TECNOLOGICO DE ESTUDIOS SUPERIORES DE

ECATEPEC

REPORTE TINCIN DE GRAM

CEBADA ESTEBAN
HERNANDEZ CONTRERAS MIGUEL
SUREZ PEAROJA ADRIANA
VEGA MENDOZA BERENICE
VILLEGAS CARREO PAMELA

03/04/17
Introduccin

La tincin Gram es utilizada como una tcnica de la microscopia que nos ayuda
a identificar las propiedades morfolgicas de la bacteria

Las bacterias Gram-positivas tienen generalmente una sola membrana rodeada por
una gruesa capa de peptidoglicano. Y tie a los microorganismos de color purpura

Las bacterias Gram-negativas poseen generalmente una fina capa de

peptidoglicano entre dos membranas y esto conlleva a que se tian de color rosita

Nosotros observamos a los microorganismos salmonella thypi y a E.Coli

Los microorganismos del gnero Salmonella y E.coli son bacilos, Gram negativos,
anaerobios facultativos, pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. Su
tamao oscila de 0,3 a 1 um x 1,0 a 6,0 um

Estos microorganismos su forma de invadir el cuerpo humano son muy parecidos

provocan diarrea y en ocasiones fiebre

Objetivo

* Utilizacin de tcnicas tincin gram para la observacin de los microorganismos

* Poner en prctica los conocimientos acerca del microscopio para la
observacin de bacterias

FUNDAMENTO

Una de las caractersticas ms importante de las bacterias es su morfologa,

definida por el tamao, la forma, el arreglo y la estructura. Existen bacterias en
forma redondeada denominadas cocos, en forma cilndrica, denominadas
bacilos y una tercera morfologa como son las que tienen forma de espirales,
denominadas espirilos. A su vez cada categora puede subclasificarse con base a
diferentes arreglos. Estas caractersticas pueden determinarse examinando
muestras al microscopio. Las clulas no teidas son prcticamente transparentes,
pero pueden observarse al microscopio de luz haciendo preparaciones entre
lmina y laminilla o con microscopios especiales como por ejemplo: de contraste
de fases o de campo oscuro. Cuando se dispone de un microscopio de luz, se
pueden teir las bacterias para facilitar su visualizacin. Si se tie una muestra del
cultivo extendida y fijada en una lmina portaobjeto con un colorante dado, las
clulas adquirirn el color del colorante aadido y podr observarse la forma,
tamao y el arreglo de las mismas. Este tipo de coloracin se conoce con el
nombre de coloracin simple.

Para obtener mayor informacin sobre la morfologa y composicin qumica de

las bacterias, debe recurrirse a tinciones diferenciales que involucran el uso de
varios reactivos y stas pueden diferenciarse con base al color que retienen. Ej.
Tincin de Gram y Tincin de Ziehl Neelsen.
PREPARACIN ENTRE LMINA Y LAMINILLA

Este tipo de preparacin permite observar vivos a los microorganismos y resulta

muy til cuando se quiere determinar su motilidad. Estas preparaciones son muy
fciles de realizar, pues slo se coloca sobre la lmina portaobjeto la suspensin
de microorganismos a observar y luego sta se cubre con una laminilla. Entre los
principales inconvenientes que tiene esta preparacin, es que al no estar los
microorganismos teidos, se dificulta su observacin al microscopio y se puede
confundir el movimiento microbiano con las corrientes internas que se producen a
causa de la evaporacin del medio a travs del borde de la laminilla.

