desregulado en los pacientes con cncer. En este sentido,
Sun et al, demuestra que miR-10a es capaz de suprimir la expresin de BICR5
(survivina) en clulas de cncer de pulmn A549, el cual como ya se detall
anteriormente, es un importante inhibidor de la apoptosis (89). Este resultado abre
la posibilidad de estudiar al detalle la funcin ejercida en el contexto del cncer
colorrectal especficamente; estudios futuros que validen experimentalmente
nuestros resultados podran postular a hsa-miR-10a-5p como un miRNA circulante
bajamente regulado en cncer colorrectal que tiene funciones de supresor tumoral.

79
En contraste, dos miRNAs circulantes presentaron niveles de expresin
aumentados en cncer frente a los controles estos fueron hsa-miR-20a-5p y hsa-
miR-423-3p. De hsa-miR-20a-5p existe informacin en la literatura que lo vincula a
la regulacin de uno de los principales puntos de chequeo del ciclo celular en G1
que es p21 (90). Este miRNAs segn datos experimentales, se une al 3UTR del
transcrito de p21 e impide que codifique la protena, de esta manera evita que la
clula con alteraciones entre en fase de chequeo promoviendo su proliferacin
descontrolada. Por otro lado, existen pocos estudios que mencionan a hsa-miR-
20a-5p como un miRNA circulante en cncer colorrectal; Yau et al, evalu el rol de
miR-20a-5p como biomarcador diagnstico en heces fecales de pacientes con
cncer colorrectal, encontrando altos niveles de expresin de este miRNA, el cual
discrimina los grupos entre pacientes y muestras circundantes normales (50). En
tejido tumoral de cncer colorrectal tipo II, Zhang et al, evaluaron el valor pronstico
de hsa-miR-20a-5p de muestras con tumor frente a muestras circundantes
normales, encontrando que la expresin de este miRNAs fue capaz de catalogar
individuos con alto riesgo de progresin de la enfermedad (91).

En nuestro estudio, se encontr que hsa-miR-20a-5p fue sobre-expresado en

cncer colorrectal en comparacin a los controles sanos, corroborando lo publicado
por los anteriores estudios; igualmente nuestro resultado ha sido uno de los
primeros en vincular este miRNA circulante (secuenciado en tejido tumoral y
expresado en suero), con alteraciones en cncer colorrectal, lo cual resulta un
importante aporte para la investigacin de biomarcadores basados en miRNAs
circulantes. Finalmente, asociando las evidencias reportadas en la literatura con los
resultados obtenidos en este estudio, se sugiere que hsa-miR-20 a-5p podra tener
funciones de oncomiR, al regular negativamente a p21 y estar altamente expresado
en pacientes con CCR.

Igualmente se observ en nuestros resultados la sobreexpresin de hsa-miR-423-

3p en las muestras de cncer; la literatura lo asocia igualmente con la regulacin

80
negativa de p21(77) este rasgo podra asociarlo similarmente a una funcin de
oncomiR; biolgicamente esta supresin de p21 desencadena una cadena de
eventos moleculares que influencian la tumorogenesis. Por otra parte, Xing et al,
investigaron un campo novedoso en miRNAs, los polimorfismos de nucletido nico
(SNPs de sus siglas en ingls) de precursores de miRNAs, ellos centraron su
atencin en el SNP rs6505162 del pre-miR-423-3p; esta firma gentica, reconoce
sobrevivencia total y sobrevivencia libre de recurrencia en pacientes con CCR,
convirtindose este SNP en un importante marcador de pronstico en CCR.

Los dos miRNAs que fueron sobre expresados en cncer en este estudio, podran
aportar informacin acerca del papel de los miRNAs circulantes como
biomarcadores en suero; una tendencia que ha sido establecida en los ltimos aos,
de bsqueda de biomarcadores de fcil obtencin e informativos.

81
9 Conclusiones

Un amplio panorama en el campo del diagnstico temprano del cncer ha sido

establecido, a travs del desarrollo de mtodos de deteccin de biomarcadores no
invasivos y que tienen la posibilidad de evidenciar las alteraciones moleculares del
cncer desde sus etapas iniciales.

