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SEPARACIN DE PROTENA
RESUMEN:
1. Introduccin
Electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato sdico (SDS-PAGE) es una tcnica para
separar protenas basadas en Sobre su capacidad de moverse dentro de una corriente
elctricaEs una funcin de la longitud de sus cadenas de polipptidos o de su peso molecular.
Esto se consigue aadiendo SDS Detergente para eliminar la protena secundaria y terciaria Y
mantener las protenas como polipptido cadenas. El SDS recubre las protenas, principalmente
proporcionales a Su peso molecular, y confiere el mismo valor Carga elctrica a travs de todas
las protenas de la muestra.
Las protenas glicosiladas pueden no emigrar a sus esperadas Peso molecular ya que su
migracin se basa ms en La masa de sus cadenas polipeptdicas, no los azcares que son
Adjunto [1].
El sistema de gel ms utilizado para Separar una amplia gama de protenas por SDS-PAGE es la
Laemmli sistema [2] que utiliza tris-glicina geles Compuesto de un componente de gel de
apilamiento (que se utiliza para Ayudar a enfocar las protenas en bandas afiladas al principio de
El recorrido electrofortico) y el gel de resolucin donde Se usan distintos porcentajes de gel de
acrilamida para separar Las protenas basadas en su peso de masa. este clsico Sistema
discontinuo en el que el pH Y la fuerza inica del tampn utilizado para hacer funcionar el gel
(Tris pH 8,3) es diferente de los tampones utilizados en la (Tris, pH 6,8) y gel de resolucin (Tris,
pH 8,8).
2. SDS
El dodecil sulfato sdico (SDS o NaDS), sodio Laurilsulfato o laurilsulfato de sodio (SLS) es un
Compuesto con la frmula CH _ {3} (CH _ {2}) _ {11} SO3Na. Es un Tensioactivo aninico utilizado
en muchas actividades de limpieza e higiene productos. SDS es un detergente (jabn) que puede
disolverse Molculas hidrofbicas, pero tambin tiene una carga negativa (Sulfato) unido a l.
Por lo tanto, si una clula es incubada Con SDS, las membranas se disolvern, todas las Las
protenas sern solubilizadas por el detergente, ms todos los Las protenas sern cubiertas con
muchas cargas negativas. As que una Protena que comenz como la que se muestra en la parte
superior de La figura 1 se convertir en la que se muestra en la La parte inferior de la figura 1. El
resultado final tiene dos Caractersticas:
2) todas las protenas tienen una carga negativa grande que Significa que todos migrarn hacia
el polo positivo cuando Colocado en un campo elctrico. La parte superior de la figura muestra
una protena con valores negativos Y las cargas positivas debidas a los grupos R cargados en la
protena. El H grande representa dominios hidrfobos Donde los grupos R no polares se han
reunido en un intento de Alejarse del agua polar que rodea a la protena.
El diagrama inferior muestra que el SDS puede interrumpir reas hidrofbicas y protenas de
recubrimiento con muchas Que sobrepasan cualquier carga positiva de la protena Debido a
grupos R cargados positivamente. La resultante Protena ha sido desnaturalizada por SDS
(reducida a su Estructura) y como resultado se ha linealizado.
Figura 1: Esta caricatura representa lo que sucede con una protena (Lnea rosa) cuando se
incuba con la desnaturalizacin Detergente SDS.
3. PAGE
Figura 2: Este dibujo muestra una losa de poliacrilamida (Gris oscuro) con tneles (anillos rojos de
diferente tamao con Sombreado para representar la profundidad) expuesto en el borde Observe que
hay muchos tamaos diferentes de tneles Dispersos aleatoriamente en todo el gel.
Figura 3: Esta es una vista superior de dos tneles seleccionados (slo Dos se muestran para mayor
claridad del diagrama).
Estos tneles se extienden todo el camino a travs del gel, pero Serpentea a travs del gel y no vaya en
lneas rectas. Observe la diferencia de dimetro de los dos tneles. Ahora estamos listos para aplicar la
mezcla de desnaturalizado Protenas al gel y aplicar la corriente (figura 4).