COLORACION SIMPLE

Las tinciones se basan en la utilizacin de colorantes que pueden clasificarse

como naturales o sintticos. Los naturales se utilizan principalmente con fines
histolgicos. La mayor parte de los colorantes que se utilizan para teir bacterias
son sintticos, muchos de ellos son las anilinas y los derivados del benceno. Se
habla de coloracin simple cuando una muestra extendida se tie con un solo
colorante. Si la preparacin se tie con safranina, las bacterias adquiriran un
color rojo, si se utiliza azul de metileno, se teirn de azul, si por el contrario se
tien con cristal violeta, las bacterias aparecern teidas de color violeta, es decir
adquirirn el color del nico colorante que se utiliz. Este procedimiento permite
distinguir la morfologa y estructuras internas de la clula bacteriana, como por
ejemplo, la presencia de endospora bacteriana. Existen coloraciones especiales
que permiten poner de manifiesto estructuras bacterianas como por ejemplo:
flagelo, cpsula, endosporas, etc.

TINCION DE GRAM

En 1884, un bacterilogo dans, Christian Gram, desarroll una tcnica de tincin

que permite separar a las bacterias en dos grandes grupos: gram positivas y gram
negativas, basados en si retienen o no, el colorante primario (cristal violeta) luego
del proceso de decoloracin. Los organismos que retienen el cristal violeta luego
de la adicin del agente decolorante, el alcohol, aparecen como azul oscuro o
violeta, y se designan como gram positivos; aquellos que pierden el cristal violeta
y se tien con el colorante secundario, la safranina, aparecen como rojos y se
designan como gram negativos. Un examen minucioso de un extendido
bacteriano teido diferencialmente, provee una informacin muy importante
sobre la caracterizacin morfolgica e identificacin de la muestra. Por ejemplo,
una reaccin positiva o negativa a la Tincin de Gram es sumamente importante
como medio primario de clasificacin. El procedimiento puede resumirse de la
siguiente manera: una vez que la preparacin ha sido fijada a la lmina
portaobjeto, se aade el colorante cristal violeta, el cual se deja en contacto por
1 minuto y las clulas se tien de color violeta, posteriormente se lava el exceso
de colorante con agua destilada, luego se aade la solucin de lugol, que acta
como mordiente, y se deja en contacto por un 1 minuto. El yodo se combina con
el cristal violeta y forma un compuesto que precipita en el interior de la clula;
este complejo puede extraerse fcilmente con alcohol etlico de las gram
negativas, pero no se remueve fcilmente de las gram positivas. Una vez
realizada la decoloracin se aade el colorante de contraste, la safranina, la cual
se deja en contacto por 30 segundos; el exceso de colorante se elimina con agua
destilada. Las lminas as preparadas se secan a temperatura ambiente o con la
ayuda de toallas absorbentes. Este procedimiento se esquematiza en la siguiente
figura:

El por qu las bacterias gram positivas retienen el complejo cristal violeta-yodo y

las gram negativas no, ha sido un tema muy controversial. Una de las
explicaciones que se dan, est relacionada con la naturaleza qumica de la
pared celular de las bacterias gram positivas que previenen la remocin del
complejo con el alcohol. Otra teora mantiene que la gruesa envoltura celular de
las gram positivas, especficamente la capa gruesa de peptidoglucano, se
deshidrata y al encogerse por el efecto del alcohol, ocasiona el cierre de los
poros lo cual impide la salida del complejo cristal violeta-lugol.

Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tien de forma distinta debido a las

diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la
clula bacteriana sirve para dar su tamao y forma al organismo as como para
prevenir la lisis osmtica. El material de la pared celular bacteriana que confiere
rigidez es el peptidoglicano. La pared de la clula gram-positiva es gruesa y
consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano as como algo de
cido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la clula gram-positiva es
peptidoglicano. La pared de la clula gram-negativa, por otro lado, contiene
una capa mucho ms delgada, nicamente de peptidoglicano y est rodeada
por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y
lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la pared de la clula gram-negativa es
peptidoglicano.

En definitiva la pared celular es la barrera para la decoloracin. Si se altera la

pared celular de las bacterias gram positivas se transforman en gram negativas.

