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GUIAS DE PRCTICAS DE MICROBIOLOGIA GENERAL


Programa de Biologia

OBSERVACIN DE BACTERIAS, TINCIONES SIMPLES Y COMPUESTAS

Introduccin:

Las preparaciones microscpicas fijas y con colorantes son tiles para visualizar los
microorganismos y diferenciarlos en grupos, ya sea para diagnostico o para estudiar sus
propiedades. Existen varias tcnicas de preparacin en hmedo, desde las ms sencillas, como
son las preparaciones frescas y sin coloracin hasta aquellas que necesitan de montaje, como el
caso de las preparaciones fijadas y coloreadas. En las preparaciones frescas, en general, son
utilizados colorantes que no comprometen la vitalidad de las clulas (no son txicos). El uso de
estos colorantes facilita la observacin de las clulas microbianas. Los colorantes son compuestos
orgnicos que presentan afinidad por determinadas estructuras la cual est basada en la carga
positiva y negativa presente en l. Existen colorantes que se unen a los elementos qumicos
especficos de la clula microbiana, colorantes fluorescentes, que cambian el color en la presencia
de reacciones qumicas y colorantes que facilitan la visualizacin.

En general en microbiologa se usan preparaciones coloreadas para mostrar las diferentes


estructuras de los microorganismos, para mostrar sus estructuras internas y para ayudar a
identificar microorganismos similares. El colorante en general es una sal, en que uno de los dos
iones es un cromforo. Si el cromforo es positivo, el colorante es bsico o catinico, como por
ejemplo el azul de metileno, el cristal violeta, fucsina o safranina. Si el cromforo es negativo, el
colorante es cido o aninico, como por ejemplo la nigrosina (tinta china) y el eosinato de metileno.
Los colorantes bsicos son ptimos para colorar las bacterias, porque los cidos nucleicos y
algunos componentes de la pared celular presentan carga negativa y atraen los cromforos
catinicos. Como generalmente los microorganismos en su parte externa tienen una carga
negativa debido al transporte de electrones, estos colorantes se combinan con estructuras de la
superficie celular, por lo cual se hacen ms comunes en las aplicaciones generales. Ya los
colorantes cidos, estn cargados negativamente por eso son repelidos por los componentes
orgnicos de las estructuras celulares, por tal razn no penetran en la clula, sino, que tie el
medio donde est se encuentra. Este tipo de colorante se emplea ms para observar la forma
celular. En las tcnicas de coloracin simple, las clulas microbianas son inicialmente frotadas en
el portaobjetos y en seguida son fijadas por el calor y coloreadas con un nico colorante. Esa
tcnica es til para visualizar la forma (cocos, bacilos o espirilo) y la agrupacin de las clulas
bacterianas. Algunas estructuras internas de las clulas tambin pueden ser visualizadas, como
grnulos metacromticos (polifosfato) y de glicgeno.

Dentro de los tipos de preparaciones se encuentran las preparaciones frescas o en hmedo y las
fijas y coloreadas.

Las preparaciones en montaje en hmedo se realizan con la finalidad de observar la forma y


movilidad de las bacterias vivas. Ej. Bacilos, cocos, espirilos. Ya las preparaciones fijas y
coloreadas se clasifican en tres tipos; tinciones simples, diferenciales y especiales. Estas
coloraciones permiten en algunos casos observar forma y agrupamiento, clasificacin y en otros
casos estructuras bacterianas. Las tinciones simples se realizan con un colorante bsico, ya las
diferenciales (Coloracin de Gram y Coloracin de Zielh Nielsen) y especiales, requieren ms de
un tipo de colorante (Scheaffer-Fulton, Coloracin negativa y flagelos).

Tinciones diferenciales:

La coloracin de Gram descrita en 1884 por Christian Gram, se basa en la diferente composicin
de la pared celular bacteriana. Con este mtodo, las bacterias se colorean inicialmente con un
colorante primario bsico (cristal violeta) mediante intercambios inicos entre los radicales del
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colorante y radicales de la pared bacteriana, posteriormente al adicionar el lugol, ste acta como
mordiente o fijador que se une al Cristal violeta (CV) y forma un complejo Lugol-CV, luego se
adiciona el alcohol acetato el cual produce una deshidratacin de la pared, como la disolucin de
lpidos, no permitiendo la salida del complejo en gram positivas y dejando perforaciones de gran
tamao en las gram negativas permitiendo la salida del complejo lugol- CV, de tal forma que al
adicionar el segundo colorante de contraste, las primeras no lo tomarn porque el cristal violeta
est ocupando los sitios de intercambio en tanto que las segundas al estar decoloradas tomando el
colorante y se tien fucsia o rosado. Esta coloracin nos permite visualizar morfologa (cocos o
bacilos) y afinidad tintorial (violeta o rosado). Aqullos que toman el color violeta se denominan
Gram POSITIVAS y los que toman el color fusin se denominan Gram NEGATIVAS.