Un archivo elctrico se establece con el polo positivo (rojo Ms) en el extremo lejano y el polo
negativo (negativo negro) en El extremo ms cercano. Dado que todas las protenas tienen una
fuerte negativa Todos se movern en la direccin en que la flecha Apuntar (correr a rojo).
4. Principio
Western blot es una tcnica mediante la cual la protena puede ser Transferido de un gel de
poliacrilamida a una lmina de Nitrocelulosa de tal manera que una rplica fiel de la Se obtiene
el patrn de gel original. Una amplia variedad de Procedimiento analtico puede aplicarse a
Protenas, lo que hace que el Western Blotting sea una poderosa Diagnosticando varias
condiciones patolgicas. En esto Tcnica se coloca una lmina de nitrocelulosa contra la
Superficie de un gel de fraccionamiento de protenas SDS-PAGE y un Corriente aplicada a
travs del gel y dentro de la nitrocelulosa Donde finalmente se unen por fuerzas no covalentes.
Los Tcnica implic tres pasos; Separacin de protenas por SDSPAGE, Blotting y ensayo
inmunolgico.
MATERIALES REQUERIDOS
1. Acrilamida (30% de stock): - disuelto 29,2 g Acrilamida y 0,8 bis-acrilamida en agua destilada
Y hacer hasta 100 ml. Guardar bajo oscuro en mbar Botella de color a 4 c (puede usar hasta
3 meses).
2. Solucin de gel / tampn de gel de separacin pH 8,8, 1,5 M Tris - HCl: - se disolvieron 18,17
g de tris en 75 ml destilados agua. Ajustar a pH 8,8 con HCl 6 N. Ajuste el total Volumen a 100
ml con agua destilada y almacenar a 4 c.
11. Mezcla de acrilamida (10%) para 25 ml de solucin Gel: -9,9 ml, agua destilada + 8,3 ml, 0%
de acrilamida + 6,3 ml, tris-HCl 0,5 M + 0,25 ml, SDS al 10% + 0,25 ml, 10% de APS + 1,0 ml,
TEMED.
12. 5% de gel de apilamiento para 5 ml: - 3,04 ml, agua destilada + 0,83 ml, 30% de acrilamida
+ 0,63 ml, 0,5 M de Tris - HCl (pH 6,8) + 0,05 ml, SDS al 1% + 0,05 ml, APS + 0,005 ml, TEMED.
Preparacin de la muestra
Las muestras pueden ser cualquier material que contenga cidos nucleicos. stos
pueden ser derivados biolgicamente, Ejemplo de clulas procariotas o eucariotas,
tejidos, Virus, muestras ambientales o protenas purificadas. En el Caso de los tejidos o
clulas slidos, a menudo se rompen primero Mecnicamente usando una licuadora
(para una muestra Volmenes), utilizando un homogeneizador (volmenes ms
Sonicador o utilizando ciclos de alta presin, y un Combinacin de tcnicas bioqumicas
y mecnicas - Incluyendo varios tipos de filtracin y centrifugacin - Pueden utilizarse
para separar diferentes compartimentos celulares y Orgnulos antes de la
electroforesis. Biomolculas sintticas Tales como oligonucletidos tambin se pueden
usar como analitos.
Adems de SDS, las protenas pueden ser opcionalmente brevemente Calentado hasta
casi ebullicin en presencia de un agente reductor, Tal como ditiotreitol (DTT) o 2-
mercaptoetanol (betamercaptoetanol / BME), Que desnaturaliza an ms la Protenas
mediante la reduccin de enlaces disulfuro, superando as Algunas formas de
plegamiento de protenas terciarias, y la ruptura Estructura de protena cuaternaria
(subunidades oligomricas). Esto es Conocido como SDS-PAGE reductor. Un colorante
de seguimiento puede ser Aadido a la solucin. Esto suele tener un Movilidad
electrofortica que los analitos para permitir la Experimentador para seguir el progreso
de la solucin a travs El gel durante el recorrido electrofortico.
6. Procedimientos
Bandeja de fundicin de gel
Carga de muestra
Electroforesis
Varios sistemas tampn se utilizan en PAGE dependiendo de La naturaleza de la muestra
y el objetivo experimental. Los tampones utilizados en el nodo y el ctodo pueden ser
los Iguales o diferentes [12, 13, 14]. Se aplica un campo elctrico A travs del gel,
causando la carga negativa de protenas o cidos nucleicos a migrar a travs del gel
desde el negativo Electrodo (el ctodo) hacia el electrodo positivo (el nodo).