FACTORES QUE ALTERAN LA TINCIN DE GRAM

Edad de la bacteria.
Errores del operador.
Uso de antibiticos

A pesar de la gran utilidad de la tincin de Gram, este mtodo debe ser valorado
con precaucin, ya que la reaccin puede variar segn la edad de las clulas
(cultivos viejos de bacterias gram positivas pueden perder capas de
peptidoglicanos y teirse como gram negativos) y la tcnica empleada (al
decolorar por un tiempo muy prolongado se puede correr el riesgo que bacterias
gram positivas se tian como gram negativas). Por esta situacin, junto a la
muestra deben teirse controles con bacterias gram positivas (por
ejemplo Staphylococcus aureus) y gram negativas (por ejemplo, Escherichia coli).

MATERIALES
REACTIVOS:

Cristal violeta,
Yodo lugol,
Alcohol- Cetona,
Safranina.
Aceite de inmersin

EQUIPOS Y MATERIALES:

Mechero
asa de siembra,
portaobjetos,
microscopio.
Papel ceda
Peseta
Vaso de pp. de 100ml

PROCEDIMIENTO:

Paso 1
1. Preparar un frotis de cada uno de los microorganismos

Para preparar los frotis se sigue el siguiente procedimiento:

a. Colocar una pequea gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es

necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de
siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una mnima
gota de agua, que es suficiente.

b. Flamear el asa de siembra y dejar enfriar. Tomar, en condiciones aspticas,

una pequea cantidad del cultivo bacteriano en medio slido y transferirlo a la
gota de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una
suspensin homognea que quede bastante extendida para facilitar su secado.

Nota: Si la muestra se toma de un cultivo en medio lquido, no es necesario

realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de
la suspensin bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente
sobre el portaobjetos.

c. Esperar hasta que el lquido se evapore o acelerar su evaporacin acercando

el portaobjetos a la llama del mechero.

3. Permita que los frotis se sequen al aire y luego fjelos con calor.
Paso 2 Tincin

4. se empieza a teir con cristal violeta agregando suficiente colorante y dejar

actuar durante 1 minuto.

5. Lavar suavemente con agua.

6. agregar una gota, yodo lugol, y deje actuar durante 1 minuto.

7. Lavar suavemente con agua.

8. Decolorar con unas gotitas de alcohol- cetona

Nota: no sobre decolorar, agregar el alcohol gota a gota hasta que este salga
casi claro, solo ligeramente azul.

9. Lavar suavemente con agua.

10. Agregar la safranina por 1 min

11. Lavar suavemente con agua.

12. Examinar al microscopio con el objetivo 100X de inmersin de aceite.

Representacin grafica del procedimiento

RESULTADOS

E.coli (24/03/2017)
frotis & tincin; Villegas Pamela

En la Imagen se muestra la morfologa del microorganismo se observa que son bacilos y

gram Negativo debido a su color, Se observa en diversas zonas el color purpura que se
debe a que la muestra estuvo expuesta al calor mucho tiempo

S. thypi (24/03/2017)

Frotis & tincin; Hernndez Alejandro

En la Imagen se muestra la morfologa del microorganismo se observa que son bacilos y

gram Negativo debido a su color, sin embargo no podemos observar la forma especfica
del bacilo
 S. thypi (24/03/2017)

Frotis & tincin; Suarez Adriana

En la Imagen se muestra la morfologa del microorganismo se observa que son gram
Negativo debido a su color, debemos tomar en cuenta que en este frotis hay muy poquita
muestra y no se puede ver con claridad los bacilos y fue muy difcil enfocar el
microorganismo

En los frotis que no se muestran se da a notar que no tuvimos las precauciones necesarias
para establecer el frotis

Al momento de hacer la decoloracin perdimos la muestra es decir no pudimos establecer

donde se haba colocado la muestra

CONCLUSIONES

La tcnica de la tincin de gram tiene como objetivo identificar las bacterias en Gran Positivo y
Gram Negativo, en el trabajo que realizamos si identificamos el microrganismo a estudiar tambin
tuvimos que poner los conocimientos previos en prctica cmo manejar el microscopio y el
microorganismo a estudiar

BIBLIOGRAFIAS GRAM

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