En este estudio fueron secuenciados 763 miRNAs maduros, fueron encontrados 64

candidatos a nuevos miRNAs, se validaron 21 y fueron descritos tres con potencial
uso clnico a futuro. La bsqueda y validacin de miRNAs circulantes podra brindar
un panorama ms amplio para la deteccin temprana y diagnstico del cncer.

Nuestro estudio detect dos miRNAs circulantes hsa-miR-20 a5p y hsa-miR-423-

3p, que presentaron diferencias significativas respecto a los controles sanos; estos
miRNAs podran tener un potencial diagnstico dentro del modelo de cncer
colorrectal. Igualmente aunque los tres presentaron diferencias significativas, la
mayora de miRNAs evaluados se detectaron en tejido y suero, lo cual es un rasgo
importante desde el punto de vista del diagnstico, encontrando en suero lo que
estara reflejando el tumor.

La bsqueda de miRNAs empleando secuenciacin de ltima generacin es una

metodologa de alto procesamiento debido a que brinda informacin detallada de
toda la poblacin de miRNAs hallada en los tejidos tumorales para nuestro estudio,
adems es la metodologa ms apropiada para la bsqueda de nuevos candidatos
a miRNAs maduros.

82
10 Perspectivas

De acuerdo a lo reportado en la literatura, se asume que los miRNAs aislados y

analizados en este estudio eran procedentes de exosomas. Se sugiere para
estudios futuros, realizar un aislamiento de exosomas a partir de suero de pacientes
con CCR, con el nimo de secuenciar y validar los datos por PCR en tiempo real,
con el fin de corroborar los resultados presentados en este trabajo.

El experimento de secuenciacin arrojo 763 miRNAs maduros de los cuales en este

estudio fueron evaluados 21, a futuro podra emplearse este resultado para indagar
ms especialmente si estos miRNAs tendran potencial de biomarcadores.

El anlisis bioinformtico, realiz la prediccin de estos candidatos, empleado

algoritmos basados en secuencia y termodinmica, resultara interesante indagar
con ms detalle s regiones circundantes a las regiones aqu presentadas podran
estar dentro del marco de lectura de algunos de los genes relacionados con cncer
colorrectal para de esta manera poder establecer que rol biolgico podran estar
desempeando en cncer.

De acuerdo al resultado de los miRNAs circulantes que tuvieron una expresin

diferencial en cncer y detectados en suero y tejido se sugiere validar estos
resultados empleando un tamao de muestra ms amplio.

83
11 Bibliografa

1. Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, Eser S, Mathers C, Rebelo M, et al. Cancer incidence