Dependiendo de su tamao, cada biomolcula se mueve Diferente a travs de la matriz
de gel: molculas pequeas ms Fcilmente a travs de los poros en el gel, mientras que
los ms grandes Tienen ms dificultad. El gel se ejecuta normalmente por unos pocos
Horas, aunque esto depende de la tensin aplicada a travs El gel; La migracin ocurre
ms rpidamente a voltajes ms altos, Pero estos resultados son tpicamente menos
precisos que los de Bajos voltajes. Despus de la cantidad de tiempo Las biomolculas
han migrado diferentes distancias su tamao. Las biomolculas ms pequeas viajan
Gel, mientras que los ms grandes se mantienen ms cerca del punto de origen.
Por lo tanto, las biomolculas pueden separarse Segn el tamao, que depende
principalmente de la Bajo condiciones desnaturalizantes, sino que tambin depende
Conformacin de orden superior en condiciones nativas. Sin embargo, ciertas
glicoprotenas se comportan de manera anmala SDS.
1. Conecte el aparato a la fuente de alimentacin y aplique 8 V / Cm para el gel de
almacenamiento (70V) y 15 V / Cm para Gel de resolucin (150-200V)
2. La electroforesis se contina hasta que el azul de bromofenol Llega al fondo del gel.
3. Desmonta el aparato y retira el gel de entre Y colocar en una bandeja que contenga
agua destilada Pequea esquina del gel para indicar la direccin de cargando.
Tincin de Coomassie
1.Immersethe el gel en 5volume de solucin de la mancha y la mancha Durante 4 hrs.
A temperatura ambiente con un ligero shacking. Coomassie brillante azul R reacciona
de forma no especfica con protenas.
2. Agitar suavemente el gel teido en la solucin destinada hasta El fondo queda claro.
3. Conservar en cido actico al 7%. Visualice la banda en una iluminador.
7. Resultado
La muestra utilizada en el experimento es E. coli DH5.we separ con xito la protena En SDS-
PAGE y la protena se puede separar sobre la base de Su peso molecular por separado por la
transferencia en una Papel de nitrocelulosa.
8. Conclusin
SDS - PAGE, gel de poliacrilamida de dodecil sulfato sdico Electroforesis, es una tcnica
ampliamente utilizada Bioqumica, forense, gentica y biologa molecular para Protenas
separadas de acuerdo con su electrofortico Movilidad (funcin de la longitud de la cadena
polipeptdica o Peso molecular, as como plegado de protenas de orden superior,
Modificaciones postraduccionales y otros factores).
Electroforesis en gel de muestras que tienen una carga idntica a Masa, resulta en el
fraccionamiento por tamao y probablemente El mtodo bioqumico ms utilizado en el mundo.
Las protenas son compuestos anfteros; Su cargo neto Por lo tanto, se determina por el pH del
medio en el que Estn suspendidos. En una solucin con un pH por encima de su Punto
isoelctrico, una protena tiene una carga negativa neta y Migra hacia el nodo en un campo
elctrico. Debajo de su Punto isoelctrico, la protena est cargada positivamente y
Migra hacia el ctodo. La carga neta Protena es adems independiente de su tamao, es decir,
la Carga transportada por unidad de masa (o longitud, protenas y cidos nucleicos son
macromolculas lineales) de la molcula Difiere de la protena a la protena. A un pH dado, por
tanto, Y en condiciones no desnaturalizantes, el electrofortico Separacin de protenas se
determina tanto por tamao como Carga de las molculas. Sin embargo, los cidos nucleicos
Negativo a cualquier pH utilizado para la electroforesis y adems Llevan una carga negativa fija
por unidad de longitud de la molcula, Proporcionado por el grupo PO4 de cada nucletido de
la cido nucleico. Separacin electrofortica de cidos nucleicos Por lo tanto es estrictamente
de acuerdo a su tamao.
Expresiones de gratitud
Los autores estn agradecidos a todas las (CIFRI) para una amplia ayuda y apoyo. Nosotros
tambin estn agradecidos a la biblioteca central del CIFRI por el mismo.