La coloracin de Ziehl Neelsen (ZN) se realiza para microorganismos como las Mycobacterias las
cuales se pueden teir con la coloracin de Gram pero no se visualizan porque el poder de
resolucin de los microscopios no alcanza a amplificar su tamao de manera ptima. Esta tincin
ha sido muy utilizada para bactrias del gnero Mycobacterium y cepas patgenas de Nocardia.
Los componentes de esta tincin permiten aumentar la sensibilidad y especificidad de estos grupos
bacterianos al emplear coloraciones que reaccionan con componentes propios y exclusivos de
estos microorganismos como son los cidos miclicos en las Mycobacterias y el cido
mesodiaminopimelico, arabinosa, galactosa en Nocardias. La tincin de ZN se basa en la
utilizacin de Fucsina fenicada caliente, donde el fenol (fenicado) ayuda a penetrar el colorante, el
cual colorea la pared de fucsia, a la vez que el calor aumenta el grosor de la pared (por los lpidos),
el cual al enfriarse queda atrapado en el interior de la bacteria. Al adicionar ALCOHOL ACIDO este
decolora a aquellas bacterias que no poseen estos cidos especficos, en tanto que las que lo
poseen RESISTENla decoloracin, de tal forma que al adicionar el segundo colorante Azul de
metileno, este solo lo toman las bacterias que se decoloraron. De esta forma nos quedan dos
grupos de Bacterias, unas ACIDO ALCOHOL RESISTENTES de color fucsia y otras NO
RESISTENTES de color azul.

Tinciones especiales:

El Mtodo de Schearffer-Fulton, permite la observacin de la endospora bacteriana la cual est


presente en algunos gneros bacterianos como Bacillus, Clostridium y Sporosarcinas. El esporo es
de gran importancia por que resiste a altas temperaturas y factores adversos del ambiente. La
posicin y el tamao que presente la endospora dentro de la clula es un padrn de referencia
para cada especie. En el gnero Clostridium, la endospora presenta generalmente un dimetro
mayor al de la clula vegetativa, ya en el gnero Bacillus, la espora puede ser del tamao menor o
igual, y ubicada en posicin central en la clula vegetativa. Para colorear la endospora se utiliza la
Tincion de Schearffer-Fulton, aqu se aplica el colorante verde de malaquita como colorante
primario, el cual se calienta hasta la emisin de los primeros vapores, aqu el calor ayuda a que el
colorante atraviese la pared impermeable de la endospora. Luego se lava el preparado para
eliminar el exceso del colorante, quedando solo coloreadas las endosporas, posteriormente se
adiciona la safranina, que es el colorante de contraste que tie las clulas diferentes de las
endosporas. As las endosporas aparecen verdes dentro de clulas rojas o rosadas, con este
mtodo se puede determinar la ubicacin intracelular de la misma (terminal, subterminal o central).

Con la Tincin negativa, se puede observar la capsula, la cual es una estructura bacteriana
localizada extracelularmente y no est presente en todas las bacterias. Su composicin qumica es
variable y compleja, segn el tipo de bacteria. Su visualizacin puede realizarse con coloracin
negativa. Con esta tincin se puede identificar la estructura externa que envuelve algunas
bacterias como Klebsiella, Streptococcus y Clostridium. Esta tcnica utiliza como colorante primario
la tinta china o nigrosina. La tcnica de tincin negativa incorpora la tinta china, que posee
componentes de gran tamao los cuales no consiguen entrar dentro de la clula, por esta razn la
capsula aparecer como una zona transparente que rodea a la pared celular (las clulas no son
teidas), sobre un fondo negro. Con este mtodo no se puede afirmar que todas las regiones
claras son capsulas, debido al encogimiento de las clulas o separacin de la tinta china, que
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puede presentar apariencia similar con la capsula. Sin embargo cuando se presentan siluetas
uniformes, es posible que sean reales.

Objetivos
Diferenciar entre los distintos tipos de preparacin.
Entender los principios de cada una de las preparaciones usadas para la observacin
microbiana
Identificar las formas, agrupaciones, clasificaciones y estructuras bacterianas.

Metodologa

Montaje en fresco o hmedo


Muestra en medio liquido: tomar con el asa estril una gota de cultivo (inculo), colocar en el centro
del portaobjetos y posteriormente el cubreobjetos tomando cuidado de no formar burbuja y
observar al microscopio con objetivo de 40x -100x.
Muestra en medio solido: Colocar en el portaobjetos una gota de agua destilada, seguidamente
depositar una colonia del cultivo y realizar una emulsin con la gota, cubra con el cubreobjetos y
observar al microscopio con objetivo de 40x -100x.

Preparacin fija y coloreada


Estas preparaciones permitirn observar las formas, estructuras internas y externas y clase de
agrupacin.

Tincin simple

Tincin con colorante bsico (azul de metileno, el cristal violeta, fucsina o safranina): Tomar el
inculo (lquido o solido) y depositarlo en el portaobjetos y realizar un extendido homogneo, secar
la muestra al calor controlando la temperatura, evitando sobrecalentar y dejar enfriar antes de la
tincin. Cubrir el extendido con un colorante bsico, durante un minuto, lavar con agua para
eliminar el exceso de colorante, dejar secar al aire y observar al microscopio con objetivo de 40x -
100x.
Tincin con colorante cido(Tinta china): realizar una emulsin microbiana (depositar una colonia
del cultivo y mezclar con una gota de agua), colocar una gota del colorante cido sobre la emulsin,
extender el cultivo teido con portaobjetos limpio, hasta obtener una pelcula fina, dejar secar al
ambiente y observar al microscopio con objetivo de 40x -100x.