and mortality worldwide: Sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer.
2015;136(5):E359-86.
2. Sharp L, Tilson L, Whyte S, O'Ceilleachair A, Walsh C, Usher C, et al. Cost-effectiveness of
population-based screening for colorectal cancer: a comparison of guaiac-based faecal occult
blood testing, faecal immunochemical testing and flexible sigmoidoscopy. Br J Cancer.
2012;106(5):805-16.
3. Gonzalez de Castro D, Angulo B, Gomez B, Mair D, Martinez R, Suarez-Gauthier A, et al. A
comparison of three methods for detecting KRAS mutations in formalin-fixed colorectal cancer
specimens. Br J Cancer. 2012;107(2):345-51.
4. Mitchell PS, Parkin RK, Kroh EM, Fritz BR, Wyman SK, Pogosova-Agadjanyan EL, et al.
Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proc Natl Acad Sci U S
A. 2008;105(30):10513-8.
5. Morn A, Ortega P, de Juan C, Fernndez-Marcelo T, Fras C, Snchez-Pernaute A, et al.
Differential colorectal carcinogenesis: Molecular basis and clinical relevance. World J Gastrointest
Oncol. 2010;2(3):151-8.
6. Sanabria MC UA, Serrano ML, et al. Vas de carcinognesis colorrectal y sus implicaciones
clnicas. 2012. p. 170-81.
7. Vogelstein B, Fearon ER, Hamilton SR, Kern SE, Preisinger AC, Leppert M, et al. Genetic
alterations during colorectal-tumor development. N Engl J Med. 1988;319(9):525-32.
8. Liu B, Nicolaides NC, Markowitz S, Willson JK, Parsons RE, Jen J, et al. Mismatch repair
gene defects in sporadic colorectal cancers with microsatellite instability. Nat Genet. 1995;9(1):48-
55.
9. Grady WM, Markowitz S. Genomic instability and colorectal cancer. Curr Opin
Gastroenterol. 2000;16(1):62-7.
10. Boland CR, Goel A. Microsatellite instability in colorectal cancer. Gastroenterology.
2010;138(6):2073-87.e3.
11. Gatalica Z, Torlakovic E. Pathology of the hereditary colorectal carcinoma. Fam Cancer.
2008;7(1):15-26.
12. Wiratkapun S, Kraemer M, Seow-Choen F, Ho YH, Eu KW. High preoperative serum
carcinoembryonic antigen predicts metastatic recurrence in potentially curative colonic cancer:
results of a five-year study. Dis Colon Rectum. 2001;44(2):231-5.
13. Jen J, Kim H, Piantadosi S, Liu ZF, Levitt RC, Sistonen P, et al. Allelic loss of chromosome
18q and prognosis in colorectal cancer. N Engl J Med. 1994;331(4):213-21.
14. Munro AJ, Lain S, Lane DP. P53 abnormalities and outcomes in colorectal cancer: a
systematic review. Br J Cancer. 2005;92(3):434-44.
15. Andreyev HJ, Norman AR, Cunningham D, Oates J, Dix BR, Iacopetta BJ, et al. Kirsten ras
mutations in patients with colorectal cancer: the 'RASCAL II' study. Br J Cancer. 2001;85(5):692-6.
16. Ahmad J, Hasnain SE, Siddiqui MA, Ahamed M, Musarrat J, Al-Khedhairy AA. MicroRNA in
carcinogenesis & cancer diagnostics: a new paradigm. Indian J Med Res. 2013;137(4):680-94.
17. Ambros V. The functions of animal microRNAs. Nature. 2004;431(7006):350-5.
18. Kozomara A, Griffiths-Jones S. miRBase: annotating high confidence microRNAs using deep
sequencing data. Nucleic Acids Res. 2014;42(Database issue):D68-73.

84
19. Ambros V, Bartel B, Bartel DP, Burge CB, Carrington JC, Chen X, et al. A uniform system for
microRNA annotation. RNA. 2003;9(3):277-9.
20. Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell.
2004;116(2):281-97.
21. Schwarzenbach H, Nishida N, Calin GA, Pantel K. Clinical relevance of circulating cell-free
microRNAs in cancer. Nat Rev Clin Oncol. 2014;11(3):145-56.
22. Geeleher P, Huang SR, Gamazon ER, Golden A, Seoighe C. The regulatory effect of miRNAs
is a heritable genetic trait in humans. BMC Genomics. 2012;13:383.
23. Chen PS, Su JL, Hung MC. Dysregulation of microRNAs in cancer. J Biomed Sci. 2012;19:90.
24. Davis-Dusenbery BN, Hata A. Mechanisms of control of microRNA biogenesis. J Biochem.
2010;148(4):381-92.
25. Fabbri M. miRNAs as molecular biomarkers of cancer. Expert Rev Mol Diagn.
2010;10(4):435-44.
26. Vasudevan S, Tong Y, Steitz JA. Switching from repression to activation: microRNAs can up-
regulate translation. Science. 2007;318(5858):1931-4.
27. rom UA, Nielsen FC, Lund AH. MicroRNA-10a binds the 5'UTR of ribosomal protein
mRNAs and enhances their translation. Mol Cell. 2008;30(4):460-71.
28. Place RF, Li LC, Pookot D, Noonan EJ, Dahiya R. MicroRNA-373 induces expression of genes
with complementary promoter sequences. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105(5):1608-13.
29. Cortez MA, Bueso-Ramos C, Ferdin J, Lopez-Berestein G, Sood AK, Calin GA. MicroRNAs in
body fluids--the mix of hormones and biomarkers. Nat Rev Clin Oncol. 2011;8(8):467-77.
30. Lawrie CH, Gal S, Dunlop HM, Pushkaran B, Liggins AP, Pulford K, et al. Detection of
elevated levels of tumour-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell
lymphoma. Br J Haematol. 2008;141(5):672-5.
31. Weber JA, Baxter DH, Zhang S, Huang DY, Huang KH, Lee MJ, et al. The microRNA spectrum
in 12 body fluids. Clin Chem. 2010;56(11):1733-41.
32. Hessvik NP, Sandvig K, Llorente A. Exosomal miRNAs as Biomarkers for Prostate Cancer.
Front Genet. 2013;4:36.
33. Turchinovich A, Samatov TR, Tonevitsky AG, Burwinkel B. Circulating miRNAs: cell-cell
communication function? Front Genet. 2013;4:119.
34. Vickers KC, Palmisano BT, Shoucri BM, Shamburek RD, Remaley AT. MicroRNAs are
transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol.
2011;13(4):423-33.
35. Arroyo JD, Chevillet JR, Kroh EM, Ruf IK, Pritchard CC, Gibson DF, et al. Argonaute2
complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma.
Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108(12):5003-8.
36. Calin GA, Dumitru CD, Shimizu M, Bichi R, Zupo S, Noch E, et al. Frequent deletions and
down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia.
Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99(24):15524-9.
37. Lu J, Getz G, Miska EA, Alvarez-Saavedra E, Lamb J, Peck D, et al. MicroRNA expression
profiles classify human cancers. Nature. 2005;435(7043):834-8.
38. Rosenfeld N, Aharonov R, Meiri E, Rosenwald S, Spector Y, Zepeniuk M, et al. MicroRNAs
accurately identify cancer tissue origin. Nat Biotechnol. 2008;26(4):462-9.
39. Meiri E, Mueller WC, Rosenwald S, Zepeniuk M, Klinke E, Edmonston TB, et al. A second-
generation microRNA-based assay for diagnosing tumor tissue origin. Oncologist. 2012;17(6):801-
12.