Tinciones diferenciales

Tincin de Gram Coloque una gota o emulsin de la muestra (dependiendo de s es lquida o


semislido)no mayor a 20uL, y realice un extendido en forma circular, deje secar la lmina a
temperatura ambiente, una vez seca a temperatura ambiente, fjela al calor pasando la 2-3 veces
por el mechero, coloque la lmina en el soporte para colorear que hay en los mesones y agregue el
colorante cristal violeta de manera que cubra la preparacin y djelo por un minuto, de manera
suave y sin quitar la lmina de los soportes, ni llevrsela para el mesn, lave con agua la
preparacin, sin quitar la lmina de soporte, adiciones Lugol por un minuto, lave con agua, sin
quitar la lmina de soporte, adicione alcohol Acetano por 20 segundos, lave suavemente con agua,
sin quitar la lmina de soporte, adicione Fucsina bsica por un minuto, lave suavemente con agua,
saque la lmina de soporte y djela secar a temperatura ambiente en forma vertical. Observe en
100x e informe.

Tincin de Ziehl Neelsen (AAR). Coloque una gota o emulsin de la muestra (dependiendo de s
es lquida o semislido) y proceda a extenderla sobre la lmina. Deje secar la lmina a
temperatura ambiente. No la seque al calor, crea aerosoles y recuerde que la Tuberculosis se
trasmite por va area. Para esta prctica el alumno recibir la lmina ya hecha y fijada,
agregue el colorante Fucsina Fenicada de manera que cubra toda la lmina. No deje que se riegue
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el colorante. Caliente la lmina con llama suave, use el mechero, o tome la pinza con algodn
impregnado en alcohol, encindalo, y pselo por debajo de la lmina hasta que esta emita vapores.
OJO, EL COLORANTE NO SE PUEDE DERRAMAR, adems debe EVITAR LA FORMACIN DE
PRECIPITADOS. Deje que los vapores del colorante caliente, acten por lo menos unos 10
minutos (Puede pasar el mechero por lo menos cada 2-3 minutos para crear los vapores). De
manera suave y sin quitar la lmina de los soportes, lave con agua, adicione alcohol cido hasta
que la lmina quede totalmente decolorada. Lave suavemente con agua. Adicione Azul de
metileno por 3 minutos. Lave suavemente con agua. Por ultimo deje secar la lmina a temperatura
ambiente y en forma vertical. Observe en 100x e informe.

Tinciones especiales
Tincin de Schearffer-Fulton para Endosporas. Preparar y fijar el frotis al calor, cubrir con verde de
malaquita al 5%, flamear la muestra hasta que salgan los primeros vapores, lavar con agua y
repetir la operacin durante cinco minutos. Procurar que el verde de malaquita no se seque ni
ebulla, enfriar la preparacin durante cinco minutos, lavar el exceso de colorante, agregar safranina
durante un minuto, lavar el exceso de colorante, dejar secar la preparacin y observar al
microscopio con los objetivos de 40x -100x.

Tincin negativa para capsula Pueden emplearse dos tcnicas. Tcnica A: realizar una emulsin
microbiana (depositar una colonia del cultivo y mezclar con una gota de agua), colocar una gota de
tinta china, extender el cultivo teido con portaobjetos limpio en forma perpendicular formando un
ngulo de 45, hasta obtener una pelcula fina, dejar secar al ambiente y observar al microscopio
con objetivo de 40x -100x. Tcnica B: realizar una emulsin microbiana (depositar una colonia del
cultivo y mezclar con una gota de agua), colocar una gota de tinta china, extender el cultivo teido
con portaobjetos limpio, hasta obtener una pelcula fina, dejar secar al aire y fijar brevemente con
calor, colorear con safranina por 15 seg, lavar y secar el frotis, observar al microscopio con los
objetivos de 40x -100x. Las bacterias encapsuladas se vern con halo blanco sobre un fondo
oscuro, y la clula de la bacteria de color rosado o rojo.
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Puntos a Considerar:

Discusin: relacione la teora y prctica sobre los diferentes mtodos para la observacin de bacterias.
Cuales son las desventajas de la tincin con un solo tipo de colorante?
Cuales son las ventajas de utilizar las distintas coloraciones citadas en la practica.
Por que la tcnica de tincin de Gram es tan antigua y aun es empleada.
Cuales son los fundamentos de la tincin de Gram, en esta podra omitirse un paso y aun as sera
posible la diferenciacin entre clulas Gram positivas y Gram negativas, cual es ese paso?
Que otros tipos de coloraciones son usadas y para cuales estructuras.

NO OLVIDE utilizar artculos recientemente publicados para consultar sobre estos puntos.

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