85
40. Heneghan HM, Miller N, Kelly R, Newell J, Kerin MJ. Systemic miRNA-195 differentiates
breast cancer from other malignancies and is a potential biomarker for detecting noninvasive and
early stage disease. Oncologist. 2010;15(7):673-82.
41. Sun Y, Wang M, Lin G, Sun S, Li X, Qi J, et al. Serum microRNA-155 as a potential biomarker
to track disease in breast cancer. PLoS One. 2012;7(10):e47003.
42. Mahn R, Heukamp LC, Rogenhofer S, von Ruecker A, Mller SC, Ellinger J. Circulating
microRNAs (miRNA) in serum of patients with prostate cancer. Urology. 2011;77(5):1265.e9-16.
43. Moltzahn F, Olshen AB, Baehner L, Peek A, Fong L, Stppler H, et al. Microfluidic-based
multiplex qRT-PCR identifies diagnostic and prognostic microRNA signatures in the sera of prostate
cancer patients. Cancer Res. 2011;71(2):550-60.
44. Yaman Agaoglu F, Kovancilar M, Dizdar Y, Darendeliler E, Holdenrieder S, Dalay N, et al.
Investigation of miR-21, miR-141, and miR-221 in blood circulation of patients with prostate
cancer. Tumour Biol. 2011;32(3):583-8.
45. Komatsu S, Ichikawa D, Tsujiura M, Konishi H, Takeshita H, Nagata H, et al. Prognostic
impact of circulating miR-21 in the plasma of patients with gastric carcinoma. Anticancer Res.
2013;33(1):271-6.
46. Tsujiura M, Ichikawa D, Komatsu S, Shiozaki A, Takeshita H, Kosuga T, et al. Circulating
microRNAs in plasma of patients with gastric cancers. Br J Cancer. 2010;102(7):1174-9.
47. Yu J, Wang Y, Dong R, Huang X, Ding S, Qiu H. Circulating microRNA-218 was reduced in
cervical cancer and correlated with tumor invasion. J Cancer Res Clin Oncol. 2012;138(4):671-4.
48. Schetter AJ, Leung SY, Sohn JJ, Zanetti KA, Bowman ED, Yanaihara N, et al. MicroRNA
expression profiles associated with prognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma.
JAMA. 2008;299(4):425-36.
49. Hu J, Xu Y, Cai S. Specific microRNAs as novel biomarkers for combination chemotherapy
resistance detection of colon adenocarcinoma. Eur J Med Res. 2015;20(1):95.
50. Yau TO, Wu CW, Tang CM, Chen Y, Fang J, Dong Y, et al. microRNA-20a in human faeces as
a non-invasive biomarker for colorectal cancer. Oncotarget. 2015.
51. Basati G, Razavi AE, Pakzad I, Malayeri FA. Circulating levels of the miRNAs, miR-194, and
miR-29b, as clinically useful biomarkers for colorectal cancer. Tumour Biol. 2015.
52. Fang Z, Tang J, Bai Y, Lin H, You H, Jin H, et al. Plasma levels of microRNA-24, microRNA-
320a, and microRNA-423-5p are potential biomarkers for colorectal carcinoma. J Exp Clin Cancer
Res. 2015;34:86.
53. Yu J, Jin L, Li W, Jiang L, Hu Y, Zhi Q, et al. Serum miR-372 is a diagnostic and prognostic
biomarker in patients with early colorectal cancer. Anticancer Agents Med Chem. 2015.
54. Nonaka R, Miyake Y, Hata T, Kagawa Y, Kato T, Osawa H, et al. Circulating miR-103 and
miR-720 as novel serum biomarkers for patients with colorectal cancer. Int J Oncol.
2015;47(3):1097-102.
55. Yamada A, Horimatsu T, Okugawa Y, Nishida N, Honjo H, Ida H, et al. Serum miR-21, miR-
29a, and miR-125b Are Promising Biomarkers for the Early Detection of Colorectal Neoplasia. Clin
Cancer Res. 2015;21(18):4234-42.
56. Aherne ST, Madden SF, Hughes DJ, Pardini B, Naccarati A, Levy M, et al. Circulating miRNAs
miR-34a and miR-150 associated with colorectal cancer progression. BMC Cancer. 2015;15:329.
57. Nonaka R, Nishimura J, Kagawa Y, Osawa H, Hasegawa J, Murata K, et al. Circulating miR-
199a-3p as a novel serum biomarker for colorectal cancer. Oncol Rep. 2014;32(6):2354-8.
58. Perilli L, Vicentini C, Agostini M, Pizzini S, Pizzi M, D'Angelo E, et al. Circulating miR-182 is a
biomarker of colorectal adenocarcinoma progression. Oncotarget. 2014;5(16):6611-9.
59. Wang J, Huang SK, Zhao M, Yang M, Zhong JL, Gu YY, et al. Identification of a circulating
microRNA signature for colorectal cancer detection. PLoS One. 2014;9(4):e87451.

86
60. Ogata-Kawata H, Izumiya M, Kurioka D, Honma Y, Yamada Y, Furuta K, et al. Circulating
exosomal microRNAs as biomarkers of colon cancer. PLoS One. 2014;9(4):e92921.
61. Toiyama Y, Hur K, Tanaka K, Inoue Y, Kusunoki M, Boland CR, et al. Serum miR-200c is a
novel prognostic and metastasis-predictive biomarker in patients with colorectal cancer. Ann Surg.
2014;259(4):735-43.
62. Yong FL, Law CW, Wang CW. Potentiality of a triple microRNA classifier: miR-193a-3p, miR-
23a and miR-338-5p for early detection of colorectal cancer. BMC Cancer. 2013;13:280.
63. Girldez MD, Lozano JJ, Ramrez G, Hijona E, Bujanda L, Castells A, et al. Circulating
microRNAs as biomarkers of colorectal cancer: results from a genome-wide profiling and
validation study. Clin Gastroenterol Hepatol. 2013;11(6):681-8.e3.
64. Wang Q, Huang Z, Ni S, Xiao X, Xu Q, Wang L, et al. Plasma miR-601 and miR-760 are novel
biomarkers for the early detection of colorectal cancer. PLoS One. 2012;7(9):e44398.
65. Nugent M, Miller N, Kerin MJ. Circulating miR-34a levels are reduced in colorectal cancer. J
Surg Oncol. 2012;106(8):947-52.
66. Faltejskova P, Bocanek O, Sachlova M, Svoboda M, Kiss I, Vyzula R, et al. Circulating miR-
17-3p, miR-29a, miR-92a and miR-135b in serum: Evidence against their usage as biomarkers in
colorectal cancer. Cancer Biomark. 2012;12(4):199-204.
67. Ng EK, Chong WW, Jin H, Lam EK, Shin VY, Yu J, et al. Differential expression of microRNAs
in plasma of patients with colorectal cancer: a potential marker for colorectal cancer screening.
Gut. 2009;58(10):1375-81.
68. Zarin DA, Tse T, Williams RJ, Califf RM, Ide NC. The ClinicalTrials.gov results database--
update and key issues. N Engl J Med. 2011;364(9):852-60.
69. Illumina. An introduction to next generation sequencing thechnology. 2014:15.
70. Schmittgen TD, Livak KJ. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.
Nat Protoc. 2008;3(6):1101-8.
71. Hackenberg M, Rodrguez-Ezpeleta N, Aransay AM. miRanalyzer: an update on the
detection and analysis of microRNAs in high-throughput sequencing experiments. Nucleic Acids
Res. 2011;39(Web Server issue):W132-8.
72. Li F, Ambrosini G, Chu EY, Plescia J, Tognin S, Marchisio PC, et al. Control of apoptosis and
mitotic spindle checkpoint by survivin. Nature. 1998;396(6711):580-4.
73. Slattery ML, Lundgreen A, Wolff RK. MAP kinase genes and colon and rectal cancer.
Carcinogenesis. 2012;33(12):2398-408.
74. Shintani M, Okazaki A, Masuda T, Kawada M, Ishizuka M, Doki Y, et al. Overexpression of
cyclin DI contributes to malignant properties of esophageal tumor cells by increasing VEGF
production and decreasing Fas expression. Anticancer Res. 2002;22(2A):639-47.
75. Muoz NM, Upton M, Rojas A, Washington MK, Lin L, Chytil A, et al. Transforming growth
factor beta receptor type II inactivation induces the malignant transformation of intestinal
neoplasms initiated by Apc mutation. Cancer Res. 2006;66(20):9837-44.
76. Nilsson JA, Cleveland JL. Myc pathways provoking cell suicide and cancer. Oncogene.
2003;22(56):9007-21.
77. Li HT, Zhang H, Chen Y, Liu XF, Qian J. MiR-423-3p Enhances Cell Growth Through
Inhibition of p21Cip1/Waf1 in Colorectal Cancer. Cell Physiol Biochem. 2015;37(3):1044-54.
78. Chen X, Ba Y, Ma L, Cai X, Yin Y, Wang K, et al. Characterization of microRNAs in serum: a
novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res. 2008;18(10):997-
1006.
79. Gallo A, Tandon M, Alevizos I, Illei GG. The majority of microRNAs detectable in serum and
saliva is concentrated in exosomes. PLoS One. 2012;7(3):e30679.

87
80. MacLellan SA, MacAulay C, Lam S, Garnis C. Pre-profiling factors influencing serum
microRNA levels. BMC Clin Pathol. 2014;14:27.
81. Williams Z, Ben-Dov IZ, Elias R, Mihailovic A, Brown M, Rosenwaks Z, et al. Comprehensive
profiling of circulating microRNA via small RNA sequencing of cDNA libraries reveals biomarker
potential and limitations. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(11):4255-60.
82. Shanker S, Paulson A, Edenberg HJ, Peak A, Perera A, Alekseyev YO, et al. Evaluation of
commercially available RNA amplification kits for RNA sequencing using very low input amounts of
total RNA. J Biomol Tech. 2015;26(1):4-18.
83. Schee K, Lorenz S, Worren MM, Gnther CC, Holden M, Hovig E, et al. Deep Sequencing
the MicroRNA Transcriptome in Colorectal Cancer. PLoS One. 2013;8(6):e66165.
84. SJ C. Cancer Genetics Web: http://www.cancer-genetics.org/index.htm 2015 [
85. Schwarzenbach H, da Silva AM, Calin G, Pantel K. Data Normalization Strategies for
MicroRNA Quantification. Clin Chem. 2015;61(11):1333-42.
86. Xiang M, Zeng Y, Yang R, Xu H, Chen Z, Zhong J, et al. U6 is not a suitable endogenous
control for the quantification of circulating microRNAs. Biochem Biophys Res Commun.
2014;454(1):210-4.
87. Becker C, Hammerle-Fickinger A, Riedmaier I, Pfaffl MW. mRNA and microRNA quality
control for RT-qPCR analysis. Methods. 2010;50(4):237-43.
88. Lopez JP, Diallo A, Cruceanu C, Fiori LM, Laboissiere S, Guillet I, et al. Biomarker discovery:
quantification of microRNAs and other small non-coding RNAs using next generation sequencing.
BMC Med Genomics. 2015;8:35.
89. Sun W, Ma Y, Chen P, Wang D. MicroRNA-10a silencing reverses cisplatin resistance in the
A549/cisplatin human lung cancer cell line via the transforming growth factor-
/Smad2/STAT3/STAT5 pathway. Mol Med Rep. 2015;11(5):3854-9.
90. Sokolova V, Fiorino A, Zoni E, Crippa E, Reid JF, Gariboldi M, et al. The Effects of miR-20a
on p21: Two Mechanisms Blocking Growth Arrest in TGF--Responsive Colon Carcinoma. J Cell
Physiol. 2015;230(12):3105-14.
91. Zhang JX, Song W, Chen ZH, Wei JH, Liao YJ, Lei J, et al. Prognostic and predictive value of a
microRNA signature in stage II colon cancer: a microRNA expression analysis. Lancet Oncol.
2013;14(13):1295-306.

88
 Anexo 1

Flujo de trabajo empleado por la herramienta miRanalyzer

89
 Anexo 2

Muestra RNA BR [ug/mL] Nmero de Index DNA HS [ug/mL]

11115 >6 1 9,75

76188 >6 2 7,22

761178 2,45 3 7

11132 >6 4 10,75

76184 >6 5 10,15

76196 5,90 6 7,43

76198 >6 7 10,3

76032 >6 8 11,3

11104 >6 9 10,35

11087 >6 10 7,5

11100 >6 11 10,6

13126 5,8 12 3,9

68137 >6 13 11,2

76202 >6 14 13

76207 >6 15 8,5

76228 >6 16 13,7

90
 Anexo 3

Lesion: Adenoma
Edad
Media (SD) 56.71 (15.71)
Mediana (IQR) 53 (45 - 70.50)
Sexo
Femenino
Caso 4 Edad
57,1%
Masculino 3 42,9%
Lesion: Cancer de colon
Edad *
Media (SD) 62.3 (9.29)
Mediana (IQR) 65 (54 - 70)
Sexo
Femenino
Caso 20 54,1%
Edad
Masculino 17 45,9%
Lesion: Control
Edad
Media (SD) 48.13 (12.55)
Mediana (IQR) 45 ( 36 - 59.5)
Sexo
Femenino
Caso 8 Edad
53,3%
Masculino 7 46,7%
Lesion: Polipo
Edad
Media (SD) 56 (12.55)
Mediana (IQR) 56 (49 - 66)
Sexo
Femenino
Caso 10 58,8%
Edad
Masculino 7 41,2%

91